Phân lập và đánh giá tác dụng chống oxy hóa của một số hợp chất từ cỏ sữa lá lớn (euphorbia hirta l )

Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn .... Dịch chiết nước và dịch chiết methanol của toàn cây cỏ sữa lá lớn có tác dụng ch

PHẠM BÁ HẠNH

Mã sinh viên: 1101160

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, sự biết ơn sâu sắc tới PGS.TS

Nguyễn Thu Hằng (giảng viên Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội)

- người thầy đã luôn giành thời gian, tâm huyết, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên tôi trong suốt quãng thời gian nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Dược liệu và thời gian hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Dƣợc sĩ Nguyễn Ngọc Cầu – người thầy, người anh; em Cao Huy Bình đã luôn đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá

trình thực nghiệm và hoàn thành khóa luận

Xin gửi lời cảm ơn đến TS Đỗ Thị Hà, Thạc sĩ Nguyễn Thị Ngọc Loan và

các cán bộ tại Khoa Hóa Thực Vật – Viện Dược Liệu đã hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi trong quá trình thực nghiệm

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên công tác tại Bộ môn Dược liệu - Trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu khoa học và hoàn thành khóa luận

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, các thầy cô, các anh chị, các bạn và các em sinh viên tại mái trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên Phạm Bá Hạnh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.2 Phân bố 3

1.3 Thành phần hóa học 3

1.4 Tác dụng sinh học 10

1.5 Công dụng 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn 19

2.3.2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết 19

2.3.3 Phân lập các hợp chất từ cỏ sữa lá lớn 20

2.3.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập được 20

2.3.5 Xử lý kết quả thực nghiệm 20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn 21

3.2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và các phân

đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn 23

3.3 Phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của cỏ sữa lá lớn 23

3.4 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập đƣợc 28

3.4.1 Hợp chất CS 2 28

3.4.2 Hợp chất CS 1 29

3.5 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập đƣợc 31

3.6 Bàn luận 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa lá lớn 4

1.2 Các hợp chất triterpen trong cây cỏ sữa lá lớn 7

1.3 Các hợp chất diterpen trong cây cỏ sữa lá lớn 8

3.1 Kết quả chiết xuất các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá

3.3 Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa của hai chất

CS1 và CS2 trên mô hình dọn gốc tự do DPPH in vitro 33

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

2.1 Ảnh chụp cây cỏ sữa lá lớn nghiên cứu tại thực địa 15 2.2 Ảnh chụp BPTMĐ cỏ sữa lá lớn 16 2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 18

3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất dịch chiết methanol và

các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn

22

3.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập các hợp chất từ phân

đoạn ethyl acetat cỏ sữa lá lớn

24

3.3 Cấu trúc hóa học của CS2 (Quercetin) 29

3.4 Cấu trúc hóa học của CS1 (Quercitrin) 30

4.1 Sơ đồ tóm tắt quá trình nghiên cứu phát triển thuốc từ

dược liệu

32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự gia tăng quá mức các gốc tự do trong cơ thể gây ra hiện tượng “stress oxy hóa” (oxidative stress) được cho là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh mạn tính và thoái hóa như ung thư, tiểu đường, xơ vữa động mạch, nhồi máu cơ tim, Alzheimer và Parkinson [14], [33], [70] Các hợp chất chống oxy hóa có khả năng thu dọn gốc tự do, giảm nguy cơ “stress oxy hóa” [56], [70] Vì vậy, việc tìm kiếm những hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa để nghiên cứu ứng dụng trong phòng và điều trị những bệnh có liên quan tới gốc tự do là cần thiết, trong đó các hợp chất tự nhiên là một đối tượng tiềm năng và được quan tâm

Cây cỏ sữa lá lớn có tên khoa học là Euphorbia hirta L., thuộc họ Thầu dầu

(Euphorbiaceae), là loài cây mọc hoang và tương đối phổ biến ở hầu hết các tỉnh ở nước ta [8] Theo kinh nghiệm dân gian, bộ phận trên mặt đất của cây được sử dụng

để chữa một số bệnh như nhiễm khuẩn đường ruột, nhiễm khuẩn ngoài da, viêm phế quản, viêm thận [5], [8] Nghiên cứu bằng thực nghiệm cho thấy cỏ sữa lá lớn có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư, hạ đường huyết [17], [42], [43], [60] Trong số các tác dụng được nghiên cứu của cỏ sữa lá lớn, nhiều tác dụng có liên quan đến khả năng dọn gốc tự do Trên thế giới, một số tài liệu cũng đã công bố về tác dụng chống oxy hóa của cỏ sữa lá lớn [44], [73] Tuy nhiên, ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào đánh giá tác dụng chống oxy hóa, dọn gốc tự do của

dược liệu này Chính vì vậy, đề tài “Phân lập và đánh giá tác dụng chống oxy

hóa của một số hợp chất từ cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.)” đã được thực

hiện với hai mục tiêu:

1 Phân lập 2 hợp chất từ cây cỏ sữa lá lớn

2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được

Bộ: Euphorbiales (Thầu dầu)

Họ: Euphorbiaceae (Thầu dầu)

1.1 Đặc điểm thực vật

Cây thảo, sống hằng năm, cao 30-60 (70) cm Rễ cọc, đường kính 3-5 mm [21] Thân thường phân nhánh ít, phân nhánh từ giữa hoặc phía trên, mọc thẳng đứng, hiếm khi mọc bò, đường kính 3 mm, màu đỏ nhạt [5],[8], có nhựa mủ trắng [1],[8] và có nhiều lông che chở dài màu vàng nâu và lông ngắn hơn màu trắng [21]

Lá đơn, mọc đối, gốc cuống lá có hai lá kèm nhỏ hình tam giác [21] hay hình lông cứng, kích thước 0,8-1,7 mm, rụng sớm [21] Cuống lá dài 1-3,5 mm, phiến lá hình mác-thuôn, elip dài, hoặc hình trứng-mác, kích thước 10-50 x 3-16 mm, màu không đồng đều từ xanh đến đỏ, thỉnh thoảng có các đốm màu đỏ tía dọc theo gân giữa, cả hai mặt đều có lông dày [21], gốc phiến lá tròn, hơi lệch [8], mép lá nửa dưới toàn

bộ hoặc một phần có răng cưa, nửa trên có răng cưa nhỏ hơn [21], ngọn lá nhọn [8, 21], hoặc tù [21] Cụm hoa giống đầu [21], mọc ở nách lá, dạng xim, có cuống dài

25 mm, tất cả các bộ phận đều có nhiều lông, tổng bao hình chuông [8], [21], kích thước 1×1 mm, có lông [21], mép chia 5 thùy, hình trứng-tam giác, có 4 tuyến màu

đỏ, hình tròn đến elip, ở giữa hơi trũng, phần phụ có màu từ trắng đến đỏ, hình elip đến tam giác, kích thước 0,3-0,2 mm, toàn bộ mép hơi gợn sóng [21] Hoa đơn tính [21] Một cụm hoa có 4-5 hoa đực [1] Hoa đực tiêu giảm chỉ còn 1 nhị, đối diện lá bắc nhỏ [21], bao phấn màu đỏ [21], mở ở đỉnh hoặc cạnh [8] Hoa cái có cuống

ngắn, bầu cao, nhô ra khỏi tổng bao hình chuông [21], bầu 3 ngăn, có lông thưa thớt, vòi nhụy chia 2 thùy [21] Quả nang 3 góc, kích thước 1-1,5×1-1,5 mm [21],

có nhiều lông ngắn, mịn, cuống dài 1,5 mm [21], có 3 hạt [1] Hạt thuôn, hình lăng trụ bốn mặt, 0,7-0,9×0,4-0,5 mm, hơi xù xì, màu đỏ và không có mào Số nhiễm sắc thể 2n=18 Mùa hoa và quả từ tháng 6 đến tháng 12 [21]

1.2 Phân bố

Loài Euphorbia hirta L có nguồn gốc từ vùng Trung Mỹ [17], [36] nhưng

phân bố chủ yếu ở một số nước thuộc khu vực nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Á gồm

Ấn Độ, Malaysia, Philippin, Thái Lan, Lào, Việt Nam và một số nơi ở phía nam Trung Quốc Ở Việt Nam, cây mọc tương đối phổ biến ở hầu hết các tỉnh trong cả nước [8]

1.3 Thành phần hóa học

Theo các tài liệu thu thập, thành phần hóa học của cỏ sữa lá lớn gồm các hợp chất có cấu trúc đa dạng và có thể chia thành 8 nhóm chính như sau: flavonoid, tanin, triterpen, diterpen, sterol, acid hữu cơ, tinh dầu và các thành phần khác

Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa lá lớn được trình bày tóm tắt ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa lá lớn

13

Pelargonidin-3,5-diglucosid

Toàn cây

[17], [36]

TMĐ [77]

TMĐ [77]

cây

[17], [36]

cây

[8], [17], [36]

20

5,7-dihydroxy-2-(3’,4’,5’-

trihydroxy-phenyl)-3-O-benzopyran-4-on

rhamnosyl-4H-Toàn cây [50]

1.3.2 Triterpen

Các triterpen trong cây cỏ sữa lá lớn được trình bày tóm tắt ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Các triterpen trong cây cỏ sữa lá lớn

26 24-hydroperoxy

cycloart-25-en-3β-ol

Toàn cây [63]

cây

[17], [36]

MĐ [2]

Các diterpen trong cây cỏ sữa lá lớn được trình bày tóm tắt ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Các diterpen trong cây cỏ sữa lá lớn

Ký

Bộ phận

TLTK

33

12-deoxyphorbol-13-dodecanoate-20-acetat

Toàn cây [17],

[36]

34

12-deoxyphorbol-13-phenylacetate-20-acetat

Toàn cây

[17], [36]

35 Ingenol triacetat Toàn

cây

[17], [36]

36

2β-16α-19-trihydroxy-ent-kauran

Toàn cây

[78]

37

2β-16α-dihydroxy-ent-kauran

Toàn cây

[78]

Ký

Bộ phận

TLTK

38

16α-19-dihydroxy-ent-kauran

Toàn cây

[78]

1.3.4 Sterol

Các sterol trong cây cỏ sữa lá lớn gồm: brassicasterol [62], campesterol [62], cholesterol [62], stigmasterol [62], β-sitosterol, [2], [50], [62], β-sitosterol-D-glucosid,

[52], [62], β-sitosterol 3-O- β-D-glucopyranosid [2]

1.3.5 Các acid hữu cơ

Các acid hữu cơ trong cây cỏ sữa lá lớn gồm: acid caffeic [62], acid ellagic [8] , acid gallic [8], [47], [77], acid maleic, acid tartric [17], [36], acid syringic [62], acid tricosanoic [2], acid phthalic [57], acid oleic [57], [83], acid ferulic [58], acid protocatechuic [83], acid shikmic [83], acid lauric [83], acid eicosanoic [83], acid palmitic [83], acid linoleic [83]

1.3.6 Tinh dầu

Thành phần tinh dầu lá cỏ sữa lá lớn gồm: hexadecen-1-ol, 6,10,14-trimethyl-2-pentadecanon, hexadecanal, phytol, acid n-hexadecanic, 2-butoxy ethanol, butyl tetradecyl phthalat, 13-heptadecyn-1-ol, 2-methyl-1-hexadecanol, diisooctyl 1,2-benzen dicarboxylat [57]

3,7,11,15-tetramethyl-2-1.3.7 Tanin

Các hợp chất tanin đã được phân lập trong cây cỏ sữa lá lớn đều thuộc nhóm tanin thủy phân, được trình bày tóm tắt ở phụ lục 2

1.3.8 Các thành phần khác

 Alcol: quercitol [36], alcol myricyl [5], [36], inositol, L-hexacosanol [8]

 Alkan: hentriacontan [8], heptacosan, n-nonacosan [17]

 Đường: glucose, fructose, sucrose [8]

 Alcaloid, acid amin [8], saponin [37] và muối khoáng [17], [36]

 Ngoài ra có hai hợp chất mới được phân lập: n-butyl-1-O-β-L-rhamnopyranosid

và n-butyl-1-O-L-rhamnopyranosid [50]

1.4 Tác dụng sinh học

1.4.1 Tác dụng chống oxy hóa

Tác dụng chống oxy hóa của cỏ sữa lá lớn là tác dụng được quan tâm và có nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng bằng các phương pháp dọn gốc tự do DPPH,

dọn gốc tự do superoxid, dọn gốc tự do hydroxyl, dọn gốc tự do nitric oxid in vitro

Dịch chiết nước của lá cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng chống oxy hóa và dọn gốc tự do mạnh nhất ở nồng độ 0,25 mg/ml [44] Ở nồng độ này, tác dụng dọn gốc

tự do DPPH, hydroxyl và ức chế peroxyd hóa lipid với giá trị % ức chế (I%) tương ứng là 68,80 %, 73,36 % và 77,45 % [44] Dịch chiết ethanol thân cỏ sữa lá lớn ở nồng độ 250 µg/ml thể hiện tác dụng dọn gốc tự do DPPH, superoxyd, nitric oxyd với I% tương ứng là 59,95 %, 59,67 % và 28,54 % [73] Dịch chiết ethanol của toàn cây cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng dọn gốc tự do DPPH với giá trị IC50 = 0,205 mg/ml [67]

Dịch chiết nước và dịch chiết methanol của toàn cây cỏ sữa lá lớn có tác dụng chống oxy hóa tương đương với các loại trà xanh và trà đen [25] Dịch chiết methanol của các bộ phận (lá, hoa, thân, rễ) của cây cỏ sữa lá lớn ở cùng nồng độ 1 μg/ml được đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH; dịch chiết lá cho tác dụng mạnh nhất với I% đạt (72,96 %), tiếp theo lần lượt là dịch chiết hoa (52,45 %), rễ (48,59

%), thân (44,42 %), thuốc đối chứng BHT (1 μg/ml) (75,13 %) [19] Giá trị IC50 của dịch chiết methanol các bộ phận lá, hoa, rễ, thân và BHT lần lượt là 0,803; 0,972; 0,989; 1,358 và 0,794 mg/ml [19]

1.4.2 Tác dụng hạ đường huyết

Dịch chiết ethanol của các bộ phận (lá, thân, hoa) của cây cỏ sữa lá lớn được đánh giá tác dụng hạ đường huyết trên chuột gây đái tháo đường bởi streptozotocin [43] Kết quả đường huyết sau 15 ngày của nhóm chuột dùng dịch chiết lá (500 mg/kg), dịch chiết hoa (500 mg/kg), dịch chiết thân (500mg/kg), glibenclamid (10 mg/kg) có giá trị lần lượt là 77,6; 84,6; 80,3;75,7 mg/dl; các giá trị này đều giảm so với nhóm chứng gây đái tháo đường bởi streptozotocin (192,5 mg/dl) [43]

Dịch chiết ethanol và ether dầu hỏa của lá cỏ sữa lá lớn được đánh giá tác dụng hạ đường huyết trên chuột gây đái tháo đường bởi alloxan dùng đường uống [64] Kết nồng quả độ đường huyết sau 21 ngày của chuột dùng dịch chiết ether dầu hỏa (250 mg/kg), dịch chiết ethanol (250 mg/kg), glibenclamid (10 mg/kg) tương ứng là 98,3, 82,0, 194,75 mg/dl; và các giá trị này đều giảm so với nhóm chứng (192,5 mg/dl) [64]

Phân đoạn dịch chiết ethanol và ethyl acetat của cỏ sữa lá lớn đã được chứng minh có tác dụng hạ đường huyết theo cơ chế ức chế hoạt tính enzym α-glucosidase, chống oxy hóa và tăng khả năng tiết insulin ở tế bào β đảo tụy (đảo Langerhans) [65] Kết quả nghiên cứu của tác giả Sheliya MA (2015), cho thấy cấu trúc 5,7,4'- trihydroxyflavon có vai trò quan trọng đối với tác dụng ức chế α-glucosidase [68]

Ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu của Trương Hoàng Kiên và cộng sự [4] cho thấy trà cỏ sữa lá lớn thể hiện khả năng hạn chế tăng đường huyết rõ nhất chỉ sau 15 phút và 30 phút sau ăn trên bệnh nhân đái tháo đường typ II

1.4.3 Tác dụng ức chế tế bào ung thư

Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết (ethanol, chloroform, ether dầu hỏa) BPTMĐ cỏ sữa lá lớn trên dòng tế bào EL-4 trên chuột bạch Swiss ở mức liều 200 mg/kg/ngày dùng đường uống so với mẫu chứng và 5-fluoro uracil (20 mg/kg) cho thấy dịch chiết ethanol và chloroform có tác dụng kéo dài thời gian sống trung bình

và giảm rõ rệt kích thước khối u [60]

Dịch chiết methanol của toàn cây cỏ sữa lá lớn được đánh giá ảnh hưởng trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ở các nồng độ 1,96-250,00 μg/ml cho thấy thể hiện tác dụng ức chế với giá trị IC50 = 25,26 μg/ml sau 24h [46]

1.4.4 Tác dụng chống viêm

Dịch chiết n-hexan BPTMĐ cỏ sữa lá lớn, thành phần chính được xác định là

các triterpen như β-amyrin, 24-methylenecycloartenol và β-sitosterol thể hiện tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm bằng 12-O-tetradecanoyl phorbol acetat

trên tai chuột [48], [52] Dịch chiết nước và ethanol toàn cây của cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng chống viêm rõ rệt ở chuột trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan ở các mức liều 100 mg/kg và 200 mg/kg dùng đường uống so với mẫu

chứng và natri diclofenac 50 mg/kg, cơ chế có thể do thành phần trong dịch chiết ức chế một trong những trung gian gây viêm như histamin, 5-HT, kinin hoặc

Prostaglandin [28]

Dịch chiết ethanol của cỏ sữa lá lớn và β-amyrin (một thành phần của cây)

có tác dụng chống viêm vượt trội, có thể phong bế hầu hết các chức năng của protein iNOS và sự cảm ứng NO; thể hiện tiềm năng ức chế chọn lọc NO để điều trị viêm khớp [69]

Phân đoạn A (được phân lập từ dịch chiết nước toàn cây cỏ sữa lá lớn bằng phương pháp sắc ký pha đảo, hệ dung môi rửa giải nước – methanol (1:0  0:1) tác dụng ức chế PGE2 mạnh nhất tại các nồng độ 0,1, 1 và 10 μg/ml so với dịch chiết nước và các phân đoạn khác trên nguyên bào sợi hoạt dịch của thỏ (HIG-82) [24]

1.4.5 Tác dụng trên hệ thống thận

Dịch chiết nước và ethanol lá cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng lợi tiểu trên chuột Wistar ở mức liều 50 mg/kg tại 24h và 100 mg/kg tại 6h dùng đường tiêm; so với mẫu chứng và furosemid (5 mg/kg), acetazolamid (5 mg/kg) [41] Kết quả cho thấy, dịch chiết nước làm tăng đào thải Na+, K+, HCO3-; trong khi dịch chiết ethanol làm tăng đào thải HCO3-

và K+, ít ảnh hưởng đến đào thải Na+ [41] Nghiên cứu cho rằng các thành phần có hoạt tính trong dịch chiết nước lá cỏ sữa lá lớn có cơ chế lợi tiểu tương tự như acetazolamid [41]

Bên cạnh đó, dịch chiết methanol của lá và thân cỏ sữa lá lớn có tác dụng ức chế men chuyển angiotensin 90% và 50% ở các mức liều tương ứng 500 μg và 150

μg sử dụng xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết enzym (ELISA) Nghiên cứu cho thấy rằng hầu hết các hợp chất ức chế men chuyển angiotensin có mặt trong phân đoạn phân cực mạnh và phân cực trung bình [76]

1.4.6 Tác dụng chống dị ứng

Dịch chiết ethanol của BPTMĐ cỏ sữa lá lớn có tác dụng ức chế phản ứng quá mẫn rõ rệt trên chuột Wistar và chuột BALB ở các mức liều 125 mg/kg, 250 mg/kg, 500 mg/kg dùng đường uống so với mẫu chứng và cetirizin (10 mg/kg)

Nghiên cứu in vitro trên tế bào mast phúc mạc chuột cho thấy dịch chiết trên có tác

dụng giảm sự giải phóng TNF-α và IL-6 ở các nồng độ 10 µg/ml, 30 μg/ml và 90 μg/ml [82] Một nghiên cứu khác cũng cho thấy dịch chiết ethanol 95% của BPTMĐ cỏ sữa lá lớn có tác dụng ngăn chặn phản ứng dị ứng giai đoạn sớm và muộn do tính kháng viêm và ức chế miễn dịch [71]

1.4.7 Tác dụng ức chế miễn dịch

Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết ethanol toàn cây cỏ sữa lá lớn trên đáp ứng miễn dịch dịch thể và trung gian tế bào trên chuột dùng đường uống cho thấy ở mức liều 100 mg/kg và 200 mg/kg, dịch chiết thể hiện tác dụng ức chế miễn dịch so với thuốc đối chiếu cyclosporin (5 mg/kg) và levamisol (2,5 mg/kg) [11]

1.4.8 Tác dụng chống tiêu chảy

Dịch chiết nước lá cỏ sữa lá lớn làm giảm rõ rệt nhu động ruột trên chuột bình thường và làm giảm tác dụng gây tiêu chảy của dầu thầu dầu trên chuột ở mức liều 100 mg/kg, 300 mg/kg và 1000 mg/kg dùng đường uống so với mẫu chứng [35]

Dịch chiết nước được sắc toàn cây cỏ sữa lá lớn ở mức liều 350 mg/kg và 700mg/kg có tác dụng chống tiêu trên mô hình gây tiêu chảy bởi dầu thầu dầu, acid arachidonic và prostaglandin E2 [31] Quercitrin được phân lập từ cỏ sữa lá lớn cũng được chứng minh hoạt động như một hợp chất có tác dụng chống tiêu chảy từ mức liều 25 mg/kg [31]

1.4.9 Tác dụng làm lành vết bỏng

Dạng kem 2% (kl/kl) được bào chế từ dịch chiết ethanol toàn cây cỏ sữa lá lớn có tác dụng làm lành vết thương do bỏng trên chuột đối chiếu với mẫu chứng và thuốc đối chứng là thuốc mỡ nitrofurazon 0,2% (kl/kl) [39] Khả năng dọn gốc tự do của các hợp chất phenolic trong cỏ sữa lá lớn như myricitrin, quercitrin, kaempferol, luteolin và acid gallic có vai trò quan trọng trong quá trình làm lành vết bỏng [58]

1.4.10 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Dịch chiết ethanol của lá cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng ức chế sự tăng

trưởng của các chủng vi khuẩn như Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa, và Bacillus subtili [40] Các hợp chất tanin, alcaloid và

flavonoid trong cây được cho là có vai trò chính trong tác dụng kháng khuẩn [40]

Dịch chiết ethyl acetat của lá cỏ sữa lá lớn ức chế sự tăng trưởng của Pseudomonas

mentagrophytes [30]

1.4.11 Tác dụng khác

Các dịch chiết của cỏ sữa lá lớn còn có tác dụng giảm đau và an thần [15], trị hen [29], diệt giun sán [10], diệt ký sinh trùng sốt rét [49], diệt ấu trùng [72] và nhuyễn thể [72], chống viêm khớp [12], bảo vệ gan [23], kháng virus [32]

1.5 Công dụng

Cây cỏ sữa lá lớn theo kinh nghiệm dân gian được dùng để chữa các bệnh đường tiêu hóa như tiêu chảy, kiết lỵ, giun sán, nhiễm khuẩn đường ruột [8]; dùng làm thuốc chữa ho, hen, viêm phế quản, khí phế thũng; các bệnh đường niệu, bệnh lậu [8], viêm thận, viêm bể thận [1]; cao huyết áp, phù nề [36], chữa tắc tia sữa [1] Bên cạnh đó, nhựa cỏ sữa lá lớn được dùng để chữa mụn cóc, vết thương [8], viêm giác mạc, loét giác mạc [1]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

vào đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, đối chiếu với khóa phân loại của Thực

vật chí Trung Quốc [21], mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu đã được giám định tên khoa

học là Euphorbia hirta L., họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

BPTMĐ của cây cỏ sữa lá lớn được sấy khô, cắt thành các đoạn 4-6 cm và được bảo quản trong túi nilon, để nơi khô ráo, thoáng mát

Ảnh chụp mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu được trình bày ở hình 2.1 và hình 2.2

Hình 2.1 Ảnh chụp cây cỏ sữa lá lớn nghiên cứu tại thực địa

Hình 2.2 Ảnh chụp BPTMĐ cỏ sữa lá lớn

2.1.2 Hóa chất, dung môi

Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích gồm có:

- Các dung môi: ethanol tuyệt đối, methanol (MeOH), n-hexan, chloroform (CHCl3), ethyl acetat (EtOAc), dichloromethan (CH2Cl2), aceton, toluen, acid formic

- Hóa chất: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich, Mỹ)

- Thuốc thử: Dung dịch ammoniac đặc, acid sulphuric 10% trong ethanol

2.1.3 Máy móc, thiết bị và dụng cụ

- Sắc ký cột: các loại cột có đường kính từ 1,6-5,5 cm, chiều dài từ 15-50 cm; với các chất nhồi cột: Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich, Mỹ), silica gel pha thuận (silica gel 60; 0,040-0,063 mm; 230 - 400 mesh; Merck, Đức), silica gel pha đảo YMC (30-50 m; Fujisilisa Chemical Ltd., Nhật Bản)

- Bản mỏng tráng sẵn pha thuận DC-Alufolien 60 F254 (Merck, Đức) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, Đức)

- Dụng cụ thủy tinh: pipet, bình định mức, ống nghiệm, bình cầu, cốc có mỏ, ống đong, phễu thủy tinh, ống đựng mẫu NMR,…

- Máy đo độ ẩm MB 25 Ohaus (Mỹ)

- Bộ dụng cụ bình ngâm, bộ dụng cụ chiết Soxhlet

- Máy cất quay Buchi Rotavapor R-200 (Đức)

- Đèn soi tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AVANCE AM500 FT-NMR tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy đo quang Hitachi U-1900

- Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Máy ảnh Canon

- Bể đun cách thủy Memmert (Đức)

- Đĩa 96 giếng

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được mục tiêu nghiên cứu để ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

2.2.1 Nội dung 1: Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ

cỏ sữa lá lớn

Chiết xuất dịch chiết methanol từ bộ phận trên mặt đất cỏ sữa lá lớn và tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần thu được

4 phân đoạn tương ứng là phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat và nước

2.2.2 Nội dung 2: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn

Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và 4 phân đoạn

dịch chiết trên mô hình dọn gốc tự do DPPH in vitro Lựa chọn phân đoạn dịch

chiết có tác dụng mạnh nhất để tiến hành phân lập các hợp chất

2.2.3 Nội dung 3: Phân lập và nhận dạng 2 hợp chất từ cỏ sữa lá lớn

Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ phân đoạn dịch chiết

có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất của cỏ sữa lá lớn được lựa chọn ở mục 2.2.2

2.2.4 Nội dung 4: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được

Tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được đánh giá trên mô

hình dọn gốc tự do DPPH in vitro

Thiết kế nghiên cứu của khóa luận được tóm tắt ở sơ đồ hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Bộ phận trên mặt đất cỏ sữa lá lớn

Dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết

Phân đoạn dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất

Các hợp chất phân lập đƣợc

Đánh giá tác dụng

chống oxy hóa

Đánh giá tác dụng chống oxy hóa Xác định cấu trúc hóa học

- Chiết bằng dung môi methanol

- Chiết phân đoạn bằng các

dung môi có độ phân cực tăng dần

Phân lập

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn

Bộ phận trên mặt đất cỏ sữa lá lớn sau khi thu hái được rửa sạch, sấy khô và cắt thành các đoạn dài 4 - 6 cm

Dược liệu được xay thành bột thô, xác định độ ẩm bột dược liệu bằng máy

đo độ ẩm MB 25 Ohaus (Mỹ) Bột dược liệu ngâm với methanol ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày, rút lấy dịch chiết lần 1 Bổ sung thêm dung môi và tiến hành chiết lần

2 và lần 3 như trên Gộp các dịch chiết, cất thu hồi methanol dưới áp suất giảm thu được dịch chiết đậm đặc Lấy 3/4 thể tích dịch chiết đậm đặc phân tán trong nước nóng, tỷ lệ thể tích dịch chiết – nước cất nóng (1:1), sau đó lần lượt chiết với các dung môi n-hexan, chloroform, ethyl acetat; mỗi dung môi được chiết lặp lại 5 lần, mỗi lần khoảng 100 ml dung môi Kết quả thu được các phân đoạn dịch chiết tương ứng là phân đoạn n-hexan, phân đoạn chloroform, phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn nước Cất thu hồi dung môi (THDM) các phân đoạn dịch chiết dưới áp suất giảm và cô cách thủy thu được các cắn phân đoạn tương ứng là cắn n-hexan, cắn chloroform, cắn ethyl acetat và cắn nước Lấy 1/4 thể tích dịch đậm đặc còn lại cô cách thủy thu được cắn methanol

2.3.2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết

Dịch chiết methanol và 4 phân đoạn dịch chiết được đánh giá tác dụng

chống oxy hóa dựa trên mô hình dọn gốc tự do DPPH in vitro của tác giả Md

Maniruzzaman Manir và cộng sự [51] Cắn dịch chiết methanol và cắn các phân đoạn dịch chiết được hòa tan trong methanol thành các dung dịch mẫu thử với các nồng độ khác nhau Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa 96 giếng Hỗn hợp phản ứng gồm: 40 µL dung dịch các mẫu thử, 160 µL dung dịch DPPH (nồng độ 150µM) trong methanol Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 30 phút Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 517 nm Song song với mỗi mẫu thử, một mẫu chứng được tiến hành trong cùng điều kiện với thành phần gồm: 40 µL MeOH, 160 µL dung dịch DPPH (nồng độ 150µM) trong methanol

Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH được đánh giá thông qua giá trị phần trăm ức

chế I (%) và được tính theo công thức: I (%) = [(A chứng - Athử )/Achứng] × 100 Với

- Kiểm tra các phân đoạn (PĐ) bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) [3], [7], quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm, sau

đó hơ bản mỏng trên dung dịch ammoniac đặc để hiện màu, bản mỏng tiếp tục được phun dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và hơ nóng để hiện các vết khác [3]

- Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được xác định dựa trên số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR - Nucear Magnetic Resonance Spectroscopy)

2.3.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập được

Tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất được đánh giá trên mô hình dọn

gốc tự do DPPH in vitro theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.2

Các chất được hòa tan trong methanol thành các dung dịch mẫu thử có nồng

độ 7, 21, 35 và 70 µg/ml

2.3.5 Xử lý kết quả thực nghiệm

Kết quả thực nghiệm được lưu trữ và xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2013

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn

Bộ phận trên mặt đất cỏ sữa lá lớn sau khi thu hái được rửa sạch, sấy khô và cắt thành các đoạn dài 4 - 6 cm

Dược liệu (1,44 kg) được xay thành bột thô, xác định độ ẩm bột dược liệu bằng máy đo độ ẩm MB 25 Ohaus (Mỹ) cho kết quả là 9,50% Bột dược liệu tiếp tục được chiết xuất bằng các dung môi hữu cơ theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.1

Sơ đồ quy trình chiết xuất và kết quả chiết xuất các phân đoạn dịch chiết từ BPTMĐ cỏ sữa lá lớn được trình bày ở hình 3.1 và bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả chiết xuất các phân đoạn từ dịch chiết cỏ sữa lá lớn

Cắn

Dịch chiết methanol

PĐ n-hexan

PĐ chloroform

PĐ ethyl acetat

PĐ nước Khối

Độ ẩm

(%)

6,14 (Coi bằng 0% do không đo được

hoặc giá trị độ ẩm quá nhỏ)

8,55 11,90

Methanol, ngâm

Cất thu hồi dung môi

Nước cất (1:1)

Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất các phân đoạn dịch chiết

methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn

Cắn PĐ chloroform

Cắn PĐ ethyl acetat

3.2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn

Tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết

từ cỏ sữa lá lớn được đánh giá trên mô hình dọn gốc tự do DPPH in vitro theo

phương pháp mô tả ở mục 2.3.2, tiến hành đánh giá tại các nồng độ 7, 21, 35, 70 và

210 µg/ml Kết quả được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và

các phân đoạn dịch chiết cỏ sữa lá lớn trên mô hình

PĐ n-hexan

PĐ chloroform

PĐ ethyl acetat

PĐ nước

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.2 cho thấy dịch chiết methanol từ cỏ sữa lá

lớn thể hiện tác dụng dọn gốc tự do DPPH in vitro với giá trị phần trăm ức chế (I%)

ở các nồng độ 70 µg/ml và 210 µg/ml tương ứng là 85,52% và 94,35% Trong các

phân đoạn dịch chiết, phân đoạn ethyl acetat thể hiện hoạt tính dọn gốc tự do DPPH

in vitro mạnh nhất với I% ở nồng độ thấp 21 µg/ml đã đạt đến 93,77% và IC50 = 7,31 µg/ml Vì vậy, phân đoạn ethyl acetat được lựa chọn để tiến hành phân lập các hợp chất

3.3 Phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của cỏ sữa lá lớn

Cắn phân đoạn ethyl acetat được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột với chất nhồi cột silica gel pha thuận, hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp dichloromethan

và methanol Kết quả thu được 4 phân đoạn ký hiệu tương ứng PĐ1, PĐ2, PĐ3 và

PĐ4 Phân đoạn PĐ2 và PĐ4 tiếp tục được phân lập bằng sắc ký cột để thu được các

hợp chất Quy trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của cỏ sữa lá lớn được tóm tắt ở sơ đồ hình 3.2

Các bước tiến hành cụ thể như sau:

3.3.1 Phân lập chất từ phân đoạn ethyl acetat bằng cột silica gel pha thuận

- Cột sắc ký: Cột sắc ký đường kính 5,5 cm, rửa sạch để khô, cố định trên giá

theo phương thẳng đứng Đáy cột được lót một lớp bông mỏng

- Chất nhồi cột: Hạt silica gel pha thuận (kích thước hạt 0,040 - 0,063 mm)

được hoạt hóa trong tủ sấy (105oC trong 2-3h), để nguội trong bình hút ẩm

và sau đó được phân tán trong dung môi dichloromethan, đổ từ từ hỗn dịch theo thành cột, vừa đổ cho vừa gõ nhẹ quanh thành cột để hạt nén chặt, thoát hết bọt khí và phân bố đều, bằng mặt Chiều dài chất nhồi cột là 11 cm Cho

Phân đoạn ethyl acetat

PĐ 1

Cột silica gel pha đảo Methanol- nước (2:1)

Hình 3.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập các hợp chất từ

phân đoạn ethyl acetat cỏ sữa lá lớn

Cột Sephadex Methanol

Để lắng, ly tâm

Cột Sephadex Methanol

Cột silica gel pha thuận Dichloromethan - methanol (50:1  1:1)

một lớp bông lên mặt trên cột sao cho không xáo trộn bề mặt khi tiếp dung môi Cột được để ổn định trong 9 giờ ở nhiệt độ phòng

- Đưa chất lên cột: 10,35 g cắn ethyl acetat được hòa tan trong một lượng tối

thiểu methanol, dung dịch thu được trộn đều với khoảng 10 g hạt silica gel pha thuận đã hoạt hóa, để bốc hơi dung môi trong tủ sấy tới khi bột cắn đều, khô, mịn và tơi Nghiền hỗn hợp bột cắn trong cối sứ Nhồi bột cắn mịn từ từ lên cột, vừa cho vừa gõ nhẹ vào thành cột để hỗn hợp nén chặt, bằng mặt Lót một lớp bông mỏng lên mặt trên của bột cắn

- Rửa giải: Sử dụng hỗn hợp dung môi CH2Cl2 và MeOH có độ phân cực tăng

dần (50:1; 30:1; 10:1; 1:1) Hứng các phân đoạn vào từng ống hứng riêng

biệt, mỗi ống hứng thể tích khoảng 55ml dịch rửa giải Dịch rửa giải được kiểm tra bằng SKLM pha thuận với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-H2O (6:1:0,1) và SKLM pha đảo với hệ dung môi MeOH-H2O (1:1) Các sắc ký

đồ được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng UV254 nm và UV365

nm, sau đó hơ bản mỏng trên dung dịch ammoniac đặc để hiện vết, bản mỏng tiếp tục được phun dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và hơ nóng để hiện các vết khác Gộp các ống hứng có sắc ký đồ giống nhau Kết quả thu được 4 phân đoạn ký hiệu tương ứng là PĐ1, PĐ2, PĐ3 và PĐ4

3.3.2 Phân lập chất từ phân đoạn 2 (PĐ 2 )

Tiến hành với sắc ký cột với chất nhồi cột Sephadex LH-20

- Cột sắc ký: Cột sắc ký đường kính 3 cm, rửa sạch để khô, cố định trên giá

theo phương thẳng đứng Đáy cột được lót một lớp bông mỏng

- Chất nhồi cột: Hạt Sephadex LH-20, được ngâm trong MeOH trong 2-4 giờ, sau đó được đổ từ từ theo thành cột, vừa đổ cho vừa gõ nhẹ quanh thành cột

để hạt nén chặt, thoát hết bọt khí và phân bố đều, bằng mặt Chiều dài chất nhồi cột là 38 cm Cột được để ổn định trong 9h ở nhiệt độ phòng

- Đưa chất lên cột: 0,31 g cắn PĐ2 được hòa tan trong lượng tối thiểu methanol Dùng pipet đưa dịch lên cột vòng theo thành cột để tránh xáo trộn

lớp Sephadex bề mặt và dịch phân bố đều trên bề mặt Sephadex

- Rửa giải: Sử dụng methanol là dung môi rửa giải Hứng các phân đoạn vào

từng ống hứng riêng biệt, mỗi ống hứng khoảng 30 ml dịch rửa giải Dịch rửa giải được kiểm tra bằng SKLM pha đảo với hệ dung môi MeOH - H2O (1:1), SKLM pha thuận với hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH- H2O (5:1:0,1), sắc

ký đồ được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng UV254 nm và

mỏng tiếp tục được phun dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và hơ nóng để hiện các vết khác Gộp dịch rửa giải ở các ống hứng có sắc ký đồ giống nhau Kết quả thu được 3 phân đoạn là PĐ2.1, PĐ2.2 và PĐ2.3

Tiến hành với sắc ký cột với chất nhồi cột silica gel pha đảo

- Cột sắc ký: Cột sắc ký đường kính 1,6 cm, rửa sạch để khô, cố định trên giá

theo phương thẳng đứng Đáy cột được lót một lớp bông mỏng

- Chất nhồi cột: Hạt silica gel pha đảo, kích thước hạt 30-50 µm, được ngâm

trong methanol, sau đó khuấy đều tạo hỗn dịch, hỗn dịch thu được tiếp tục được đổ từ từ theo thành cột, vừa đổ cho vừa gõ nhẹ quanh thành cột để hạt nén chặt, thoát hết bọt khí và phân bố đều, bằng mặt Chiều dài chất nhồi cột

là 35 cm Cho một lớp bông lên mặt trên cột sao cho không xáo trộn bề mặt khi tiếp dung môi Cột được để ổn định trong 9 giờ ở nhiệt độ phòng

- Cho hỗn hợp dung môi rửa giải MeOH-H2O (2:1) lên cột, mở khóa điều chỉnh cho bề mặt dung môi sát bề mặt silica gel, khóa cột và tiến hành đưa cắn lên cột

- Đưa chất lên cột: 80 mg cắn PĐ2.3 được hòa tan trong lượng tối thiểu methanol Dùng pipet đưa dịch lên cột vòng theo thành cột để tránh xáo trộn

lớp silica gel bề mặt và dịch phân bố đều trên bề mặt silica gel

- Rửa giải: Sử dụng hỗn hợp MeOH - H2O (2:1) là dung môi rửa giải Hứng các phân đoạn vào từng ống hứng riêng biệt, mỗi ống hứng khoảng 4 ml dịch rửa giải Dịch rửa giải được kiểm tra bằng SKLM pha thuận với hệ dung môi

CH2Cl2 - MeOH - H2O (5:1:0,1), SKLM pha đảo với hệ dung môi MeOH -

H2O (1:1) Các sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước

sóng UV254 nm và UV365 nm, sau đó hơ bản mỏng trên dung dịch ammoniac đặc

để hiện vết, bản mỏng tiếp tục được phun dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và hơ nóng để hiện các vết khác Gộp dịch rửa giải ở các ống hứng

có sắc ký đồ giống nhau và có 1 vết Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được chất bột màu vàng có khối lượng 25 mg (ký hiệu CS2)

3.3.3 Phân lập hợp chất từ phân đoạn 4 (PĐ 4 )

Phân đoạn PĐ4 (5,4 g) được tiến hành sắc ký cột với chất nhồi Sephadex

LH-20

- Cột sắc ký: Cột sắc ký đường kính 3 cm, rửa sạch để khô, cố định trên giá

theo phương thẳng đứng Đáy cột được lót một lớp bông mỏng

- Chất nhồi cột: Hạt Sephadex LH-20, được ngâm trong methanol trong 2-4

giờ, sau đó được đổ từ từ theo thành cột, vừa đổ cho vừa gõ nhẹ quanh thành cột để hạt nén chặt, thoát hết bọt khí và phân bố đều, bằng mặt Chiều dài chất nhồi cột là 38 cm Cho một lớp bông lên mặt trên cột sao cho không xáo trộn bề mặt khi tiếp dung môi Cột được để ổn định trong 9 giờ ở nhiệt độ phòng

- Đưa chất lên cột: Cắn PĐ4 được hòa tan trong lượng tối thiểu methanol Dùng pipet đưa dịch lên cột vòng theo thành cột để tránh xáo trộn lớp bề mặt

và dịch phân bố đều trên bề mặt Sephadex

- Rửa giải: Sử dụng methanol là dung môi rửa giải Hứng các phân đoạn vào

từng ống hứng riêng biệt, mỗi ống hứng khoảng 30 ml dịch rửa giải Dịch rửa giải được kiểm tra bằng SKLM pha đảo với hệ MeOH - H2O (2:1), SKLM pha thuận với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH - H2O (5:1:0,1) Các sắc

ký đồ được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng UV254 nm và

mỏng tiếp tục được phun dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và hơ nóng để hiện các vết khác Gộp các ống hứng có sắc ký đồ giống nhau Kết quả thu được 2 phân đoạn PĐ4.1 và PĐ4.2, trong đó phân đoạn PĐ4.2 sắc ký đồ cho 1

vết Để lắng, ly tâm phân đoạn PĐ4.2 thu được một chất bột màu vàng có khối lượng 130 mg (ký hiệu CS1)

3.4 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập đƣợc

3.4.1 Hợp chất CS 2

162,50 (C-5); 99,25 (C-6); 165,56 (C-7); 94,42 (C-8); 158,24 (C-9); 104,53 (C-10); 124,15 (C-1’); 116,01 (C-2’); 146,22 (C-3’); 148,77 (C-4’); 116,24 (C-5’); 121,69 (C-6’)

1 H-NMR (500 MHz, MeOD, ) H: 6,21 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 6,41 (1H,

d, J = 2,0 Hz, H-8); 6,91 (1H, d, J = 8,5, H-5’); 7,66 (1H, dd, J = 2,0 Hz, J = 8,5

Hz, H-6’); 7,76 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’)

Phổ 13 C-NMR có xuất hiện 15 tín hiệu carbon, trong đó có 1 tín hiệu của

nhóm carbonyl ở C 177,36 (C-4) và 14 tín hiệu đặc trưng cho carbon vòng thơm hay liên kết đôi C (94,42- 165,56) Kết hợp phổ DEPT ta thấy có 5 tín hiệu CH và

10 tín hiệu của C bậc 4 nên cho biết hợp chất này là một flavon

Phổ 1 H-NMR của CS2 xuất hiện 5 tín hiệu của 5 proton vòng thơm, trong đó

có tín hiệu của 2 proton meta ở H 6,21 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); H 6,41 (1H, d, J =

2,0 Hz, H-8) và 3 proton thuộc vòng B của khung flavon khác nhau mang 3 nhóm thế ở H 6,91 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’); H 7,66 (1H, dd, J = 2,0 Hz, J = 8,5 Hz, H-

6’) và H 7,76 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’)

Số liệu phổ của hợp chất CS2 so sánh với số liệu phổ tương ứng của quercetin

đã được công bố trong tài liệu [54] cho kết quả phù hợp

Như vậy, CS2 được nhận dạng là quercetin có cấu trúc hóa học được trình bày ở hình 3.3