Phân lập và nhận dạng cấu trúc một số hợp chất từ lá sa kê

Năm 2013-2015, nhóm nghiên cứu tại trường Đại học Dược Hà Nội đã khảo sát đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của lá Sa kê và đã bước đầu phân lập được một số hợp chất.. Nhằm tiếp tục

LƯƠNG LỆ THỦY

1101505

PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LÁ SA KÊ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

LƯƠNG LỆ THỦY

1101505

PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LÁ SA KÊ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ tận tình từ các thầy cô, gia đình và bạn

bè Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến:

PGS.TS Nguyễn Thái An, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận

tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành khóa luận

Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới DS Nguyễn Thị Thúy An,

DS Bạch Thúy Anh đã cho tôi những đóng góp quý báu về đề tài và trực tiếp

hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn

Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội đã hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên

cứu

Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, cùng toàn thể các

thầy cô giáo, các cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện để tôi có

thể lĩnh hội những kiến thức quý giá về ngành Dược trong suốt 5 năm học

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn sát

cánh, động viên tôi hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Lương Lệ Thủy

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

1.3.7 Tác dụng chống cao huyết áp 15

3.3.2 Định tính cắn phân đoạn ethyl acetat bằng sắc kí lớp mỏng 27

2D-NMR Two Dimensions Nuclear Magnetic Resonance

HSQC Hetoronuclear Single Quantum Coherence

Bảng Tên bảng Trang

Bảng 3.2 Kết quả SKLM của AR4 với 3 hệ dung môi sau khi

32

Bảng 3.3 Kết quả SKLM của AR5 với 3 hệ dung môi, quan sát ở

ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử

33

Hình Tên hình Trang

acetat chiết xuất từ lá Sa kê

31

sáng thường sau khi phun thuốc thử

33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sa kê (Artocarpus communis J R Forster & G Forster) họ Dâu tằm

(Moraceae) được phát hiện từ khoảng 3000 năm trước từ các vùng Papua New Guinea, Philippine, Malaysia, sau này được di thực đến nhiều vùng nhiệt đới Nam Mỹ, Thái Bình Dương trong đó có Việt Nam [12], [14] Ở Việt Nam, quả Sa kê được sử dụng như một loại thực phẩm, ngoài ra, theo kinh nghiệm dân gian, cây Sa kê có tác dụng lợi tiểu, tiêu viêm, sát trùng… dùng để điều trị các bệnh phù thũng, mụn nhọt, áp xe, kiết lỵ , tiêu chảy, gút, sỏi thận, tăng huyết áp, tiểu đường týp 2…[6], [7], [14] Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh Sa kê có những tác dụng sinh học như: chống oxy hóa [17], [20], [30], chống ung thư [23], [47], [59], hạ đường huyết [46], chống xơ vữa động mạch [16], [58], hạ huyết áp [48], [55], kháng khuẩn, kháng nấm [50], [51]…

Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu chuyên sâu

về thành phần cũng như tác dụng sinh học của Sa kê để chứng minh kinh nghiệm sử dụng dược liệu trong dân gian

Năm 2013-2015, nhóm nghiên cứu tại trường Đại học Dược Hà Nội đã khảo sát đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của lá Sa kê và đã bước đầu phân lập được một số hợp chất Nhằm tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của lá Sa kê, đề tài “Phân lập và nhận dạng cấu trúc một số hợp chất từ lá Sa kê” được thực hiện với các mục tiêu:

Để thực hiện các mục tiêu đã đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

 Chiết xuất, định tính cắn phân đoạn ethyl acetat bằng phản ứng hóa

học và sắc kí lớp mỏng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Artocarpus J R Forster & G Forster

Theo hệ thống phân loại thực vật có hoa của Takhtajan năm 2009 và

thực vật chí Trung Quốc [57], [62], chi Artocarpus J R Forst & G Forst

được phân loại như sau:

Chi Artocarpus J R Forster & G Forster

1.1.2 Đặc điểm thực vật của họ Dâu tằm (Moraceae)

Họ Dâu tằm có khoảng 40 chi, 1100-1400 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, ít xuất hiện ở vùng ôn đới [62] Ở Việt Nam có 11

chi: Antiaris, Artocarpus, Brosimum, Broussonetia, Dorstenia, Fatoua, Ficus,

Maclura, Morus, Streblus,Trophis, có khoảng 120 loài [3], [4]

Họ Dâu tằm thường là cây gỗ, bụi, hay cây cỏ, dây leo Có khi có rễ phụ Các bộ phận có nhựa mủ trắng Lá đơn, mọc so le Có lá kèm bọc lấy chồi, rụng sớm, để lại hai vết sẹo dạng nhẫn trên thân Hoa thường nhỏ, đơn tính cùng gốc hay khác gốc họp thành cụm hoa chùm, bông, tán, đầu hoặc các hoa cái phủ toàn bộ mặt trong của một đế cụm hoa lõm hình quả gioi Hoa đực có

4 lá đài, không có cánh hoa, 4 nhị đứng đối diện với lá đài Bộ nhụy hoa cái

có 2 lá noãn, bầu trên hoặc dưới 1 ô, đựng 1 noãn Quả kép [4]

1.1.3 Đặc điểm thực vật của chi Artocarpus J R Forster & G Forster

Cây gỗ cao 15-20 m Lá mọc so le, nguyên hay chia thùy sâu nhiều hay

ít [7]

Hoa cùng gốc, các hoa đực xếp thành bông đuôi sóc, các hoa cái tập hợp trên một đế hoa lồi Đài của hoa đực gồm 2 hay 4 phiến Một nhị có chỉ nhị ở giữa, với bao phấn 2 ô mở bởi 2 kẽ nứt Bao hoa dính liền, có lộ ở đỉnh và có bầu không cuống ở gốc, ban đầu có 3 ô, sau đó chỉ còn 1 ô [7]

Quả thực, là một quả bế nhưng tổng thể các quả bế này được bao trong một chất bột của đế hoa, tạo thành một quả tụ [7]

Chi Artocarpus có khoảng 50 loài, phân bố ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt

đới châu Á, một số đảo của Thái Bình Dương [62] Nước ta, chi Mít có 13 loài [7]

1.1.4 Đặc điểm thực vật, phân bố và sinh thái của loài Artocarpus

communis J R Forster & G Forster

1.1.4.1 Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Artocarpus communis J R Forster & G Forster [14]

Artocarpus incisa L [12]

Tên khác: Cây bánh mì [7], [11], [12], [14]

Tên nước ngoài: Bread-fruit (Anh), Arbre à pain (Pháp) [11], [12], [14] Cây gỗ, thân to, cao 10 – 12 m hoặc hơn, có nhựa mủ trắng Thân có đường kính khoảng 90 cm Cành có đường kính khoảng 0,5-1,5 cm Các nhánh và các thân non hơi khúc khuỷu, có vỏ màu nâu và phủ nhiều lông trắng áp sát Lá to, mọc so le, lá chia 3 - 9 thùy, dài 30 – 50 cm, có khi đến gần 1m, gốc tròn, đầu nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt và nháp, cuống lá dài 8-12 cm, lá kèm hình mác, sớm rụng, dài 12 – 13 mm [12], [14], [62]

Cụm hoa mọc ở kẽ lá, cụm hoa đực và cụm hoa cái riêng Cụm hoa đực màu vàng [62], hình chùy hoặc tụ hợp thành đuôi sóc dài 20 cm, hoa có 1 nhị [62] Cụm hoa cái xếp trên một đế, hình cầu [12], [14]

Quả phức, hình cầu hoặc hình trứng [12], có gai, kích thước khoảng

15-30 × 8-15 cm [62], màu xanh hay vàng, chuyển màu nâu hay đen khi chín [62], thịt trắng, chứa nhiều bột Hạt vàng nhạt, to 1 cm [14]

1.1.4.2 Phân bố và sinh thái

Cây Sa kê có nguồn gốc từ các đảo phía nam Thái Bình Dương, châu Đại Dương (Châu Úc) Hiện nay Sa kê đã di thực vào các đảo Giava, Sumatra (Indonesia), Malaysia, các vùng Đông Nam Á [12]

Trung tâm đa dạng nhất của các giống Sa kê nằm ở khu vực từ một số đảo thuộc Indonesia đến Papua New Guinea [14]

Ở Việt Nam, Sa kê mới chỉ được trồng rải rác trong các vườn cây ăn quả của gia đình từ Đà Nẵng trở vào Cây không trồng được ở các tỉnh phía Bắc [14]

Sa kê là loại cây gỗ lớn, ưa sáng và khí hậu của vùng nhiệt đới nóng và

ẩm, nhiệt độ trung bình từ 23 - 30°C Cây có thể chịu được thời tiết nắng nóng đến 40°C; lượng mưa từ 2000 – 3000 mm/năm và độ ẩm không khí trung bình là 70 - 90% Sa kê sinh trưởng và phát triển kém ở những vùng có nhiệt độ trung bình năm dưới 20°C hoặc có mùa đông lạnh kéo dài Cây mọc

từ hạt, sau 4 - 5 năm bắt đầu có hoa, quả, vào những năm sau cây sẽ có nhiều quả hơn Hoa Sa kê thụ phấn nhờ gió hoặc côn trùng, số hoa cái đậu quả thường đạt 75% Quả non sẽ bị rụng khi gặp mưa nhiều Hạt tươi có tỷ lệ nảy mầm rất cao khoảng 95% Cây con ưa bóng và ưa ẩm Từ gốc cây mẹ hằng năm mọc ra nhiều chồi rễ Cây trồng từ chồi rễ sẽ chóng cho thu hoạch Cây

Sa kê có giống không hạt và giống có hạt Giống không hạt được dùng phổ biến hơn [14]

1.2.1 Rễ

 Vỏ rễ

Năm 1991, Lin C N phân lập từ vỏ rễ 2 prenylflavonoid là cycloartomunin và dihydro cycloartomunin, cùng với một pyrano dihydro benzoxanthon là cycloartomunoxanthon [40]

Năm sau đó, Lin C N tiếp tục phân lập 3 hợp chất pyranoflavonoid là cyclocommunol, cyclocommunin và dihydroisocycloartomunin, sử dụng dữ

cyclomulberrin [41]

Chan S C và cộng sự công bố vỏ rễ còn chứa prenylflavonoid xác định bằng phương pháp đo phổ, đó là artocommunol CA (1), CB (2), CC (3), CD (4), CE (5) cùng hợp chất đã biết là cyclomorusin [24]

Đến năm 2007, tiếp tục nhận dạng 3 hợp chất prenylflavonoid là

 Thân rễ

Boonphong S phân lập 6 prenylflavonoid là morusin, cudraflavon B, cycloartobiloxanthon, artonin E, cudraflavon C và artobiloxanthon [23]

1.2.2 Thân

Năm 1990, Hano Y phân lập được 2 prenyl flavonoid từ dịch chiết benzen vỏ thân Sa kê là artonin E và F, cùng với một hợp chất đã biết là cycloartobiloxanthon [28]

Năm 1993, Chen C C tiếp tục phân lập được 6 prenyl flavonoid từ dịch chiết ethanol của thân, gồm isocyclomorusin, isocyclomulberrin, cycloaltilisin, cyclomorusin, cyclomulberrin, engeletin trong đó có 3 hợp chất mới là isocyclomorusin, isocyclomulberrin, cycloaltilisin dựa vào những hợp chất liên quan và phân tích phổ [25]

Năm 2006, Han A R phân lập 11 prenylated chalcon là 3’’,3’’-dimethyl pyrano[3’,4’]2,4,2’-trihydroxy chalcon, (−)-cycloartocarpin, (−)-cudraflavon

A, isobacachalcon (2), morachalcon A (3), gemichalcon B (4) và C (5), artocarpin (6), cudraflavon C (7), licoflavon C (8), and (2S)-euchrenon a(7) (11) trong đó hợp chất 3’’,3’’-dimethyl pyrano[3’,4’]2,4,2’-trihydroxychalcon lần đầu tiên được nhận dạng bằng dữ liệu phổ 1D, 2D- NMR [27]

Bảng 3.1 Các hợp chất flavonoid phân lập được từ lá Sa kê

STT Tên hợp chất Cấu trúc hóa học TLTK

1

dihydroxyphenyl)-3-

17

kaempferol-3-O-α-rhamnopyranosid-7-

kê [21]

Ngoài ra, Nguyễn Trung Nhân phân lập được 4 hợp chất gồm 5-hydroxymethyl fural, acid gallic, 5-hydroxy-7,4'-dimetoxy flavon, epifriedelanol [13]

2-formyl-1.3 TÁC DỤNG DƢỢC LÝ CỦA CÂY SA KÊ

1.3.1 Tác dụng chống lao, chống sốt rét

Boonphong S sử dụng dịch chiết diclomethan, phân lập 9 prenylflavon,

3 chất từ thân rễ là cycloartocarpin, artocarpin, và chaplashin, 6 chất từ vỏ rễ

là morusin, cudraflavon B, cycloartobiloxanthon, artonin E, cudraflavon C,

artobiloxanthon Chúng có khả năng chống lao với chủng Mycobacterium

tuberculosis H37Ra, sử dụng phương pháp MABA, cho giá trị MIC từ 3,12

đến 100 µg/mL trong đó artocarpin, chaplashin là hai chất tiềm năng nhất khi MIC đạt 3,12µg/mL, so sánh với kanamycin (2,5 µg/mL); chống sốt rét chủng

Plasmodium falciparum (K1, đa kháng thuốc), IC50 từ 1,9 đến 4,3 µg/mL [23]

1.3.2 Tác dụng chống xơ vữa động mạch

Năm 2006, Wang Y và cộng sự nghiên cứu dịch chiết ethyl acetat lá Sa

kê, phân tích dịch chiết ethyl acetat trên cột sắc kí silicagel với hệ dung môi ether dầu hỏa – ethyl acetat, thu được 12 phân đoạn Các phân đoạn 2, 4, 7, 9

có tác dụng ức chế OxLDL (một yếu tố trong quá trình hình thành xơ vữa động mạch), bảo vệ tế bào U937 ở người [58]

Năm 2014, Adaramoye cho thấy dịch chiết methanol vỏ thân của Sa kê

có khả năng làm giảm chỉ số cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-C, tăng HDL-C ở chuột cống nuôi bằng chế độ ăn giàu cholesterol, ở hai mức liều dịch chiết là 100 và 200 mg/kg Cơ chế được đưa ra là dịch chiết có thể ức chế sự oxy hóa lipid, ức chế enzym HMG-CoA reductase, giảm hoạt động của hormon nhạy cảm với lipase Bên cạnh đó, sử dụng dịch chiết Sa kê với mức liều 200 mg/kg làm giảm AST, ALT, LDH huyết tương Ngoài ra, các hợp chất polyphenolic trong dịch chiết Sa kê còn giúp bình thường hóa các chỉ số của enzym SOD, CAT (hai enzym có vai trò dọn gốc tự do) trong gan và tim của chuột tăng cholesterol máu [16]

1.3.3 Tác dụng chống oxy hóa

Lan W L đưa ra bằng chứng flavonoid từ dịch chiết gỗ và vỏ cây, ức

chế tyrosinase và sinh tổng hợp melanin in vitro Các prenylflavonoid phân

lập được là 10 - oxoartogomezianon, 8- geranyl-3-(hydroxyprenyl) isoetin, hydroxy artoflavon A, isocyclo artobilo xanthon, và furanocyclo communin, cùng với 12 hợp chất khác có khả năng dọn gốc tự do DPPH, ABTS+, anion superoxid (O2), ức chế sản xuất tyrosinase và melanin, xác định một chất chống oxy hóa và làm trắng tự nhiên Hydroxyartoflavon A, isocyclo artobilo

xanthon và artoflavon A có khả năng dọn gốc DPPH ở mức trung bình, isocycloartobiloxanthon dọn gốc tự do ABTS+ ở mức có ý nghĩa, norartocarpetin và artogomezianon ngăn chặn gốc ABTS+ ở mức trung bình [39]

Năm 2014, Akanni O đã nghiên cứu tương tự với dịch chiết methanol

vỏ thân, thu được kết quả, mẫu nghiên cứu có khả năng dọn gốc tự do DPPH

ức chế LPO phụ thuộc liều; ở 750 µg/mL, ức chế 79% so với 28% của chất đối chiếu là catechin [20]

Năm 2015, Adaramoye O A nghiên cứu trên đối tượng chuột cống trong mô hình thử nghiệm gây độc gan và thận bằng cadmium, khi dùng dịch chiết methanol vỏ thân Sa kê, hoạt động của enzym SOD gan, thận giảm đáng

kể 78%, GSH giảm 66% so với nhóm chứng Tại mức liều 200 mg/kg làm đảo ngược những tác dụng bất lợi của Cd bằng cách bình thường hóa các enzym, ổn định hình thái, số lượng tiểu cầu, phục hồi cấu trúc mô thận, giảm tắc nghẽn các tế bào gan Cơ chế được dự đoán liên quan đến các hoạt động dọn gốc tự do hay cảm ứng enzym chống oxy hóa [17]

1.3.4 Tác dụng làm trắng da

Ba hợp chất norartocarpetin, artogomezianon, và artonin M có khả năng

ức chế sản xuất melanin mạnh do ngừng sản xuất tyrosinase tối đa Những flavonoid này có thể làm trắng da tuy nhiên cần nghiên cứu sâu về cơ chế [39] Rao G V và cộng sự trong năm 2013 đã công bố: dịch chiết methanol của lá, các phân đoạn hay chất tinh khiết phân lập được (AC-5-1 – dẫn xuất của dihydrochalcon) ở nồng độ 50 µg/ml, đều có tác động trên tế bào sắc tố đen B16F10 Theo đó, dịch chiết thô, các phân đoạn hay hoạt chất có thể sử dụng trong các công thức làm trắng da [52]

Cũng trong năm đó, Ko H H nghiên cứu hợp chất norartocarpein cho thấy nó không chỉ vô hại với tế bào B16F10 và tế bào sợi của người mà còn không gây kích ứng da chuột, bên cạnh đó, nó ức chế hoạt động của tyrosinase (TRP-1 và TRP-2) và giảm lượng melanin [37]

1.3.5 Tác dụng ức chế α-glucosidase và α-amylase

Các hợp chất altilisin H, I, J phân lập từ lá Sa kê có tác dụng ức chế

Nair và cộng sự thử nghiệm in vitro đánh giá hoạt động ức chế enzym

α-glucosidase và α-amylase của dịch chiết methanol quả của Sa kê ở các nồng

độ khác nhau, cho thấy Sa kê có khả năng ức chế enzym glucosidase và

1.3.6 Tác dụng kháng khuẩn

Năm 2012, Pradhan C chiết xuất lá Sa kê bằng các dung môi khác nhau, tiến hành thử nghiệm ức chế vi khuẩn trên các đĩa thạch, kết quả, với chủng

Pseudomonas aeruginosa và Streptococus mutans, dịch chiết ethanol ức chế

mạnh nhất ở nồng độ 50 µl, đường kính đĩa thạch lần lượt là 18 mm và 16

mm Ở chủng Enterococus faecalis, dịch chiết dầu hỏa ức chế vi khuẩn ở

nồng độ 25 µl với đường kính 15 mm Dịch chiết ethanol tiếp tục ưu thế với

chủng Staphylococus aureus, nồng độ 25 µl, ức chế được vùng rộng 24 mm

[49] Nghiên cứu tương tự được thực hiện với dịch chiết quả (methanol và ethyl acetat), đánh giá tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết thu được kết quả:

dịch chiết methanol có tác dụng mạnh nhất trên chủng Strep mutans và E

faecalis với 25 µl dịch chiết, giá trị MIC tương ứng là 0,9 và 0,6 mg/ml

Ngược lại, dịch chiết ethyl acetat ức chế trên chủng S aureus và P

aeruginosa, sử dụng 25 µl, MIC có giá trị 0,9 mg/ml ở cả 2 chủng [51]

1.3.7 Tác dụng chống cao huyết áp

Siddesha J M chiết xuất lá Sa kê bằng những dung môi khác nhau (ethyl acetat, acetone, n-butanol, ethanol, methanol, nước), trong điều kiện chiết nóng và nhiệt độ phòng, nghiên cứu tác dụng của dịch chiết trên mô

hình ức chế men chuyển in vitro Kết quả cho thấy, dịch chiết nóng của

Nwokocha và cộng sự sử dụng dịch chiết nước lá Sa kê, tiêm tĩnh mạch vào chuột cống Sprague-Dawley huyết áp bình thường đã gây mê Với mức liều 20,88-146,18 mg/kg, gây ra tác dụng hạ huyết áp, chậm nhịp tim thông qua hoạt hóa α-adrenoceptor và chẹn kênh canxi Bên cạnh đó, dịch chiết gây

ức chế enzym CYP450 (CYP3A4 và CYP2D6) ở mức trung bình, với giá trị

1.3.8 Tác dụng chống ung thƣ

Các hợp chất 6a,7,8,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-5-yl}-1-propanon (2), 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[3,4-dihydro-3,8-dihydroxy-2-methyl-2-(4-methyl-3-pentenyl)-2H-1-benzopyran-5-yl]-1-propanon (4), 2-[6-hydroxy-3,7-dimethyl octa-2 (E), 7-dienyl]-2',3,4,4'-tetrahydroxydihydro chalcon (9) có tác dụng ức chế các dòng tế bào ung thư SPC-A-1, SW-480, SMMC-7721 ở mức trung bình [59]

1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-{4-hydroxy-6,6,9-trimethyl-Boonphong S phân lập 9 prenylflavone từ rễ là cycloartocarpin, artocarpin, chaplashin, morusin, cudraflavone B, cyclo artobilo xanthone, artonin E, cudraflavone C, artobilo xanthone, có khả năng gây độc tế bào KB (ung thư biểu bì miệng) và BC (ung thư vú) và dòng tế bào Vero [23]

Dịch chiết methanol lá Sa kê gây độc tế bào PANC-1 gây ung thư tuyến tụy ở người, dưới điều kiện thiếu dinh dưỡng, ở nồng độ 50 µg/mL Các nhà khoa học đã phân lập 8 chất geranyl dihydrochalcon mới là sakenin A-H (1-8)

cùng với 4 chất đã biết F(6) và H(8) là những chất tiềm năng nhất với chỉ số

1.3.9 Tác dụng chống muỗi

Cụm hoa đực khô được đốt cháy ở các vùng Châu Đại Dương để ngăn chặn côn trùng bay, bao gồm cả muỗi Nghiên cứu đã tìm ra hoạt chất có khả năng này Dịch chiết thu được từ quá trình cất kéo hơi nước được đưa vào các quá trình tách phân đoạn Tất cả các phân đoạn đều cho thấy có khả năng ngăn chặn muỗi Phân tích bằng sắc kí GC-MS cho thấy có hơn 100 peak, 30 chất được xác định, bao gồm một hỗn hợp của terpen, andehyd, acid béo, chất

thơm Nghiên cứu trên chủng muỗi cái Aedes aegypti cho thấy các chất:

capric, undecanoic, và axit lauric có tác dụng ngăn chặn mạnh nhất Một số acid béo cho hiệu quả hơn cả N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) [34]

1.3.10 Tác dụng cầm máu, làm lành vết thương

Năm 2015, Singh M K dùng nhựa mủ của Sa kê, sau một vài công đoạn

sơ chế, tạo ra enzym thô (CE) CE có tác dụng ức chế hoạt động tiêu protein với casein là chất nền Tác dụng tăng lên theo hướng tăng nồng độ protein trong mủ 20-100 µg protein nhựa mủ gây ra tác dụng từ 11±0,2 đến 45±0,3 U/h, cao hơn có ý nghĩa so với protease papain Bên cạnh đó, CE còn làm giảm thời gian hình thành cục máu đông khi tăng nồng độ Điều này đặt ra một cơ hội trong việc tìm một giải pháp trong quá trình cầm máu, làm lành vết thương [56]

1.4 CÔNG DỤNG CỦA CÂY SA KÊ

Thịt quả có tác dụng bổ tỳ, ích khí Hạt có tác dụng bổ trung, ích khí, lợi trung tiện Vỏ cây tác dụng sát trùng Lá cây có tác dụng như kháng sinh, tiêu viêm, lợi tiểu [14]

Thịt quả dùng để ăn Quả còn xanh có bột dùng làm thực phẩm, với nhiều cách chế biến như:

 Quả luộc chín rồi vùi trong tro nóng, bóc ăn [12], [14]

 Quả gọt vỏ, thái lát mỏng, rán hoặc phết bơ nướng ăn, có hương vị như bánh mì, phơi, sấy khô, rồi xay thành bột làm bánh [12]

 Thịt quả cho lên men, do một loài mốc biến đổi một số thành phần thịt thành sản phẩm phụ, có hương vị đặc biệt rồi chế thành một món ăn giống pho mát, tên là “popoi”, có giá trị dinh dưỡng cao, ăn ngon, bổ, lạ miệng [12], [14]

 Thịt quả thái thành miếng, nấu món cà ri hoặc nấu với cá, tôm [14]

 Thịt quả thái chỉ, phơi khô, trộn với gạo nếp, thổi xôi ăn [14]

Hạt Sa kê luộc hoặc rang, ăn ngon như hạt giẻ, có tác dụng lợi trung tiện, kích dục [14]

Lá có tác dụng lợi tiểu, có thể chữa phù thũng, nhưng thường dùng ngoài chữa mụn rộp, đinh nhọt, áp xe [7], [14]

Vỏ thân và rễ ở Indonesia dùng chữa rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, kiết lị, đau răng, ghẻ Nhựa pha loãng chữa lị và tiêu chảy (New Guinea) [14]

Bài thuốc chứa Sa kê :

 Mụn rộp: Lá đốt thành than, tán mịn, phối hợp với dầu dừa, nghệ tươi, giã nát, làm thành bánh để đắp [14]

 Sưng háng, mụn nhọt, áp xe: lá Sa kê và Đu đủ để tươi, lượng bằng

nhau, giã với vôi tôi đến khi màu vàng, đắp lên chỗ mụn [14]

 Trị tiểu đường týp 2: 100g lá Sa kê tươi, 100g trái Đậu bắp tươi, 50g lá

Ổi non, nấu nước uống trong ngày [15]

 Chữa viêm gan, vàng da: 100g lá Sa kê tươi, 50g Diệp hạ châu tươi, 50g Củ móp gai tươi, 20-50g Cỏ mực khô Tất cả để chung nấu nước

uống trong ngày [15]

 Trị chứng huyết áp cao dao động: 2 lá Sa kê vàng vừa mới rụng, 50g Rau ngót tươi, 20g lá Chè xanh tươi, để chung nấu nước uống trong ngày

[15]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên liệu

- Mẫu nghiên cứu:

+ Mẫu cây tươi để giám định tên khoa học

+ Lá cây Sa kê, sấy ở 60°C đến khô, làm nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát làm nguyên liệu nghiên cứu

- Nơi thu hái: Quận Thủ Đức - Thành phố Hồ Chí Minh

- Thời gian thu hái: tháng 11/2013

- Bột silicagel pha thuận cỡ hạt 40 – 60 µm

- Bột silicagel pha đảo cỡ hạt 30 – 50 µm

- Cột sắc kí

- Cân kỹ thuật Sartorius

- Cân phân tích Precisa

- Máy đo phổ khối lượng (ESI-MS): AGILENT 6310 LC-MSD Trap, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

- Máy đo điểm nóng chảy: Kofler micro-hostade, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Dịch chấm sắc kí: Mẫu phân tích được hòa tan trong methanol

trong 1h

• Khai triển với nhiều hệ dung môi khác nhau

• Tiến hành: Chấm dịch phân tích lên bản mỏng đã hoạt hóa và để nguội, sấy nhẹ cho khô, đặt bản mỏng vào bình sắc kí đã bão hòa dung môi Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nhẹ cho bay hết dung môi Quan sát

rồi quan sát dưới ánh sáng thường

2.2.2 Chiết xuất

- Chiết xuất bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi methanol thu được cắn toàn phần

- Cắn toàn phần được chiết bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform và ethyl acetat

- Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi tới cắn

- Các cắn được làm khô tới khối lượng không đổi

2.2.3 Phân lập

Sử dụng phương pháp sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng điều chế để phân lập các chất

2.2.3.1 Sắc kí cột

- Cột sắc kí: cột thủy tinh, đường kính 20 mm

- Chất hấp phụ: silicagel pha thuận cỡ hạt 40 – 60 µm và silicagel pha đảo cỡ hạt 30 – 50 µm

- Dung môi rửa giải: hỗn hợp được pha từ các dung môi thường dùng như chloroform, methanol, acid formic, nước, ethyl acetat

- Tiến hành:

• Chuẩn bị cột:

Cột được rửa sạch, sấy khô, lắp thẳng đứng trên giá cố định

• Ổn định cột:

Lót một lớp bông ở đáy cột Cân một lượng silicagel cần dùng vào cốc

có mỏ, thêm dung môi rửa giải rồi khuấy đều Cho hỗn dịch trên vào cột, mở vòi, rót tiếp dung môi vào và để cho silicagel lắng xuống đáy cột Tiếp tục hứng dung môi và rót liên tục vào cột trong một thời gian Để ổn định cột trong 24h

• Nạp mẫu lên cột:

Cắn được hòa tan trong một lượng dung môi tối thiểu đến tan hoàn toàn sau đó trộn đều với một lượng tối thiểu silicagel, để dung môi bay hơi hết, làm thành bột mịn rồi rải thành một lớp đều đặn trên mặt silicagel trong cột sao cho không làm xáo trộn lớp silicagel bề mặt

• Rửa giải:

Sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải Kiểm soát tốc độ dòng chảy dung môi theo thời gian Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm và bình nón thích hợp Sử dụng SKLM để kiểm tra thành phần dịch hứng, dồn các phân đoạn có cùng thành phần

- Tinh chế các chất thu được

- Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập: sử dụng phương pháp SKLM

2.2.3.2 Sắc kí lớp mỏng điều chế

phát hiện vết chất bằng ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm

phát hiện vết chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất Sau đó cạo lớp silicagel có chất, phản hấp phụ và tinh chế bằng cách kết tinh lại nhiều lần trong dung môi thích hợp

2.2.4 Nhận dạng các chất tinh khiết

Nhận dạng chất phân lập được từ dữ liệu các phổ: phổ khối lượng

phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều HMBC, HSQC

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC

Mẫu nghiên cứu được PGS.TS Nguyễn Khắc Khôi - Viện Sinh thái và

Tài nguyên sinh vật giám định tên khoa học là Artocarpus communis J R Forst & G Forst., tên đồng nghĩa là Artocarpus altilis (Park.) Fosb hay

Artocarpus incisus (Thunb.) L., họ Dâu tằm (Moraceae) (Phụ lục 1)

3.2 CHIẾT XUẤT

3.2.1 Xác định độ ẩm dược liệu

Lấy khoảng 2 g mẫu nghiên cứu đã làm nhỏ để xác định độ ẩm Bật máy

C Trải đều mẫu nghiên cứu lên đĩa cân, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả

Độ ẩm mẫu nghiên cứu là 10,51%

3.2.2 Chiết xuất

Lá Sa kê làm nhỏ, cho vào bình chiết inox, sử dụng dung môi methanol, ngâm ở nhiệt độ phòng Rút dịch chiết 3 lần (ở 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ), lọc Các dịch lọc gộp lại và cô dưới áp suất giảm thu được cắn toàn phần, kí hiệu

là AR Với 1000 g lá Sa kê thu được 71,25 g cắn toàn phần

pháp chiết lỏng-lỏng chiết lần lượt với các dung môi là n-hexan, chloroform

và ethyl acetat Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi tới cắn được kí hiệu lần lượt là AR-H (0,65 g), AR-C (6,22 g), AR-E (2,05 g), dịch chiết nước còn lại được kí hiệu là AR-W

Sơ đồ chiết xuất thể hiện trong hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá Sa kê

Theo các tài liệu tham khảo được, phân đoạn chloroform đã được tiến hành phân lập, công bố nhiều hợp chất, trong khi phân đoạn ethyl acetat chưa

được quan tâm nhiều Vì vậy, chúng tôi lựa chọn phân đoạn ethyl acetat để

tiếp tục tiến hành nghiên cứu ,định tính, phân lập các hợp chất

3.3 ĐỊNH TÍNH CẮN PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT

3.3.1 Định tính cắn phân đoạn ethyl acetat bằng phản ứng hóa học

Định tính flavonoid

Hòa tan cắn vào ethanol 90%, lọc qua giấy lọc nếp gấp lấy dịch lọc đem làm các phản ứng:

Cho dịch lọc vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10%

Hiện tượng: ống nghiệm có tủa đục màu vàng

Kết quả: Phản ứng dương tính (+)

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 1 ml dịch lọc Ống thứ nhất thêm ít bột Magie kim loại rồi nhỏ từ từ vài giọt acid hydrocloric đậm đặc, ống thứ 2 để đối chiếu

Hiện tượng: ống 1 xuất hiện màu đỏ đậm hơn ống đối chiếu

Kết quả: Phản ứng dương tính (+)

Cho khoảng 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt dung dịch

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch lọc Ống 1 cho thêm 0,5 ml NaOH 10% rồi đun cách thủy cả 2 ống Để nguội, thêm vào mỗi ống 2 ml nước cất

Hiện tượng: ống 1 trong hơn ống 2 nhưng sau khi acid hóa có kết tủa như ống 2

Kết quả: Phản ứng âm tính (-)

Nhỏ hai giọt dịch chiết ethanol lên giấy lọc, sau đó nhỏ tiếp lên 1 giọt NaOH 10%, để khô Che nửa vết chất thử bằng một mảnh kim loại rồi soi dưới ánh sáng tử ngoại trong khoảng 30 giây, bỏ vật che ra

Hiện tượng: nửa của vết chất thử không che có cường độ màu sáng hơn nửa vết chất thử bị che

Sơ bộ kết luận: Cắn ethyl acetat có tanin

Nhận xét: Bằng các phản ứng hóa học thường quy, kết quả cho thấy

trong cắn phân đoạn ethyl acetat của lá Sa kê có chứa nhóm chất flavonoid, tanin

3.3.2 Định tính cắn phân đoạn ethyl acetat bằng sắc kí lớp mỏng

- Mẫu thử: cắn ethyl acetat được hòa tan trong methanol

Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi khai triển

Hệ I: Dichloromethan - Ethyl acetat - Acid formic (8:3:1)

Hệ II: Ethyl acetat - Methanol - Nước (12:2:1)

Hệ III: Toluen - Aceton (2:3)

Hệ IV: Chloroform - Aceton - Acid acetic băng (3:2:0,1)

Hệ V: Ethyl acetat - Aceton - Nước (30:5:2)

- Tiến hành: Chấm dịch chấm sắc kí lên bản mỏng, sấy nhẹ cho bay hết dung môi, đặt vào bình sắc kí đã bão hòa dung môi Sau khi khai triển, lấy

C, quan sát tiếp dưới ánh sáng thường

Hình ảnh SKLM cắn ethyl acetat với các hệ dung môi khác nhau thu được như hình 3.2

I II III IV V

Hình 3.2 Sắc kí đồ của cắn ethyl acetat với 5 hệ dung môi dưới UV365nm

Sau khi thăm dò 5 hệ dung môi trên thấy hệ I cho kết quả tách rõ ràng và nhiều vết nhất

Tiến hành sắc kí lớp mỏng cắn ethyl acetat với hệ dung môi I và quan sát

ở các điều kiện khác nhau Kết quả thể hiện ở hình 3.3 và bảng 3.1

Hình 3.3 trình bày sắc kí đồ của cắn ethyl acetat khi khai triển với hệ

Hình 3.3 Sắc kí đồ của cắn ethyl acetat với hệ I ở các điều kiện quan

sát a) Không phun TT, ánh sáng thường c) Không phun TT, UV 365nm

b) Không phun TT, UV 254nm d) Phun TT, ánh sáng thường

Nhận xét:

Ở ánh sáng thường, quan sát thấy ba vết màu vàng mờ

rõ

và hai vết màu xanh lam rõ

Sau khi phun thuốc thử, quan sát ở ánh sáng thường thấy chín vết trong

Phân đoạn AR-E1 tiếp tục được phân lập trên cột pha đảo YMC-ODS, rửa giải với hệ dung môi aceton-nước (1:3) thu được 3 phân đoạn AR-E1A (110 mg), AR-E1B (30 mg), AR-E1C (50 mg) Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM Tiến hành SKLM điều chế với phân đoạn AR-E1B với hệ dung môi

khai triển là dichlomethan-methanol (5:1) thu được AR4 (6 mg)

Phân đoạn AR-E3 tiếp tục được phân lập trên cột pha đảo YMC-ODS, rửa giải với hệ dung môi aceton-nước (1:2) thu được 3 phân đoạn AR-E3A (100 mg), AR-E3B (70 mg), AR-E3C (50 mg) Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM Phân đoạn AR-E3B tiếp tục được phân lập trên cột silicagel, cỡ hạt

40-60 µm, rửa giải với hệ dung môi n-hexan-EtOAc (1,5:1) thu được AR5

(10 mg)