Nghiên cứu sản phẩm tạo thành trong quá trình tạo trầm sử dụng chế phẩm sinh học TK1

Danh mục các bảng 2 Bảng đánh giá lượng sản phẩm tạo thành trong quá trình tạo trầm sau 8 tháng 20 3 Bảng đánh giá lượng sản phẩm tạo thành trong quá trình tạo trầm sau 16 tháng 20 4 Bản

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:

PGS.TS Nguyễn Viết Thân

Nơi thực hiện:

Bộ môn Dƣợc Liệu

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy, cô giáo, cùng các đồng nghiệp và bạn bè

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Viết Thân

đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn DS Nguyễn Thanh Tùng, các thầy cô giáo, các anh

chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Cho phép tôi được gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, phòng Đào tạo và phòng Quản lý khoa học, các thầy cô giáo trong trường đã trang bị kiến thức

và tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu khoa học

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Trần Xuân Trường

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 Tổng quan về trầm hương 2

1.1 Nguồn gốc, thành phần của Trầm hương : 2

1.1.1 Nguồn gốc Trầm hương : 2

1.1.2 Thành phần hóa học của trầm hương : 3

1.1.3 Phân loại Trầm hương: 5

1.2 Phương pháp tạo Trầm hương: 6

1.2.1 Cơ sở lý luận của việc kiến tạo trầm: 6

1.2.2 Các phương pháp cơ bản cấy tạo trầm: 6

1.3 Chế phẩm tạo trầm: 7

1.4 Công dụng và giá trị kinh tế của trầm hương: 9

1.4.1 Giá trị của Trầm hương: 9

1.4.2 Công dụng của Trầm hương: 10

1.5 Các phương pháp chiết tách tinh dầu trầm hương: 11

1.6 Hiện trạng trồng cây Dó bầu ở nước ta hiện nay: 13

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu .15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị: 15

2.1.1 Nguyên liệu: 15

2.1.2 Thiết bị: 17

2.1.3 Hóa chất sử dụng: 17

2.2 Nội dung nghiên cứu: 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu: 17

2.3.1 Xác định tỷ lệ khối lượng sản phẩm tạo thành trong phần gỗ thân và cành cây Dó bầu qua các giai đoạn tạo trầm: 17

2.3.2 Nghiên cứu đặc điểm hiển vi của nguyên liệu: 18

2.3.3 Nghiên cứu hàm lượng và thành phần hóa học sản phẩm tạo thành: 18

Chương 3: Thực nghiệm, kết quả 20

3.1 Đánh giá lượng sản phẩm tạo thành trong quá trình tạo trầm qua các giai

đoạn: 20

3.2 Nghiên cứu đặc điểm hiển vi sản phẩm tạo thành trong quá trình tạo trầm ở cây Dó bầu: 21

3.3 Nghiên cứu hàm lượng và thành phần hóa học sản phẩm tạo thành: 25

3.3.1 Sắc kí lớp mỏng: 26

3.3.2 Sắc ký khí: 30

Bàn luận 31

Kết luận và đề nghị 32

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

- SKLM : Sắc kí lớp mỏng

- SKK : Sắc kí khí

- GC/MS : Sắc kí khí kết hợp khối phổ

Danh mục các bảng

2 Bảng đánh giá lượng sản phẩm tạo thành

trong quá trình tạo trầm sau 8 tháng

20

3 Bảng đánh giá lượng sản phẩm tạo thành

trong quá trình tạo trầm sau 16 tháng

20

4 Bảng đánh giá lượng sản phẩm tạo thành

trong quá trình tạo trầm sau 24 tháng

21

5 Bảng kết quả phân tích thành phần dịch

Dó bầu bằng phương pháp GC-MS

30

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

1 Sản phẩm tạo thành từ cây Dó bầu bằng phương pháp khoan

3 Sơ đồ chiết xuất tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước 12

4 Sơ đồ chiết xuất tinh dầu bằng phương pháp CO2 lỏng siêu tới

8 Vi phẫu gỗ thân cây Dó bầu mẫu 8 tháng chưa chiết xuất

(chưa nhuộm xanh methylen)

22

9 Vi phẫu gỗ thân cây Dó bầu mẫu 8 tháng chưa chiết xuất (đã

nhuộm xanh methylen)

22

10 Vi phẫu gỗ thân cây Dó bầu mẫu 16 tháng chưa chiết xuất

(chưa nhuộm xanh methylen)

23

11 Vi phẫu gỗ thân cây Dó bầu mẫu 16 tháng chưa chiết xuất (đã

nhuộm xanh methylen)

23

12 Vi phẫu gỗ thân cây Dó bầu mẫu 24 tháng chưa chiết xuất (đã

nhuộm xanh methylen)

24

13 Vi phẫu gỗ thân cây Dó bầu mẫu đã chiết xuất (đã nhuộm

xanh methylen)

24

14 Sắc ký đồ dịch chiết các mẫu Trầm hương ở bước sóng

254nm với hệ dung môi Toluen – Ethylacetat – Acid formic

(6 : 6 : 0,5)

27

15 Sắc ký đồ dịch chiết các mẫu Trầm hương ở bước sóng

365nm với hệ dung môi Toluen – Ethylacetat – Acid formic

(6 : 6 : 0,5)

28

16 Sắc ký đồ dịch chiết các mẫu Trầm hương hiện màu bằng

thuốc thử Vanilin/Ethanol/H2SO4 với hệ dung môi Toluen –

Ethylacetat – Acid formic (6 : 6 : 0,5)

29

Hiện nay diện tích trồng Dó bầu tại Việt Nam rất lớn, có một số chế phẩm được coi là có khả năng thúc đẩy quá trình tạo trầm Tuy nhiên, hiệu quả của các chế phẩm này và các sản phẩm tạo thành chưa được nghiên cứu nhiều Theo yêu cầu của Cục Quản lý Y Dược học Cổ truyền về việc đánh giá tính khả thi quá trình tạo trầm của Công ty Cổ phần Dó bầu Hương Quảng Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu sản phẩm tạo thành trong quá trình tạo trầm sử dụng chế phẩm sinh học TK1” với mục tiêu:

- Xác định sản phẩm tạo thành trầm trong quá trình tạo trầm

- Thành phần hóa học của sản phẩm tạo thành này

Chương 1 Tổng quan về trầm hương

1.1 Nguồn gốc, thành phần của Trầm hương :

1.1.1 Nguồn gốc Trầm hương :

Trầm hương là phần gỗ nhiễm dầu của cây ở một số loài thuộc chi Aquilaria,

họ Trầm (Thymelacaceae) [15]

Trên thế giới có khoảng 25 loài Aquilaria nhưng chỉ có 19 loài có khả năng

cho trầm Ở nước ta, theo thống kê có khoảng 4 loài có khả năng cho trầm được định danh là:

+ Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte, tìm thấy năm 1899, thường được gọi

+ Aquilaria rugosa L.C.Kiet & P.J.A.Kessler, tìm thấy năm 2005, thường

được gọi là cây Dó Quả nhăn [9],[ 10],[ 18]

+ Ngoài ra, theo Vũ Văn Dũng và Nguyễn Quốc Dựng (Viện điều tra quy hoạch

rừng VN), nước ta còn có 2 loài dó cũng cho trầm, gồm Gyrinops vidalii P.H.Ho (Dó bụi) và Linostma deccandrum Wallich ex Endlicher (Dó leo) [18]

Tại Việt Nam, Trầm hương thường được thu hoạch từ gỗ của cây Dó bầu,

tên khoa học là Aquilaria crassna Pierre [8] Cây Dó bầu là cây gỗ to, thường

xanh, cao đến 15-20m, có khi tới 30m, đường kính 40-50cm hay hơn Vỏ có màu nâu xám, nứt dọc, dễ bóc Cây thường mọc rải rác trong rừng kín thường xanh ở độ cao 300-1000m, trên sườn dốc và thoát nước [16] Ngoài ra trong rừng, Dó bầu có thể mọc tập trung thành quần thể hoặc phân bố rải rác trong các bản làng ở một số vùng trung du miền núi [1],[ 8]

Tại Việt Nam, cây Dó bầu phân bố rải rác khắp các tỉnh vùng núi từ Hà Giang, Tuyên Quang, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An đến Tây Ninh và đảo Phú Quốc, Kiên Giang.Tuy nhiên cây tập trung nhiều nhất ở các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên như Quảng Bình, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Gia Lai, Kon Tum, Đắc Lắc, Phú Yên, Bình Định, Khánh Hòa [15]

Vùng gây trồng cây dó trầm nhiều nhất ở nước ta được xác định là Bắc Trung

Bộ (chủ yếu là Hà Tĩnh), Nam Trung Bộ (Quảng Nam), Tây Nguyên (Kon Tum, gần đây là Đăk Lăk và Đăk Nông) , Đông Nam Bộ (Bình Phước) và Tây Nam Bộ (Kiên Giang, An Giang) [10]

1.1.2 Thành phần hóa học của trầm hương :

Theo Masakazu I và cộng sự (1993) trầm hương thu mua ở Việt Nam qua thị

trường Hong Kong thuộc 2 loài Aquilaria agallocha và Aquilaria sinensis

A.agallocha: trầm hương có 2 sesquiterpen aldehyd là:

(-) – sehna – 3,11 – dien – 4 – al ,

(+) – selina – 4,11 – dien – 14 – al

Các dẫn chất Methyl ester của 3 acid carboxylic sesquiterpin là:

(-) – Me selina – 3,11 – dien – 14 – oat ,

(+) – Me selina – 4,11 – dien – 14 – oat,

(+) – Me 9 – hydroxyselina – 4,11 – dien – 14 – oat,

và 1 ceton nor – sesquiterpen là (+) – 1,5 – epoxy – nor – cetoquaien

Cũng theo các tác giả trên (1991) trầm hương còn có 7 sesquiterpen có khung gnatan là:

(-) – guaia – 1(10) – 15 – ol – acid,

(-) – guaia – 1 (10) ,11 – dien – 15 carboxylic,

Me guaia – 1 (10), 11 – dien – 15 – carboxylat ,

(+) – guaia – 1(10) ,11 – dien – 9 – on ,

(-) – 1 – epoxyguai – 11 –en,

(-) – guaia – 1(10),11 – dien – 15,2 – olid,

Theo Chen H và cộng sự (2011), trầm hương từ Aquilaria sinensis ở có thành

phần chính là sesquiterpene như: guaia – 1(10) – dien – 9 – on, guaiol,

benzylacetone, hinesol; ngoài ra còn có baimuxinal; α – copaen – 11- ol;

1,2,5,5,8a – pentamethyl – 1,2,3,5,6,7,8,8a – octahydronaphthalen – 1 – ol; acid N – hexadecanoic; acid oleic… [20]

Khi phân tích 2 loại Trầm được khai thác ở Việt Nam và xuất khẩu qua Hong

Kong, các nhà khoa học Nhật Bản đã thấy loại trầm Jinkih (Aquilaria sinensis) có

chứa lượng lớn các thành phần Phenylethyl chromone hơn nhưng chứa ít

sesquiterpene hơn so với loại Trầm Kanakoh (Aquilaria agallocha) [6]

Tinh dầu trầm hương có thành phần chủ yếu là benzylaxeton 26%,

metoxybenzylaxeton 53% và tecpen ancol 11%, ngoài ra còn acid xinamic và các dẫn xuất của nó [8]

Theo Nguyễn Thị Tâm, thành phần chính của tinh dầu Trầm là:

2 - (2 - (4- methoxyphenyl) chromon 27,0%,

2 – (2 – phenylethyl) chromon 15,0%,

Oxoagarospirol 5,0%,

9,11 – eremophilandien – 8 – on 3,0%,

6 – methoxy – 2 – (2 – (4 – methoxyphenylethyl) chromon 2,5%,

Guaia – 1 (10), 11 – dien – 15 – al,

Và những sesquiterpen khác [11]

1.1.3 Phân loại Trầm hương:

Theo Nguyễn Hiền và Võ Văn Chi (1991), Trầm hương được chia thành 3 loại:

+ Kỳ Nam: là loại Trầm hương có phẩm cấp cao nhất, chứa nhiều tinh dầu, có mùi thơm tự nhiên Trong phần gỗ chứa Kỳ Nam không còn các vách tế bào, chỉ cần rạch phần vỏ sẽ thu được tinh dầu Khi đốt Kỳ Nam cho hương thơm đặc biệt, khói xanh, bay thẳng và dài lên không trung Kỳ Nam được chia thành 4 loại: Bạch kỳ: Sắc trắng ngà, xám nhạt, vô cùng quý hiếm

Thanh Kỳ: Sắc xanh xám, ánh lục, rất quý hiếm và đắt sau Bạch kỳ

Huỳnh kỳ: Sắc vàng sẩm, vàng nâu, quý hiếm và đắt sau Thanh kỳ

Hắc kỳ: Sắc đen chàm, hắc ín, quý và đắt sau Huỳnh kỳ [2],[ 3]

+ Trầm: chứa ít tinh dầu hơn Kỳ Nam, đốt lên mới xuất hiện mùi thơm Khi đốt xuất hiện khói màu trắng, bay quanh rồi tan ngay Trầm khác Kỳ Nam ở chỗ phần gỗ chứa Trầm vẫn còn các vách tế bào nên muốn thu được tinh dầu phải sử dụng các phương pháp chưng cất Theo phẩm cấp Trầm chia thành 6 loại từ 1 đến

6 theo giá trị giảm dần

Loại 1: sắc sáp trắng, có giá trị cao nhất

Loại 2: sắc xanh đầu vịt

Loại 3: sắc sáp xanh

Loại 4: sắc sáp vàng

Loại 5: sắc vằn lông hồ

Loại 6: sắc vàng đốm dầu [2],[ 3]

+ Tốc: chứa ít tinh dầu nhất Tốc được chia làm 4 nhóm:

Tốc đĩa: là nhóm tốc có mức độ nhiễm dầu nhiều trong các thớ gỗ, dạng nhỏ

cỡ ngón tay hay đầu đũa con

Tốc dây: là nhóm tốc có dầu tạo nhiều vòng giữa các thớ gỗ, thường có dạng tròn, dài, dáng rễ cây

Tốc hương: là nhóm tốc có mực độ nhiễm dầu dạng mảnh

Tốc pi: là nhóm tốc có mức độ nhiễm dầu mỏng, bao quanh bên ngoài các thớ

gỗ theo dạng hình tháp, hình ống lớn [2],[ 3]

1.2 Phương pháp tạo Trầm hương:

1.2.1 Cơ sở lý luận của việc kiến tạo trầm:

Sự tạo trầm là quá trình tích lũy tinh dầu ở một số khu vực của mô gỗ bên trong thân cây dưới tác dụng của yếu tố tự nhiên, theo cơ chế đặc biệt của cây Quá trình này xảy ra trong một thời gian dài đến hàng chục năm Hiện tượng tụ trầm là kết quả của tiến trình bệnh lý diễn ra trong mô gỗ của cây Dó bầu Những tế bào Libe tập trung bên trong mạch gỗ sẽ phản ứng với các tác nhân kích thích bên ngoài để tạo thành hợp chất Sesquiteipones tạo thành mùi đặc trưng cho gỗ trầm

Để tạo trầm, trước tiên phải tạo vết thương trên tế bào libe bên trong mạch gỗ Việc làm này có thể dùng nhiều biện pháp như vật lý, hóa học, sinh học… Những tác động vết thương bằng tác nhân thông thường không mang lại hiệu quả như mong muốn mà phải có chất xúc tác và tác nhân sinh học kèm theo [7]

1.2.2 Các phương pháp cơ bản cấy tạo trầm:

- Phương pháp vật lý (gây vết thương cơ giới): Đây là phương pháp tác động

cơ giới vào thân cây Dó bầu : sử dụng các tác động vật lý tạo vết thương trên cây như đóng đinh hoặc khoan vào thân cây Phương pháp này chỉ là điều kiện cần cho quá trình hình thành trầm của cây Qua vết thương các loài vi sinh vật sẽ xâm nhập vào trong thân cây để kí sinh, từ đó cây dần tiết ra các chất nhựa và sau một thời gian sẽ hình thành trầm

- Phương pháp sinh học (men vi sinh): Phương pháp này thực chất là phương pháp gây bệnh cho cây bằng một loại nấm hoặc vi khuẩn nào đó đã được xác định Các loài nấm cùng với môi trường dinh dưỡng được đưa vào phần gỗ của thân cây

Dó qua các vết thương tạo thành được tạo thành trước đó Tương tự như trên, cây

Dó bầu sẽ tiết ra nhựa để cô lập vết thương và dần hình thành trầm

Hình 1 – Sản phẩm tạo thành từ cây Dó bầu bằng phương pháp khoan lỗ cấy

Nấm

- Phương pháp hóa học ( xúc tác hóa chất): Thông qua các vết thương có sẵn hay tự tạo thành trên thân cây Dó bầu, người ta tiêm các hóa chất với hi vọng kích thích tạo trầm vào bên trong Các hóa chất có thể là các chất vô cơ mà thành phần hiện nay chưa được công bố Có ý kiến cho rằng phương pháp này tạo ra trầm trong thời gian ngắn nhưng sản phẩm nếu tồn dư các gốc độc hại SO4 , Cl-, PO3 thì sẽ gây ảnh hưởng không tốt đến chất lượng sản phẩm trầm thu được [7]

1.3 Chế phẩm tạo trầm:

Chế phẩm tạo trầm là các hợp chất được tiêm vào phần gỗ thân cây Dó bầu nơi có các thương tổn của cây với hi vọng tạo trầm có chất lượng Hiện nay ở Việt Nam có 2 loại chế phẩm: Chế phẩm hóa học và chế phẩm sinh học [19]

+ Chế phẩm hoá học gồm nhiều loại khác nhau : Hiện nay công thức thành phần các chế phẩm này đều chưa được công bố Có ý kiến cho rằng các chế phẩm này có thể có một hoặc vài hoá chất như các loại muối hoặc acid có gốc là lưu huỳnh (S) như acid sunfuaric (H2SO4 ), Sodium metan bisulfit, muối sunfat đồng

(CuSO4) Muối hoặc acid có gốc là Clo (Cl) như acid Clohydric (HCl), muối Natriclorua (NaCl)… Một số ôxít có gốc sắt (Fe) như các loại Ôxit sắt (FeO2, Fe2O3….) [19]

+ Chế phẩm sinh học gồm 2 nhóm:

Nhóm 1: Chế phẩm được tạo thành từ các chất có nguồn gốc thiên nhiên như

nước dừa, nước của một số loại cây như nước lá chè, nước lá khoai, đường, mật, bột khoai, bột sắn

Tương tự như chế phẩm hóa học, thành phần công thức các chế phẩm sinh học nhóm này thường không được công bố [19],

Hình 2 – Mẫu Dó bầu tạo trầm xử lý bằng chế phẩm sinh học TK1 sau 8

tháng

Nhóm 2: Chế phẩm vi sinh có chứa bào tử một số loại nấm và môi trường

nuôi dưỡng

Theo Báo cáo của Xí nghiệp điều tra thiết kế Lâm Nông Nghiệp thì một số

loài nấm có thể được sử dụng là Aspergillus phoenicis (Cda) Thom., Pénicillium citrinum Thom., Pénicillium sp [17]

Theo Nguyễn Huy Sơn, Lê Văn Thành (Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) hiện nay có chế phẩm của Công ty TNHH Lâm Viên Hà Nội có chứa bào tử

nấm Phialophora sp Và Fusarium sp., ngoài ra trong chế phẩm còn chứa tinh bột,

glucose, potex và đã được cấp Giấy chứng nhận đăng ký nhãn hiệu số 106868 của Cục sở hữu trí tuệ ngày 01/01/2006 [10]

1.4 Công dụng và giá trị kinh tế của trầm hương:

1.4.1 Giá trị của Trầm hương:

Trên thế giới: Giá Trầm phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của từng loại Trầm Năm 1993, trên thị trường Arập Xêut giá 1kg Trầm dao động từ 27 USD (loại xấu) đến 10.000 USD (loại thượng hạng), trong khi đó ở Thái Lan giá 1kg Trầm loại xấu là 1,20 USD và loại thượng hạng là 2.800 USD Năm 1996, tại Malaysia giá 1kg Trầm loại hỗn hợp là 5 USD, loại thượng hạng là 1000 USD, ở Vương quốc Anh giá tinh dầu Trầm là 160 USD cho 2,5ml tinh dầu [11]

Ở Việt Nam:

Ngay từ thế kỷ 16, theo lời một du khách Bồ Đào Nha còn ghi lưu bút lại tại chợ Hội An, giá một gối bằng gỗ trầm nặng gần 500g lên tới gần 8kg vàng ( tương đương 269.840.000 VND) Năm 1956 tại Nha Trang giá 1kg Trầm hương cũng xấp

xỉ 20 lạng vàng (tương đương 25.297.500 VND) Từ năm 1977 đến nay ở các tỉnh phía Nam nước ta cũng đang có phong trào tìm khai thác Trầm hương xuất khẩu, dẫn tới khai thác bừa bãi, phá hoại một nguồn đặc sản có giá trị của nước ta [8] Theo Nguyễn Ngọc Hạnh, Mai Thành Chí, qua khảo sát thị trường tại TPHCM vào thời điểm năm 2005 của công ty tinh dầu Đất Việt [2], Trầm hương được phân thành 6 loại với mức giá trung bình như sau:

5 300 – 600

Tinh dầu Trầm hương có giá 10.000 – 14.000 USD/lít

Kỳ nam (loại đặc biệt) có giá 30.000 – 35.000 USD/kg

1.4.2 Công dụng của Trầm hương:

Trầm hương có rất nhiều tác dụng khác nhau,như:

- Trừ sơn lam chướng khí: Người ta thường xông trầm trong nhà để trừ khí độc và thường mang Kỳ nam trong người để ngừa sơn lam chướng khí Ở một vài vùng, nhất là Phú Yên, Khánh Hòa, người ta thường bọc Kỳ nam trong túi vải thưa

để đeo ở cổ xem như “ bùa hộ mệnh” Trẻ em dưới 1 tuổi đeo 2 chỉ, từ 1 đến 5 tuổi đeo 3 chỉ, người lớn đeo 5 chỉ [7]

- Theo Dược học cổ truyền thì công năng chủ trị của Trầm hương thể hiện: a/ Giáng khí bình suyễn, dung đối với trường hợp suyễn tức, nôn nấc, dung Trầm hương 2g, Chỉ xác 8g, Mộc hương 4g, Lai phục tử 12g

b/ Ôn trung, chỉ thống, dung đối với trường hợp hàn ngưng khí trệ, bụng ngực đầy trướng, đau tức hai bên sườn dùng Trầm hương 2g, Cam thảo 8g, Sa nhân 4g, Hương phụ 8g [4],[ 5],[ 12]

- Dùng làm thuốc giải nhiệt và trừ sốt rét: Ở Campuchia, theo các bác sĩ Menaut và Phana Douk, người ta thường dùng Kỳ nam, Trầm và ngà voi mài với nước lạnh để uống [14]

- Thuốc trừ đau bụng: Theo bác sĩ Sallet ghi nhận thì thuốc Nam có toa thuốc trị đau bụng rất hay gồm: Trầm hương 2 chỉ, sắc cùng Đậu khấu, hạt cau, vỏ cây Mộc lan, Sa nhơn, Can khương trong 2 chén rưỡi nước còn lại 9 phân chia uống thành 2 lần trong ngày sẽ làm cho bụng hết quặn đau [14]

- Theo Đông y, Kỳ nam dùng để trị các chứng độc thủy do phong thổ gây nên, làm tiêu chứng chướng mãn, no hơi, đau bụng, ói mửa, hen suyễn thở gấp, hạ được nghịch khí, thông chứng bế do khí hư gây nên [14]

- Trầm hương khi đốt có mùi thơm thường dùng trong các nghi lễ tôn giáo,các ngày lễ Tết ở các nước phương Đông Ngoài ra Trầm hương còn được sử dụng để trích tinh dầu làm chất định hương và điều hương [8],[ 11],[ 12]

- Trầm hương còn được sử dụng để chế tác đồ thủ công mỹ nghệ như tượng, vật cảnh, đồ trang trí, chuỗi hạt, vòng tay; làm nhang đốt lên có mùi thơm…, vỏ cây làm giấy quý (vẽ tranh, viết kinh thánh)…,[2] ,[7] ,[18]

- Theo Tây y, trầm hương có tính kháng sinh, tạo kháng thể mạnh (diệt khuẩn, làm lành vết thương), có tác dụng chữa một số bệnh về tim mạch (suy tim, đau ngực), bệnh về hô hấp (hen suyễn), bệnh về thần kinh (an thần, mất ngủ, giảm đau, trấn tĩnh …), bệnh về tiêu hoá (đau bụng, buồn nôn, tiêu chảy), bệnh về tiết niệu (bí tiểu tiện) [18]

- Đặc biệt các giáo sư của Nhật Bản đã tìm ra một Sesquiterpens mới trong

trầm hương VN (Kỳ Nam từ Khánh Hòa) và chứng minh trong phòng thí nghiệm hiệu ứng kích cảm của nó trên quá trình sinh trưởng của chất nuôi dưỡng tế bào thần kinh – BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) [22]

1.5 Các phương pháp chiết tách tinh dầu trầm hương:

Theo Nguyễn Ngọc Thanh (Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam) có 2 phương pháp chiết xuất sản phẩm từ trầm hương chính, đó là phương pháp cất kéo hơi nước và phương pháp chiết xuất tinh dầu bằng CO2 lỏng siêu tới hạn [13] Phương pháp cất kéo hơi nước: ủ nguyên liệu là phần gỗ mang trầm đã được nghiền hoặc xay nhỏ thành bột trong vài ngày rồi cho vào bình chứa của thiết bị chưng cất tinh dầu Tiến hành chưng cất trong khoảng thời gian thích hợp đến khi lượng tinh dầu thu được không thay đổi Sau đó tiến hành loại nước thu lấy tinh dầu

Dung môi hữu cơ

Hình 3- Sơ đồ chiết xuất tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước Nguyên tắc của phương pháp này là: khi đun sôi hỗn hợp nguyên liệu và nước cất, tinh dầu trong sản phẩm trầm tạo thành sẽ bay hơi cùng với nước theo ống dẫn hơi bộ phận làm lạnh và ngưng tụ lại chảy xuống ống thu tinh dầu Ở đây, tinh dầu không hòa tan trong nước nên tinh dầu sẽ nằm ở trên bề mặt (tinh dầu nhẹ hơn nước) hoặc nằm ở dưới đáy ống (tinh dầu nặng hơn nước) Nước chưng cất hồi lưu vào bình chứa Sau khi chưng cất xong, tách lấy tinh dầu, làm khan rồi bảo quản trong lọ tối màu ở nhiệt độ thấp [2],[ 13]

Ngoài phương pháp cất kéo hơi nước truyền thống đã được sử dụng, các nhà khoa học ở Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu phương pháp chiết xuất Concret trầm (chứa tinh dầu) bằng CO2 siêu tới hạn từ gỗ hóa trầm ở cây Dó bầu và đã sẵn sàng chuyển giao công nghệ cho các nhà sản xuất Trầm hương

Nguyên liệu (bột)

và được tuần hoàn trở lại nhờ hệ thống ống dẫn và máy nén, ta loại bã thu sản phẩm chiết có chứa tinh dầu [2],[ 13]

1.6 Hiện trạng trồng cây Dó bầu ở nước ta hiện nay:

CO2 (khí) → CO2(lỏng)

Bình chứa nguyên liệu

và CO2

Sản phẩm chiết được trong CO2

Bã dược

liệu

Sản phẩm chiết

Diện tích trồng gió trầm ở nước ta tính đến tháng 9/2009 là 11.000- 12.000 ha, phần lớn là trồng phân tán hoặc trồng xen trong vườn rừng và vườn hộ gia đình với mật độ từ 500- 700 cây/ha.Nếu quy ra rừng trồng tập trung thuần loài với mật độ từ 1.100- 1.600 cây/ha thì chỉ có khoảng 5.000- 6.000 ha [10] [9]

Vùng gây trồng cây dó trầm nhiều nhất ở nước ta được xác định là Bắc Trung

Bộ (chủ yếu là Hà Tĩnh), Nam Trung Bộ (Quảng Nam), Tây Nguyên (Kon Tum, gần đây là Đăk Lăk và Đăk Nông) , Đông Nam Bộ (Bình Phước) và Tây Nam Bộ (Kiên Giang, An Giang) [10]

Hầu hết diện tích rừng trồng theo thống kê đều là loài Dó bầu [10]

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị:

2.1.1 Nguyên liệu:

Đối tượng nghiên cứu: Thân và cành cây Dó bầu được trồng ở Công ty Cổ phần Dó bầu Hương Quảng Nam

Thời gian lấy mẫu: tháng 4 năm 2016

Địa điểm lấy mẫu: Công ty Cổ phần Dó bầu Hương Quảng Nam, Xã Liêng Srônh, Đam Rông, Lâm Đồng

- Phần gỗ thân và cành cây Dó bầu được xử lý chế phẩm sinh học TK1 sau 16 tháng (truyền dịch TK1 từ tháng 12/2014)

Hình 6 – Gỗ thân và cành cây Dó bầu được xử lý chế phẩm sinh học TK1 sau

Các mẫu này lấy trên các cây Dó bầu khác nhau

Trong quá trình thu các mẫu tiến hành nghiên cứu thực địa quá trình tạo trầm

2.1.2 Thiết bị:

- Cân phân tích SARTORIUS TE 3102S

- Cân kĩ thuật SARTORIUS TE 214S

- Nồi đun WISE THEM HEATING MANTLE

- Các dụng cụ thủy tinh: bình chiết Shoxlet, bình nón dung tích 250ml, bình cassia, bình gạn, sinh hàn hồi lưu

- Hóa chất: Ethanol 96°, nước cất, chloroform

- Dung môi: Toluen, Ethyl acetate, acid formic, n-hexane

- Thuốc thử: Vanillin/ Ethanol/ H2SO4.

- Các hóa chất sử dụng đạt tiêu chuẩn theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam 4

2.2 Nội dung nghiên cứu:

- Xác định tỷ lệ khối lượng sản phẩm tạo thành trong phần gỗ thân và cành cây Dó bầu qua các giai đoạn tạo trầm

- Nghiên cứu đặc điểm hiển vi sản phẩm hình thành trong cây Dó bầu qua quá trình tạo trầm

- Nghiên cứu thành phần hóa học của sản phẩm tạo thành trong quá trình tạo trầm sử dụng chế phẩm TK1

2.3 Phương pháp nghiên cứu:

2.3.1 Xác định tỷ lệ khối lượng sản phẩm tạo thành trong phần gỗ thân và cành cây Dó bầu qua các giai đoạn tạo trầm:

Tiến hành nghiên cứu tại Bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội

Xử lý nguyên liệu: Bỏ vỏ thân và cành các mẫu Cân khối lượng thân và cành sau khi bỏ vỏ trên cân kỹ thuật Sau đó loại phần không tạo trầm, lấy phần sản phẩm tạo trầm cân trên cân kỹ thuật Tính phần trăm khối lượng phần tạo trầm thu được so với tổng khối lượng thân cành ban đầu

2.3.2 Nghiên cứu đặc điểm hiển vi của nguyên liệu:

Tiến hành nghiên cứu tại Bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội

Xử lý nguyên liệu :

Từ phần gỗ tạo trầm đã thu được ở trên, chẻ dọc thành từng đoạn mỏng có độ dài phù hợp rồi tiến hành cắt vi phẫu cắt ngang, nhuộm vi phẫu bằng xanh methylen trong 30 giây rồi soi dưới kính hiển vi

Nhuộm soi tương tự với mẫu gỗ trầm sau khi chiết (mẫu sau khi làm nghiên cứu hàm lượng và thành phần hóa học) và so sánh kết quả

2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học sản phẩm tạo thành:

Tiến hành nghiên cứu tại Bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội

Xử lý nguyên liệu: lấy phần gỗ trầm đã tách ra được ở trên chẻ nhỏ thành từng đoạn ngắn có kích thước phù hợp, sau đó buộc với nhau thành từng bó có kích thước phù hợp với bình Shoxlet, cho vào túi lọc rồi tiến hành chiết xuất bằng bộ dụng cụ chiết shoxlet sử dụng dung môi ethanol 96° đến khi chiết kiệt thu được dịch chiết ethanol toàn phần Lấy một phần dịch chiết đem pha loãng độ cồn bằng nước cất, sau đó lắc hỗn hợp này với một lượng cloroform xác định.Dịch chiết cloroform được phân tích bằng phương pháp sắc ký

A.Sắc kí lớp mỏng [SKLM] :

+ Bản mỏng cỡ 10cm × 10cm

+ Chất hấp thụ silicagel GF254 của Merck, Germany

+ Mẫu chấm: Concret trầm hòa tan trong dung môi cloroform

+ Dung môi khai triển: