Nghiên cứu xác định MDMA trong tóc và nước tiểu bằng phương pháp sắc kí khí khối phổ

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AM Amphetamin ATS Các chất kích thích thần kinh dạng amphetamin Amphetamin Type Stimulants CTPT Công thức phân tử DMA 2,5- Dimethoxyamphetamin GC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ SINH

Mã sinh viên: 1101437

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MDMA TRONG TÓC VÀ NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHÍ

KHỐI PHỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ SINH

Mã sinh viên: 1101437

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MDMA TRONG TÓC VÀ NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHÍ

LỜI CÁM ƠN

Sau một thời gian thực hiện khóa luận với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn

thành khóa luận, tôi muốn được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới những người

đã quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Trước tiên với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cám ơn tới ThS

Phạm Lê Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi làm khóa luận tại Viện Pháp y Quốc gia

Xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS Phạm Quốc Chinh, cán bộ Khoa Hóa pháp – Viện

pháp y Quốc gia, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian làm

nghiên cứu

Xin gửi lời cám ơn tới ban giám đốc Viện Pháp y Quốc gia và khoa Hóa pháp đã luôn

tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị trong thời gian qua đã nhiệt tình chỉ bảo

cho tôi các thao tác tiến hành thí nghiệm, các thao tác kĩ thuật trên máy

Cuối cùng, với tất cả tình yêu thương, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và

những người thân đã luôn động viên tôi trong suốt thời gian học tập tại trường Đại

học Dược Hà Nội

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016

Sinh viên Nguyễn Thị Sinh

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ v

Đặt vấn đề 1

Chương I.Tổng quan 3

1.1 Tổng quan về nhóm chất ATS 3

1.2 Tổng quan về 3,4-methylendioxymethamphetamin (MDMA) 5

1.2.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa 5

1.2.2 Tác dụng dược lý 6

1.2.3 Dược động học và phân bố của MDMA 8

1.3 Tổng quan về chiết 3, 4-methylendioxymethamphetamin trong tóc và nước tiểu 11

1.3.1 Cấu trúc của tóc 11

1.3.2 Liên kết thuốc trong tóc 12

1.3.3 Xử lý mẫu 12

1.4 Tổng quan về sắc kí khí khối phổ 15

1.4.1 Một số khái niệm 15

1.4.2 Cấu tạo của máy sắc kí khí khối phổ 16

1.4.3 Một số kĩ thuật MS 20

1.5 Các phương pháp xác định MDMA trong tóc và nước tiểu 20

1.5.1 Phương pháp miễn dịch 20

1.5.2 Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS) 20

1.5.3 Phương pháp sắc kí khí khố phổ 21

Chương II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 22

2.1 Nguyên liệu, thiết bị 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 23

2.2.1 Xây dựng phương pháp xác định MDMA trong tóc và nước tiểu 23

2.2.2 Thẩm định phương pháp 23

2.2.3 Ứng dụng phân tích MDMA trong mẫu thực 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Chuẩn bị mẫu 24

2.3.2 Xử lí mẫu, chiết và tạo dẫn xuất 24

2.3.3 Định tính, định lượng MDMA trong mẫu nước tiểu và mẫu tóc 24

2.4 Áp dụng quy trình để phân tích mẫu thực tế 30

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 30

Chương III Kết quả và thảo luận 32

3.1 Xây dựng phương pháp xác định MDMA 32

3.1.1 Thiết lập chương trình sắc kí 32

3.1.2 Khảo sát phổ khối của MDMA-HFBA và MA-d5-HFBA 32

3.2 Thẩm định phương pháp 34

3.2.1 Tính phù hợp của hệ thống 34

3.2.2 Độ đặc hiệu và tính chọn lọc 35

3.2.3 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 39

3.2.4 Độ đúng và độ chính xác 41

3.2.5 Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 42

3.2.6 Đánh giá hiệu suất chiết 42

3.2.7 Độ ổn định của mẫu 43

3.3 Áp dụng trên mẫu thực tế 45

BÀN LUẬN 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO vi

PHỤ LỤC……….vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AM Amphetamin

ATS Các chất kích thích thần kinh dạng amphetamin (Amphetamin Type

Stimulants) CTPT Công thức phân tử

DMA 2,5- Dimethoxyamphetamin

GC Sắc kí khí (Gas Chromatography)

GC-FID Sắc kí khí với detector ion hóa ngọn lửa (Gas Chromatography –

Flame ionization Detector) GC-MS Sắc kí khí khối phổ (Gas Chromatography – Mass spectrometry HFBA Hepta Flouro Butyric Anhydrid

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liqid

Chromatography) KLPT Khối lượng phân tử

LC-MS Sắc kí lỏng khối phổ (Liquid Chromatography – Mass

Spectrometry) LOD Giới hạn phát hiện (Limit Of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation)

MA Methamphetamin

MA-d5 Methamphetamin-d5

MDMA 3,4- Methylendioxymethamphetamin

MeOH Methanol

MS Khối phổ (Mass Spectrometry)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

TLC Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

3.5 Sắc kí đồ mẫu tóc trắng sau khi xử lý tách ion với mảnh 254 và

3.11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đáp ứng (tỷ

lệ diện tích pic MDMA/MA-d5) với hàm lượng mẫu nhiễm trên

mẫu tóc

39

3.12 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đáp ứng (tỷ

lệ diện tích pic MDMA/MA-d5) với nồng độ mẫu nhiễm trên mẫu

nước tiểu

40

Đặt vấn đề

Tệ nạn ma túy đang là hiểm họa của các quốc gia, dân tộc trên toàn thế giới; là một trong những nguyên nhân chủ yếu làm phát sinh tội phạm, tệ nạn xã hội và lây nhiễm HIV/AIDS Những hậu quả do tệ nạn ma túy gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng đến phát triển kinh tế - xã hội và an ninh trật tự của đất nước

Theo số liệu của Cơ quan phòng chống ma túy và tội phạm của Liên Hiệp Quốc

- UNODC, hiện nay có tới 4% dân số thường xuyên sử dụng ma túy, tức khoảng 230 triệu người, khoảng 37 triệu người lạm dụng ma túy tổng hợp ATS (Amphetamine Type Stimulants) trong số đó tới 60% thuộc khu vực Đông và Đông Nam Á [29] Tại Việt Nam, theo UNODC, tính đến cuối năm 2014, có 204.377 người sử dụng ma túy có hồ sơ quản lý, trong đó những người sử dụng heroin chiếm tỉ lệ lớn nhất (72%), sau đó là những người sử dụng ma túy tổng hợp (14,5 %) Từ năm 2008 đến nay, tình trạng mua bán, vận chuyển và sử dụng trái phép ATS ngày càng mạnh chiếm khoảng 20-30% số người nghiện Số vụ và đối tượng bắt giữ tăng khoảng 30% hàng năm ATS đã xâm nhập sâu vào xã hội, không chỉ có ở các vũ trường, quán bar, nhà nghỉ ở các thành phố lớn mà đã lan đến cả các khu vực nông thôn, vùng sâu, vùng

xa [8]

Để thực hiện tốt công tác phòng chống các hành vi bất hợp pháp liên quan tới loại ma túy trên, công việc kiểm nghiệm và phát hiện ATS cũng đóng một vai trò không hề nhỏ Sự kết hợp của phương pháp phân tích hiện đại GC-MS với các mẫu pháp y dễ thu thập như nước tiểu và tóc đã thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới và đã được ứng dụng thành công Tại Việt Nam hiện nay, một số cơ quan giám định cũng đã bắt đầu nghiên cứu, xác định ma túy bằng phương pháp GC/MS và LC/MS, mở ra một hướng mới cho việc phân tích các chất gây nghiện, trong đó ATS được chú trọng nhiều Xuất phát từ nhu cầu thiết thực đó, chúng tôi đặt vấn đề xác định 3,4-methylenedioxymethamphetamin (MDMA) trong nước tiểu và tóc bằng phương pháp GC/MS nhằm đưa ra quy trình chuẩn cho việc giám định chính xác MDMA trong nước tiểu và tóc, ứng dụng trong

các xét nghiệm hình sự với hy vọng mang lại một luồng gió mới trong công tác phòng chống tệ nạn ma túy trong phạm vi cả nước

Để thực hiện được mục tiêu đề ra, nội dung của bài khóa luận đề xuất gồm hai phần:

1 Xây dựng phương pháp định tính và định lượng MDMA trong nước tiểu và tóc bằng phương pháp sắc kí khí khối phổ

2 Thẩm định phương pháp đã xây dựng và áp dụng phân tích mẫu thực tế

Chương I Tổng quan

ATS là tên viết tắt của Amphetamine Type Stimulants - các chất kích thích thần kinh dạng amphetamin, bao gồm nhiều chất có cấu trúc tương tự nhau, trong đó amphetamin là chất được phát hiện và tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1887 tại Đức Ngoài ra còn có rất nhiều chất khác trong nhóm như MDMA, MDA, DMA [5], [7] Năm 1889, Tiến sĩ Nagayoshi Nagai người Nhật phát hiện và tổng hợp ra một chất có tác dụng kích thích thần kinh trung ương là methamphetamin Trong Đại chiến thế giới thứ hai methamphetamin được sản xuất và sử dụng rộng rãi trong binh lính Nhật Bản để làm tăng thêm lòng dũng cảm Sau đó, việc lạm dụng các chất kích thích thần kinh này đã trở thành vấn đề nghiêm trọng ở Nhật Bản, Mĩ và nhiều nước châu

Âu, nhất là ở những người trẻ tuổi Càng ngày, tác hại của thuốc này càng thể hiện nghiêm trọng: dễ gây nghiện, dùng liều cao gây loạn thần, hoang tưởng, dễ kích động, bạo lực vì thế chúng còn được gọi là “các chất loạn thần”, “ma túy điên”, “ma túy bạo lực”[3], [13]

Việc sử dụng các chất đó đã lan rộng trên toàn thế giới trong đó có Việt Nam, hàng loạt các chất mới với tác dụng mạnh hơn nhiều đã được ra đời Đây là dạng ma túy tổng hợp xuất hiện phổ biến hiện nay với nhiều hình thức đa dạng: ma túy đá, hồng phiến, thuốc lắc, v.v… và nhiều nhất là methamphetamin dạng tinh thể (ma túy đá) Liên hợp quốc đã đưa các chất này vào danh sách cần kiểm soát và phân vào nhóm kích thích thần kinh dạng amphetamin [8]

Hình 1.1 Một số dạng ma túy tổng hợp ATS trên thị trường Việt Nam

Công thức hóa học chung của nhóm ATS:

Bảng 1.1 Công thức một số ATS điển hình

1.2.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa

 Tác dụng dược lý: các tác dụng được báo cáo của MDMA thay đổi theo liều, tần suất và khoảng thời gian sử dụng Nhìn chung, tác dụng mong muốn của thuốc chỉ có được khi sử dụng thuốc với liều đơn và thấp [3]

 Tác dụng cấp [16], [17]

- Tác dụng mong muốn: MDMA làm tăng sự tỉnh táo, sức chịu đựng, cảm giác đầy năng lượng, tăng ham muốn tình dục, làm mất đi sự uể oải và cảm giác buồn ngủ Tác dụng lên thần kinh được mô tả gồm trạng thái phởn phơ, cảm

giác khỏe khoắn, nhạy cảm, hòa đồng xã hội, muốn gần gũi với mọi người và

sự khoan dung

- Tác dụng không mong muốn: MDMA có nhiều tác dụng không mong muốn thậm chí khi dùng với liều trung bình với mục đích chữa trị ban đầu, chúng được biểu hiện qua các trạng thái như căng cơ, nghiến hàm, nghiến răng và gây ra những cử động không ngừng của chân Thuốc làm tăng hoạt động của

cơ và tác động lên trung tâm điều nhiệt ở não làm tăng nhiệt độ cơ thể Cứng, đau lưng và nhược cơ thường gặp 2-3 ngày sau khi sử dụng thuốc Đau đầu, buồn nôn, chán ăn, nhìn mờ, khô miệng, mất ngủ thường gặp trong thời gian dùng thuốc và sau khi dùng một thời gian Nhịp tim, huyết áp thường tăng và

có xu hướng dao động nhiều hơn bình thường trong những ngày dùng thuốc Nếu sự kích thích vượt quá mức có thể gây lên tình trạng kích động thoái quá, mất tập trung, mất ngủ Những triệu chứng liên quan thường gồm ảo giác, mất

tự tin (cảm giác bị tách biệt với mọi người), lo lắng, xúc động, những hành xử

kì lạ và thiếu suy nghĩ Những triệu chứng này có thể gây lên những cơn mê sảng và những cơn rối loạn tâm thần Hai ngày sau khi dùng thuốc, triệu chứng phổ biến nhất là khó tập trung, trầm cảm, lo âu và mệt mỏi

 Tác dụng dài hạn [8], [16], [17]

- Độc tính lên thần kinh liên quan serotonin: MDMA làm tăng nồng độ của serotonin trong synap làm cải thiện tâm trạng và các giác quan của người dùng, tuy nhiên, nếu dùng với liều cao hơn sẽ gây ra sự giải phóng ồ ạt serotonin không chỉ tạo ra các hội chứng thần kinh cấp mà còn làm tổn thưởng những tế bào sản sinh ra chúng

- Các vấn đề về tâm thần lâu dài: nghiên cứu chỉ ra rằng, tác dụng có hại của MDMA lên hệ thống serotonin có thể gây ra những vấn đề về thần kinh và hành xử kéo dài từ vài tháng đến một năm sau khi dùng thuốc, bao gồm những biểu hiện sau:

+ Suy giảm trí nhớ

+ Giảm khả năng quyết định, tiếp cận thông tin và giải quyết vấn đề

+ Nghiến răng, nghiến hàm

+ Đau nhức cơ và có xu hướng làm tăng sự căng cơ và co thắt cơ nhất là vùng lưng và cổ

+ Hệ thống tuần hoàn: gây lên hiện tượng tăng huyết áp, nhưng tác động dài hạn lại gây giảm huyết áp Làm giảm khả năng tự điều chỉnh huyết áp và nhịp tim của hệ thống thần kinh tự động

+ Tổn thương thần kinh: thường gặp hội chứng Parkinson và hội chứng bại liệt hai dây thần kinh

1.2.3 Dược động học và phân bố của MDMA

MDMA dễ dàng hấp thu nhanh chóng qua đường tiêu hóa Thời gian khởi phát trong vòng 30 phút và đạt nồng độ đỉnh trong vòng từ 1-3 giờ Thời gian bán thải của thuốc vào khoảng gần 7 giờ [16], [20]

Enzym P450 2D6 là enzym chính chuyển hóa thuốc, ngoài ra còn một vài enzyme khác Một số enzym có thể bị bão hòa, do đó khi enzym này bị bão hòa, đồng thời với liều dùng tăng sẽ làm tăng một lượng lớn nồng độ thuốc trong máu và não, làm tăng độc tính của thuốc

MDMA được chuyển hóa thành MDA (methylenedioxyamphetamin) chất chuyển hóa còn hoạt tính – là chất chuyển hóa duy nhất được tìm thấy trong máu và huyết tương có nửa đời bán thải 16-38 giờ [19] MDA tiếp tục bị chuyển hóa tạo thành các dẫn xuất 2-hydroxy-4-methoxy và 3,4-dihydroxy (HMA và HHA) Ngoài

ra chất chuyển hóa của MDMA còn có 3-hydroxy-4-methoxymethamphetamin

(HMMA) và 3,4-dihydroxymethamphetamin (HHMA) Những chất chuyển hóa phân cực này được liên hợp trước khi được thải trừ qua nước tiểu Nước tiểu bị kiềm hóa

có thể làm tăng thời gian bán thải của MDMA lên 16-31 giờ Trong 24 giờ đầu, MDMA được đào thải qua đường nước tiểu khoảng 43% ở dạng không biến đổi, khoảng 15% ở dạng 4-hydroxymethamphetamin, khoảng 5% ở dạng amphetamin và một số chất chuyển hóa khác ở dạng biến đổi hoặc kết hợp [10], [16], [20], [27]

Sự thải trừ của thuốc ra khỏi cơ thể diễn ra chậm và từ từ, một số chất chuyển hóa của MDMA vẫn còn hoạt tính, đặc biệt là chất chuyển hóa đầu tiên của nó, MDA,

do đó thời gian tác dụng của thuốc có thể dài hơn thời gian MDMA tồn tại trong cơ thể người [10], [16], [20], [27]

Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hóa của MDMA

MDMA N-demethylation

H: CYP1A R: CYP1A

HHA

O-methylation COMT

HMA

Liên hợp với glucuronide sulfate

1.3 Tổng quan về chiết 3, 4-methylendioxymethamphetamin trong tóc và nước tiểu

1.3.1 Cấu trúc của tóc

Tóc có dạng hình sợi trụ, phát triển từ một túi bao nhỏ gọi là nang tóc Phần trên nang tóc gọi là thân tóc [24]

- Nang tóc: là một phần nhỏ bao quanh chân tóc, nằm dưới bề mặt da từ 3-4 mm

và được gắn chặt với biểu bì của da đầu, bao quanh bởi hệ thống mao mạch nuôi dưỡng tóc Nang tóc là phần sống duy nhất của sợi tóc, giúp cho tóc mọc dài ra [18], [30]

- Thân tóc: là những sợi tóc mà ta nhìn thấy hàng ngày, là phần tóc đã chết Chúng cấu tạo từ nhiều lớp tế bào, gồm ba phần chính: phần biểu bì (vảy tóc), phần lõi và tủy tóc [18], [24], [30]

 Phần biểu bì: là phần ngoài cùng của sợi tóc, đóng vai trò giúp cho sợi tóc bám chặt với nang tóc và bảo vệ những phần bên trong của sợi tóc Biểu bì bao gồm một lớp tế bào hình thoi, trong suốt, xếp khít nhau Sự phơi nhiễm của tóc với những chất có hại trong môi trường như hóa chất, nhiệt độ, ánh sáng, hoặc những liệu pháp trị liệu tóc có thể gây hại hoặc phá hủy lớp biểu bì tóc Lớp biểu bì do đó đóng một vai trò như hàng rào bảo vệ mạnh, chống lại sự mất mát của thuốc bên trong sợi tóc Khi biểu bì bị tổn hại thì thuốc dễ dàng di chuyển từ bên trong tóc ra bên ngoài do đó mất đi một cách dễ dàng

 Phần lõi tóc: chính là phần chính của sợi tóc, bao gồm nhiều bó sợi nhỏ hợp thành và các hạt melanin tạo lên màu sắc của tóc

 Phần tủy tóc: là phần trong cùng của sợi tóc, bên trong rỗng, chứa các hạt chất béo và không khí

Hình 1.2 Cấu trúc của tóc 1.3.2 Liên kết thuốc trong tóc

Thực tế, sự hiểu biết chính xác của sự liên kết thuốc trong tóc vẫn chưa rõ ràng

Sự vận chuyển thuốc từ bên trong cơ thể tới tóc được tiến hành bởi rất nhiều các chuyển hóa tại các thời điểm khác nhau trong chu trình phát triển của tóc Cụ thể MDMA và chất chuyển hóa của nó liên kết vào trong tóc trong quá trình hình thành của sợi tóc (thông qua sự khuyếch tán từ máu vào nang tóc đang phát triển và nằm chủ yếu ở tủy tóc, do nang tóc dưới da đầu được bao quanh bởi một mạng lưới dày đặc các mạch máu), sau quá trình hình thành sợi tóc (thông qua sự thải trừ của chất

bã nhờn và mồ hôi) và sau khi tóc mọc lên từ bề mặt của da đầu MDMA có thể tồn tại trong tóc vài tháng, thậm chí vài năm [3], [26]

1.3.3 Xử lý mẫu

 Để giải phóng thuốc từ mẫu tóc, các phương pháp xử lí mẫu dưới đây được sử dụng [26], [31]:

- Xử lí bằng kiềm: tóc được ủ trong môi trường kiềm, dịch thu được chuyển sang ống nghiệm khác để thực hiện bước tiếp theo

- Xử lí bằng β-glucuronidas: tóc được ủ với dung dịch đệm phosphate pH 6,0 cùng với dung dịch β-glucuronidas, phần dịch thu được chuyển sang ống nghiệm khác

để thực hiện bước tiếp theo

- Xử lí bằng methanol: tóc được ủ với methanol, dịch chiết methanol được chuyển sang một ống sạch khác để thực hiện bước tiếp theo

- Xử lí bằng acid: tóc được ủ với dung dịch acid rồi trung tính hóa bằng dung dịch kiềm Dịch thu được được chuyển sang một ống thủy tinh sạch khác để thực hiện bước tiếp theo

 Chiết xuất: để có thể chiết xuất MDMA trong tóc hoặc nước tiểu, thường dung hai phương pháp là chiết lỏng lỏng và chiết pha rắn [24], [26], [30], [31]

 Chiết lỏng lỏng:

Chiết lỏng lỏng là sự tách các chất dựa trên cơ sở sự hòa tan hay phân bố của các chất trong hai dung môi không trộn lẫn vào nhau Trong thực tế thường dùng cân bằng nước, dung môi hữu cơ không hòa tan trong nước để tách và tinh chế chất phân tích Đối với MDMA, dạng base tan tốt trong dung môi hữu cơ, dạng muối tan trong nước, do đó người ta thường chuyển qua lại giữa hai dạng acid, base để chiết và làm sạch với dung môi ether, dung môi này thường cho hiệu suất cao

 Chiết pha rắn [24], [30], [31]

Kĩ thuật chiết pha rắn đặc biệt là ở chế độ mixed-mode được sử dụng rộng rãi trên thế giới để xử lý các mẫu sinh học Trong khóa luận này, sử dụng phương pháp chiết pha rắn để xử lý mẫu phân tích

Trong một vài năm trở lại đây, xu hướng sử dụng SPE (Solid Phase Extraction) thay thế LLE (Liquid Phase Extraction – Chiết pha lỏng ) đang phát triển do những ưu điểm vượt trội có thể dễ dàng nhận thấy được thông qua thực nghiệm khi so sánh với LLE để chiết xuất được chất cần phân tích, chúng bao gồm:

 Độ đặc hiệu cao

 Độ thu hồi cao

 Chiết xuất sạch hơn và làm tăng khả năng loại trừ các chất gây nhiễu dẫn đến tạp nhiễm từ các thiết bị ít hơn

 Loại bỏ được nhũ tương

 Kết quả có độ lặp lại tốt hơn

 Giảm sử dụng dung môi, cũng như giảm sự ảnh hưởng gây ô nhiễm của dung môi tới môi trường

 Sử dụng dễ dàng và kĩ thuật chiết pha rắn có thể tự động hóa

 Tăng độ nhạy phân tích, giảm LOD và LOQ

 Lượng mẫu ít hơn và thời gian chiết xuất mẫu ngắn hơn

Các phương pháp chiết pha rắn dựa trên những loại tương tác phổ biến xảy ra giữa chất hấp phụ của cột và chất cần phân tích bao gồm [31]:

 Chiết pha đảo

 Chiết pha thuận

 Trao đổi ion

 Chế độ chiết pha rắn hỗn hợp (mixed-mode)

Quy trình chiết pha rắn gồm các bước [28], [31]:

 Xử lý cột bằng dung môi và dung dịch đệm thích hợp nhằm hoạt hóa cột, chuyển cột từ pha rắn sang trạng thái có thể lưu giữ chất phân tích

 Tách chất phân tích: mẫu trong dung dịch được cho qua cột, pha rắn sẽ lưu giữ lại chất phân tích và một số tạp chất

 Loại tạp: dùng dung môi hoặc dung dịch đệm cho qua cột để loại một số tạp

đã được giữ lại trên pha rắn

 Rửa giải: dùng dung môi hay hỗn hợp dung môi thích hợp để đẩy chất phân tích ra khỏi pha rắn, lấy dịch chiết và xác định bằng phương pháp thích hợp

Cơ chế phân tách và phân lập chất phân tích được thể hiện cụ thể qua bốn bước chính [28], [31]:

 Bước 1: hoạt hóa cột bằng dung môi hữu cơ và dung dịch đệm, đưa mẫu lên cột, rửa cột bằng nước đã loại ion

 Bước 2: khóa cột bằng acid HCl 0,1 M, acid sẽ giúp tạo liên kết ion giữa nitơ của MDMA và nhóm sulfonic của chất hấp phụ

 Bước 3: dùng MeOH rửa để cắt liên kết Vanderwalls, các chất gây nhiễu lúc này bị loại bỏ, chất phân tích nằm lại trên cột

 Bước 4: rửa giải bằng dung môi thích hợp để cắt liên kết ion của chất phân tích và chất hấp phụ

Khối phổ (MS): dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của chúng, khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc kí, chúng đi vào đầu dò có dòng điện ion hóa (Mass Spectrometry) Khi đó, chúng sẽ tấn công vào các luồng, chúng bị vỡ thành những mảnh vụn, những mảnh vụn này có thể lớn hoặc nhỏ Những mảnh vụn này thực tế là các vật mang điện hay còn gọi là ion (z), việc đo tỷ số khối lượng và điện tích các ion (m/z) để cung cấp thông tin định tính, xác định cấu trúc và định lượng các chất [1], [13]

Bằng sự kết hợp hai kĩ thuật trên, các nhà khoa học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng, có thể đưa ra cách giải quyết với một số chất Ngày nay, người ta ứng dụng kĩ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành như

y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm, v.v…

1.4.2 Cấu tạo của máy sắc kí khí khối phổ

 Khí mang: có vai trò mang chất phân tích đi dọc theo cột, ngoài ra khí mang còn là thành phần để phát hiện chất phân tích sau cột, góp phần làm sạch hệ sắc kí

Khí mang có 5 yêu cầu chính sau:

+ Đảm bảo tính khuếch tán cần thiết, quyết định hiệu suất cột

+ Có độ tinh khiết cao và phù hợp với độ nhạy cần thiết và nguyên lý hoạt động của detector Độ tinh khiết của khí mang từ 99,995% đến 99,999% Lượng vết oxi và nước có thể phá hủy cột vì ở nhiệt độ cao, nó phản ứng với pha tĩnh

+ Trơ với tướng tĩnh lỏng cũng như chất phân tích và vật liệu làm cột

+ Có khả năng bị hấp thụ vào pha tĩnh càng nhỏ càng tốt

+ Dễ sử dụng và giá thành hạ

Các khí mang thường sử dụng là: He, H2, N2, Ar, Ne, Kr, v.v…

Bản chất của khí mang ảnh hưởng tới sự giãn rộng vùng mẫu Đối với cột lớn, hiệu ứng thành lớn phải dùng các khí nhẹ có khả năng khuếch tán lớn [1], [22], [23]

 Hệ thống tiêm mẫu [1]

 Cách thông dụng nhất để đưa mẫu vào cột là sử dụng một bơm tiêm mẫu vi lượng để tiêm một mẫu lỏng hoặc khí qua một đệm cao su chịu nhiệt vào một buồng hóa hơi (injector) Buồng này được đốt nóng với nhiệt độ thích hợp và được nối với cột tách

 Đối với cột tách thông thường, cỡ mẫu thường thay đổi từ 1 đến 20 µl Cột mao quản đòi hỏi lượng mẫu đưa vào nhỏ hơn nên trong trường hợp này hệ thống chia dòng mẫu được thiết kế trong bộ injector được sử dụng để chỉ giao một phần nhỏ lượng mẫu được tiêm đi vào cột, phần còn lại được thải ra ngoài

 Có nhiều kĩ thuật tiêm mẫu khác nhau:

- Tiêm mẫu có chia dòng (split): thích hợp cho các cấu tử phân tích có nồng độ lớn hơn 0,1% mẫu Tiêm mẫu chia dòng chỉ giới thiệu vào cột khoảng 0,2 đến 2%

lượng mẫu Tỉ lệ của mẫu không được giới thiệu vào cột được gọi là tỉ số chia dòng, có giá trị từ 50:1 đến 600:1 Sau khi mẫu bị sục ra khỏi buồng tiêm mẫu, van chia dòng đóng lại và khí mang được giảm tương ứng

- Tiêm mẫu không chia dòng (splitless): thích hợp cho phân tích lượng vết những cấu tử có nồng độ nhỏ hơn 0,01% mẫu và cách tiêm này có khoảng 80% mẫu được giới thiệu vào cột Một thể tích lớn (khoảng 2 µl) của dung dịch được pha loãng trong dung môi có nhiệt độ sôi thấp được tiêm chậm vào trong ống thủy tinh của buồng tiêm mẫu với lỗ thoát chia dòng bị đóng Nhiệt độ của buồng tiêm mẫu cho chế độ không chia dòng giữ thấp hơn (khoảng 220oC) so với chế độ chia dòng vì mẫu bị lưu giữ lâu hơn trong buồng tiêm mẫu và tránh mẫu bị phân hủy nhiệt

- Kĩ thuật tiêm thẳng vào cột (on-column): Mẫu được ngưng tụ ở đầu cột sau đó làm bay hơi theo chương trình nhiệt độ Tăng độ nhạy, giảm phân hủy mẫu do nhiêt

 Cột sắc kí [1]

Cột sắc kí cần thỏa mãn các yêu cầu sau:

- Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha động và pha tĩnh nhờ việc tối ưu hóa các thông

số của phương trình Van Deemter

- Độ thấm cao tức có độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định

- Khả năng tải trọng cao của cột

- Có khoảng nhiệt độ sử dụng rộng và chịu được nhiệt độ cao

 Cột nhồi

+ Nguyên liệu: thép không rỉ, niken, thủy tinh

+ Kích thước: đường kính khoảng từ 3-6 mm và chiều dài khoảng từ 1-5 m + Pha tĩnh: là lớp chất lỏng bao quanh hạt chất mang rắn hoặc bản thân hạt rắn

là pha tĩnh

+ Khí mang: Nitơ, Heli

+ Độ phân giải: thấp, tốt nhất chỉ có thể tách được 20 thành phần

 Cột mao quản

+ Nguyên liệu: thủy tinh oxyd tinh khiết nấu chảy có mức độ liên kết ngang cao hơn nhiều so với thủy tinh thường nên bền và chịu được nhiệt độ cao đến

+ Khí mang: Heli hoặc Hydro

+ Độ phân giải: phân tích được nhiều thành phần: 100 chất hoặc hơn, nhất là với cột có đường kính trong < 0,2 mm Chất tan được rửa giải ở nhiệt độ thấp hơn so với cột nhồi

+ Các silicon

 Detector khối phổ [1], [22]

Detector khối phổ được coi là bộ phận quan trọng nhất, nó cho phép:

- Đưa ra thông tin đặc hiệu về cấu tạo hóa học của chất phân tích

- Phân tích đúng, chính xác đối tượng chất phân tích (tính chọn lọc cao)

- Phân tích hàm lượng siêu vết trong mẫu thành phần phức tạp vì dòng khối phổ nhạy (độ nhạy cao)

Nguyên tắc hoạt động: khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến detector Tất cả các quá trình này diễn ra trong thiết bị chân không, áp suất trong hệ dao động từ 10-3 Pa đến 10-6 Pa Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất), xác định cấu trúc và định lượng các chất

Các bộ phận của detector khối phổ [1], [19]:

 Bộ phận nạp mẫu: bộ phận nạp mẫu kết nối với máy khối phổ

 Nguồn ion: là bộ phận ion hóa mẫu có nhiệm vụ ion hóa chất cần phân tích, khử dung môi để đưa tiếp ion vào bộ phận phân tích khối, cách li phần tạo ion

ở áp suất khí quyển với bộ phận nằm trong chân không sâu, và rút ra ngoài các phân tử trung hòa, ion khác dấu có thể ảnh hưởng tới phép đo Các kĩ thuật ion hóa đã được phát triển và sử dụng là: va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa bằng nguồn ion phun sương khử solvat, ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển, ion hóa bởi nguồn ion bằng giải hấp

 Bộ phận phân tích khối: là phần quan trọng nhất của máy khối phổ có nhiệm

vụ tách các ion có tỉ số m/z khác nhau thành những phần riêng biệt Các ion được gia tốc, tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector

 Detector: có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

 Bộ xử lí dữ liệu: tín hiệu từ detector được khuếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ khối, định lượng, v.v…

1.4.3 Một số kĩ thuật MS

 Kĩ thuật phân tích toàn thang (FULL SCAN)

Với một hỗn hợp nhiều chất sau khi được tách ra qua cột sắc kí khí và đưa vào detector khối phổ, detector sẽ ghi nhận tổng cường độ các ion sinh ra từ mỗi chất Ta có một sắc kí đồ toàn bộ ion TIC (Total Ion Chromatogram) và phổ khối được lấy toàn bộ các ion (FULL SCAN) FULL SCAN cho đầy đủ thông tin về chất phân tích hơn, tuy nhiên độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn [1], [3], [5]

 Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM, Selected Ion Mornitoring)

Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc kí đồ theo thời gian Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng

độ nhạy, tức tăng tỉ lệ tín hiệu (S) trên nhiễu đường nền (N) [1], [3], [5]

1.5 Các phương pháp xác định MDMA trong tóc và nước tiểu

1.5.1 Phương pháp miễn dịch

Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng kháng thể đặc hiệu với chất cần phân tích (kháng nguyên) và dạng đánh dấu của chất phân tích Dạng đánh dấu của chất phân tích sẽ tranh chấp với chất phân tích để kết hợp với kháng thể theo cơ chế phản ứng giữa kháng nguyên với kháng thể Kết quả là số lượng phân tử bị đánh dấu

sẽ tỉ lệ nghịch với lượng chất cần phân tích trong mẫu Tùy thuộc vào bản chất của chất đánh dấu mà các phương pháp phân tích sẽ được áp dụng Phương pháp này thường dùng để tạo ra các kit xác định nhanh MDMA Mẫu tóc sau khi được xử lý và chiết sẽ được đem xác định bằng phương pháp miễn dịch để phát hiện MDMA [15], [21]

1.5.2 Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS)

Sau khi chiết MDMA bằng phương pháp thích hợp rồi đưa vào hệ thống máy sắc kí lỏng khối phổ mà không cần tạo dẫn xuất như GC/MS Bộ phận LC có chức năng phân tách MDMA từ dung dịch, đưa vào bộ phận khối phổ với vai trò detector

để định tính, định lượng [3], [14], [24]

1.5.3 Phương pháp sắc kí khí khối phổ

Phương pháp sắc kí khí khối phổ ngày càng được sử dụng rộng rãi để phân tích MDMA Máy sắc kí khí tách MDMA và đưa vào detector khối phổ, có khả năng định tính, định lượng MDMA với độ nhạy và độ chính xác cao Để sử dụng phương pháp này, MDMA cần được tạo dẫn xuất để tăng khả năng bay hơi và bền với điều kiện sắc kí [19], [24]

Chương II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Nguyên liệu, thiết bị

- Chất chuẩn, hóa chất, thuốc thử:

+ Chất chuẩn MDMA: 1,0 mg/ml MeOH

Lot: FE 082712-03, Expires: 08/2017, USDEA Exempt/TK#61-15

+ Nội chuẩn MA-d5: 1,0 mg/ml MeOH

Lot: FE 042012-02, Expires: 04/2017, USDEA Exempt/TK#61-105

+ Đệm phosphat 0,1 M; pH 6; acid clohydric 0,1 M; nước cất đã loại ion, ethyl acetat, methanol, ammoniac, HFBA

- Thiết bị, dụng cụ:

Hình 2.1 Máy sắc kí khí khối phổ Agligent Technologies

+ Máy sắc kí khí khối phổ Agilent, Detector MS: 5975 C

+ Cột sắc kí khí HP5MS: (30 m × 250 µm × 0,25 µm)

+ Cột chiết pha rắn AccuBOND II Evidex Cartridges, 200 mg, 3 ml

+ Máy lắc siêu âm Branton 5200, tủ sấy, máy lắc ly tâm, hệ thống thổi khô bằng khí N2

+ Bộ dụng cụ chiết pha rắn

+ Bình nón, bình định mức, pipet và các dụng cụ thủy tinh khác, v.v…

- Đối tượng nghiên cứu:

+ Mẫu nước tiểu trắng và tóc trắng (không nhiễm MDMA) của Khoa Hóa pháp, Viện Pháp y quốc gia

+ Mẫu tóc và nước tiểu nhiễm MDMA tự tạo

+ Mẫu nước tiểu và tóc thực tế gửi tới giám định tại Khoa Hóa pháp, Viện Pháp

y Quốc gia

2.2 Nôi dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng phương pháp xác định MDMA trong tóc và nước tiểu

Xây dựng phương pháp xác định MDMA trong tóc và nước tiểu bằng GC-MS bao gồm các nội dung:

- Xử lí mẫu: đưa ra quy trình xử lí mẫu

- Lựa chọn điều kiện sắc kí, lựa chọn chuẩn nội: đưa ra chương trình sắc kí khí khối phổ để định lượng, chất chuẩn nội phù hợp

- Hiệu xuất chiết

- Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

- Độ ổn định của mẫu

2.2.3 Ứng dụng phân tích MDMA trong mẫu thực

Sử dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích MDMA trong mẫu tóc và nước tiểu của người nghi ngờ sử dụng ma túy gửi đến giám định tại Khoa Hóa pháp, Viện Pháp

y Quốc gia

2.3.1 Chuẩn bị mẫu

Bao gồm chuẩn bị mẫu chuẩn, mẫu nhiễm và mẫu thực

 Lấy mẫu và bảo quản mẫu thực

Mẫu tóc gửi đến hoặc lấy trực tiếp ở Khoa Hóa pháp - Viện Pháp y quốc gia, đựng trong túi polymer sạch Mẫu được xử lý ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh nhiệt

độ 2-8oC

Mẫu nước tiểu gửi đến Khoa Hóa pháp - Viện Pháp y quốc gia, đựng trong ống nhựa sạch có nắp kín Mẫu được xử lý ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ 2-8oC

 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

 Mẫu chuẩn

Pha loãng dung dịch chuẩn gốc MDMA và MA-d5 nồng độ 1 mg/ml bằng MeOH thành các dụng dịch chuẩn làm việc có nồng độ 100 µg/ml methanol Từ dung dịch MDMA chuẩn này pha loãng thành các dung dịch MDMA có nồng độ 1 µg/ml và 0,1 µg/ml Từ dung dịch MA-d5 chuẩn làm việc trên pha loãng thành dung dịch có nồng độ 1 µg/ml

 Các mẫu tóc và nước tiểu nhiễm:

Sử dụng mẫu tóc trắng và nước tiểu trắng để có các mẫu nhiễm với các lượng của chất chuẩn MDMA thêm vào là 10 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng,

400 ng, chuẩn nội MA-d5 100 ng

 Các mẫu tóc thực và nước tiểu thực:

Thêm vào các mẫu tóc và nước tiểu thực 100 ng nội chuẩn MA-d5 để tiến hành định lượng

2.3.2 Xử lý mẫu, chiết và tạo dẫn xuất

 Xử lý mẫu: