Xây dựng phương pháp xác định ketamin trong nước tiểu bằng phương pháp sắc kí khí khối phổ (GC MS)

Trên thế giới, người ta đã xác định ketamin trong nước tiểu, máu, tóc, móng bằng các phương pháp phân tích khác nhau như sắc ký khí khối phổ GC-MS, sắc ký lỏng khối phổ LC-MS, sắc kí khí

LÊ THỊ LIỄU

Mã sinh viên : 1101291

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KETAMIN TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHÍ

KHỐI PHỔ (GC-MS)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ LIỄU

Mã sinh viên : 1101291

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KETAMIN TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHÍ

LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, em đã hoàn thành khóa luận của mình

Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Phạm Lê Minh đã tạo mọi điểu kiện cho em tham gia làm khóa luận tại Viện Pháp y Quốc gia

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS Phạm Quốc Chinh, cán bộ khoa Hóa pháp – Viện Pháp y Quốc gia, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo nhiệt tình cho em trong suốt thời gian làm nghiên cứu trên Viện

Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám đốc Viện Pháp y Quốc gia và Khoa Hóa pháp đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị trong thời gian qua đã nhiệt tình chỉ bảo cho em các thao tác tiến hành thí nghiệm, các thao tác kỹ thuật trên máy

Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, người thân đã luôn bên em, chia sẻ khó khăn, động viên, và giúp đỡ trong học tập cũng như trong cuộc sống

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không thể tránh những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô giáo và các bạn sinh viên

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016 Sinh viên

Lê Thị Liễu

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về ketamin 2

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa 3

1.1.2 Dược động học 4

1.1.3 Tác dụng dược lý 7

1.2 Tổng quan về chiết ketamin trong nước tiểu 9

1.2.1 Phương pháp chiết ma túy từ dịch sinh học 9

1.2.2 Phương pháp chiết SPE 9

1.2.3 Phương pháp chiết pha rắn ketamin trong nước tiểu 12

1.3 Tổng quan về sắc kí khí khối phổ (GC-MS) 13

1.3.1 Khái niệm 13

1.3.2 Hệ thống GC – MS 13

1.4 Các phương pháp xác định ketamin trong nước tiểu……… ….17

1.4.1 Phương pháp miễn dịch 17

1.4.2 Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) 18

1.4.3 Sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 18

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 19

2.1.1 Nguyên liệu 19

2.1.2 Thiết bị dụng cụ 19

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng ketamin trong nước tiểu 20

2.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng ketamin trong nước tiểu 20

2.2.3 Ứng dụng phân tích ketamin trong nước tiểu 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Chuẩn bị mẫu 21

2.3.2 Xử lý mẫu 21

2.3.3 Định tính, định lượng ketamin trong mẫu nước tiểu 22

2.4 Áp dụng quy trình để phân tích mẫu thực tế 26

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 26

Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng ketamin bằng GC-MS 28

3.1.1 Thiết lập chương trình GC-MS xác định ketamin 28

3.1.2 Khảo sát khối phổ của ketamin-HFBA và ketamin-4-HFBA 28

3.2 Thẩm định phương pháp 31

3.2.1 Tính phù hợp hệ thống sắc kí 31

3.2.2 Tính chọn lọc 31

3.3 Đánh giá phương pháp 33

3.3.1 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 33

3.3.2 Độ đúng và độ chính xác 35

3.3.3 Đánh giá hiệu suất chiết 36

3.3.4 Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 36

3.4 Áp dụng quy trình phân tích mẫu nước tiểu thực tế 38

BÀN LUẬN 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CTPT Công thức phân tử

KLPT Khối lượng phân tử

ELISA Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay)

GC-FID Sắc kí khí với detector ion hóa ngọn lửa (Gas Chromatograph –

Flame Ionization Detector)

GC-MS Sắc kí khí khối phổ (Gas Chromatography – Mass Spectrometry) HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography)

LC-MS Sắc kí lỏng khối phổ (Liquid Chromatography – Mass

Spectrometry)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

MeOH Methanol

HFBA Heptafloro butyric anhydrid

DHNK Dehydronorketamin

NMDA N-methyl-D-aspartic acid

CNS Hệ thống thần kinh trung ương (Central Nervous System)

SPE Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với ketamin 31

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của ketamin

trong nước tiểu

34

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 35

Bảng 3.4 Kết quả khảo hiệu suất chiết của phương pháp 36

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ ổn định của phương pháp 38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 3.6 Thời gian lưu của mẫu nước tiểu chứa ketamin-HFBA

và ketamin-d4-HFBA

32

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu

đáp ứng (Sketamin-HFBA/Sketamin-d4-HFBA) với nồng độ mẫu nhiễm trong nước tiểu

34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ma túy từ lâu đã trở thành vấn đề nhức nhối của xã hội Trong thời gian gần đây, trên các phương tiện thông tin đại chúng thường xuyên nhắc đến một loại ma túy tống hợp có tên gọi là “ke” Đó chính là một loại ma túy có tên gọi ketamin Với mức độ gây hại gấp nhiều lần so với các loại ma túy truyền thống trước đây như: heroin, tài mà, thuốc phiện…, "ke" đã và đang trở thành

"cơn lốc ảo" cuốn đi tương lai của một bộ phận dân chơi [6] Sử dụng ketamin không chỉ ảnh hưởng đến cá nhân người sử dụng mà nó còn kéo theo nhiều hệ lụy, là một vấn đề nguy hiểm của xã hội Vì vậy, việc phát hiện sử dụng, sản xuất, tàng trữ ketamin là nhiệm vụ của nhiều bộ phận chức năng cũng như của

cả cộng đồng

Trên thế giới, người ta đã xác định ketamin trong nước tiểu, máu, tóc, móng bằng các phương pháp phân tích khác nhau như sắc ký khí khối phổ (GC-MS), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), sắc kí khí với detector ion hóa ngọn lửa (GC-FID), miễn dịch huỳnh quang (ELISA) [17] Trong khi đó, ở Việt Nam, một số cơ quan giám định mới chỉ sử dụng các test thử nhanh, nghiên cứu về phương pháp GC-FID [8] mà chưa thấy có nghiên cứu nào về phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) trên mẫu nước tiểu trong khi GC-

MS là một phương pháp có độ nhạy, độ chọn lọc và đặc hiệu rất cao với ketamin, ketamin lại là một chất thải trừ một phần qua nước tiểu, mẫu nước tiểu cũng là một mẫu vật rất tiện lợi để xác định nhanh ketamin Để phục vụ cho nhu cầu phát hiện bắt giữ tội phạm được nhanh chóng và chính xác hơn, chúng tôi đặt vấn đề xác định ketamin trong nước tiểu bằng phương pháp sắc

ký khí khối phổ (GC-MS) với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp xác định ketamin trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ

2 Thẩm định phương pháp đã xây dựng và áp dụng vào mẫu thực tế

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về ketamin

Ketamin là một chất giảm đau, gây nghiện Nó được tổng hợp bởi Calvin Stevens tại phòng thí nghiệm Parke Davis vào năm 1962 Thuốc đã được cấp bằng sáng chế vào năm 1963 tại Bỉ và vào năm 1989 tại Hoa Kỳ [26] Ketamin được đưa ra thị trường trong năm 1970 và lần đầu tiên được sử dụng bởi một đơn vị quân đội Anh Jordan để điều trị các vết bỏng nặng bằng tiêm bắp Ketamin cũng được sử dụng rất nhiều trong chiến tranh ở nước ta vào những năm 70 [9]

Tới thập niên 1990, ketamin tái xuất hiện với tên mới là Special K Dân

sử dụng ketamin gọi nó bằng các tên lóng như K, vitamin K, hoặc cat valium Đây là một chất gây hoang tưởng rất mạnh làm rối loạn thị giác, khiến cho người dùng mất định hướng về không gian và thời gian Thời gian tác dụng có thể kéo dài cả giờ, đôi khi cả ngày Sử dụng nhiều ketamin có thể xảy ra tử vong vì suy hô hấp và suy tim

Ketamin thường được tìm thấy dưới dạng viên đơn độc nhưng cũng được dùng làm chất pha trộn trong viên methamphetamin và ecstasy Ở Việt Nam, ketamin không phổ biến và không sử dụng rộng rãi nhưng cũng đã tăng lên cùng với tình trạng sử dụng Ecstasy Trong hai, ba năm gần đây, ketamin bị thu giữ ngày càng nhiều ở nước ta [5] Với mục đích như một loại ma túy, do

đó ngày 16/11/2013, Chính phủ đã ban hành Nghị định số 133/2003/NĐ-CP

bổ sung ketamin vào danh mục các chất được kiểm soát [1]

Hình 1.1 Một số hình ảnh của ketamin 1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa

Ketamin thường gặp dưới hai dạng là dạng base và muối hydroclorid

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của ketamin

 Ketamin hydroclorid [2], [15], [17], [35]

- CTPT: C13H16ClNOHCl

- KLPT: 274,2

- Điểm chảy: 262 – 263oC

- Đây là dạng thuốc của ketamin

- Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng Dung dịch 10% trong nước có

pH từ 3,5 đến 4,1 Dạng muối hydrochlorid tan được trong nước (tỷ lệ 1:4), tan được trong methanol và chloroform, 1:14 trong ethanol, 1:60 trong ethanol tuyệt đối và chloroform, thực tế không tan trong ether

1.1.2 Dược động học

1.1.2.1 Hấp thu

Trong thực hành lâm sàng, dạng tiêm là đường dùng phổ biến nhất đưa ketamin vào cơ thể Dạng tiêm có thời gian phân bố nhanh hơn (Tmax = 5-15 phút) so với đường hít (Tmax = 20 phút) và đường uống (Tmax = 30 phút) Sinh khả dụng của đường uống hoặc đặt trực tràng giảm từ 17-25 % so với đường tiêm do ảnh hưởng của chuyển hóa bước một qua gan và ruột Sinh khả dụng đường hít cũng thấp hơn (giảm hơn 50% so với đường tiêm bắp), nguyên nhân có thể là do hít một lượng chất đáng kể qua mũi [24]

1.1.2.2 Phân bố

Ketamin dạng base tan tốt trong lipid và liên kết yếu với protein huyết tương (12%) Nó đi qua được hàng rào nhau thai và nhanh chóng đến máu não, có ảnh hưởng tức thì đến đích, không kể người hay động vật Nghiên cứu trên động vật chỉ ra rằng, thuốc đạt nồng độ cao trong phổi, mỡ và gan trong khi đạt nồng độ thấp ở tim, cơ xương Nồng độ ketamin trong não cao gấp bốn đến năm lần so với huyết tương Sau đó, có hiện tượng tái phân bố thuốc

từ các mô [32]

1.1.2.3 Chuyển hóa

Hình 1.3 Con đường chuyển hóa của ketamin

Chuyển hóa pha I của ketamin chủ yếu xảy ra ở gan, chỉ 2 - 4% liều được thải trừ ở dạng nguyên vẹn qua nước tiểu, 88% liều được thải trừ ở dạng chuyển hóa sau 72 giờ

Ketamin bị khử nhóm methyl tại vị trí nguyên tử nitơ bởi enzym microsom cytocrom P450 qua CYP3A4, CYP2B6 và CYP2C9 tạo thành chất chuyển hóa cơ bản là norketamin (chất chuyển hóa I) [18] Norketamin gắn hydroxy vào vị trí số 5 và số 6 của vòng cyclohexanon tạo thành chất chuyển hóa III và IV Hai chất này có thể thải trừ dưới dạng liên hợp hoặc biến đổi tạo thành chất chuyển hóa II bằng phản ứng loại nước Bản thân ketamin có thể tự hydroxy hóa vòng cyclohexanon ở vị trí số 5 và 6 tạo thành chất chuyển hóa V và VI, nó có thể thải trừ tương tự bằng cách liên hợp hoặc biến đổi tạo thành chất chuyển hóa VII bằng phản ứng loại nước Chất chuyển hóa VII có thể chuyển thành chất chuyển hóa số II bởi phản ứng khử nhóm methyl tại vị trí nguyên tử nitơ Chỉ 16% liều có thể được tái hấp thu trong nước tiểu dưới dạng hydroxy ketamin hoặc norketamin

Pha II là pha hydroxy hóa các chất chuyển hóa, tạo điều kiện liên hợp với O-glucuronic Các chất chuyển hóa sau khi liên hợp có thể dễ dàng tan trong nước và thải trừ qua thận (> 80% liều) Những chất chuyển hóa chính, norketamin và dehydroxynorketamin có thể được kiểm tra bằng các xét nghiệm cùng với ketamin vì chúng có liên quan về mặt hóa học Con đường

chuyển hóa của ketamin được trình bày ở Hình 1.2 Dehydronorketamin

(DHNK) ban đầu được cho rằng là sản phẩm của quá trình phân tích bởi sắc

kí khí ở nhiệt độ cao nhưng phát hiện gần đây chỉ ra rằng DHNK là thực sự là sản phẩm chuyển hóa chính của ketamin [22]

1.1.2.4 Thải trừ

Con đường thải trừ chính của ketamin là chuyển hóa qua gan tạo thành chất chuyển hóa hydroxy Chất này liên hợp và thải trừ chính qua thận vào nước tiểu Ketamin có thể được phát hiện ở nước tiểu 5-6 ngày sau khi dùng Lượng thải trừ qua thận khoảng 90% liều dùng, trong đó có 4% lượng

ketamin thải trừ ở dạng nguyên vẹn, lượng thải trừ qua phân chỉ khoảng hơn 5% Thời gian bán thải của ketamin là 2 – 3 giờ [29]

1.1.3 Tác dụng dược lý

Ketamin hydrochlorid là loại thuốc gây mê đường tĩnh mạch được chỉ định trong chuẩn bị cho phẫu thuật nhỏ Từ khi ra đời, ketamin nhanh chóng được dùng hợp pháp ở cả con người (như thuốc giảm đau trong những tiểu phẫu Với liều cao, nó có thể gây ra ngộ độc và gây ảo giác Ketamin ngày nay vẫn được sử dụng trong điều trị, ví dụ như biệt dược Ketamin 50 mg/ml, Ketalar 100 mg/ml [35]

1.1.3.1 Ảnh hưởng đến hệ thống thần kinh trung ương

Ketamin tác động lên hầu hết hoặc tất cả các neuron thần kinh Ketamin ức chế thụ thể NMDA ở hệthần kinh trung ương và nó đóng vai trò như một chất đối kháng thụ thể NMDA không cạnh tranh Kết quả là làm giảm sự nhạy cảm của thần kinh trung ương với các kích thích gây đau dẫn đến giảm hiện tượng tăng cảm giácđau và giảm cường độ đau [11]

Một số tác động của ketamine lên hệ thống catecholamin trong đó đáng chú ý là tăng cường hoạt động của dopamin Ketamin làm tăng Nac dopamin bởi sự huy động dopamin trong các nơi dự trữ và không ngăn chặn tái hấp thu dopamine [31],[16] Sử dụng ketamin lặp đi lặp lại sẽ làm giảm sự giải phóng dopamin tại vỏ não trước trán gấp năm lần so với không sử dụng, đồng thời tăng cường nồng độ acid ngoại bào 5-hydroxyindoleacetic (5-HIAA), một chất chuyển hóa serotonin Do đó sử dụng ketamin lặp đi lặp lại có thể làm thay đổi sự cân bằng giữa dopamin và serotonin [23] Điều này cho thấy rằng tính chất gây nghiện và loạn tâm thần của ketamin có thể liên quan đến các tác dụng dopaminergic

S-ketamin có ái lực với thụ thể NMDA cao hơn 3-4 lần so với ketamin và do đó có nhiều tiềm năng gây mê S-ketamin là đối hình gây ra

R-những ảnh hưởng loạn tâm thần của ketamin còn R-ketamin có thể tạo ra một trạng thái thư giãn dưới liều gây mê [33]

1.1.3.2 Ảnh hưởng lên hệ thống tim mạch

Ketamin có thể làm tăng huyết áp và nhịp tim nên nó được sử dụng để gây mê cho bệnh nhân tim mạch bởi nó duy trì hoặc tăng cung lượng tim Tuy nhiên, đã có những báo cáo về giảm hoạt động của tim và phổi ở những bệnh nhân bị bệnh nặng và loạn nhịp tim [32] Các tác dụng phụ tim mạch khi sử dụng ketamin bao gồm: tăng huyết áp và nhịp xoang nhanh, hạ huyết áp, chậm nhịp xoang và các rối loạn nhịp tim khác Bệnh nhân cao huyết áp, thiếu máu cục bộ cơ tim hoặc tắc nghẽn mạch máu não phải tránh việc sử dụng ketamin [34]

1.1.3.3 Tác động lên hệ thống hô hấp

Sau khi sử dụng liều cao ketamin, người dung có thể bị suy hô hấp và ngưng thở Điều này không xảy ra sau khi dùng liều thấp ketamin vì nó được biết đến như một thuốc làm dịu hô hấp nhẹ Chưa có trường hợp suy hô hấp nào được báo cáo sau khi sử dụng ketamin để giải trí [32], [30]

1.1.3.4.Tác dụng chống trầm cảm

Hầu hết các nghiên cứu lâm sàng cho thấy sử dụng ketamin tiêm tĩnh mạch đơn độc điều trị thay thế cho bệnh nhân trầm cảm kháng trị cho kết quả chống trầm cảm nhanh chóng nhưng thoáng qua Cho đến nay, phương pháp điều trị tiếp với các chất glutamat như riluzol không đem lại hiệu quả cao [10], [13] Ketamin đã được chứng minh có tác dụng chống trầm cảm trong một số nghiên cứu ngẫu nhiên có đối chứng Bệnh nhân trầm cảm kháng thuốc nặng cho thấy tỷ lệ đáp ứng lên đến 70% sau một liều ketamin duy nhất [20], [27]

1.2 Tổng quan về chiết ketamin trong nước tiểu

1.2.1 Phương pháp chiết ma túy từ dịch sinh học

Dịch sinh học như máu, huyết tương hoặc nước tiểu có nền mẫu phức tạp và thường chứa một số thành phần nội sinh Những thành phần của mẫu

có thể can thiệp và ảnh hưởng xấu đến việc xác định các chất phân tích liên quan nếu không được loại bỏ Do đó, phần lớn thời gian phân tích trong phương pháp sắc ký là các bước chuẩn bị mẫu và thường là nguồn gốc của những lỗi lớn trong quá trình phân tích tổng thể Sai số trong bước này rất lớn, đôi khi quyết định sự thành bại của kết quả

Một vài loại phương pháp chiết được sử dụng thường xuyên trong phân tích độc chất như chiết lỏng-lỏng (LLE), chiết pha rắn (SPE), vi chiết pha rắn (SPME) và chiết pha rắn siêu phân tử (MISPE) Hiện nay, phương pháp thuận tiện nhất để chiết ma túy trong dịch sinh học là SPE do đơn giản và linh hoạt hơn LLE vì LLE là phương pháp tiêu thụ dung môi nhiều [17]

1.2.2 Phương pháp chiết SPE

Chiết pha rắn là phương pháp phổ biến trong chiết tách các mẫu đơn giản ứng dụng các kỹ thuật phân tích cụ thể cho dịch sinh học trong phân tích hóa học Đây là một kỹ thuật rất đơn giản được sử dụng, giá thành không cao, cột dùng một lần và nó có sẵn với nhiều loại cột kích cỡ khác nhau Thành phần chiết pha rắn có sẵn trong ống, hôp và đĩa [17], [14]

Trong một vài năm trở lại đây, xu hướng sử dụng SPE thay thế LLE đang phát triển do những ưu điểm vượt trội có thể dễ dàng nhận thấy được thông qua thực nghiệm khi so sánh với LLE để chiết xuất được chất cần phân tích, chúng bao gồm:

- Tập trung hay làm giàu mẫu

- Loại các chất gây nhiễu

Ngoài ra, chiết pha rắn còn có các ưu điểm:

- Lượng dung môi dùng ít, do đó ít ảnh hưởng đến sức khỏe của kỹ thuật viên

- Có thể kết nối với GC hoặc HPLC, dễ dàng tự động hóa quá trình phân tích

- Có nhiều lựa chọn cột chiết, cơ chế cột chiết đa dạng, phù hợp với chất phân tích, do đó có tính chọn lọc tốt hơn [3]

1.2.2.1 Nguyên lý của phương pháp chiết pha rắn

Chuẩn bị mẫu với SPE bao gồm bốn bước cơ bản: hoạt hóa, nạp mẫu, tách và rửa giải Mục đích là để giữ lại các chất phân tích ở trên cột chất hấp thụ, rửa sạch nhiễu và cuối cùng rửa giải chất phân tích để thu được một lượng nhỏ dịch chiết sạch trước khi phân tích bằng phương pháp thích hợp như LC-MS, GC-MS

Về nguyên tắc, mẫu được nạp trên một cột SPE Nhiễu đi qua cột trong khi chất phân tích được giữ lại trên các vật liệu hấp thụ trong cột Nhiễu có thể được loại bỏ từ cột thông qua việc lựa chọn chính xác dung môi rửa Cuối cùng, các chất phân tích có thể được thu hồi chọn lọc từ các cột bằng dung môi rửa giải thích hợp Ngoài ra, có một loại cột chiết tách khác có thể được lựa chọn mà vẫn giữ được nhiễu trong mẫu, nhưng cho phép các chất phân tích đi qua không giữ lại [17]

1.2.2.2 Quy trình chiết

- Xử lý cột: bằng dung môi và dung dịch đệm thích hợp, để hoạt hóa cột nhằm

chuyển pha rắn sang trạng thái có thể lưu giữ chất phân tích

- Tách chất phân tích: mẫu trong dung dịch được cho qua cột, pha rắn sẽ lưu

giữ chất phân tích và một số tạp

- Loại tạp: dùng dung môi hoặc dung dịch đệm cho qua cột để loại một số tạp

đã được giữ lại trên pha rắn

- Rửa giải: dùng dung môi hay hỗn hợp dung môi thích hợp để đẩy chất phân

tích ra khỏi pha rắn, lấy dịch chiết và xác định bằng phương pháp thích hợp [3]

1.2.2.3 Các loại cột chiết pha rắn thông thường [3]

Nguyên liệu dể chiết pha rắn là dẫn chất Polysiloxan, polymer tạo ra pha liên kết, ngoài ra còn sử dụng cả pha không liên kết Pha liên kết gồm có pha thuận, pha đảo và trao đổi ion

 Chiết pha đảo

Nguyên liệu cho cột chiết pha rắn của pha đảo thường là dẫn chất của C18, C8, C2, cyclohexyl, phenyl Trong đó tương tác giữa chất phân tích và pha liên kết là lực Vanderwaals có năng lượng thấp, chất phân tích càng sơ nước càng có khuynh hướng nằm lại trên pha liên kết Quá trình rửa giải cũng đơn giản, chỉ cần một dung môi ít phân cực đủ để phá vỡ lực Vanderwaals, các dung môi thường dùng là methanol, acetonitril và ethyl acetat

 Chiết pha thuận

Nguyên liệu cho cột chiết pha rắn của pha thuận thường là cyano, amino, diol, silicagel Trong đó, tương tác lưu giữ chất phân tích trên pha thuận-pha phân cực bắt nguồn từ tương tác phân cực, đó là liên kết hydro, liên kết π-π hoặc tương tác lưỡng cực-lưỡng cực

 Trao đổi ion

Nguyên liệu chiết pha rắn của trao đổi ion là nhựa trao đổi ion

+ Trao đổi cation mạnh: Dẫn chất phenylsulfonic

+ Trao đổi anion mạnh: Dẫn chất amon bậc 4

Tùy tính chất của pha rắn mà cơ chế lưu giữ và rửa giải cũng khác nhau Đối với chiết pha rắn trao đổi ion, lực tương tác giữa chất phân tích và pha liên kết là lực hút tĩnh điện

 Chế độ chiết pha rắn hỗn hợp (mixed-mode)

Kĩ thuật chiết pha rắn đặc biệt là chế độ mixed-mode được sử dụng rộng rãi trên thế giới để xử lý các mẫu sinh học Thuật ngữ mixed-mode hàm chứa

sự kết hợp giữa các cơ chế phân bố, thường là pha đảo và trao đổi cation Trong chế độ này, chất phân tích và chất gây nhiễu cùng liên kết với pha rắn nhưng chất phân tích được liên kết với pha rắn bằng hai loại tương tác: tương tác Vanderwaals và tương tác tĩnh điện, trong khi đó chất gây nhiễu ở lại trên cột chỉ tham gia tương tác Vanderwaals, dùng một dung môi rửa chất gây nhiễu bằng cách cắt đi các liên kết Vanderwaals, chất phân tích còn lại trên cột sẽ được rửa giải ra sau đó bằng dung môi thích hợp Nguyên liệu cho chế

độ chiết pha rắn hỗn hợp cũng được tạo nên nhờ sự kết hợp của pha đảo (C8 hoặc C18) và các nhóm trao đổi cation mạnh

1.2.3 Phương pháp chiết pha rắn ketamin trong nước tiểu

Thừa kế quy trình chiết pha rắn ketamin đã được xây dựng tại Viện Pháp y Quốc gia Các bước và cơ chế phân tách và cô lập chất phân tích được thể hiện cụ thể như sau:

- Bước 1: hoạt hóa cột bằng dung môi hữu cơ (MeOH) và dung môi đệm

(đệm phosphat 0,1M; pH 6), đưa mẫu lên cột, rửa cột bằng nước đã loại ion

- Bước 2: khóa cột bằng acid HCl 0,1M, acid sẽ giúp tạo liên kết ion giữa nitơ

của ketamin và nhóm sulfonic của chất hấp phụ

- Bước 3: cắt và rửa trôi các liên kết Vanderwaals bằng MeOH, do đó các

chất gây nhiễu sẽ bị loại bỏ, chất phân tích nằm lại trên cột

- Bước 4: rửa giải bằng dung môi thích hợp để cắt liên kết ion của chất phân

tích và chất hấp phụ

1.3 Tổng quan về sắc kí khí khối phổ (GC-MS)

1.3.1 Khái niệm

Sắc ký khí (GC) là một phương pháp tách các chất từ một hỗn hợp ở thể khí bay hơi với pha động là một chất khí thường là khí trơ

Khối phổ (MS) là một kỹ thuật dựa trên việc đo tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) để cung cấp thông tin định tính xác định cấu trúc và định lượng các chất Kỹ thuật này là một kỹ thuật phân tích mạnh được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau để xác định các chất vô cơ và hữu cơ [3]

Sự kết hợp hai kỹ thuật trên, GC và MS, đã cho ra đời kỹ thuật sắc ký khí khối phổ GC-MS Phương pháp GC-MS sử dụng kỹ thuật GC để tách các chất và MS để phát hiện chúng với detector MS nhờ đó phát huy được ưu điểm của cả hai phương pháp, phát triển và mở rộng ứng dụng của hai kỹ thuật này [6]

1.3.2 Hệ thống GC – MS

 Sơ đồ máy sắc ký khí khối phổ gồm các bộ phận sau [3]:

- Pha động: Khí mang đưa mẫu đi qua cột

- Pha tĩnh: Cột sắc kí đặt trong cột

- Hệ thống tiêm mẫu: Đưa mẫu vào cột

- Detector: Phát hiện chất phân tích trong mẫu

- Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

1.3.2.1 Hệ cấp pha động

Pha động trong sắc ký khí hay còn gọi là khí mang giữ vai trò vận chuyển chất phân tích qua cột Khí mang thường là khí có phân tử lượng nhỏ,

phải đảm bảo yêu cầu trơ về mặt hóa học, đảm bảo tinh khiết và phù hợp với từng loại detector Một số loại khí mang thường dùng như heli, nitơ, hydro, argon…

Với cột nhồi thường dùng nhất là heli và nitơ Heli thường cho pic hẹp hơn (do chuyển khối nhanh hơn) Với cột mao quản thường dùng heli hoặc hydro Các khí cần phải thật tinh khiết, thường cho qua các chất hấp phụ thích hợp (than hoạt, rây phân tử) để loại hơi nước và các tạp chất (không khí hoặc oxy, hydrocarbon…)

1.3.2.2 Buồng tiêm mẫu

Mẫu phân tích lỏng hoặc khí được tiêm nhanh vào dòng pha động với một lượng vừa đủ bằng bơm tiêm nhỏ (microsyringe) hoặc van tiêm mẫu (sampling salve) Nếu tiêm mẫu dư thì pic sắc kí giãn rộng, độ phân giải kém

Có nhiều kỹ thuật tiêm mẫu khác nhau Với cột mao quản thường dùng 3 kỹ thuật tiêm mẫu sau:

- Kỹ thuật tiêm chia dòng (split): chia dòng khí mang 1:10 đến 1:100 để giảm

lượng mẫu vào cột (giảm 90% hoặc hơn) Thích hợp cho cột mao quản Độ nhạy của mẫu giảm vì chỉ một phần nhỏ vào cột

- Kỹ thuật không chia dòng (spitless): toàn bộ mẫu ngưng tụ ở đầu cột đã làm

lạnh, sau đó tăng nhiệt độ làm bay hơi mẫu Độ nhạy tăng nhưng có nguy cơ giãn rộng pic

- Kỹ thuật tiêm thẳng vào cột (on-column): mẫu được ngưng tụ ở đầu cột sau

đó làm bay hơi theo chương trình nhiệt độ Phương pháp này tăng độ nhạy,

giảm phân hủy mẫu do nhiệt

1.3.2.3 Cột và lò cột

Chương trình nhiệt độ cột của sắc ký khí là thông số rất quan trọng cần kiểm soát chính xác và lò cột đảm bảo nhiệm vụ điều nhiệt này Trong sắc ký

có hai loại cột: cột nhồi (packed column) và cột mao quản (capillary column) Ngày nay do nhiều ưu điểm nên người ta sử dụng phổ biến cột mao quản

1.3.2.4 Pha tĩnh

Pha tĩnh chủ yếu sử dụng là chất lỏng và được cố định trong cột cần

đảm bảo yêu cầu sau:

- Áp suất hơi thấp, tức là điểm sôi cao, ít nhất là cao hơn 100oC so với nhiệt

- Pha tĩnh phân cực thường có nhóm chức -CN, -CO, -OH

- Pha tĩnh không phân cực thường là dẫn chất dialkyl siloxan, hydrocarbon bão hòa

- Pha tĩnh rất phân cực như các polyol

- Phân cực trung bình: các hợp chất ether, ceton, aldehyd

Hiện nay có hai nhóm chất được dùng phổ biến để làm pha tĩnh cho sắc kí khí như: nhóm dẫn chất polydimethyl siloxan và nhóm polyethylen glycol

1.3.2.5 Detector khối phổ

- Detector khối phổ là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu

- Nguyên tắc hoạt động: Khối phổ được dùng để xác định một chất hóa học

dựa trên cấu trúc của nó Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc kí,

chúng đi vào đầu dò có dòng điện ion hóa (mass spectrometry) Khi đó, chúng

sẽ tấn công vào các luồng, chúng bị vỡ ra thành các mảnh vụn, những mạnh vụn này có thể lớn hoặc nhỏ Những mảnh vụn thực tế là các vật mang điện hay còn gọi là các ion và đi qua được bộ lọc Các khối nhỏ chắc chắn, khối của mảnh vỡ được chia bởi các vật mang gọi là tỷ lệ vật mang khối (m/z) Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến được detector Tất cả quá trình này diễn ra trong hệ chân không: áp suất hệ dao động từ 10-6 Pa đến 10-3 Pa Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại hành một khối phổ đồ hoặc khối phổ Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc

và nhận dạng các chất

 Detector khối phổ gồm có 5 bộ phận:

- Bộ nạp mẫu: đưa mẫu vào máy, là đầu ra của máy GC nối với máy khối phổ

- Bộ nguồn ion: ion hóa các nguyên tử, phân tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc

hơi

- Bộ phân tích khối: tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc tách

riêng nhờ tác dụng của từ trường và điện trường để đi đến detector

- Detector: có nhiệm vụ chuyển các ion đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ

điện tử của máy

- Bộ xử lý dữ liệu: tín hiệu từ detector được khuếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ

khối, định lượng…

 Trình bày dữ liệu

Khối phổ cho nhiều dạng dữ liệu Phổ biến nhất là phổ khối, trình bày trên

hệ trục: cường độ tương đối – trị số m/z

- Chế độ TIC: người ta chọn pic có cường độ mạnh nhất gọi là pic cơ bản chấp nhận là 100 để tính cường độ tương đối của các pic khác

- Chế độ SIM: chọn tín hiệu của một ion hoặc chế độ MIM chọn tín hiệu của một số ion đặc trưng của chất phân tích Phân tích định lượng hoặc bán định lượng được thực hiện theo đường chuẩn hoặc nội chuẩn

1.4 Các phương pháp xác định ketamin trong nước tiểu

Có một số quy trình phân tích để phát hiện và nhận dạng ketamin và các chất chuyển hóa của nó trong dịch sinh học Các phương pháp cụ thể được lựa chọn phụ thuộc vào một số yếu tố như khối lượng công việc, chi phí,

và sự sẵn có của thiết bị đo đạc, thời gian quay vòng, độ nhạy, độ đặc hiệu và

độ tin cậy [21]

1.4.1 Phương pháp miễn dịch

Hầu hết các phương pháp kiểm tra liên quan đến các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch Nguyên tắc của xét nghiệm miễn dịch dựa trên sự cạnh tranh giữa các kháng nguyên đánh dấu và không đánh dấu liên kết với kháng thể đặc hiệu Có rất nhiều loại xét nghiệm miễn dịch sử dụng để phân tích thuốc trong dịch cơ thể như xét nghiệm miễn dịch enzym (EIA), xét nghiệm huỳnh quang phân cực miễn dịch (FPIA) và miễn dịch phóng xạ (RIA) Ngày nay, nhân bản vô tính miễn dịch enzym (CEDIA) và thử nghiệm miễn dịch gắn enzym (ELISA) đang ngày càng phổ biến cho sàng lọc thuốc

Trong năm 2003, đã có một báo cáo trình bày về việc sử dụng ELISA

để sàng lọc ketamin Sau đó trong năm 2005, một bài viết đã được công bố liên quan đến việc sử dụng ELISA để phát hiện ketamin và norketamin trong nước tiểu khỉ ELISA đáp ứng với các hợp chất có cấu trúc liên quan đến ketamin trong khi GC-MS sẽ cho các chất phân tích ketamin cụ thể [28]

1.4.3 Sắc ký khí khối phổ (GC-MS)

Các phân tử thành phần của mẫu phân tích phân tách vào pha tĩnh theo

hệ số phân tách giữa chúng với pha tĩnh và pha động Khi ở trong pha tĩnh chúng sẽ không đi qua cột và vì vậy chất có hệ số phân tách cao di chuyển chậm hơn qua cột so với những người có hệ số phân tách thấp Nhiệt độ đóng một vai trò quan trọng trong tốc độ tách các chất phân tích trên GC, áp dụng cho các hợp chất ổn định và có thể dễ bay hơi tại nhiệt độ lên đến 350◦C Khi các chất tách, mở cột để chúng chảy vào khối phổ hoặc vào một máy dò như detector ion hóa ngọn lửa (FID) và dò bắt điện tử (ECD) [19], [12]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

+ Methanol, nước cất, đệm phosphat 0,1M; pH6, nước cất đã loại ion

+ Dung môi rửa giải ethyl acetat: methanol: amoniac tỷ lệ 80:18:2

+ Heptafloro butyric anhydrid

+ Bình nón, bình định mức, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh khác,

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

+ Mẫu nước tiểu trắng (không nhiễm ketamin) tại Khoa Hóa Pháp – Viện Pháp y Quốc gia

+ Mẫu nước tiểu tự tạo

+ Mẫu nước tiểu thực tế gửi tới giám định tại Khoa Hóa Pháp – Viện Pháp y Quốc gia

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng ketamin trong nước tiểu

2.2.1.1 Lựa chọn điều kiện sắc kí

Dựa theo quy trình sắc kí khí khối phổ được ghi nhận trong tài liệu

“Quy trình giám định pháp y” (2014) – Bộ Y Tế [4], tiến hành khảo sát các

mảnh phổ chuẩn để có điều kiện khối phổ phù hợp

2.2.1.2 Xây dựng phương pháp định lượng ketamin trong nước tiểu

 Chuẩn bị mẫu

- Chuẩn bị mẫu chuẩn, mẫu chuẩn nội và mẫu nhiễm ketamin

- Đưa ra quy trình xử lý mẫu chiết pha rắn

 Lựa chọn nội chuẩn

2.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng ketamin trong nước tiểu