Định lượng sildenafil trong một số viên nén trên thị trường bằng máy quang phổ cận hồng ngoại (NIR) cầm tay

Các phương pháp phân tích thông thường như sắc ký lớp mỏng TLC, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, sắc ký lỏng khối phổ LC_MS, quang phổ UV_Vis, IR …cho kết quả với độ chính xác cao, nhưng

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG SƠN HẢI

Mã sinh viên: 1101144

ĐỊNH LƯỢNG SILDENAFIL TRONG MỘT SỐ VIÊN NÉN TRÊN

THỊ TRƯỜNG BẰNG MÁY QUANG PHỔ CẬN HỒNG NGOẠI (NIR) CẦM TAY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG SƠN HẢI

Mã sinh viên: 1101144

ĐỊNH LƯỢNG SILDENAFIL TRONG MỘT SỐ VIÊN NÉN TRÊN

THỊ TRƯỜNG BẰNG MÁY QUANG PHỔ CẬN HỒNG NGOẠI (NIR) CẦM TAY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến ThS Đặng Thị

Ngọc Lan, người đã luôn tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi trong quá trình thực

hiện khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn DS Bùi Văn Trung đã chỉ bảo những kiến

thức thiết thực giúp tôi có thêm nhiều hiểu biết để hoàn thành tốt đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị Khoa Vật lý đo lường - Viện kiểm nghiệm thuốc TW đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi được học tập và thực tập tại Viện

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến toàn thể Quý thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt 5 năm học tập và rèn luyện tại trường

Cuối cũng tôi xin gửi lời cảm ơn đến bố mẹ, bạn bè, những người đã luôn bên cạnh và ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này

Mặc dù đã rất cố gắng để hoàn thành đề tài, song vẫn còn những hạn chế

và thiếu sót Tôi rất mong được nhận những ý kiến đóng góp, phê bình của Quý thầy cô và các anh chị

Xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016

Sinh viên Hoàng Sơn Hải

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Sildenafil 3

1.1.1 Công thức 3

1.1.2 Tính chất 3

1.1.3 Các dạng bào chế hay dùng và sản phẩm trên thị trường 4

1.1.4 Các phương pháp định tính, định lượng thông thường 4

1.2 Tổng quan về phương pháp quang phổ cận hồng ngoại 4

1.2.1 Lịch sử phát triển 4

1.2.2 Nguyên lý cơ bản của phương pháp quang phổ NIR 5

1.2.3 Các kỹ thuật đo phổ NIR 11

1.2.4 Thiết bị 13

1.2.5 Ưu nhược điểm của phương pháp quang phổ NIR 14

1.2.6 Ứng dụng phổ NIR trong ngành Dược 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị 19

2.2.1 Nguyên liệu 19

2.2.2 Thiết bị 20

2.3 Nội dung nghiên cứu 20

2.3.1 Xây dựng quy trình phân tích 20

2.3.2 Thẩm định quy trình phân tích 21

2.3.3 Khảo sát định lượng một số chế phẩm trên thị trường 21

2.4 Phương pháp tiến hành 21

2.4.1 Xây dựng quy trình phân tích 21

2.4.2 Thẩm định quy trình phân tích 23

2.4.3 Ứng dụng phân tích thuốc trên thị trường 24

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Xây dựng quy trình phân tích 25

3.1.1 Chế tạo các viên nén mô hình 25

3.1.2 Thiết lập đường tuyến tính cho các viên nén mô hình mỗi mẫu phân tích 29

3.2 Thẩm định quy trình phân tích 32

3.2.1 Thẩm định độ tuyến tính 32

3.2.2 Thẩm định độ đặc hiệu 32

3.2.3 Thẩm định độ đúng 33

3.2.4 Thẩm định độ lặp lại 35

3.2.5 Độ chính xác trung gian 38

3.3 Ứng dụng phân tích thuốc trên thị trường 40

3.4 Bàn luận 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

AOTF Acousto-optic tunable filter Bộ phận điều tiết quang

âm

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Coupled Mass Spectroscopy

Sắc ký lỏng- khối phổ

NIRS Near Infrared Spectroscopy Phổ cận hồng ngoại

NIDQC National Institute of Drug

UV-Vis Ultraviolet-Visible Tử ngoại- khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Ứng dụng phổ NIR trong ngành Dược 16

Bảng 2.1 Thông tin các mẫu thử nghiên cứu 19

Bảng 2.2 Các tá dược sử dụng trong quá trình nghiên cứu 20

Bảng 3.1 Thành phần viên Activ-gra không bao 25

Bảng 3.2 Lượng dược chất và placebo cân trong quá trình xây dựng viên mô hình Activ-gra 26

Bảng 3.3 Thành phần viên Siloflam-50 không bao 27

Bảng 3.4 Lượng dược chất và placebo cân trong quá trình xây dựng viên mô hình Siloflam-50 27

Bảng 3.5 Thành phần cho viên Majegra-50 không bao 28

Bảng 3.6 Lượng dược chất và placebo cân trong quá trình xây dựng viên mô hình Majegra-50 29

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp NIRS với các mẫu phân tích 33

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp NIRS đối với viên nén mô hình Activ-gra 34

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp NIRS đối với viên nén mô hình Siloflam-50 34

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp NIRS đối với viên nén mô hình Majegra-50 35

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp NIRS với mẫu Activ-gra 36

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp NIRS với mẫu Siloflam-50 37

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp NIRS với mẫu Majegra-50 37

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp NIRS với mẫu Activ-gra 38 Bảng 3.15 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp NIRS với mẫu Siloflam-50 39 Bảng 3.16 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp NIRS với mẫu Majegra-50 40 Bảng 3.17 Kết quả định lượng 3 mẫu thuốc trên thị trường 41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo và cấu trúc phân tử của Sildenafil 3

Hình 1.2 (a,b,c) Mô hình các kiểu dao động hóa trị của phân tử 6

Hình 1.3 (a,b,c) Mô hình các kiểu dao động uốn của phân tử 7

Hình 1.4 Giản đồ phân bố thế năng dao động trong phân tử 8

Hình 1.5 Phổ MIR đo bằng ATR và phổ NIR đo bằng phản xạ khuếch tán của Magie stearat 10

Hình 1.6 Máy quang phổ NIR đo truyền qua 13

Hình 1.7 Máy quang phổ NIR đo phản xạ 13

Hình 1.8 Phân tích phổ NIR xuyên qua bao bì 16

Hình 1.9 Phân tích hàng loạt viên trên dây chuyền sản xuất bằng NIR 16

Hình 2.1 Sơ đồ dập viên 22

Hình 2.2 Thiết bị NIR 23

Hình 3.1 Tuyến tính của viên nén mô hình Activ-gra 30

Hình 3.2 Tuyến tính của viên nén mô hình Siloflam-50 31

Hình 3.3 Tuyến tính của viên nén mô hình Majegra-50 32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xã hội càng phát triển nhu cầu chăm sóc sức khỏe càng được chú trọng

Do vậy các thuốc mới liên tục được nghiên cứu và cho ra đời nhằm đáp ứng nhu cầu của người bệnh Nhưng cùng với đó tình trạng sản xuất thuốc giả, thuốc kém chất lượng cũng trở nên phổ biến và đang trở thành một vấn nạn của xã hội

Năm 1998, hoạt chất Sildenafil với tên biệt dược là Viagra được FDA công nhận là thuốc điều trị rối loạn cương dương (ED) đầu tiên trên thế giới Rối loạn cương dương ảnh hưởng khá lớn tới chất lượng cuộc sống của các gia đình, thường xuất hiện ở tuổi trung niên vì vậy nhu cầu sử dụng thuốc chứa Sildenafil ngày càng cao Bên cạnh đó, giá thành của những dược phẩm này rất đắt, đặc biệt là các sản phẩm thuốc ngoại cao hơn nhiều lần so với thuốc nội Chính vì vậy, chúng ta đang phải đối mặt với việc làm giả, làm nhái tạo ra các sản phẩm chứa Sildenafil không đạt chất lượng, làm ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh Trong báo cáo thường niên của hội đồng dược điển Mỹ (USP) năm 2007 đã nêu

rõ rằng “trộn Sildenafil và dẫn chất” trở thành vấn đề mang tính toàn cầu [21]

Các phương pháp phân tích thông thường như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng khối phổ (LC_MS), quang phổ UV_Vis, IR …cho kết quả với độ chính xác cao, nhưng tốn rất nhiều thời gian, chi phí để phân tích và rất khó có thể kiểm soát hết được chất lượng của tất cả các thuốc trên thị trường

Trước thực trạng trên, việc tìm ra những phương pháp có thể phân tích nhanh để kiểm soát được chất lượng của các thuốc trên thị trường, nhất là những thuốc có nguy cơ bị làm giả cao như Sildenafil là vấn đề cấp thiết

Cùng với sự phát triển của khoa học, kỹ thuật, phương pháp quang phổ cận hồng ngoại ngày càng được ứng dụng rộng rãi, đặc biệt ở một số nước như

Mỹ, Pháp, Singapore nó đã trở thành một trong những công cụ hữu hiệu để định lượng các chế phẩm thuốc trên thị trường

Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại được biết đến là kỹ thuật mới mang những ưu điểm như phân tích nhanh, ít phá hủy mẫu, ít phải chuẩn bị mẫu, không tốn dung môi, hóa chất, không độc hại có thể đáp ứng được các nhu cầu

cấp thiết trên

Sau quá trình tìm hiểu, tôi đã chọn đề tài:―Định lượng Sildenafil trong một

số viên nén trên thị trường bằng máy quang phổ cận hồng ngoại (NIR) cầm tay‖

làm đề tài cho báo cáo khóa luận tốt nghiệp của mình Đề tài có 3 mục tiêu như sau:

1 Xây dựng được quy trình định lượng Sildenafil

2 Thẩm định quy trình định lượng đã xây dựng

3 Ứng dụng phân tích một số chế phẩm trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Sildenafil

1.1.1 Công thức

Tên khoa học: methyl-3-n-propyl-1,6-dihydro-7H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-7-one [13]

5-[2-ethoxy-5-(4-methylpiperazinnylsulfonyl)phenyl]-1-Tên khác: d]pyrimidin -5-yl)-4-ethoxyphenyl]sulfonyl]-4-methylpiperazine [13]

Sildenafil

Hình 1.1 Công thức cấu tạo và cấu trúc phân tử của Sildenafil

Công thức phân tử: C22H30N6O4S

Khối lượng phân tử của Sidenafil: 474,6 g/mol

Khối lượng phân tử của Sildenafil citrate: 666,7 g/mol

- Tồn tại ở dạng muối liên kết với acid citric (C22H30N6O4S.C6H8O7) [13]

1.1.3 Các dạng bào chế hay dùng và sản phẩm trên thị trường

- Dạng viên nén bao phim là chủ yếu

- Các sản phẩm chứa Sildenafil lưu hành trên thị trường:

+ Viagra 25mg, 50mg, 100mg

+ Activ-gra, Siloflam-50, Majegra-50

1.1.4 Các phương pháp định tính, định lượng thông thường

- Định tính: Phương pháp phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại của mẫu thử phải phù hợp với phổ chuẩn của Sildenafil citrate

hoặc với phổ của Sildenafil citrate chuẩn [3], [23]

- Định lượng: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [3], [23]

Dung môi pha mẫu: Pha động

1.2 Tổng quan về phương pháp quang phổ cận hồng ngoại

1.2.1 Lịch sử phát triển

Phổ cận hồng ngoại được biết đến từ đầu thế kỷ XIX, nhưng do sự phát triển mạnh mẽ suốt một thời gian dài của phổ UV-VIS và phổ hồng ngoại giữa (MIR), gần đây là sự bùng nổ của công nghệ quang phổ Raman mà phổ NIR hầu như bị lãng quên Khoảng 30 năm trở lại đây, nhờ sự cải tiến về công nghệ của thiết bị NIR và hỗ trợ đắc lực của phần mềm phân tích, vai trò quan trọng của

phổ NIR đã dần được phát huy [5] Đã có nhiều nghiên cứu được công bố cho thấy phổ NIR không chỉ là công cụ phân tích thường quy mà còn là công cụ nghiên cứu quan trọng Nó cung cấp những thông tin quan trọng và có những ứng dụng mà không thể có được từ bất kỳ phương pháp phân tích nào khác

1.2.2 Nguyên lý cơ bản của phương pháp quang phổ NIR

Bức xạ cận hồng ngoại (NIR) là các bức xạ có bước sóng từ 780 nm đến

2500 nm nằm trong vùng hồng ngoại [3], [5], [23] Phổ cận hồng ngoại là phổ dao động phân tử, nó khác với phổ Raman và phổ hồng ngoại giữa (MIR) [8], [10] Để tìm hiểu chi tiết về phổ NIR, chúng ta cùng tìm hiểu về mô hình dao động của các nguyên tử trong phân tử

Các liên kết trong phân tử có các kiểu dao động như sau:

+ Dao động duỗi (Hình 1.2): Gồm dao động duỗi đối xứng và không đối

xứng Dao động duỗi làm thay đổi khoảng cách giữa các nguyên tử trong phân

tử

(a)

(b)

(c)

Hình 1.2 (a,b,c) Mô hình các kiểu dao động hóa trị của phân tử

+ Dao động uốn (Hình 1.3): Uốn trong mặt phẳng và ngoài mặt phẳng Dao động uốn làm thay đổi góc liên kết giữa các nguyên tử trong phân tử

(a)

(b)

(c)

Hình 1.3 (a,b,c) Mô hình các kiểu dao động uốn của phân tử

Trong phân tử, dao động của các nguyên tử cũng tồn tại ở các trạng thái khác nhau, được xếp theo bậc dựa vào các mức năng lượng mà chúng tồn tại [4], [7], [10] Ở điều kiện thường, chúng dao động ở trạng thái cơ bản (bậc 0) và

càng lên bậc cao, năng lượng dao động của phân tử càng lớn

Khi khoảng cách giữa hai nguyên tử (khối lượng lần lượt m 1 và m 2 ) trong

liên kết là r e , tần số dao động của liên kết được cho bởi công thức:

√Trong đó

và k là hệ số đàn hồi của liên kết

Năng lượng dao động thực tế của phân tử được ngoại suy từ phép tính gần đúng của phương trình Schrodinger, được gọi là phương trình thế năng Morse Biểu diễn phương trình thế năng ấy dưới dạng số sóng như sau:

( ) ( ) ( ) ( )

Ở phương trình trên, là tần số góc dao động tương ứng với trạng thái

mà khoảng cách hai nguyên tử là re; là số thứ tự của bậc năng lượng đang xét;

là các hằng số, trong đó

Khi làm gần đúng thêm bước nữa, bỏ bớt số hạng thứ ba, phương trình có

dạng là:

( ) ( ) ( )Đây là phương trình gần đúng của biểu thức thế năng dao động của phân

tử hay được sử dụng nhất trong các tài liệu [5], [10]

Giản đồ phân bố năng lượng như sau:

Hình 1.4 Giản đồ phân bố thế năng dao động trong phân tử

Từ giản đồ trên trên ta thấy, khi tương tác với các bức xạ NIR thích hợp, phân tử sẽ hấp thụ một phần năng lượng để chuyển lên trạng thái dao động cao hơn, kết quả là tạo nên các dải dịch chuyển trên phổ đồ của chất phân tích Các chuyển dịch xảy ra từ mức năng lượng cơ bản (bậc 0) lên trạng thái dao động bậc

1 thì gọi là các dải chuyển dịch cơ bản Các dịch chuyển xảy ra giữa trạng thái dao động cơ bản và các mức năng lượng có bậc cao hơn (từ bậc 2 trở lên) thì

được gọi là các overtone [5], [9], [10]

Các dao động rung lắc, uốn và xoay dễ xảy ra hơn các dao động dọc theo trục và chúng cần năng lượng nhỏ hơn năng lượng tạo các overtone Các bức xạ trong vùng MIR và FIR tạo nên các dịch chuyển cơ bản Bức xạ vùng FIR có bước sóng dài, năng lượng yếu, ít làm thay đổi trạng thái dao động, có chăng chỉ làm thay đổi được các trái thái rung lắc đơn giản Phổ FIR ít được ứng dụng

trong phân tích [10]

Các bức xạ vùng MIR có năng lượng phù hợp với nhiều loại liên kết nên rất dễ bị hấp thụ, cường độ các dải hấp thụ lớn Mỗi liên kết hấp thụ một dải sóng đặc trưng khác nhau và tách biệt nhau rõ ràng Vì thế, mỗi dải trong phổ MIR đặc trưng cho từng kiểu dao động khác nhau của mỗi liên kết khác nhau Tập hợp các dải ấy (phổ MIR) đặc hiệu cho một chất khác nhau Trong phân tích, phổ MIR được xem là phổ vân tay để xác định các chất Phân tích phổ MIR

còn có thể xác định được cấu trúc phân tử các chất phân tích

Đối với các bức xạ trong vùng NIR, do có năng lượng lớn nên khi tương tác với phân tử chất phân tích sẽ có hai khả năng xảy ra: Thứ nhất, làm thay đổi trạng thái dao động phân tử từ cơ bản lên các bậc cao 2,3,4… tạo nên overtone; thứ hai, làm các dao động cơ bản khác nhau trong phân tử xảy ra đồng thời Bởi vậy, phổ NIR chính là sự kết hợp của các dải dịch chuyển bội tần và các dải dịch

chuyển cơ bản Các dải phổ trong vùng NIR có sự chồng chập lên nhau nên hình dáng phổ tù, không tách biệt được các dải hấp thụ cho từng kiểu liên kết Thêm vào đó, cường độ phổ NIR là thấp hơn rất nhiều so với phổ MIR nên so với phổ

MIR và phổ Raman, phổ NIR có độ đặc hiệu không cao [2], [5], [9]

Overtone thường xảy ra ở các bước sóng ngắn trong vùng NIR và đặc trưng cho các liên kêt X-H (cụ thể là C-H, S-H, N-H và O-H) Overtone bậc càng cao thì càng khó xảy ra hơn, cường độ phổ hấp thụ càng yếu hơn Trên phổ NIR, overtone có cường độ thấp hơn từ 10 đến 1000 lần so với cường độ của các dải

bì trong suốt như thủy tinh, polymer… tạo nên các ưu việt của phổ NIR [7]

Các ứng dụng phổ NIR sẽ tiếp tục được trình bày ở các phần tiếp theo

1.2.3 Các kỹ thuật đo phổ NIR

Có ba kỹ thuật đo phổ NIR đó là: Truyền qua, phản xạ truyền qua và phản

xạ khuếch tán [4], [16], [19]

Kỹ thuật đo truyền qua và phản xạ truyền qua có cùng bản chất, đều dựa trên việc xác định tỉ lệ cường độ của chùm bức xạ trước và sau khi truyền qua mẫu phân tích Tỉ lệ ấy phụ thuộc vào độ hấp thụ riêng của phân tử ε, nồng độ

chất phân tích C và quang trình l khi bức xạ đi qua mẫu Chúng tuân theo định

luật Lambert – Beer:

sử dụng [16], [19]

Trong kỹ thuật đo phản xạ khuếch tán, người ta xây dựng phổ dựa trên tỷ

lệ R của cường độ ánh sáng sau khi phản xạ qua mẫu đo I với cường độ ánh sáng phản xạ qua bề mặt nền chuẩn hoặc nền mẫu I R :

Khi thâm nhập vào chất phân tích, bức xạ NIR truyền một phần năng lượng làm thay đổi trạng thái dao động của phân tử Phần năng lượng còn lại được truyền đến detector Sự chênh lệch cường độ giữa ánh sáng phản xạ bởi nền mẫu

và ánh sáng phản xạ thu được từ mẫu phân tích tạo nên “độ hấp thụ giả”

log 10 (1/R) ở từng bước sóng tương ứng [5], [23] Phổ đồ được xây dựng từ sự

thay đổi “độ hấp thụ giả” theo bước sóng của mẫu phân tích được gọi là phổ NIR của chất ấy

So với các kỹ thuật trên, kỹ thuật đo phản xạ khuếch tán đang cho thấy nhiều ưu thế:

● Thứ nhất, phép đo phản xạ khuếch tán không phụ thuộc vào độ dày, quang trình của chất phân tích mà chỉ phụ thuộc vào bản chất và tỉ lệ của chất phân tích trong mẫu phân tích Đối với các mẫu đo rắn, người ta chiếu trực tiếp bức xạ NIR vào mẫu để đo Đối với các mẫu lỏng, người ta thiết kế thêm các hạt nhỏ phản xạ ánh sáng để cho vào dung dịch (quicksand), bức xạ NIR khi chiếu vào dung dịch, sau khi tương tác với chất phân tích ở dạng dung dịch, tín hiệu đầu ra được phản xạ lại và vẫn mang thông tin về chất phân tích Điều này giúp chúng ta có thể phân tích nhanh mà không cần hoặc rất ít phải chuẩn bị mẫu trong quá trình phân tích, tiết kiệm thời gian, chi phí, không cần nhiều phụ kiện trợ giúp (cu vét, cốc đo…), giảm sai số do các yếu tố ngoại lai và tăng độ chính xác của phép đo [16], [19]

● Thứ hai, các phần mềm phân tích phổ hiện nay sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu từng phần tại nhiều bước sóng (Partial least square - PLS), phương pháp phân tích cấu tử chính (Principal component analysis - PCA) cho phép định lượng được các thành phần chất phân tích dựa vào sự thay đổi tỉ lệ đáp ứng của nó trong nền mẫu Khi thay đổi nồng độ chất phân tích, tỉ lệ “độ hấp

thụ” của nền mẫu và của chất phân tích tại các điểm khác nhau cũng thay đổi theo Dựa vào sự thay đổi ấy, chúng ta có thể thiết lập được đường chuẩn từ phổ chất phân tích và nồng độ tương ứng Khi có sự thay đổi về điều kiện đo, tỉ lệ cường độ giữa các đỉnh vẫn không thay đổi nhiều nên đường chuẩn được xây dựng khá chính xác, ít bị ảnh hưởng bởi các thay đổi nhỏ trong quá trình đo Sử dụng đường chuẩn ấy, chúng ta đo phổ của chất phân tích và có thể xác định được ngay hàm lượng của chất phân tích trong mẫu [16], [19]

1.2.4 Thiết bị

1.2.4.1 Nguyên tắc cấu tạo

Về cơ bản, máy quang phổ NIR cấu tạo bởi các bộ phận sau: Nguồn sáng,

hệ quang, bộ phận đựng mẫu và detector Tùy theo kiểu đo mà vị trí của detector

được bố trí khác nhau như hình dưới [7]

Hình 1.6 Máy quang phổ NIR đo truyền qua

Hình 1.7 Máy quang phổ NIR đo phản xạ 1.2.4.2 Nguyên tắc hoạt động

Nguyên tắc hoạt động chung của máy quang phổ NIR cũng tương tự như máy quang phổ MIR Chùm tia sáng từ nguồn đi vào hệ quang được tách thành các dải phổ đơn sắc hoặc được biến điệu thành các đặc trưng riêng cho mỗi loại tia đơn sắc Sau khi qua hệ quang, bức xạ này được chia làm hai phần bằng gương bán mạ hoặc gương quay Một phần các bức xạ này tiếp tục tới và tương tác với mẫu phân tích, phần còn lại tới thẳng detector Bằng cách ghi nhận, số hóa và so sánh tín hiệu tới trực tiếp và tín hiệu sau tương tác, người ta thiết lập nên phổ NIR của các chất phân tích Các phần mềm hiện nay cho phép xử lý phổ sau phân tích, xây dựng thư viện phổ chuẩn, so sánh phổ để định tính và có các thuật toán riêng để thiết lập phương pháp định lượng các thành phần mẫu phân

tích [5], [7], [9]

1.2.5 Ưu nhược điểm của phương pháp quang phổ NIR

1.2.5.1 Ưu điểm

Phổ NIR có năng lượng lớn, có thể đi sâu vào trong mẫu phân tích, mang

đủ thông tin của chất phân tích, đảm bảo được sự đồng đều bên trong mẫu phân

tích [14], [19]

Bằng kỹ thuật đo phản xạ khuếch tán, có thể đo mẫu trực tiếp, không cần phá hủy mẫu, tiết kiệm thêm thời gian phân tích, đặc biệt có thể kiểm soát chất

lượng thuốc ngay trong quy trình sản xuất kín

Thời gian phân tích nhanh (không quá 30 giây), giúp phân tích được nhiều

mẫu, rất hiệu quả trong công tác sàng lọc nhanh thuốc giả [14], [19]

Vừa có thể ứng dụng định tính, vừa có thể ứng dụng định lượng trực tiếp

các mẫu cần phân tích

Đo được nhiều dạng mẫu, nhiều dạng bào chế khác nhau,giới hạn phát

hiện thấp

So với phương pháp phổ MIR, phổ NIR ít bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi

trường hơn nên độ ổn định của phép phân tích cao hơn

So với phương pháp phổ UV-VIS, phổ NIR đặc hiệu hơn Phổ UV chỉ đo được dung dịch lỏng ở nồng độ thích hợp, phổ NIR có thể đo trực tiếp mẫu mà không cần hoặc rất ít chuẩn bị mẫu, xác định được các mẫu có hàm lượng lớn,

đo được cả chất rắn, bột, lỏng, hỗn dịch

So với phương pháp quang phổ Raman, do điểm thu phổ có kích thước lớn hơn nên thông tin thu được từ chất phân tích có tính đồng đều cao nên phép định tính mang đầy đủ thông tin hơn, phép định lượng chính xác hơn Phép định lượng mẫu rắn bằng phương pháp NIRS chính xác hơn phép định lượng bằng

phương pháp quang phổ Raman [14], [19]

phân tích sau đó mới đảm bảo được [14], [19]

Cần phải căn chỉnh lại máy trước khi tiến hành định lượng để cho kết quả chính xác

1.2.6 Ứng dụng phổ NIR trong ngành Dược

Phổ NIR được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như y tế, thực phẩm, công nghệ sinh học… và trong ngành dược, phổ NIR cũng đóng góp một vai trò quan trọng [6], [12] Từ bản chất phổ và kỹ thuật đo phổ, phương pháp phân tích phổ NIR có một số ứng dụng điển hình sau:

Bảng 1.1.Ứng dụng phổ NIR trong ngành Dược

Hình 1.8 Phân tích phổ NIR xuyên

qua bao bì

Hình 1.9 Phân tích hàng loạt viên trên dây chuyền sản xuất bằng NIR

1.2.6.1 Định tính

Do phổ NIR có độ đặc hiệu không cao nên trong định tính, người ta khó

có thể dựa vào phổ của thành phẩm để xác định được xem nó có chứa dược chất cần tìm hay không mà thường chỉ so sánh các mẫu có sự tương đồng cao về tính chất với nhau mà thôi Ví dụ, so sánh phổ của nguyên liệu với nguyên liệu, dung dịch với dung dịch, thành phẩm với thành phẩm để xem sản phẩm đã cho có đúng là sản phẩm mình dự đoán hay không Muốn định tính được chính xác

thường phải kết hợp đồng thời với một phương pháp khác Giá trị chấp nhận của

hệ số tương đồng phổ để có thể khẳng định được sự giống nhau giữa mẫu chuẩn

và mẫu thử tùy thuộc vào loại mẫu và tùy thuộc vào yêu cầu của người sử dụng

[17], [24], [25]

1.2.6.2 Định lượng

Nguyên tắc của việc định lượng là: Thiết lập đường chuẩn từ sự đáp ứng phổ của chất phân tích ở các nồng độ khác nhau, sau đó đo phổ mẫu cần phân tích để dựa vào đường tuyến tính đưa ra kết quả về nồng độ hoặc hàm lượng của

mẫu phân tích [20], [22], [24]

Các bước tiến hành định lượng như sau:

- Kiểm tra thiết bị, kiểm tra điều kiện môi trường

- Lựa chọn điều kiện đo (tương tự phần định tính)

- Tạo ra các viên mô hình có hàm lượng thay đổi xung quanh hàm lượng

mẫu thử

- Đo phổ các viên mô hình và thiết lập đường tuyến tính bằng các phần mềm chuyên dụng: Bình phương tối thiểu (PLS), phân tích cấu tử chính (PCA)

hoặc hồi quy truyến tính nhiều điểm (MLR)

- Đo phổ mẫu thử, sử dụng đường tuyến tính để xác định hàm lượng thành

phần cần phân tích trong mẫu đo

- Trong quá trình thiết lập đường chuẩn cần chú ý một số vấn đề sau:

+ Chọn khoảng phổ thích hợp: Nên chọn khoảng phổ mà đáp ứng của chất phân tích là tốt nhất Có thể chọn bằng cách so sánh phổ chất phân tích với phổ nền mẫu hoặc bằng đạo hàm bậc 2, bậc 3 của phổ chất phân tích

+ Lựa chọn số điểm (factor) cũng vô cùng quan trọng Các phần mềm chuyên dụng sẽ tự động lựa chọn các điểm để dựa vào đó thiết lập đường chuẩn

Nếu chọn số điểm ít quá độ chính xác của phép đo không được đảm bảo, nếu chọn số điểm nhiều quá thì các điểm đáp ứng thấp có thể gây sai số lớn làm ảnh hưởng đến dẫn đến sai số tuyến tính giả cho phép đo

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng Sildenafil trong các mẫu thuốc Activ-gra, Siloflam-50, Majegra-50 bằng phương pháp quang phổ cận hồng ngoại

2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.2.1 Nguyên liệu

- Chất chuẩn: Sildenafil citrate (NIDQC, C22H30N6O4S.C6H8O7, 983,8 µg/mg (nguyên trạng), lô: WS 0110265)

- Mẫu thử: các chế phẩm viên nén có trên thị trường theo bảng 2.1

Bảng 2.1 Thông tin các mẫu thử nghiên cứu

lô

Ngày sản xuất/Hạn sử dụng

ltd/India

•VN-16039-12

•F501

23/11/2015 22/11/2017

- Tá dược:

Bảng 2.2 Các tá dược sử dụng trong quá trình nghiên cứu

2.2.2 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu: Máy quang phổ NIR, cân phân tích, chày, cối, máy dập viên

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng quy trình phân tích

Thu thập tài liệu trong nước và nước ngoài liên quan đến Sildenafil

Tham khảo phương pháp và kỹ thuật phân tích của các nước tiên tiến trên thế giới về phổ NIR và các ứng dụng của nó trong phân tích dược phẩm

Nghiên cứu cách thức sử dụng, triển khai phần mềm trên thiết bị: Hiệu chỉnh thiết bị, cách xác định phổ, xử lý số liệu, thiết lập đường chuẩn để định lượng Sildenafil

Khảo sát điều kiện đo

Đưa ra quy trình phân tích thuốc chứa Sildenafil

2.3.2 Thẩm định quy trình phân tích

Đánh giá: Độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, độ chính xác trung gian của quy trình vừa thiết lập theo tiêu chuẩn International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH)

2.3.3 Khảo sát định lượng một số chế phẩm trên thị trường

Khảo sát với 3 chế phẩm Activ-gra, Siloflam-50, Majegra-50

2.4 Phương pháp tiến hành

2.4.1 Xây dựng quy trình phân tích

2.4.1.1 Xây dựng các viên nén mô hình

- Với mỗi mẫu, xây dựng các viên nén mô hình có hàm lượng Sildenafil thay đổi xung quanh hàm lượng viên thực tế trên các nền placebo tương ứng Với mỗi hàm lượng chế tạo 05 viên có khối lượng khoảng 400mg

- Xây dựng 03 viên placebo cho mỗi mẫu phân tích

- Dập viên theo quy trình sau:

Hình 2.1.Sơ đồ dập viên 2.4.1.2 Định lượng Sildenafil citrat bằng phương pháp quang phổ cận hồng ngoại

- Thiết bị: