Nghiên cứu phương pháp xác định auramin o trong thức ăn chăn nuôi bằng LC MSMS

Từ yêu cầu quản lý trên, về mặt chuyên môn cần có các phương pháp phân tích đáng tin cậy với độ nhạy phù hợp để kiểm soát được lượng Auramin O có trong các mẫu thực phẩm cần giám sát.. -

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THU HÀ

MÃ SINH VIÊN: 1101139

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC

ĐỊNH AURAMIN O TRONG THỨC ĂN

CHĂN NUÔI BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

TS Trần Cao Sơn ThS Đặng Thị Ngọc Lan

Nơi thực hiện:

Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn của mình tới những người đã nhiệt tình dạy dỗ, giúp đỡ em trong thời gian qua

Trước hết em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Trần Cao Sơn, người đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt

quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này

Em cũng xin chân thành cảm ơn ThS Đặng Thị Ngọc Lan đã định hướng cho em trong quá trình tìm tài liệu cũng như góp ý hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích và Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, ban lãnh đạo cùng toàn thể cán bộ nhân viên Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian nghiên cứu để thực hiện đề tài

Cuối cùng, với tất cả lòng biết ơn sâu nặng em xin dành cho gia đình, bạn bè đã chăm sóc, cổ vũ, động viên em trong suốt quá trình học tập cũng như trong cuộc sống

Trong quá trình thực hiện đề tài, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết sức nhưng không tránh khỏi nhưng thiếu sót, em kính mong nhận được những ý kiến chỉ bảo và phê bình của quý thầy cô

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Phạm Thị Thu Hà

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ……… i

MỤC LỤC ……… ……ii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ………… ……… v

DANH MỤC CÁC BẢNG ……… ….vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ……… ….vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Auramin O 2

1.1.1.Khái quát chung 2

1.1.2 Cấu trúc, tính chất hóa lý 2

1.1.3.Độc tính 3

1.1.4.Các quy định về hàm lượng của Auramin O 4

1.2 Tổng quan phương pháp xác định Auramin O 4

1.2.1 Các phương pháp đã được thực hiện để xác định Auramin O 4

1.2.2 Phương pháp LC-MS/MS 8

1.2.2.1 Sắc kí lỏng (HPLC) 9

1.2.2.2 Khối phổ 10

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Nguyên vật liệu – trang thiết bị 13

2.2.1 Nguyên vật liệu 13

2.2.1.1 Chất chuẩn 13

2.2.1.2 Hoá chất, dung môi 13

2.2.2 Trang thiết bị 14

2.2.2.1 Thiết bị 14

2.2.2.2 Dụng cụ 14

2.3 Nội dung nghiên cứu 14

2.3.1 Khảo sát các điều kiện xác định chất màu AUO bằng LC-MS/MS 15

2.3.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 15

2.3.3 Thẩm định phương pháp 15

2.3.4 Ứng dụng phương pháp 15

2.4 Phương pháp nghiên cứu 15

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 16

2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu sơ bộ………16

2.4.3 Phương pháp chiết pha rắn……….16

2.4.4 Phương pháp thẩm định 18

2.4.4.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc 18

2.4.4.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng……… 18

2.4.4.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 19

2.4.4.4 Độ lặp lại và độ thu hồi 19

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 20

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Tối ưu hóa điều kiện tách và xác định AuO bằng LC-MS/MS 21

3.1.1 Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ 21

3.1.1.1 Lựa chọn ion phân tử và ion sản phẩm 21

3.1.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện MS 22

3.1.2 Lựa chọn các điều kiện sắc kí lỏng 23

3.1.2.1 Chọn pha tĩnh 23

3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động 23

3.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 25

3.2.1 Chọn quy trình xử lý mẫu 25

3.2.2 Khảo sát dung môi chiết 26

3.2.3 Khảo sát cột chiết pha rắn SPE 28

3.2.4 Khảo sát dung môi rửa giải 29

3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 31

3.3.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc 31

3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 32

3.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 34

3.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi 36

3.4 Kết quả xác định AUO trong một số mẫu TACN 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41

Kết luận 41

Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt

AOAC Association of Official

CAV Cell Accelerator Voltage Thế gia tốc màng

ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử FLD Fluoroscence detector Detector huỳnh quang

HLB Hydrophilic – lipophilic

HPLC High performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC-MS/MS Liquid chromatography tandem

mass spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ

2 lần

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SCX Strong Cation eXchange Trao đổi cation mạnh

SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn

TACN Thức ăn chăn nuôi TLC Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Giá trị giới hạn quốc tế của Auramin năm 2007 4

Bảng 1.2 Một số phương pháp xác định và định lượng Auramin O trong các nền mẫu khác nhau 5

Bảng 1.3 Một số phương pháp xác định Auramin O trong thực phẩm bằng LC-MS hoặc LC-MS/MS 7

Bảng 2.1 Số điểm IP cho các kỹ thuật phân tích 18

Bảng 3.1 Các điều kiện phân tích AUO bằng ESI(+)-MS/MS 21

Bảng 3.2 Các thông số tối ưu của MS đối với chế độ ion dương 23

Bảng 3.3 Chương trình gradient phân tích Auramin O 24

Bảng 3.4 So sánh các loại dung môi chiết đến diện tích pic của AUO 27

Bảng 3.5 Khảo sát cột SPE đến độ thu hồi của AUO 28

Bảng 3.6 Khảo sát tỷ lệ dung môi rửa giải 30

Bảng 3.7 Sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ trong dung môi 35

Bảng 3.8 Sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ trong nền mẫu……….35

Bảng 3.9 Độ lặp lại và thu hồi của AUO trên nền mẫu TACN 37

Bảng 3.10 Kết quả xác định hàm lượng AUO trong một số mẫu TACN tại Hà Nội 39

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Auramin O 3

Hình 1.2 Mô hình hệ thống LC-MS/MS 11

Hình 3.1 Sắc đồ các ion sản phẩm……….22

Hình 3.2 Sắc kí đồ dung dịch chuẩn AUO 50 ng/mL phân tích bởi các hệ gradient 25

Hình 3.3 Quy trình xử lý mẫu khảo sát 26

Hình 3.4 Sắc ký đồ AUO khi sử dụng các dung môi chiết khác nhau 27

Hình 3.5 Khảo sát các loại cột SPE 29

Hình 3.6 Quy trình xử lý mẫu tối ưu 31

Hình 3.7 Sắc đồ pic AUO ở mẫu thêm chuẩn, mẫu chuẩn và mẫu trắng 32

Hình 3.8 Sắc đồ AUO tại LOD 0,2 ng/mL ( tương đương 8 µg/kg trên mẫu) 33

Hình 3.9 Sắc đồ AUO tại LOQ 0,5 ng/mL ( tương đương 20 µg/kg trên mẫu) 33

Hình 3.10 Đường chuẩn AUO trong dung môi 36

Hình 3.11 Đường chuẩn AUO trong nềnmẫu……… 36

Hình 3.12 Sắc đồ phân tích lặp lại mẫu AUO nồng độ 25 ng/mL………38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm đang là một vấn đề nhận được sự quan tâm ngày càng lớn của xã hội và các cơ quan quản lý Trong những năm trở lại đây, việc sử dụng các chất cấm trong chăn nuôi gia súc, gia cầm đã gây nhiều bức xúc và là một vấn đề có nguy cơ tiềm tàng gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người Chính vì vậy, các cơ quan quản lý ngày càng đưa ra các yêu cầu giám sát gắt gao hơn

Chất Auramin O hay còn gọi là chất vàng ô được dùng phổ biến trong công nghiệp dệt may, sơn hay tạo màu trong ve quét tường hoặc để nhuộm màu vi khuẩn [25] Ở Việt Nam, các cơ quan chức năng của Bộ NN&PTNT

đã phát hiện được nhiều cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi trộn chất màu này vào trong thức ăn cho gà với mong muốn tạo màu vàng bắt mắt cho da và chân gà để dễ bán Khi người tiêu dùng ăn thịt gà thì sẽ hấp thụ luôn lượng Auramin O còn tồn dư, dẫn tới nguy cơ bất lợi cho sức khỏe và có thể gây ung thư [18] Chính vì vậy, từ 11/2015 Bộ NN&PTNN đã ban hành thông tư

bổ sung Auramin O vào danh mục các chất cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam [2]

Từ yêu cầu quản lý trên, về mặt chuyên môn cần có các phương pháp phân tích đáng tin cậy với độ nhạy phù hợp để kiểm soát được lượng Auramin

O có trong các mẫu thực phẩm cần giám sát Xuất phát từ nhu cầu thực tế và những đặc tính ưu việt của kỹ thuật LC-MS/MS trong phân tích, chúng tôi đã

tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phương pháp xác định Auramin O trong thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS” với 2 mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định Auramin O trong thức

ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS

2 Áp dụng phương pháp trên để xác định hàm lượng Auramin O trong một số mẫu thức ăn chăn nuôi trên thị trường

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Auramin O

1.1.1 Khái quát chung

Auramin O (dạng muối hydrochlorid) thuộc phân nhóm dẫn xuất ketoimin của nhóm thuốc nhuộm diphenylmethan Auramin được tổng hợp bằng cách nung nóng 4,4'- bis (dimethylaminodiphenyl) methan (Michler’s base; CAS N 101–61–1) với một hỗn hợp gồm ure, acid sulfamic và lưu huỳnh trong amoniac ở 175ºC Auramin sulfat hình thành trong phản ứng có thể sử dụng trực tiếp trong quá trình nhuộm hoặc có thể chuyển sang dạng Auramin base hay dạng muối hydrochlorid [20], [28] Sản xuất Auramin O diễn ra đầu tiên ở châu Âu nhưng hiện nay nó chỉ được sản xuất chủ yếu ở Ấn

Độ và Trung Quốc [13]

Thuốc nhuộm Auramin O được sử dụng phổ biến trong công nghiệp nhuộm da, nhuộm giấy, tạo màu sơn Ngoài ra Auramin O còn được dùng làm chất nhuộm màu huỳnh quang trong nhuộm nhanh vi khuẩn acid có trong đờm, mô nhiễm bệnh; kết hợp cùng thuốc nhuộm Rhodamin trong phép

nhuộm Auramin-Rhodamin để phát hiện các vi khuẩn Mycobacterium

tuberculosis [25]

Auramin O đã từng được sử dụng ở một số nước như một loại màu thực phẩm [10] Auramin O đã được phát hiện với một tỷ lệ nhỏ ở các mẫu thực phẩm từ Ấn Độ [30], bao gồm cả đậu Hà Lan tươi [24] Những năm gần đây, Auramin O cũng được tìm thấy trong nhiều mẫu thực phẩm ở các quốc gia như: Việt Nam và Trung Quốc [16]

1.1.2 Cấu trúc, tính chất hóa lý

 Tính chất hóa lý [15],[20]

- Tinh thể ánh kim, màu từ vàng nhạt đến vàng nâu

nghiên cứu ung thư thế giới IARC đã xếp Auramin O vào nhóm 2B là nhóm các chất hoặc hỗn hợp có thể gây ung thư cho người [18]

1.1.4 Các quy định về hàm lượng của Auramin O

Ở châu Âu, việc sản xuất Auramin và Auramin hydrochlorid phải tuân theo quy định của chỉ thị 2004/37/EC áp dụng cho các hoạt động mà người lao động phải tiếp xúc với chất gây ung thư hoặc các chất gây đột biến gen [11] Chỉ thị 2004/93/EC ngày 21 tháng 9 năm 2004 xếp Auramin và muối của nó vào nhóm không được có mặt trong các thành phần của mỹ phẩm [10]

Bảng 1.1 Giá trị giới hạn quốc tế của Auramin năm 2007 [14]

hạn-Ghi chú

Australia 0,08 aerosol có thể hít

phải

0,32 aerosol có thể hít phải

Hướng dẫn nồng độ

kĩ thuật (dựa trên tính khả thi) Thụy Sĩ 0,08

Ở Việt Nam, Auramin và các dẫn xuất đã bị cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm [2] Theo quy định của Bộ NN&PTNT, giới hạn phát hiện mà phương pháp thử cần phải đạt

để phân tích Auramin O trong thức ăn chăn nuôi là 1 mg/kg [3]

1.2 Tổng quan phương pháp xác định Auramin O

1.2.1 Các phương pháp đã được thực hiện để xác định Auramin O

Nghiên cứu xác định Auramin O được bắt đầu vào những năm 1970,

1980 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC và phương pháp sắc

ký lớp mỏng TLC Các nghiên cứu được tiến hành từ những năm 1990 đến

nay sử dụng phương pháp HPLC và khối phổ có độ nhạy cao hơn và chọn lọc hơn

Bảng 1.2 Một số phương pháp xác định và định lượng Auramin O trong các

nền mẫu khác nhau

Nền

mẫu

Xử lý mẫu, Đối tượng

lỏng với acid acetic

và nhựa trao đổi

anion lỏng, chiết

với ethyl acetact,

rửa ethyl acetat với

- Bước sóng 436

nm

LOD: 0,25 µg/mL R(%) : 95%

[22]

Nền

mẫu

Xử lý mẫu, Đối tượng

- Pha động:

Kênh A: MeOH Kênh B: H3PO4

0,03%

LOD: 0,25 µg/g R: 95-116%

với các dung môi

hữu cơ phân cực và

LOD: 0,05 µg/g LOQ: 0,125 µg/g R: 70,2-102,8 %

[26]

Do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, kỹ thuật LC-MS và LC-MS/MS đã được ứng dụng để nghiên cứu phân tích Auramin O trong các nền mẫu thực phẩm khác nhau Bảng 1.3 giới thiệu một số phương pháp xác định Auramin

O trong thực phẩm bằng LC-MS hoặc LC-MS/MS

Bảng 1.3 Một số phương pháp xác định Auramin O trong thực phẩm bằng

cơ phân cực

và không phân cực

- Làm sạch bằng qua cột Oasis HLB

LC-ESI-MS/MS

- cột ODS

- Pha động:

Kênh A: AA 20mM (chỉnh PH 4,5 = acid acetic) Kênh B: ACN

- Làm sạch qua cột SPE C18

UPLC-MS/MS LOD:

1,28 µg/kg LOQ:

4,27 µg/kg R: 80,1 -95,3%

[32]

Nền

mẫu

Đối tượng Xử lý mẫu Phương pháp Đánh giá

phương pháp

- Qua cột SPE WAX

LC-MS/MS

- Cột aligent ODS C18

- Pha động:

Kênh A: AA 50mM (0,1% AF) Kênh B: ACN

LOQ: 40 ng/g R: 79,8- 95,2 % [21]

- Qua cột SPE MCX

HPLC-MS

- Cột C18

- Pha động : Kênh A : ACN Kênh B : AF 0,1

%

LOD: 2 µg/kg LOQ: 5 µg/kg R: 71,3 -92,5%

- Có tính chọn lọc cao, với khả năng xác định các chất dựa vào khối lượng

và cấu tạo của chất nên rất đặc trưng cho từng chất

- Có khả năng phân tích được những chất không thể phân tích bằng sắc kí khí, như các chất kém bay hơi, các chất không bền nhiệt

Về cơ bản, sắc kí lỏng khối phổ là phương pháp sắc kí lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ [1], [6]

1.2.2.1 Sắc kí lỏng (HPLC)

Sắc kí lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn

và pha động là chất lỏng (sắc kí lỏng – rắn) Khi tiến hành chạy sắc kí, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [1],[5]

a Pha tĩnh trong HPLC

Trong HPLC, pha tĩnh chính là bề mặt chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Tùy theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc kí lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc kí pha thuận (NP-HPLC)

và sắc kí pha đảo (RP-HPLC)

- Sắc kí pha thuận: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm alkyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN…)

- Sắc kí pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được alkyl hóa, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37 [1],[5]

b Pha động trong HPLC

Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc kí nhất định Có thể chia pha động thành hai loại:

- Pha động phân cực: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực như methanol, acetonitril Pha động loại này được dùng trong sắc kí pha liên kết pha đảo

- Pha động không phân cực: bao gồm các dung môi ít phân cực như xyclopentan, n-pentan, n-hexan, n-heptan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), clorobutan, CCl4, toluen…

Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ [1],[5]

1.2.2.2 Khối phổ

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân

tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, … Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin

về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất [1],[7]

Một sơ đồ tóm tắt mô hình hệ thống LC-MS được trình bày ở hình 1.2 Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, bộ phân tích khối và bộ phận phát hiện

Hình 1.2 Mô hình hệ thống LC-MS/MS

a Nguồn ion hoá

Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử Các kĩ thuật ion hóa thường được sử dụng trong sắc kí lỏng khối phổ là ion hóa phun điện tử (ESI)

và ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI

Kỹ thuật ESI chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí Dung dịch mẫu được dẫn vào vùng có trường điện từ mạnh được duy trì ở hiệu điện thế khoảng 1- 5kV Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và được hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân tích khối phổ Các giọt nhỏ trước khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ được kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi Có hai chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương ESI(+) và ion âm ESI(-) Đối với chế độ ESI(+), ion được tạo thành thường là ion [M+H]+ , còn đối với chế độ ESI(-), ion được tạo thành thường là ion [M-H]-

[7]

b Bộ phận phân tích khối

Sau khi đã được ion hóa, các ion được đưa đến bộ phận phân tích khối nhằm loại bỏ những ion không cần thiết, lựa chọn các ion phân tử, thực hiện bắn phá thêm để thu được các ion con Các kỹ thuật phân tích khối được sử

Sắc ký

lỏng

Ion hóa

Bộ phân tích khối

Detector/lưu giữ số liệu

Chân không

dụng phổ biến là bộ phận phân tích tứ cực, bộ phận phân tích bẫy ion, bộ phân tích thời gian bay Bộ phân tích khối ba tứ cực được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật LC-MS/MS và đây chính là kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này

Tứ cực có cấu tạo gồm 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua Những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể

đi qua bộ lọc này Tứ cực thứ 1 (Q1) và thứ 3 (Q3) có vai trò như là các bộ lọc khối Còn tứ cực thứ 2 (Q2) có vai trò như là buồng va chạm, tại đó các ion sau khi qua Q1 (ion mẹ) được bắn phá bởi năng lượng và khí trơ để tạo thành các ion nhỏ hơn (ion con) Các ion này được lựa chọn tại Q3 [1], [7]

c Bộ phận phát hiện:

Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion dương tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển

Bộ phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất,

có độ nhạy cao Các ion sau khi qua Q3 sẽ đập vào bề mặt diod làm bật ra các electron Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các diod tiếp theo và sẽ tạo

ra các electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron Cứ như vậy tín hiệu sẽ được khuếch đại và được ghi lại Tín hiệu này tỷ lệ thuận với lượng ion do đó tỷ lệ với nồng độ chất phân tích ban đầu [7]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các mẫu thức ăn chăn nuôi (TACN)

được thu thập trên thị trường Hà Nội

Pha dung dịch chuẩn:

- Dung dịch chuẩn AUO nồng độ 150 µg/mL : Cân 0,02g chuẩn AUO dạng rắn, hòa tan và định mức bằng methanol đến 100 mL, thu được chuẩn có nồng độ 150 µg/mL Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2-8˚C, có thể sử dụng được trong 6 tháng

- Dung dịch chuẩn trung gian AUO nồng độ 1 µg/mL : Hút 67 L chuẩn AUO nồng độ 150 g/mL vào bình 10 mL và định mức đến vạch bằng methanol Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ từ 2-8oC, có thể sử dụng được trong

3 tháng

- Dung dịch chuẩn trung gian AUO nồng độ 100 ng/mL: Hút 1 mL chuẩn AUO nồng độ 1 g/mL vào bình định mức 10 mL và định mức đến vạch bằng methanol Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2-8oC, có thể sử dụng được trong 3 tháng

2.2.1.2 Hoá chất, dung môi

Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích:

- Dung môi loại dùng cho sắc kí: acetoniril, methanol, acid formic của Merck, Đức

- Acid acetic, amoni acetat , acetonitril của Merck, Đức

- Máy lắc xoáy IKA

- Máy đồng nhất mẫu HR1843, Philips

- Máy li tâm Z383K, Hermle

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo

- Bộ chiết pha rắn Supleco và máy hút chân không

2.2.2.2 Dụng cụ

- Micropipet có thể tích điều chỉnh đƣợc 20-200 µL, 100-1000 µL và 1000-5000 µL

2.3.1 Khảo sát các điều kiện xác định AUO bằng LC-MS/MS

- Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: tìm các điều kiện tách sắc ký bao gồm pha động, pha tĩnh

- Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion phân tử; lựa chọn các ion sản phẩm phù hợp

2.3.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu

- Khảo sát về dung môi chiết

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu

- Các mẫu TACN được lấy từ 3 quận trên địa bàn Hà Nội là quận Hoàng Mai, quận Từ Liêm và quận Long Biên trong khoảng thời gian từ tháng 11/2015 – 12/2015

- Mỗi quận lấy 5 mẫu khác nhau

- Mỗi mẫu lấy ít nhất 1 kg

- Bảo quản mẫu ở nơi thoáng mát, nhiệt độ phòng

2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu sơ bộ

- Các mẫu sau khi thu thập được mã hóa từ M-01 đến M-15

- Đồng nhất tối thiểu 1 kg mẫu bằng máy đồng nhất mẫu HR1843, Philips

- Mẫu sau khi đồng nhất có thể đem phân tích hoặc được bảo quản nơi thoáng mát, nhiệt độ 20 ± 4ºC

2.4.3 Phương pháp chiết pha rắn

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE) để làm sạch mẫu phân tích

Chiết pha rắn (hay chiết rắn-lỏng) là quá trình phân bố chất tan giữa 2 pha lỏng và rắn Trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nước hoặc dung môi hữu cơ), chất để hấp phụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt nhỏ và xốp) gọi là pha rắn

- Pha rắn (còn gọi là pha tĩnh) thường là các hạt silica gel xốp trung tính, hạt oxit nhôm, silica gel trung tính đã được alkyl hóa nhóm –OH bằng các gốc hydrocacbon mạch thẳng –C2, -C4, -C8, -C18,…hay nhân phenyl, các polyme hữu cơ, các loại nhựa hoặc than hoạt tính… Các hạt này được nhồi vào cột chiết nhỏ (thể tích 5-10ml) hoặc nén dưới dạng đĩa dày 1-2

mm với đường kính 3-4 cm (đĩa chiết)

- Pha lỏng là pha chứa chất cần phân tích, chúng có thể là dung môi hữu cơ, dung dịch đệm… Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết, pha rắn tương tác với chất phân tích và liên kết với một (hoặc mhóm chất phân tích trên pha tĩnh Sau đó dùng dung môi thích hợp hòa tan tốt các chất phân tích

để rửa giải chúng ra khỏi pha tĩnh và thu chất phân tích

Qui trình chiết pha rắn:

 Hoạt hóa chất hấp phụ và pha rắn

- Làm ướt vật liệu nhồi, solvat hóa các nhóm chức của chất hấp phụ

- Loại không khí trong các khoảng trống trong lớp hấp phụ, lấp đầy khoảng trống bằng dung môi

- Không được để chất hấp phụ bị khô do khả năng hấp phụ xảy ra không hoàn toàn và độ thu hồi chất phân tích sẽ bị giảm

 Hấp phụ chất phân tích lên cột

- Dung dịch chứa chất phân tích được cho qua cột với tốc độ thích hợp

- Chất phân tích được làm giàu trên chất hấp phụ

- Một vài thành phần ảnh hưởng khác cũng có thể bị giữ lại

- Các thành phần không bị hấp phụ sẽ bị loại ra ngoài cùng dung môi

- Pha rắn sẽ lưu giữ chất phân tích và một số tạp chất

Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng

và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC 657/2002 của Châu Âu [12]

Bảng 2.1 Số điểm IP cho các kỹ thuật phân tích

Kỹ thuật Số ion Số điểm

IP

2.4.4.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ tối thiểu của một chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng và cho kết quả có độ chụm mong muốn

Xác định LOD,LOQ dựa trên tỉ lệ tín hiệu nhiễu đường nền (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tí hiệu của chất phân tích (n=4) Xác định tỉ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = signal to noise ratio)

LOD là nồng độ mà tại đó S/N= 3

LOQ là nồng độ mà tại đó S/N = 10

Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích

N là nhiễu đường nền

2.4.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích

Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích

Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó vẽ đường cong sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

Sau khi xác định được khoảng tuyến tính của các chất tiến hành xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu chất ngoại chuẩn và chia cho nội chuẩn (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ chuẩn (trục hoành x)

2.4.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) là mức độ gần nhau của các giá trị riêng

lẻ của các phép đo lặp lại

Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận Độ đúng là khái niệm định tính và có thể được biểu diễn định lượng dưới dạng độ thu hồi

Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng

độ khác nhau của AuO và tính toán kết quả theo các công thức:

- Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn SD hay độ lệch chuẩn tương đối RSD:

RSD(%) = ̅ 100% SD = √∑ ̅

Trong đó:

xi : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “i”

: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm

C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/mL)

Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/mL)

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả được tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết

bị (phần mềm MassHunter) Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel

x

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Tối ưu hóa điều kiện tách và xác định AUO bằng LC-MS/MS

3.1.1 Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ

3.1.1.1 Lựa chọn ion phân tử và ion sản phẩm

Để xác định các ion phân tử và ion sản phẩm của AUO, chúng tôi tiêm dung dịch chuẩn AUO nồng độ 50 ng/mL vào khối phổ và thực hiện các khảo sát bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử (ESI) với chế độ bắn ion dương Lựa chọn ion mẹ là ion có dạng [M+H]+; sau đó phân mảnh ion mẹ để thu được các ion con Ion con có cường độ cao nhất được chọn làm ion định lượng, các ion con có cường độ thấp hơn được sử dụng để khẳng định sự có mặt của chất phân tích (định tính) Năng lượng va chạm (CE) được tối ưu tự động theo từng ion con dựa vào phần mềm của thiết bị

Các kết quả được trình bày trong bảng 3.1, hình 3.1 và phụ lục 1

Bảng 3.1 Các điều kiện phân tích AUO bằng ESI(+)-MS/MS

Tên chất

phân tích

Mảnh mẹ (m/z)

Mảnh con (m/z) CE (eV) CAV(V) Ghi chú