Nghiên cứu xác định hàm lượng silymarin trong một số loại thực phẩm chức năng bằng HPLC

Tuỳ theo công thức, hàm lượng vi chất và hướng dẫn sử dụng, thực phẩm chức năng còn có các tên gọi sau: thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng, thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ

NGUYỄN KHÁNH LINH

MÃ SINH VIÊN: 1101299

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SILYMARIN TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM CHỨC

NĂNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM CHỨC

NĂNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Lê Đình Chi

2 ThS Cao Công Khánh

Nơi thực hiện:

Viện Kiểm Nghiệm An Toàn

Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia

HÀ NỘI – 2016

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Lê Đình

Chi và ThS Cao Công Khánh là những người thầy đã dìu dắt tôi từ những ngày

đầu làm nghiên cứu khoa học và cũng là những người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia, 65 Phạm Thận Duật - Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em

đã dành cho tôi sự giúp đỡ và động viên quý báu trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Khánh Linh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1.Tổng quan về silymarin 2

1.1.1 Cấu trúc : 3

1.1.2 Tính chất lý hóa 4

1.1.3 Tính chất dược động học, tác dụng dược lý 5

1.2. Tổng quan về HPLC 9

1.2.1 Khái niệm chung 9

1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký 9

1.2.3 Các thông số đặc trưng trong HPLC [1], [2] 10

1.2.4 Thiết bị HPLC: 13

1.2.5 Ứng dụng phương pháp HPLC 16

1.3.Một số phương pháp phân tích silymarin 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1.Đối tượng nghiên cứu 24

2.2.Nguyên vật liệu - thiết bị 25

2.2.1 Nguyên vật liệu 25

2.2.2 Thiết bị 25

2.2.3 Nội dung nghiên cứu 25

2.3.Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Khảo sát các điều kiện phân tích silymarin bằng HPLC 26

2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 27

2.3.3 Thẩm định quy trình 27

2.4.Phương pháp xử lý số liệu 30

3 CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31

3.1.Thực nghiệm và kết quả 31

3.1.1 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích silymarin 31

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 35

3.1.3 Thẩm định phương pháp: 40

3.1.4 Kết quả áp dụng phương pháp xác định silymarin trong một số sản phẩm 56

3.2.Bàn luận 60

4 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

4.1.Kết luận 61

4.2.Kiến nghị 62

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm

Spectrometry )

LOD Giới hạn phát hiên (Limit of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Silymarin [16], [17], [18] 4

Hình 1.2 Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B 10

Hình 1.3 Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC 13

Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với chương trình 1 32

Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với chương trình 2 33

Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với chương trình 3 34

Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với chương trình 4 35

Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 36

Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch mẫu nang cứng chiết bằng methanol 36

Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch mẫu nang mềm chiết bằng methanol 38

Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp silymarin 41

Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu trắng 41

Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn hỗn hợp 42

Hình 3.11 Đường chuẩn của Silybin A 44

Hình 3.12 Đường chuẩn của Silybin B 45

Hình 3.13 Đường chuẩn của isosilybin A 46

Hình 3.14 Sắc ký đồ dung dịch mẫu NC01 58

Hình 3.15 Sắc ký đồ dung dịch mẫu NC03 58

Hình 3.16 Sắc ký đồ dung dịch mẫu nang NM01 59

Hình 3.17 Sắc ký đồ dung dịch mẫu NM02 59

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất vật lý của một số silymarin chính [8] 5

Bảng 1.2 Phân lọai sắc ký 15

Bảng 1.3 Một số phương pháp phân tích Silymarin 17

Bảng 2.1 Danh mục các mẫu phân tích 24

Bảng 3.1 Chương trình gradient dung môi 1 31

Bảng 3.2 Chương trình gradient dung môi 2 32

Bảng 3.3 Chương trình gradient dung môi 3 33

Bảng 3.4 Chương trình gradient dung môi 4 34

Bảng 3.5 Kết quả định lượng silybin A trong viên nang cứng theo dung môi 36

Bảng 3.6 Kết quả định lượng silybin B trong viên nang cứng theo dung môi 37

Bảng 3.7 Kết quả định lượng isosilybin A trong viên nang cứng theo dung môi 37

Bảng 3.8 Kết quả định lượng Silymarin tổng trong viên nang cứng theo dung môi 37

Bảng 3.9 Kết quả định lượng silybin A trong viên nang mềm theo dung môi 39

Bảng 3.10 Kết quả định lượng silybin B trong viên nang mềm theo dung môi 39

Bảng 3.11 Kết quả định lượng isosilybin A trong viên nang mềm theo dung môi 39 Bảng 3.12 Kết quả định lượng silymarin tổng trong viên nang mềm theo dung môi 40

Bảng 3.13 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống 42

Bảng 3.14 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của Silybin A 43

Bảng 3.15 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của Silybin B 44

Bảng 3.16 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của isosilybin A 46

Bảng 3.17 Giới hạn phát hiện Silybin A 47

Bảng 3.18 Giới hạn phát hiện Silybin B 48

Bảng 3.19 Giới hạn phát hiện Isosilybin A 48

Bảng 3.20 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang cứng tính theo Silybin A 50

Bảng 3.21 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang cứng tính theo Silybin B 50 Bảng 3.22 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang cứng tính theo Isosilybin A 51

Bảng 3.23 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang mềm tính theo Silybin A 51

Bảng 3.24 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang mềm tính theo Silybin B 52

Bảng 3.25 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang mềm tính theo Isosilybin A 52 Bảng 3.26 Độ thu hồi Silybin A của phương pháp với viên nang cứng 53

Bảng 3.27 Độ thu hồi Silybin A của phương pháp với viên nang mểm 54

Bảng 3.28 Độ thu hồi Silybin B của phương pháp với viên nang cứng 54

Bảng 3.29 Độ thu hồi Silybin B của phương pháp với viên nang mềm 55

Bảng 3.30 Độ thu hồi Isosilybin A của phương pháp với viên nang cứng 55

Bảng 3.31 Độ thu hồi Isosilybin A của phương pháp với viên nang mềm 56

Bảng 3.32 Kết quả phân tích mẫu thực 57

Bảng 4.1 Gradient pha động 61

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xã hội hiện đại giúp chất lượng cuộc sống được nâng cao đáng kể, từ đó con người càng chú trọng đến vấn đề sức khỏe Bên cạnh việc ăn uống hợp lý, thể dục điều độ thì bổ sung dinh dưỡng từ các loại thực phẩm chức năng đang được quan tâm Thế nhưng, bản chất của thực phẩm chức năng đang bị hiểu chưa đúng dẫn đến những tranh cãi trong cộng đồng người tiêu dùng Thực phẩm chức năng là thực phẩm có lợi cho một hay nhiều hoạt động của cơ thể như cải thiện tình trạng sức khoẻ và làm giảm nguy cơ mắc bệnh hơn là so với giá trị dinh dưỡng mà nó mang lại [39] Bộ Y tế Việt Nam định nghĩa thực phẩm chức năng: là thực phẩm dùng để

hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh Tuỳ theo công thức, hàm lượng vi chất và hướng dẫn sử dụng, thực phẩm chức năng còn có các tên gọi sau: thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng, thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, sản phẩm dinh dưỡng y học.[3]

Theo các nghiên cứu thì Silymarin có các hoạt tính rất tốt như: giúp ổn định màng tế bào gan [41], là chất chống oxy hóa, chống peroxyd hóa lipid, tăng khả năng oxi hóa acid béo của gan, làm ổn định các tế bào gây viêm, ức chế phản ứng viêm [5], [20], [41], giảm các nồng độ enzym gan, làm cải thiện các triệu chứng của bệnh gan như gan nhiễm mỡ, viêm gan…[26] Chính vì thế mà các thực phẩm chức năng chứa Silymarin được sản xuất ngày càng nhiều và đối tượng sử dụng ngày càng đông đảo Do đó để bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng cũng như hỗ trợ các cơ quan chức năng trong việc kiểm soát tốt vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm, nhất là đối với thực phẩm chức năng, chúng tôi tiến hành “ Nghiên cứu xác định hàm lượng Silymarin trong một số loại thực phẩm chức năng bằng HPLC” với các mục tiêu:

- Xây dựng quy trình xác định hàm lượng Silymarin trong thực phẩm chức năng

- Ứng dụng quy trình đã xây dựng để phân tích một số sản phẩm thực phẩm chức năng đang lưu hành trên thị trường

1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về silymarin

Silymarin là một hỗn hợp của các chất flavonoid polyphenolic được phân lập từ

cây cây kế sữa, Silybum marianum, họ Cúc [36] Silybum marianum còn được gọi

là kế sữa, kế thánh, kế đức mẹ, cúc gai, là một loại thảo dược hàng năm, có nguồn gốc Địa Trung Hải và Bắc châu Phi [9], [30], [36] Cây phát triển chủ yếu ở châu

Âu, châu Phi, Nam Mỹ, Trung và Đông Á Đây là một cây thuốc có giá trị cao, để điều trị các bệnh về gan thận Cây kế sữa đã được du nhập vào trồng ở Việt Nam từ lâu, hiện nay đang phát triển tốt tại các vùng cao có đất tốt và khí hậu mát mẻ như: Tam Đảo, Sa Pa, ; lượng dược liệu này nhu cầu ngày càng gia tăng Cây kế sữa có thể được trồng bằng cách gieo hạt trực tiếp xuống đất Môi trường sinh trưởng của cây kế sữa là ở những vùng khô ráo, nhiều ánh nắng mặt trời Cây kế sữa trưởng thành cao từ 1,2m đến 3m; lá lớn có chấm hoặc gân màu trắng, bông màu đỏ tím, trái nhỏ, có vỏ cứng màu nâu bóng với nhiều chấm Toàn thân cây và lá đều có những gai nhỏ li ti đâm vào da rất nhức nên người ta phải mang bao tay dầy khi thu hoạch Hoa cây kế sữa nở từ tháng 6 đến tháng 8, các hạt màu đen được thu hoạch vào cuối mùa hè để sử dụng cho các mục đích y học Trà làm từ cây kế sữa đã được

sử dụng cho việc điều trị các bệnh về gan trong thời cổ đại Từ thời Hy Lạp cổ đại

và La Mã, hạt giống của cây kế sữa đã được sử dụng để bảo vệ gan Nó đã trở thành một loại thuốc được chuyên dùng để điều trị các bệnh gan mật vào thế kỷ 16 và vào năm 1960 ở trung tâm châu Âu Quả kế sữa chứa khoảng 1,5-3% của một hỗn hợp đồng phân flavonolignans được gọi chung là silymarin [25] Silymarin tích tụ chủ yếu ở mặt bên ngoài của các loại trái cây của S marianum Có rất nhiều nghiên cứu đánh giá hiệu quả của sylimarin / silybinin để điều trị một loạt các bệnh về gan, túi mật và rối loạn đường ruột Tác dụng của silymarin rộng rãi và phổ biến nhất là các hoạt động bảo vệ gan chống lại bệnh viêm gan cấp tính và mãn tính, xơ gan và độc

tố gây ra bệnh viêm gan [5], [6], [13] Silymarin đã được báo cáo để bảo vệ tế bào gan khi tiếp xúc một số loại độc tố, bao gồm acetaminophen, ethanol, asen,

tetraclorua carbon, khi bị tổn thương thiếu máu cục bộ, bức xạ, ngộ độc sắt và viêm gan siêu vi.[22]

1.1.1 Cấu trúc :

Silymarin lần đầu tiên được phân lập bởi Wagner và cộng sự [39] Các thành phần chính của silymarin là silybinin (Silybin A và silybin B), isosilybinin (isosilybin A và isosilybin B), silydianin, silychristin and taxifolin [16], [17],[18] Trong số các đồng phân, Silybinin là thành phần chính và chiếm khoảng 70-80%, tiếp theo là silychristin (20%), silydianin (10%) và isosilybin (0,5%) [33] Đặc điểm chung của các hợp chất này là công thức chung C25H22O10 ( khối lượng mol 482)

Về cơ bản, cấu trúc flavonolignan gồm các dihydroflavanol taxifolin liên kết với coniferyl alcohol qua một vòng epoxid Nhóm epoxid chịu trách nhiệm cho các hoạt động sinh học của silymarin, mở vòng mất hoạt tính Chỉ silybin và isosilybin chứa các nhóm 1,4-dioxane trong cấu trúc của chúng Silybin và isosilybin có cấu hình trans tại C-2, C-3 và C-7 ', C-8' [18] Silybinin được coi là thành phần chủ yếu và hoạt động nhất trong silymarin [6]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Silymarin [16], [17], [18]

1.1.2 Tính chất lý hóa

1.1.2.1 Độ hòa tan

- Độ tan trong nước thấp (0,04 mg/ml)

- Silymarin kém hòa tan trong các dung môi phân cực protic (ethanol, methanol) và không hòa tan trong các dung môi không phân cực (chloroform, ether dầu khí), nhưng là hòa tan trong các dung môi phân cực aprotic (Acetone, tetrahydrofuran) [8]

Silymarin không có tính chất thân dầu mặc dù độ tan trong nước của nó thấp

- Hấp thu sau khi uống là khá thấp Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được

trong 4-6 giờ, cả trong động vật và ở người [29] Chỉ có 20-50% silymarin đường uống được hấp thu từ đường tiêu hóa Những nghiên cứu cho thấy có chu kỳ ruột-gan: hấp thu đường ruột, liên hợp trong gan, bài tiết qua mật, thủy phân bởi vi khuẩn đường ruột, và tái hấp thu ở ruột [20] Chu kỳ này làm cho việc nghiên cứu

sự hấp thu đường ruột rất khó khăn Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụng Silybinin ở chuột đã cho thấy sự hấp thu đường ruột của một liều lượng 20 mg / kg xuống còn khoảng 35% [13] Do đó, sự hấp thụ của silymarin qua đường tiêu hóa là thấp, làm cho sinh khả dụng kém

- Phân bố: Các hợp chất đi vào huyết tương và vào mật, với lượng tương ứng

với 80% tổng liều dùng Silybinin và các thành phần khác của silymarin nhanh chóng kết hợp với sulfate và acid glucuronic trong gan [30]

- Sự trao đổi chất: Silymarin ( đại diện là Silybinin) trải qua giai đoạn I và giai

đoạn II chuyển hoá trong gan Nó được chuyển hóa bởi CYP450-2C8 invitro thành

o-demethylated silybin (chủ yếu) và mono hoặc dihydroxy- silybin ( thứ yếu ) Trong khi giai đoạn II, nhiều phản ứng liên hợp đã được quan sát bao gồm sự hình thành của Silybin monoglucuronide, Silybin diglucuronide, Silybin monosulfate, và Silybin diglucuronide sulfate [30]

- Thải trừ: Thời gian bán hủy của nó trong khoảng 6-8 giờ [30] Silybinin được

bài tiết chủ yếu ở dạng chưa chuyển hóa qua nước tiểu sau khi uống hoặc tiêm tĩnh mạch, trong khi ở mật nó được thải trừ dạng đã chuyển hóa (không bị ảnh hưởng bởi đường dùng) Silybinin được bài tiết với lượng tối thiểu trong nước tiểu trong vòng 48 giờ sau khi uống (2-5%) hoặc tiêm tĩnh mạch (8%) Ngược lại, lượng thải trừ qua mật là khá cao trong cùng thời gian (khoảng 40-45% sau khi uống, và khoảng 80% sau khi tiêm tĩnh mạch) [20]

- Sinh khả dụng của Silybinin cũng có thể được tăng cường bằng sự tạo phức với phosphatidylcholine hay β-cyclodextrin [6]

1.1.3.2 Dược lý

Silymarin được sử dụng như một liệu pháp bảo vệ trong các bệnh gan cấp tính

và mãn tính [5], [6], [13] Tác dụng của silymarin có thể được giải thích dựa trên đặc tính chống oxy hóa do tính chất phenolic của flavonolignans, kích thích các tế bào gan tái sinh và ổn định màng tế bào để ngăn chặn các tác nhân gây độc cho gan xâm nhập vào tế bào gan [22] Gần đây đã chứng minh được rằng flavonolignans ức chế sản xuất leucotriene; sự ức chế này giải thích hoạt tính chống viêm và chống xơ

gan [6]

- Chống oxy hóa

Flavonoids thường có hoạt tính chống oxy hóa tốt Các muối natri dehydrosuccinate hòa tan trong nước của Silybinin (hỗn hợp 2 đồng phân Silybin A

và Silybin B) là một chất ức chế mạnh mẽ của quá trình oxy hóa của nhũ tương acid linoleic-nước được xúc tác bởi muối Fe2 +[12] Nó cũng ức chế một cách phụ thuộc nồng độ các peroxy microsome sản xuất bởi NADPH-Fe2 + -ADP, một nguyên nhân hình thành của các gốc OH- tự do Trong các nghiên cứu được thực hiện ở chuột đã chứng minh rằng peroxy lipid sản xuất bởi Fe (III) / ascorbate bị ức chế bởi hemisuccinate silybinin; sự ức chế là phụ thuộc nồng độ [11], [24] Trong báo cáo gần đây, với các tế bào gan chuột được điều trị với tert-butyl hydroperoxide (TBH), silymarin làm giảm sự mất của lactate dehydrogenase (LDH), làm tăng tiêu thụ oxy, giảm sự hình thành của peroxid lipid, và làm tăng sự tổng hợp urê Hơn nữa, silymarin có thể vô hiệu hóa sự tăng Ca2 + được sản xuất bởi TBH, giảm nồng độ ion xuống còn dưới 300 nmol/L Hiệu quả bảo vệ gan của silymarin thông qua sự ức chế lipid peroxy, và điều chỉnh Ca2+ nội bào [13]

- Tái tạo gan

Silymarin gây ra ảnh hưởng đến sự ổn định trên màng tế bào gan và có thể tăng tốc độ tổng hợp của rRNA bằng cách kích hoạt RNA polymerase làm tăng sản xuất protein cấu trúc và protein chức năng trong tế bào gan bị tổn thương [31]

- Chống xơ gan

Tế bào gan hình sao có một vai trò rất quan trọng trong xơ gan Khi xuất hiện các yếu tố nguy cơ (ví dụ dùng ethanol lâu dài hoặc carbon tetrachloride), tế bào hình sao sinh sôi nảy nở và biến đổi thành myofibroblasts gây lắng đọng các sợi collagen trong gan Các kết quả đã cho thấy rằng, silymarin làm giảm sự tăng sinh của các tế bào hình sao khoảng 75%, làm giảm sự chuyển đổi của các tế bào này thành myofibroblasts, và giảm bài xuất và biểu hiện gen của các thành phần ngoại bào cần cho quá trình xơ hóa [7], [31], [38]

- Ức chế cytochrome P450

Silymarin có thể ức chế cytochrome P450 (CYP) ở gan (giai đoạn I chuyển hoá) Tác dụng này có thể giải thích sự bảo vệ gan của silymarin, đặc biệt là chống lại nhiễm độc do Amanita phalloides (là một loại nấm độc trong ngành Nấm đảm) Các chất độc Amatoxin trở nên độc đối với tế bào gan chỉ sau khi đã được kích hoạt

bởi hệ thống CYP Ngoài ra, silymarin, cùng với các chất chống oxy hóa khác, có thể góp phần vào việc bảo vệ chống lại các gốc tự do sinh ra bởi các enzyme của hệ thống CYP [13], [31]

- Chống ung thư

Sự bảo vệ chống lại các yếu tố gây ung thư của silymarin đã được nghiên cứu

trên các loại tế bào khác nhau cả in vitro và in vivo: các tế bào biểu mô, tế bào khối

u tuyến tiền liệt, tế bào u, các tế bào khối u vú, các tế bào khối u ác tính…Các cơ sở của các tác dụng chống viêm và chống ung thư của silymarin chưa được biết đến;

có thể liên quan đến sự ức chế các yếu tố phiên mã NF-B, trong đó quy định các biểu hiện của các gen khác nhau tham gia vào quá trình viêm, trong cytoprotection

và ung thư Silymarin điều chỉnh sự mất cân bằng giữa tế bào sống và chết theo chương trình thông qua sự can thiệp điều chỉnh chu kỳ tế bào và protein tham gia [13], [20], [22], [31]

- Hoạt động chống lipid peroxyd

Peroxyd lipid là kết quả của sự tương tác giữa các gốc tự do và các acid béo không bão hòa dẫn đến thay đổi màng tế bào, rối loạn trao đổi chất lipoprotein, cả ở gan và ở các mô ngoại vi Silymarin thu dọn các gốc tự do, tác động đến hệ thống enzyme kết hợp với glutathione và superoxide dismutase Silymarin ức chế peroxyd hóa acid linoleic xúc tác bởi lipoxygenase [5], [6], [13], [31]

- Độc tính của silymarin

Trong các thử nghiệm lâm sàng, liều trung bình hàng ngày của silymarin (420 mg/ngày cho 41 tháng) đã được tìm thấy là không độc hại so với giả dược Tương tác thuốc - thuốc và nhiễm độc gan do cảm ứng hoặc ức chế cytochrome P450 là một vấn đề cần quan tâm đối với việc sử dụng các silymarin [6], [34]

- Chỉ định:

+ Bảo vệ tế bào gan và phục hồi chức năng gan

+ Những người đang sử dụng thuốc có hại tế bào gan như thuốc điều trị lao, ung thư, thuốc NSAIDs…

+ Rối loạn chức năng gan

+ Phòng và hỗ trợ điều trị xơ gan, ung thư gan

- Chống chỉ định:

Bệnh nhân hôn mê gan, vàng da ứ mật và xơ gan tiên phát

1.2 Tổng quan về HPLC

1.2.1 Khái niệm chung

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography – HPLC) là kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do

đó thứ tự rửa giải khác nhau Thành phần pha động đưa chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp lý [1], [2]

1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký

Mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động Pha này có thể là một chất khí, chất lỏng hoặc chất lỏng siêu tới hạn được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc

độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là tổng các tương tác:

- Tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1)

- Tương tác giữa chất phân tích và pha động (F2)

- Tương tác giữa pha tĩnh và pha động (F3)

Trong đó tương tác F1 và F2 đóng vai trò quyết định Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột như hình 1.2

Hình 1.2 Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B

Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của của quá trình sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion Ngoài ra còn có sắc ký rây phân tử Trong đó sắc ký phân bố được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm do đó tôi xin trình bày kỹ về sắc ký phân bố

1.2.3 Các thông số đặc trưng trong HPLC [1], [2]

Trong đó: CS là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh (mol/lit)

CM là nồng độ mol của chất tan trong pha động (mol/lit)

Hệ số K phụ thuộc bản chất của pha động, pha tĩnh và chất hòa tan Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm

Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn

1.2.3.2 Thời gian lưu t R

Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến

detector Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định, điều này làm cơ sở cho phép định tính Thời gian lưu của mỗi chất phụ thuộc các yếu tố:

- Bản chất của pha tĩnh

- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

- Một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động

Trong một phép phân tích nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, nếu tR quá lớn thì pic

bị doãng và độ lặp lại của pic rất kém, thời gian phân tích dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố mà tR phụ thuộc

Thời gian chết: thời gian tM của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động)

Thời gian lưu hiệu chỉnh: tR’ = tR – tM

1.2.3.3 Hệ số dung lượng k’

Hệ số k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích

A qua cột Hệ số k’ còn được gọi là hệ số phân bố khối lương giữa hai pha:

k’ =

O

O R O R M S M

S

t

t t t

t Q

Q V

QS: lượng chất trong pha tĩnh

QM: lượng chất trong pha động

CS: nồng độ mol chất tan trong pha tĩnh (mol/lít)

CM: nồng độ mol chất tan trong pha động (mol/lít)

K : hệ số phân bố

A R

B R A B A

B

t

t k

k K

Với quy ước KB> KA nên α luôn lớn hơn 1

Để tách riêng 2 chất thường chọn α dao động trong khoảng 1,05 ÷ 2 Nếu α quá lớn thời gian phân tích sẽ dài

a : khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

1.2.3.6 Số đĩa lý thuyết N

Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký

2 2

2 / 1

21654

.5

W

t W



Trong đó: W: chiều rộng đo ở đáy pic

W1/2: chiểu rộng đo ở nửa chiều cao pic

A R B R A

B

A R B R

W W

t t W

W

t t

2 / 1 2 / 1

, , ,

, 1,182

WB, WA: độ rộng pic đo ở các đáy pic

W1/2,B, W1/2,A: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Các giá trị trên được tính theo cùng một đơn vị

Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5

1.2.4 Thiết bị HPLC:

Hình 1.3 Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC

1.2.4.1 Hệ thống cung cấp pha động:

Bình dung môi pha động

- Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định

+ Trong sắc ký pha thuận, pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân cực (kỵ nước) như: n-hexan, n-heptan, benzen, cloroform Các pha động này thường được bão hoà

+ Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực như: nước, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ

- Yêu cầu: phải trơ đối với pha tĩnh, phải hòa tan được chất mẫu, ổn định theothời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

Bộ phận loại khí

Trước khi sử dụng cần lọc và đuổi khí hòa tan trong pha động Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động

+ Tạo dòng liên tục, lưu lượng bơm từ 0,1 đến 10 ml/phút

+ Không bị ăn mòn với các thành phần pha động

- Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt

1.2.4.2 Bộ phận tiêm mẫu:

Để đưa mẫu vào cột, hiện nay phổ biến dùng van tiêm có vòng chứa mẫu do ưu điểm dung tích xác định và chính xác, có thể thay đổi vòng chứa mẫu với dung tích khác nhau Dùng van tiêm mẫu cho kết quả chính xác hơn (± 1%) so với dùng bơm tiêm (±1-2%)

1.2.4.3 Cột sắc ký:

- Quá trình tách các chất diễn ra ở cột Cột được chế tạo bằng thép không rỉ, trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar Cột sắc ký có nhiều cỡ khác nhau tùy thuộc vào mức độ và mục đích của quá trình sắc ký, thông thường chiều dài cột khoảng 10 – 30 cm, đường kính trong 1- 10 mm, hạt chất nạp cỡ 5- 10 µm Cột có đường kính trong lớn hơn dùng trong sắc ký điều chế

Trong cột được nhồi pha tĩnh Thông thường chất nạp là silicagel (pha thường) hoặc là silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo) hoặc liên kết hóa học với các hợp chất hữu cơ, ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao đổi ion…

Có thể phân loại chất nạp theo gốc R của dẫn chất Siloxan Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký được chia thành 2 loại

Bảng 1.2 Phân lọai sắc ký

nước): nhóm OH hoặc các alkylamin (–CH2NH2), alkyl nitril (– CH2 – CN)

R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bằng cách alkyl hóa các nhóm

OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl-R của mạch carbon (C2;C8;C18) hay các gốc carbon vòng phenyl

phân cực (kỵ nước) như: hexan, n-heptan, benzen, cloroform

n-Hệ dung môi hữu cơ phân cực như: nước, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng

ứng dụng thực tế, nếu nhắc tới HPLC thường người ta ám chỉ các kỹ thuật sử dụng detector không phải là khối phổ

Trong nghiên cứu này, để quy trình xây dựng được có khả năng ứng dụng rộng, chúng tôi lựa chọn detector PDA, loại detector phổ biến trong cấu hình tiêu chuẩn của thiết bị HPLC hiện tại Về bản chất, đây là một detector UV-Vis cho phép đồng thời ghi nhận tín hiệu hấp thụ đồng thời trên toàn dải phổ UV gần và Vis Dải bức

xạ UV-Vis (thường các detector PDA có dải bước sóng trong khoảng 190 – 800 nm) sau khi đi qua tế bào đo được đưa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắc đi đến một mảng diod quang Mỗi diod quang đón nhận một phần dải bức xạ tương ứng với một khoảng bước sóng hẹp Như vậy, mỗi một diod có thể phát hiện một sự hấp thu ở một bước sóng nhất định Toàn bộ dãy diod được quét nhiều lần trong 1 giây bởi bộ phận vi xử lý Kết quả phổ có thể hiện trên màn hình máy tính hoặc được lưu trữ để in ra dưới dạng bản phổ bằng máy in

Ưu điểm của detector này là tạo được phổ UV của các chất phân tích trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc ký với phổ của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước

1.2.4.5 Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu:

Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang, các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số, và các thông số của peak như tính đối xứng, hệ số phân giải trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD

1.2.5 Ứng dụng phương pháp HPLC

- Phân tích định tính: thường dựa vào thời gian lưu

- Phân tích định lượng: có thể chia thành 4 bước :

+ Lấy mẫu thử

+ Tiến hành sắc ký

+ Đo tín hiệu detector

+ Phương pháp định lượng

Dựa trên nguyên tắc: Nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó

• Phương pháp chuẩn ngoại: cả hai mẫu thử và chuẩn đều được tiến hành sắc ký trong cùng một điều kiện Sau đó so sánh trực tiếp chiều cao hay diện tích píc của mẫu thử với mẫu chuẩn

• Phương pháp chuẩn nội: là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký Chất chuẩn thứ hai gọi là chuẩn nội

• Phương pháp thêm chuẩn: Mẫu thử được thêm một lượng chính xác chất chuẩn Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa trên sự chênh lệch nồng độ và

độ tăng của diện tích.Với phương pháp thêm nhiều lần ta có phương pháp thêm chuẩn

• Phương pháp thêm đường chuẩn: chuẩn bị dãy hỗn hợp gồm các lượng mẫu thử giống nhau và các chất chuẩn ( tương ứng với thành phần cần xác định) với lượng tăng dần Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký

• Phương pháp chuẩn hóa diện tích: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích tất cả các pic thành phần trên sắc đồ Yêu cầu tất cả các thành phần đều được rửa giải và được phát hiện

1.3 Một số phương pháp phân tích silymarin

Bảng 1.3 Một số phương pháp phân tích Silymarin

pháp

Mẫu phân tích

- Pha động: gồm A (methanol) và B ( nước

có chứa 0,1% axit

- Chiết pha rắn

- Cân 0,1 g sản phẩm chiết và hòa tan trong 10mL methanol

[19]

formic)

- Tốc độ dòng 1ml / phút

- Nhiệt độ cột: 300C

- Detector UV vis 288nm

- Thể tích tiêm mẫu:

10 µL

- Lọc và tiến hành chạy sắc ký

cây kế sữa

- Cột C18 (120mm x

2 mm, 7 µm

- Pha động: gồm A (methanol) và B ( nước

có chứa 0,1% axit formic)

- Các chiết xuất từ quả được pha loãng 1:20 với CH3CN-

H2O rửa giải (27:73 vol.%, PH = 3,0), -Lọc qua một bộ lọc màng NF-13

[23]

nang, viên nén

- Cột C18 (100 mm x

3 mm, 2,6 µm

- Pha động: gồm A (nước có chứa acid formic 0,1%) và B (acid formic 0,1%

trong Methanol 80%)

- Tốc độ dòng 0,4 ml / phút

- Viên nang bỏ vỏ lấy phần bột bên trong, viên nén được nghiền thành bột (100,0 mg, ± 5,0 mg) Sau đó mẫu được cân vào một bình nón 50 ml chứa methanol

[27]

- Nhiệt độ cột: 250C

- Detector UV vis 288nm

- Thể tích tiêm mẫu:

2 µL

- Các mẫu được lắc kỹ và chiết xuất bằng nước nóng ở 45°C trong 30 phút

-Các mẫu được làm lạnh đến nhiệt

độ phòng và ly tâm

ở 5000 vòng trong 5 phút

- Lọc và chạy sắc

ký

phẩm dạng viên

- Cột C18 (250mm x 4,6 mm, 5 µm

- Pha động: gồm nước có chứa H3PO410% (pH 2,6) và ACN

tỉ lệ 62:38

- Tốc độ dòng 1ml / phút

- Chạy đẳng dòng

- Detector UV vis

- Mẫu được hòa tan trong methanol vào bình định mức

100 mL

- Lấy 10 mL pha loãng 5 lần bằng methanol

- Lọc qua màng 0,45 µm rồi chạy sắc

ký

[32]

cây kế sữa

- Cột C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm)

- Pha động: gồm methanol : nước(

50:50) chạy đẳng dòng

- Tốc độ dòng 1 mL / phút

- Chiết với hexane trong 4 giờ

n-và sau đó với ethyl acetate trong 8 giờ

- Hòa tan trong methanol

- Lọc và chạy sắc

[33]

- Cột C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm)

- Pha động:

A : nước: methanol:

acid phosphoric (80:20:0.5)

B nước: methanol:

acid phosphoric (20:80:0.5)

- Tốc độ dòng 1 mL / phút

- Pha loãng 10 lần bằng dung dịch methanol: nước (50:50)

- Lọc và chạy sắc ký

[36]

nang, viên nén

- Cột C18 (150mm x 4,6 mm, 5 µm

- Detector UV vis

- Cân một lượng bột thích hợp tương ứng với một viên chuyển vào bình định mức 25 ml và sau đó thêm vào 20ml methanol

- Để yên 15 phút ở nhiệt độ phòng và

[40]

288nm

- Thể tích tiêm mẫu:

20 µL

định mức 25ml bằng methanol

VP-(150×4,6 mm, 5 µm), tiền cột (10 x 4,6 mm,

5 µm)

- Pha động gồm methanol và nước (3:

7)

- Tốc độ dòng 1,5 ml / phút

- Nhiệt độ cột: 400C

- Detector UV 288nm

[10]

phẩm dạng viên

- Chiều dài mao quản

43 cm (chiều dài hiệu dụng 35 cm, đường kính trong 50 µm)

100 mL

- Lấy 10 mL pha loãng 5 lần bằng methanol

- Lọc qua màng 0,45 µm rồi chạy sắc

ký

[32]

có chứa acid formic 0,01%

- Tốc độ dòng 0,4 ml / phút

- Nhiệt độ cột: 300C

- Detector UV vis 288nm

- Thể tích tiêm mẫu:

1 µL

- Chiết pha rắn

- Cân 0,1 g sản phẩm chiết và hòa tan trong 10mL methanol

[19]

dạng bột từ quả hoặc hạt cây kế sữa

- Bản mỏng Silicagel dày 0,25mm, dài 20 cm

- Dung môi: hỗn hợp chloroform, acetone, và acid formic khan (75: 16,5: 8,5)

- Thuốc thử A: aminoethyl

2-diphenylborinate trong methanol (10mg/ml)

- Thuốc thử B: dung dịch polyethylene glycol 4000 trong alcohol (50 mg/ml)

- Bột hòa tan trong methanol (10

mg/ml)

- Để yên trong 15 phút trước khi sử dụng

[36]

Nhận xét: Phương pháp HPLC pha đảo với detector UV rất hay sử dụng để

phân tích các hợp chất phân cực và hấp thụ UV với ưu điểm: nói chung có tính đặc hiệu cao, tách riêng được hoạt chất Vì vậy, với các trang thiết bị sẵn có ở phòng thí nghiệm, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xác định hàm lượng Silymarin bằng phương pháp HPLC đơn giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp hơn với hi vọng có thể đưa vào sử dụng trong công tác kiểm nghiệm - góp phần quản lý chất lượng các sản phẩm chứa Silymarin

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng của Silymarin Đối tượng mẫu phân tích là các thực phẩm chức năng dưới một số dạng bào chế: viên nang cứng, viên nang mềm Các mẫu phân tích được lấy

từ thị trường có nguồn gốc từ các công ty sản xuất khác nhau và được mã hóa

Bảng 0.1 Danh mục các mẫu phân tích

2.2 Nguyên vật liệu - thiết bị

2.2.1 Nguyên vật liệu

- Chất chuẩn gốc Silybinin (silybin A và silybin B tỉ lệ 1:1) (SKS BCBM4810V, độ tinh khiết 98%), isosilybin A (SKS BCBP9324V, độ tinh khiết 95%) (Sigma, Mỹ)

- Dung môi loại tinh khiết cho HPLC: methanol, tetrahydrofuran (Merck, Đức)

- Dung môi loại tinh khiết phân tích: ethanol, methanol, aceton (Merck, Đức)

- Hóa chất tinh khiết phân tích: Natri hydroxyd, aicd perchloric (Merck, Đức)

- Nước cất 2 lần

2.2.2 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu (LC 20AD) trang bị

detector PDA (Shimadzu, Nhật)

- Cột sắc ký C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) (Waters, Mỹ)

- Tiền cột C18 Symmetry Waters (20 mm x 3,9 mm; 5 µm)(Waters, Mỹ)

- Cân kỹ thuật XT1200c (Precisa Gravimetric, Thụy Sĩ)

- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,0001 g và 0,00001 g (Mettler Toledo, Thụy Sĩ)

- Máy đo pH: pH Meter 744 (Metrohm, Thụy Sĩ)

- Máy lắc siêu âm Elma (Elma Schmidbauer, Đức)

- Máy lắc Vortex IKA (Ika, Đức)

- Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 20 mL, 25 mL, 50 mL, 100 mL, cốc có mỏ, pipet các loại, autopipet 1000 μL, 200 μL, 5mL

- Ống ly tâm 50 mL

- Vial 1,8 mL

- Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45 µm, 0,2µm

2.2.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát xây dựng điều kiện chạy máy HPLC để phân tích silymarin

- Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết silymarin trong thực phẩm chức năng

- Đánh giá quy trình phân tích và xử lý mẫu

- Áp dụng quy trình phân tích và xử lý mẫu với một số sản phẩm trên thị trường

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát các điều kiện phân tích silymarin bằng HPLC

Silymarin là hỗn hợp nhiều thành phần Chính vì vậy, trong khi xây dựng quy trình phân tích silymarin trong nghiên cứu này, chúng tôi đặt mục tiêu cần khảo sát các điều kiện sắc ký cho phép tách riêng các đồng phân của Silymarin để nâng cao hiệu quả ứng dụng thực tế của quy trình

- Pha tĩnh: chúng tôi chọn pha tĩnh là cột C18 Symmetry Waters (250mm x 4,6mm; 5µm.)

- Pha động: khảo sát chế độ gradient nồng độ bằng việc thay đổi thành phần (%) của:

+ Kênh A : Natri perchlorat (pH 3.0) (0.4 g NaOH hòa tan trong 1L nước cất, chỉnh đến pH 3 bằng acid perchloric )

+ Kênh B : Methanol (Merck)

- Tốc độ dòng: Dựa trên nhiều bài báo nghiên cứu [14], [21], [33], chúng tôi khảo sát với tốc độ dòng 1 mL/phút

+ Isosilybin A 150 µg/ml: Cân chính xác khoảng 15 mg chuẩn trên cân phân tích, cho vào bình định mức 100ml, thêm khoảng 80ml methanol, lắc đều cho tan hết, định mức đến vạch bằng methanol, lắc đều

- Dung dịch chuẩn làm việc được pha loãng từ dung dịch chuẩn bằng methanol

- Dung dịch đệm Natri perchlorat (pH 3): Cân khoảng 0,4 gam NaOH, hoàn tan vào 1 lít nước cất 2 lần, chỉnh pH đến pH 3 bằng acid perchloric, thêm khoảng 10ml tetrahydrofuran, lọc qua mang lọc 0,2µm

2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Dựa khả năng hòa tan của silymarin và tham khảo nhiều bài báo, nghiên cứu [19], [27], [32], [33], [40] chúng tôi khảo sát khả năng chiết silymarin từ nền mẫu bằng các loại các dung môi sau đây: methanol, ethanol Quy trình chiết silymarin cho đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng dạng nang cứng và nang mềm dự kiến gồm các bước sau:

- Xác định khối lượng trung bình viên, đồng nhất mẫu

- Cân chính xác một lượng mẫu sau khi đồng nhất (cân khoảng 0,1-1g, tùy thuộc

lượng silymarin công bố) vào ống ly tâm 50 mL

- Thêm khoảng 20 mL dung môi chiết vào ống ly tâm

- Lắc xoáy ống ly tâm 5 - 10 phút, sau đó lắc siêu âm 15-30 phút ở nhiệt độ

- Chuẩn bị các mẫu sau:

Mẫu trắng : mẫu thực phẩm chức năng không chứa Silymarin

Mẫu chuẩn hỗn hợp Silybinin và Isosilybin A

Mẫu trắng thêm chuẩn hỗn hợp

- Tiến hành chạy sắc ký 3 mẫu trên, so sánh các pic trên các sắc ký đồ thu được

- Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu trắng thu được, không được xuất hiện tín hiệu pic của chất phân tích

Trên sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn, cho tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu trùng với sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp [4]

Khoảng tuyến tính

- Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó

có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

- Đường chuẩn là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích

- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp chất phân tích có nồng độ tăng dần Tiến hành sắc ký, xây dựng phương trình đường chuẩn và xác định hệ số hồi quy tuyến tính R

- Yêu cầu : Hệ số hồi quy tuyến tính R phải đạt yêu cầu sau:

0,995 ≤ R ≤ 1

Hoặc 0,99 ≤ R2 ≤ 1

- Kiểm tra lại bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ của các điểm chuẩn

để xây dựng đường chuẩn, tính giá trị độ chệch theo công thức:

∆i = 𝐶𝑡−𝐶𝑐

𝐶𝑐 ×100

∆i: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

Ct: Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn

Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn

Độ thích hợp của hệ thống

- Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần sắc ký

- Yêu cầu: chênh lệch diện tích pic, tR giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) không lớn hơn 2,00%[4]

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được theo phương pháp

đã xây dựng Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể định lượng được theo phương pháp đã xây dựng với

- Đánh giá LOD đã tính được: tính r = 𝑥̅/LOD

+ Nếu 4 < r < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy

+ Nếu r > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại r

+ Nếu r < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dung, làm lại thí nghiệm và tính lại.[4]

Độ lặp lại

- Độ lặp lại là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại

- Để xác định độ lặp lại, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần trên mẫu thử có chứa silymarin Tính độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD