Nghiên cứu tổng hợp và xây dựng phương pháp định lượng tạp chất a của clopidogrel

Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng của sản phẩm IAC bằng phương pháp HPLC .... Đề tài “ Nghiên cứu tổng hợp và xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp A của clopidogrel” được th

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian nghiên cứu, tìm hiểu và thực hiện đề tài với rất nhiều

cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Với lòng biết sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths Đỗ

Thị Thanh Thủy giảng viên Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà

Nội, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị

kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình, các anh chị, các bạn và các em trong nhóm kiểm nghiệm tại bộ môn Hóa Dược đã luôn động viên khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2016 Sinh viên

Nguyễn Kim Chi

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ……… 1

Chương 1 TỔNG QUAN ……….………. 3

1.1 Clopidogrel 3

1.1.1 Một số thông tin chung về Clopidogrel 3

1.1.2 Chỉ định 3

1.1.3 Các dạng bào chế của clopidogrel trên thị trường 4

1.1.4 Các tạp chất của clopidogrel 5

1.1.4.1 Các tạp chất của clopidogrel 5

1.1.4.2 Phương pháp xác định tạp chất liên quan của clopidogrel theo một số dược điển 5

1.2 Tạp chất A của clopidogrel 6

1.3 Tổng quan về một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu đề tài 6

1.3.1 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) 6

1.3.2 Phương pháp đo năng suất quay cực 7

1.3.3 Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) 8

1.3.4 Phương pháp phân tích khối phổ (MS) 8

1.3.5 Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( NMR) 9

1.3.6 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 10

1.4 Một số phương pháp HPLC xác định tạp A của clopidogrel 11

1.4.1 Phương pháp HPLC 11

1.4.2 Phương pháp HPLC/MS 13

1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước 13

1.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… ………… 15

2.1 Nguyên liệu 15

2.2 Thiết bị 15

2.3 Nội dung nghiên cứu 16

2.3.1 Tổng hợp và tinh chế 16

2.3.2 Xây dựng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng của tạp A 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Tổng hợp tinh chế và xác minh cấu trúc tạp A 17

2.4.1.1 Phương pháp tổng hợp tạp chất A 17

2.4.1.2 Phương pháp tinh chế sản phẩm thô 17

2.4.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết 17

2.4.1.4 Xác định dạng đồng phân của sản phẩm 17

2.4.1.5 Xác định cấu trúc các chất tổng hợp được 17

2.4.2 Xác định hàm lượng sản phẩm bằng phương pháp HPLC 18

Chương 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ……… 19

3.1 Tổng hợp tạp chất A của clopidogrel 19

3.1.1 Nguyên tắc phản ứng 19

3.1.2 Khảo sát lựa chọn các điều kiện tổng hợp 19

3.1.3 Quy trình tổng hợp IAC 20

3.2 Tinh chế IAC 21

3.3 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và nhiệt độ nóng chảy 22

3.3.1 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC 22

3.3.2 Xác định nhiệt độ nóng chảy 23

3.4 Xác định cấu trúc sản phẩm 23

3.4.1 Xác định dạng muối kết hợp 23

3.4.2 Đo năng suất quay cực 24

3.4.3 Đo phổ IR của sản phẩm IAC 24

3.4.4 Đo phổ khối của sản phẩm IAC 25

3.4.5 Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân của sản phẩm IAC………… … .25

3.4.5.1 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR 26

3.4.5.2 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR 26

3.4.5.2 Kết quả phân tích phổ COSY 27

3.4.5.4 Kết quả phân tích phổ HSQC 28

3.5 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng của sản phẩm IAC bằng phương pháp HPLC 30

3.5.1 Xây dựng phương pháp 30

3.5.2 Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng sản phẩm IAC 31

3.5.2.1 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký 31

3.5.2.2 Độ đặc hiệu 32

3.5.2.3 Độ tuyến tính 33

3.5.2.4 Độ chính xác 34

3.5.2.5 Độ đúng 35

3.5.3 Kết quả xác định hàm lượng sản phẩm IAC 36

3.6 Bàn luận 36

3.6.1 Tính mới và hiệu quả kinh tế 36

3.6.2 Về quy trình tổng hợp 36

3.6.3 Về quy trình tinh chế 37

3.6.4 Về việc xác minh cấu trúc của IAC tinh chế được 38

3.6.5 Về xác định hàm lượng IAC tinh chế được bằng HPLC 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……… 40

KẾT LUẬN 40

KIẾN NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 41

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Clopidogrel bisulfat : CLS

EtOH : Ethanol

EP (European pharmacopoeia) : Dược điển Châu Âu

EPRS (European pharmacopoeia reference standard) : Chất chuẩn đối chiếu

của dược điển Châu Âu

KP (Korean pharmacopoeia) : Dược điển Hàn Quốc

KTCL : Kiểm tra chất lượng

MS (Mas spectrum) : Phổ khối

NMR (Nulear magnetic resonance) : Cộng hưởng từ hạt

TLTK : Tài liệu tham khảo

USP (United State pharmacopoeia) : Dược điển Mỹ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả giá trị Rf khảo sát thời gian phản ứng bằng TLC 20 Bảng 3.2 Hiệu suất của toàn bộ quá trình bán tổng hợp và tinh chế IAC 22 Bảng 3.3 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm IAC bằng TLC 23 Bảng 3.4 Kết quả đo NSQC của sản phẩm IAC 24 Bảng 3.5 Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký 31 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát tuyến tính 33 Bảng 3.7 Kết quả thẩm định độ chính xác của phương pháp 35 Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của clopidogrel 3 Hình 1.2 Một số sản phẩm chứa clopidogrel trên thị trường 4 Hình 1.3 Một số sản phẩm phối hợp của clopidogrel với hoạt chất khác 4 Hình 1.4 Công thức cấu tạo tạp chất A của clopidogrel 6 Hình 2.1.Tạp chuẩn A của clopidogrel EPRS 15 Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp tạp A của clopidogrel dự kiến 19 Hình 3.2 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng bằng TLC 20 Hình 3.3 Sơ đồ phản ứng tổng hợp IAC 21 Hình 3.4.Sắc ký lớp mỏng sản phẩm IAC với 3 hệ dung môi 23 Hình 3.5 Phổ IR của sản phẩm IAC và mẫu chuẩn 25 Hình 3.6 Phổ khối của sản phẩm IAC 25 Hình 3.7 Cấu trúc của sản phẩm IAC xác định bằng các phương pháp phổ 26 Hình 3.8 Phổ 1H NMR của sản phẩm IAC 26 Hình 3.9 Phổ 13C NMR của sản phẩm IAC 27 Hình 3.10 Tương tác COSY 28 Hình 3.11 Phổ COSY của sản phẩm IAC 29 Hình 3.12 Phổ HSQC của sản phẩm IAC 30 Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu trắng 32 Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 32 Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu thử 33 Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn sự phục thuộc giữa nồng độ và diện tích

pic IAC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới, hàng năm trên thế giới có 17,5 triệu người tử vong do các bệnh lý tim mạch Hơn 80% số người tử vong do bệnh tim mạch xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình trong đó có Việt Nam

Clopidogrel là thuốc được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh tim mạch,

nó làm giảm đáng kể tỷ lệ tai biến do thiếu máu cục bộ so với aspirin Được biết đến với nhiều biệt dược như: Lodovat, Clopidogrel, Pidocar, Plavix…trong đó có Plavix là thuốc được kê đơn phổ biến và bán chạy thứ hai trên thế giới năm 2010

Để đảm bảo chất lượng thuốc đến tay người sử dụng, cần tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu, và thành phẩm, trong quá trình sản xuất cũng như lưu thông phân phối và bảo quản Theo tiêu chuẩn một số dược điển cần phải kiểm tra chỉ tiêu các tạp chất liên quan của clopidogrel trong nguyên liệu cũng như các thành phẩm có chứa clopidogrel Trong quá trình xác định chỉ tiêu này phải sử dụng các dung dịch tạp chuẩn A, B, C của clopidogrel [20],[21] Nhưng các tạp chuẩn này hiện chưa có mặt tại Việt Nam, phải đặt mua ở nước ngoài với giá thành cao và thời gian đặt hàng khá lâu

Xuất phát từ nhu cầu thực tế chúng tôi tiến hành tổng hợp và tinh chế tạp A

của clopidogel (acid (+)-(S)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c] pyridin-5(4H)-acetic), để tiến tới thiết lập tạp chuẩn góp phần chủ động trong

công tác kiểm tra chất lượng thuốc

Đề tài “ Nghiên cứu tổng hợp và xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp A của clopidogrel” được thực hiện với 3 mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu được phương pháp tổng hợp tạp chất A của clopidogrel

2 Tinh chế tạp A đạt hàm lượng ≥ 95%

3 Xây dựng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng của tạp A

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Clopidogrel

1.1.1 Một số thông tin chung về Clopidogrel

- Dạng dược dụng của clopidogrel là clopidogrel bisulfat

- CTPT: C16H16 Cl NO2S H2SO4

- Phân tử lượng: 419,9

- CTPT: hình 1.1

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của clopidogrel

Tên khoa học: Methyl (+)-(S)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c] pyridin-5(4H)-acetat sulfat [21],[22]

- Tính chất:

+ Bột kết tinh màu trắng, thực tế không tan trong nước ở pH trung tính, nhưng dễ tan ở pH 1 Dễ tan trong methanol, tan ít trong methylen clorid, thực tế không tan trong ethyl ether [11]

+ Có khả năng hấp thụ UV và IR

1.1.2 Chỉ định

- Nhồi máu cơ tim (từ vài ngày cho đến khi ít hơn 35 ngày), đột quỵ (từ 7 ngày cho đến khi ít hơn 6 tháng) hoặc bệnh lý động mạch ngoại biên đã thành lập [2],[10],[16],[23]

- Kết hợp với aspirin để điều trị cho bệnh nhân bị hội chứng mạch vành cấp tính mà không có đoạn ST chênh lên (đau thắt ngực không ổn định hoặc không nhồi máu cơ tim không Q-sóng)[2],[10],[16],[23]

- Phòng ngừa các biến cố xơ vữa huyết khối và rung tâm nhĩ Ở những bệnh nhân bị chứng rung tâm nhĩ có ít nhất một yếu tố nguy cơ biến cố mạch máu, không phù hợp cho việc điều trị bằng thuốc kháng vitamin K và những người

có nguy cơ chảy máu thấp [2],[10],[16],[23]

1.1.3 Các dạng bào chế của clopidogrel trên thị trường

Hiện nay trên thị trường Việt Nam lưu hành 188 biệt dược có chứa hoạt chất clopidogrel Clopidogrel được bào chế đơn thành phần hoặc kết hợp với các hoạt chất khác như aspirin để làm tăng tác dụng [13],[17]

Các sản phẩm chứa clopidogrel được sản xuất và phân phối bởi các công ty trong nước và nước ngoài như: công ty cổ phần dược phẩm GLOMED, công

ty cổ phần Dược phẩm Hà Tây, công ty NAVANA PHARMACEUTICALS LTD…

Hình 1.2 Một số sản phẩm chứa clopidogrel trên thị trường

Hình 1.3 Một số sản phẩm phối hợp của clopidogrel với hoạt chất khác

1.1.4 Các tạp chất của clopidogrel

1.1.4.1 Các tạp chất của clopidogrel

- Tạp chất A: Acid (+)-(S)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c] pyridin-5(4H)-acetic [21],[22]

- Tạp chất B: Methyl (±)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c]

pyridin-6(7H)-acetat, hydroclorid [21],[22]

- Tạp chất C: Methyl (-)-(R)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c] pyridin-5(4H)-acetat, hydrogen sulfat [21],[22]

1.1.4.2 Phương pháp xác định tạp chất liên quan của clopidogrel theo một số dược điển

- Xác định bằng phương pháp HPLC với các điều kiện sắc ký [21],[22]

+ Sử dụng cột L57 theo USP (150 mm x 4,6 mm; 5 μl)

+ Pha động là hỗn hợp gồm đệm phosphat : acetonitril tỷ lệ 75:25

+ Tốc độ dòng 1,0 ml/phút

+ Detector: 220 nm

- Dung dịch chuẩn: Hòa tan chất chuẩn clopidogrel bisulfat và các tạp chuẩn

A, B, C của clopidogrel trong methanol để được dung dịch có nồng độ lần lượt là 20 µg/ml, 40 µg/ml, 120 µg/ml, 200 µg/ml Sau đó pha loãng với pha động để được dung dịch có nồng độ tương ứng là 0,5 µg/ml; 1 µg/ml; 3µg/ml;

Cl O HO

HCl

Hình 1.4 Công thức cấu tạo tạp chất A của clopidogrel

- Tên khoa học: Acid (+)-(S)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c] pyridine-5(4H)-acetic hydroclorid

- Tính chất: Bột màu vàng nhạt Tan tốt trong nước, methanol, và acetonitril [7]

- Tạp chất A của clopidogrel là sản phẩm thủy phân của clopidogrel trong môi trường kiềm hoặc là sản phẩm chuyển hóa của clopidogrel khi vào cơ thể dưới dạng tác dụng của enzym (esterase) [9],[11],[17],[18],[20]

- Độc tính của tạp chất A của clopidogrel: Gây độc trên tế bào người đặc biệt

là tế bào tủy xương [21]

1.3 Tổng quan về một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu đề tài 1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

- Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp sắc ký dùng chất hấp thụ làm pha tĩnh trải thành lớp mỏng trên tấm kính, nhựa hay kim loại Quá trình tách các hợp chất xảy ra khi cho pha động là dung môi di chuyển qua pha tĩnh [1]

- Ứng dụng [1]:

+ Định tính và thử tinh khiết: xác định nhờ chỉ số Rf Tuy nhiên vì có quá nhiều yếu tố ảnh hưởng đến R của một chất nên trong thực tế người ta thường

xác định các chất bằng cách sắc ký so sánh chất thử với chất chuẩn trên cùng một sắc ký đồ Nếu vết chất thử ngang với vết chất chuẩn (Rf của thử bằng

Rf của chuẩn) trên các sắc ký đồ với các hệ dung môi khác nhau thì có thể xác định chắc chắn chất thử là chất chuẩn Chất thử được coi là tinh khiết khi trên sắc ký đồ không có vết lạ

+ Bán định lượng và định lượng: có hai cách

Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp Sau khi làm sạch dịch chiết, định lượng các chất bằng một kĩ thuật thích hợp (phổ hấp thụ, huỳnh quang…)

Định lượng trực tiếp trên bản mỏng: đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký

1.3.2 Phương pháp đo năng suất quay cực

- Chất làm quay mặt phẳng phân cực theo chiều kim đồng hồ được gọi là chất hữu tuyền, kí hiệu là (+) Chất làm quay mặt phẳng phân cực ngược chiều kim đồng hồ được gọi là chất hữu tuyền, kí hiệu là (-) Nếu không có hướng dẫn riêng, góc quay cực α được xác định ở nhiệt độ 20oC và với chùm tia đơn sắc

có bước sóng ứng với vạch D (589,3) của đèn natri qua lớp chất lỏng hay dung dịch có bề dày 1 dm [1],[3]

- Ứng dụng:

+ Định tính: Với một chất ở điều kiện đo nhất định (về nhiệt độ và bước sóng) thì [α] của nó là một hằng số Vì thế việc xác định [α] giúp nhận biết được chất đó cũng như mức độ tinh khiết của nó

+ Định lượng: dựa vào định luật Bio, khi đã biết chiều d của ống đo và năng xuất quay cực [α], đo góc quay cực φ của dung dịch Từ đó sẽ xác định được nồng độ của dung dịch

+ Ngoài ra trong hóa học hữu cơ, việc nghiên cứu góc quay cực của một chất

giúp cho việc xác định đồng phân quang học Điều này có ý nghĩa trong nghiên cứu hóa học lập thể

1.3.3 Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR)

- Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi

nó đi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau Xác định sự có mặt của các nhóm chức trong phân tử dựa vào phổ IR để định tính các chất Trong kiểm nghiệm thuốc hầu hết các dược điển chủ yếu sử dụng IR vào việc định tính, ít được dùng trong định lượng [1],[3],[5]

- Ứng dụng phổ hồng ngoại trong định tính [1],[5]

+ Định tính sử dụng chất chuẩn:

Chuẩn bị mẫu chuẩn so sánh và mẫu thử rồi đo phổ chúng từ 4000 đến 670

cm-1 trong cùng điều kiện Cực đại hấp thụ ở phổ của mẫu thử phải tương ứng với phổ của chất chuẩn về vị trí và trị số

+ Định tính dùng phổ chuẩn trong atlas hoặc thư viện phổ

1.3.4 Phương pháp phân tích khối phổ (MS)

- Nguyên tắc của phương pháp phổ khối là dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không cao Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và vỡ ra thành từng mảnh Ngoài ion phân tử, phổ MS còn có các pic ion mảnh khác, dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và xác định lại cấu trúc hóa học các hợp chất Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch có cường độ khác nhau tập trung thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối [5]

- Ứng dụng [5]

+ Xác định đồng vị: các nguyên tử đồng vị của một nguyên tố có cùng số điện tích hạt nhân chỉ khác nhau số neutron nên khối lượng nguyên tử khác nhau Có thể dùng MS để xác định thành phần đồng vị của các nguyên tố trong

mẫu

+ Định tính: phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các phân

tử M+, (M+1)+, (M+2)+ Bên cạnh đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của chúng cùng với khối lượng của vài mảnh ion có thể xác định được công thức của chất phân tích Trong ngành dược thường sử dụng GC-

MS, LC-MS so sánh với thư viện phổ hoặc phổ chất đối chiếu để định tính mẫu

+ Xác định công thức cấu tạo: dùng kĩ thuật ion hóa thích hợp phân tích chất nghiên cứu thành nhiều mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng Việc biện giải phổ nên kết hợp với phổ NMR và IR

+ Định lượng: thường dùng kết nối LC-MS hoặc GC-MS để làm tăng tính chọn lọc, giới hạn định lượng cho phương pháp phân tích Điểm nổi bật của phân tích khối phổ là tính chọn lọc và độ nhạy Nên kĩ thuật này thường dùng

để phân tích hàm lượng vết trong mẫu phức tạp

1.3.5 Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

- Đây là phương pháp phổ hiện đại và được dùng nhiều trong xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ nói chung Với việc sử dụng kết hợp các

kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử Nguyên lý chung của phương pháp phổ NMR là sự cộng hưởng của các tần số khác nhau của các hạt nhân

từ (1H, 13C) dưới tác dụng của từ trường Các tần số cộng hưởng khác nhau được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học Ngoài ra đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào các tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau [5]

- Các đại lượng đặc trưng

+ Độ dịch chuyển hóa học δ: là vị trí khác nhau giữa vị trí hấp thụ của hạt nhân hydro trên phổ NMR của mẫu phân tích và của chất chuẩn

+ Sự tương tác spin-spin: tương tác từ của các nhóm proton khác nhau cho biết:

Số lượng H ở nguyên tử C bên cạnh

Mối tương quan của các nguyên tử H với nhau

- Ứng dụng [5]

+ Phổ proton (1H-NMR): Xác định sự có mặt của các nhóm có proton, bộ khung của hợp chất, số lượng proton ở C láng giềng, số lượng tương đối của proton cho tín hiệu cộng hưởng, phân biệt các dạng đồng phân, tính đồng nhất

và sự có mặt của tạp chất

+ Phổ carbon, (13C-NMR): cho tín hiệu của vạch phổ carbon, mỗi nguyên

tử carbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau

C-NMR

1.3.6 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Nguyên tắc: HPLC là một kĩ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh dưới tác động của pha lỏng Quá trình sắc kí dựa trên cơ sở hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích

cỡ Tùy theo bản chất của chất phân tích mà sử dụng detector thích hợp Hiện nay có nhiều loại detector như: UV-VIS, huỳnh quang, tán xạ bay hơi, độ dẫn, MS,… nhưng sử dụng nhiều nhất vẫn là detector UV-VIS [1],[3]

- Ứng dụng

+ Định tính:

Dựa vào sự giống nhau của thời gian lưu của chất phân tích trên sắc kí đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử

Trên các máy detector hiện đại với DAD (diod array detector) ta có thể vẽ phổ UV-VIS của pic chuẩn và pic thử rồi chồng 2 phổ lên nhau và đánh giá tương đồng thông qua hệ số Match

+ Định lượng: so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ pic chuẩn và pic thử (diện tích pic và chiều cao pic) trong cùng điều kiện sắc ký xác định là cơ sở cho phép định lượng

+ Xác định tạp liên quan: tính % tạp dựa vào tạp chuẩn, hoặc đối với phép thử tạp chất liên quan khi không biết tên tạp chất hoặc không có tạp chuẩn thì có thể tính % tạp chất dựa vào % diện tích pic của tạp đó so với tổng diện tích các pic (gồm các pic tạp và pic chính)

1.4 Một số phương pháp HPLC xác định tạp A của clopidogrel

1.4.1 Phương pháp HPLC

 Phương pháp 1

Phương pháp HPLC để xác định chỉ tiêu “tạp chất liên quan” trong nguyên

liệu clopidogrel bisulfat theo USP 37 và KP X đã trình bày ở phần “1.1.4.2

Phương pháp xác định tạp chất liên quan của clopidogrel theo một số dược điển” [21],[22]

 Phương pháp 2 [13]

- Sử dụng cột C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm)

- Pha động gồm: là hỗn hợp dinatri hydrophosphat dihydrat 0,1 M được điều chỉnh đến pH 2,2 ± 0,2 bằng dung dịch axit photphoric và acetonitril tỷ lệ 50:50 v/v

- Tốc độ dòng của pha động 1,0 ml/phút

- Thể tích tiêm mẫu 20 µl

- Detector: 240 nm

- Thể tích tiêm là 10 µl

1.4.2 Phương pháp HPLC/MS

 Phương pháp 1 [8]

- Sử dụng cột nhồi carbon graphit (10 cm x 2,1 mm; 2,7 µm)

- Pha động gồm: Dung dịch methanol trong nước nồng độ 70% có thêm 0,1% trifluoroacetic với tốc độ dòng 0,25 ml/phút

- Sử dụng máy đo phổ khối để xác định các chất cần phân tích

 Phương pháp 2 [17]

- Sử dụng cột C8 (10 cm x 2,1 mm; 2,7 µm)

- Pha động gồm kênh A là hỗn hợp methanol: nước tỷ lệ 55:45 có thêm 0,1% acid formic; kênh B là methanol có thêm 0,1% acid formic và được chạy chương trình gradient dung môi với tốc độ dòng 0,35 ml/phút

- Sử dụng máy đo phổ khối bẫy ion để xác định các chất phân tích

 Phương pháp 3 [16]

- Sử dụng cột C18 (10 cm x 2,1 mm; 3,5 µm)

- Pha động: kênh A là nước có thêm 0,1% acid formic; kênh B là acetonitril

có thêm 0,1% acid formic và được chạy chương trình gradient dung môi với tốc độ dòng 0,35 ml/phút

- Sử dụng máy đo phổ khối để xác định các chất phân tích

1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện tại ở Việt Nam chưa có nghiên cứu về tổng hợp và tinh chế các tạp chất của clopidogrel để sử dụng làm nguyên liệu thiết lập các tạp chuẩn dùng trong công tác kiểm tra chất lượng clopidogrel Mới chỉ có đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ tổng hợp Clopidogrel bisulfat làm thuốc điều trị các bệnh tim mạch” của TS.Nguyễn Văn Tài, Viện Dược liệu [6] Trên thực tế trong đề

tài này để kiểm tra chất lượng sản phẩm clopidogrel bisufat tổng hợp được tác giả phải sử dụng các tạp chuẩn được đặt mua ở nước ngoài

1.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thị trường đã có tạp chuẩn A do USP và EP sản xuất được bán với giá thành khá cao, tuy nhiên thời gian đặt mua lâu Hiện chưa có công bố nào về quy trình tổng hợp và thiết lập các tạp chuẩn của clopidogrel

Một số phương pháp xác định tạp chất A trong các tài liệu tham khảo mà chúng tôi tham khảo được là các phương pháp HPLC, HPLC-MS Trong các phương pháp tác giả có chuẩn bị mẫu thử có chứa tạp A bằng các phản ứng thủy phân, nhưng đó mới là cách chuẩn bị các dung dịch thử để phân tích chứ chưa phải là một quy trình tổng hợp và tinh chế tạp chất A

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

- Clopidogrel bisulfat do Viện Dược liệu sản xuất, lô B 21, hàm lượng 98,0%

- Chất đối chiếu: Chất chuẩn Clopidogrel impurity A (Chất chuẩn dược điển châu âu EPRS, lô 2, code Y0001335)

Hình 2.1: Tạp chuẩn A của clopidogrel EPRS

- Hóa chất, dung môi:

+ Ethanol PA + Ethyl acetat PA

+ Natri hydroxyd P + Aceton PA

+ Lithi hydroxyd PA + Acid acetic băng PA

+ Acid hydrocloric PA + Natri dihydro phosphat PA + Acetonitril dùng cho HPLC + Methanol dùng trong HPLC + Diclomethan PA + AgNO3 PA

+ Propanol PA + Acid nitric PA

+ n-Hexan PA + Nước cất

+ Ether dầu hỏa PA

2.2 Thiết bị

- Bản mỏng silicagel GF 254 (Merck)

- Cân kĩ thuật điện tử Sartorius

- Cân phân tích diện tử Ohaus PA214 (0,1 mg)

- Cân phân tích điện tử Sartorius (0,01 mg)

- Máy siêu âm RK 106 Bandenlin

- Đèn soi tử ngoại UV-VIS Vilber Lourmart

- Máy cất quay chân không Burchi R201

- Máy khuấy từ gian nhiệt IKA

- Máy HPLC Agilent 1200

- Máy đo phổ hồng ngoại Agilent 660 FTIR

- Máy xác định nhiệt độ nóng chảy SMP 3 Stuart

- Máy đo phổ khối Agilent 6460 Triple Quad LC/MS

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Ascend 500MHz để ghi phổ

- Tủ sấy chân không WOV-70

- Tủ sấy chân Memmer ULM-500

- Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, sinh hàn hồi lưu, pipet, bình gạn, phễu thủy tinh, bình chạy sắc ký lớp mỏng

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp và tinh chế

- Tổng hợp tạp A của clopidogrel Acid dihydrothieno[3,2-c]pyridin-5(4H)-acetic

(+)-(S)-α-(2-chlorophenyl)-6,7 Tinh chế tạp A

- Kiểm tra độ tinh khiết

- Xác định cấu trúc của sản phẩm tổng hợp được

2.3.2 Xây dựng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng của tạp A

- Xây dựng phương pháp HPLC

- Thẩm định phương pháp

- Xác định hàm lượng của tạp A

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tổng hợp tinh chế và xác minh cấu trúc tạp A

2.4.1.1 Phương pháp tổng hợp tạp chất A

- Dựa trên nguyên tắc tổng hợp tạp chất A từ clopidogrel sulfat bằng phản ứng thủy phân trong môi trường kiềm

2.4.1.2 Phương pháp tinh chế sản phẩm thô

- Sử dụng các dung môi và điều kiện phù hợp để tinh chế sản phẩm thô

2.4.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết

- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy

• Sắc ký lớp mỏng với bản mỏng silicagel GF254 hoạt hóa ở 110oC trong vòng 1 giờ

• Đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy xác định nhiệt độ nóng chảy SMP 3 Stuart

2.4.1.4 Xác định dạng đồng phân của sản phẩm

- Xác định dạng đồng phân của sản phẩm bằng phương pháp đo năng suất quay cực Sử dụng phân cực kế Kruess với ống đo có chiều dài 1dm, mẫu trắng làm methanol

2.4.1.5 Xác định cấu trúc các chất tổng hợp được

Các chất tổng hợp được được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân

- Phổ hồng ngoại (IR): được ghi tại bộ môn Hóa Dược, trường đại học Dược

Hà Nội trên máy Agilent 660 FTIR với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400 cm-1 Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ

khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không

để loại bỏ hơi ẩm

- Phổ khối lượng (MS): được đo bằng máy khối phổ Agilent 6460 Triple Quad LC/MS, tại bộ môn Hóa phân tích, trường đại học Dược Hà Nội, chế độ

đo LC/MS, dung môi hòa tan mẫu methanol

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên máy Bruker Ascend 500MHz, tại khoa Hóa trường đại học Khoa học Tự nhiên, dung môi DMSO-d6 Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million - ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan

2.4.2 Xác định hàm lượng sản phẩm bằng phương pháp HPLC

- Xác định hàm lượng sản phẩm bằng phương pháp HPLC Tiến hành đo tại

bộ môn Hóa phân tích, trường đại học Dược Hà Nội trên máy HPLC Agilent

1200 Sử dụng cột C8, detector UV 220 nm

Chương 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Tổng hợp tạp chất A của clopidogrel (IAC)

3.1.1 Nguyên tắc phản ứng

Nguyên tắc: tổng hợp IAC dựa vào phản ứng thủy phân clopidogrel trong môi trường kiềm

Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp tạp A của clopidogrel dự kiến

3.1.2 Khảo sát lựa chọn các điều kiện tổng hợp

Tiến hành khảo sát lựa chọn dung môi hòa tan, chất thủy phân và điều kiện nhiệt độ tiến hành

- Khảo sát dung môi hòa tan: lựa chọn ethanol 96o vì đây là dung môi rẻ tiền, không độc hại và hòa tan dễ dàng nguyên liệu clopidogrel bisulfat

- Lựa chọn chất thủy phân: dựa vào đặc điểm cấu trúc của nguyên liệu clopidogrel có nhóm chức ester dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm để thủy phân như LiOH, NaHCO3, NaOH và lựa chọn NaOH là tác nhân thủy phân vì NaOH là nguyên liệu dễ mua, rẻ tiền hơn LiOH và cho phản ứng thủy phân xảy ra hoàn toàn hơn NaHCO3

- Nhiệt độ phản ứng tiến hành ở nhiệt độ 40oC theo TLTK số 15

- Khảo sát thời gian phản ứng

+ Tiến hành khảo sát thời gian phản ứng ở 4 khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ,

24 giờ, và 48 giờ Để kiểm tra phản ứng đã xảy ra hoàn toàn hay chưa chúng tôi tiến hành triển khai sắc kí lớp mỏng dung dịch phản ứng song song với dung dịch clopidogrel trong ethanol Kết quả thu được cho thấy dung dịch phản ứng ở thời điểm 48h, không còn xuất hiện vết của clopidogrel (bảng 3.1, hình 3.2) Vì vậy chọn thời gian phản ứng là 48h

Hình 3.2 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng bằng TLC

Bảng 3.1 Kết quả giá trị Rf khảo sát thời gian phản ứng bằng TLC

4 giờ 8 giờ 24 giờ 48 giờ

Rf của dung dịch clopidogrel

O NaO

Cl

HCl

N S

Cl O HO

HCl

Hình 3.3 Sơ đồ phản ứng tổng hợp IAC

Hòa tan 0,5044 g clopidogrel bisulfat (CLS) (1,2 mmol) bằng 10 ml ethanol

96o trong bình cầu dung tích 100 ml thu được dung dịch A Hòa tan 0,613 g NaOH (15 mmol) trong 2 ml nước cất thu được dung dịch B Đổ từ từ dung dịch B vào dung dịch A rồi đem khuấy từ ở nhiệt độ 40oC trong vòng 48 giờ

Để nguội khối phản ứng đến nhiệt độ phòng, sau đó thêm từ từ từng giọt dung dịch HCl đặc cho đến khi pH đạt khoảng 5 (thử bằng chỉ thị vạn năng), khuấy trộn đều 5 phút, để tủ lạnh 2-8oC qua đêm Lọc loại tủa (muối vô cơ) và thu lấy dịch cồn Rửa tủa bằng 10 ml ethanol 96o, gộp dịch rửa cùng với dịch lọc đem cất quay ở 40o

C để loại dung môi thu được IAC thô

3.2 Tinh chế IAC

Đem tinh chế toàn bộ lượng IAC thô thu được, sử dụng dung môi methanol

và acetonitril để tinh chế Với mỗi giai đoạn đều tiến hành hòa tan IAC thô trong lượng dung môi giảm dần

Giai đoạn 1: sử dụng methanol tinh chế Lần 1 dùng 30 ml, lần 2 dùng 20

ml, lần 3 dùng 10 ml

Giai đoạn 2: sử dụng acetonitril để tinh chế Lần 1 dùng 25 ml, lần 2 dùng

15 ml, lần 3 dùng 10 ml

Sau mỗi lần hòa tan lại để qua đêm trong tủ lạnh 2-8oC rồi lọc loại bỏ tủa

là các muối vô cơ, phần dịch lọc thu được đem cất quay để loại bỏ dung môi thu sản phẩm, sấy khô sản phẩm ở 60oC trong 24 giờ thu được IAC tinh khiết Tiến hành lặp lại 3 lần quá trình bán tổng hợp và tinh chế để tính hiệu xuất của toàn bộ quá trình bán tổng hợp và tinh chế Kết quả hiệu xuất trung bình

Khối lƣợng IAC tinh khiết thu đƣợc (g)

Hiệu xuất (%)

3.3.1 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC

Qua khảo sát chúng tôi đã lựa chọn ra 3 hệ sắc kí lớp mỏng để kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm như sau:

- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck) hoạt hóa ở 110oC trong vòng 1 giờ

- Các hệ dung môi khai triển:

+ Hệ 1: acetonitril: diclomethan (8:2)

+ Hệ 2: propanol: n-hexan (9:1)

+ Hệ 3: ether dầu hỏa: ethyl acetat: aceton: acid acetic (14:4:1:8)

- Tiến hành chấm sắc ký dung dịch sản phẩm trong methanol song song với dung dịch clopidogrel bisulfat trong methanol

- Phát hiện vết sắc ký bằng đèn UV 254 nm

Kết quả thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.4

Bảng 3.3 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm IAC bằng TLC

Hệ dung môi khai

Rf của IAC 0,16 0,43 0,64

Rf của clopidogrel 0,96 0,69 0,74

Hình 3.4.Sắc ký lớp mỏng sản phẩm IAC với 3 hệ dung môi

Kết quả cho thấy vết IAC và vết clopidogrel có giá trị khác nhau hoàn toàn

và trên sắc ký đồ của dung dịch IAC chỉ thu được 1 vết duy nhất cả ở 3 hệ dung môi khai triển, như vậy có thể thấy sản phẩm thu được khá tinh khiết

3.3.2 Xác định nhiệt độ nóng chảy

Đo nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm IAC bằng máy xác định nhiệt độ nóng chảy SMP 3 Stuart Kết quả nhiệt độ nóng chảy của IAC từ 134-138oC Với khoảng chảy tương đối hẹp sơ bộ xác định sản phẩm khá tinh khiết

3.4 Xác định cấu trúc sản phẩm

3.4.1 Xác định dạng muối kết hợp

Cho dung dịch IAC trong nước phản ứng với dung dịch AgNO3 2% trong môi trường HNO3 loãng Sản phẩm cho tủa trắng lổn nhổn, tủa này tan trong dung dịch amoniac Như vậy sản phẩn IAC tạo thành là dạng muối hydroclorid

3.4.2 Đo năng suất quay cực

Hòa tan 0,6310 g IAC trong 15 ml methanol , đo năng suất quay cực (NSQC), mẫu trắng là methanol

Kết quả thu được ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả đo NSQC của sản phẩm IAC

3.4.3 Đo phổ IR của sản phẩm IAC

Đo phổ IR của mẫu sản phẩm IAC và song song với mẫu tạp chuẩn A của clopidogrel Kết quả chồng phổ cho thấy 2 phổ gần như trùng khít, với các dải hấp thụ đặc trưng của nhóm carbonyl (C=O) (ν = 1639,5 và 1639,6) và nhóm hydroxyl (OH) (ν = 3407,2) và 3418,0) như hình 3.5

Như vậy kết quả nghiên cứu trong đề tài hoàn toàn phù hợp

Hình 3.5 Phổ IR của sản phẩm IAC và mẫu chuẩn

3.4.4 Đo phổ khối của sản phẩm IAC

Đo bằng máy khối phổ Agilent 6460 Triple Quad LC/MS với dung môi hòa tan mẫu methanol Kết quả trên phổ đồ cho pic [M+H]+

= 307,9 phù hợp với công thức C15H14ClNO2S của tạp A của clopidogrel Ngoài ra trên phổ

MS của IAC còn xuất hiện pic 329,9 tương ứng với [M+Na]+ , hình 3.6

Hình 3.6 Phổ khối của sản phẩm IAC 3.4.5 Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân của sản phẩm IAC

Tiến hành đo phổ 1HMNR, 13CNMR, COSY và HSQC của IAC bằng máy

đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker sử dụng dung môi là methanol

3.4.5.1 Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR

1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ: 7,78 (d, J = 7,5Hz,1H, H-3’), 7,63(d, J = 7,9 Hz, 1H, H-6’ ), 7,52 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-4’), 7,47 (t, J = 7,7 Hz, 1H, H- 5’), 7,36 (d, J = 5,1 Hz, 1H, H-2”), 6,81 (d, J = 5,1 Hz, 1H, H-3”), 5,40 (s, 1H, H-2), 4,37 (d, J = 14,5 Hz, 1H, H-6a”), 4,13 (d, J = 14,6Hz, 1H, 6b”),

Hình 3.8 Phổ 13

CNMR của sản phẩm IAC

3.4.5.2 Kết quả phân tích phổ COSY

Đo phổ COSY kết quả cho thấy hai proton của vòng thiophen có độ chuyển

ra peak phổ triplet Tương tự như thế ta có thể xác định được proton 5’ và proton 6’ Điều này cũng được thể hiện rõ qua tương tác 2 chiều COSY, khi ta

có thể nhận thấy các tương tác gây ra bởi các proton (hình 3.9)

Hình 3.9 Tương tác COSY

Các proton trên vòng piperidin cũng được xác định dễ dàng bằng phổ

1HNMR và cũng có thể được xác định chính xác bằng tương tác COSY Hai

proton tại vị trí 6” có độ chuyển dịch hóa học lần lượt là 4,37 ppm, 4,13 ppm

tương tác với nhau gây ra 2 peak phổ (d, J = 14,5 Hz) và không có tương tác

COSY với các proton còn lại trong vòng Trong khi đó, 4 proton tại vị trí 7”

và 4” có độ dịch chuyển 3,81 ppm, 3,65 ppm, 3,24 ppm có tương tác 2 chiều COSY với nhau (hình 3.10)

Hình 3.1 Phổ COSY của sản phẩm IAC 3.4.5.4 Kết quả phân tích phổ HSQC

Sau khi xác định chính xác vị trí của các proton thì việc xác định độ dịch chuyển hóa học của các carbon trở nên dễ dàng hơn rất nhiều bằng việc sử dụng phổ 2 chiều HSQC Tương tác trực tiếp giữa proton-carbon cho phép chỉ

ra vị trí của các carbon trên phổ 13C

Từ phổ HSQC ta có thể thấy, độ chuyển dịch 21,9 ppm tương ứng với carbon 7” do proton 7” có độ dịch chuyển 3,24 ppm và tương tác trực tiếp với carbon 7” trên phổ HSQC Tương tự như thế, chúng ta có thể xác định lần lượt carbon 6” và 4” có độ chuyển dịch là 50,1 ppm, carbon 2 có độ chuyển dịch là 67,8 ppm Hai carbon 2” và 3” có độ dịch chuyển lần lượt là 125,1

ppm và 124,7 ppm Các carbon trong vòng phenyl và 2 carbon còn lại trong vòng thiophen có độ dịch chuyển lần lượt là 131,6, 131,5, 130,3, 129,6, 129,4, 127,9, 127,5 ppm và có thể xác định được carbon 11 liên kết trực tiếp với clo

có độ dịch chuyển 135,5 ppm Carbon của acid carboxyic được xác định có

Như vậy phương pháp đo NSQC và các phương pháp phổ khẳng định cấu

trúc của sản phẩm là acid (+)-(S)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-] pyridine-5(4H)-acetic (hình 3.12)

N S

Cl O HO

Hình 3.12: Cấu trúc của sản phẩm IAC xác định bằng các phương pháp phổ

3.5 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng của sản phẩm IAC bằng phương pháp HPLC

3.5.1 Xây dựng phương pháp

Trên cơ sở tham khảo 1 số TLTK và dựa trên điều kiện thực nghiệm sẵn có chúng tôi xây dựng phương pháp HPLC với detector UV để xác định hàm lượng của sản phẩm IAC như sau: