Nghiên cứu khảo sát hàm lượng apigenin trong cúc hoa vàng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu khảo sát hàm lượng Apigenin trong Cúc hoa vàng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”, ngoài sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình củ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

TRẦN THỊ HIỀN

Mã sinh viên: 1101180 NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG

APIGENIN TRONG CÚC HOA VÀNG

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu khảo sát hàm lượng Apigenin

trong Cúc hoa vàng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”, ngoài sự làm

việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ

từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước hết, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Việt

Hùng - Phó Viện Trưởng Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, người đã tạo rất

nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Trần Nguyên Hà - Phó Trưởng bộ môn Hóa phân tích - Độc chất, ThS Đặng Thị Ngọc Lan - GV Bộ môn Hóa phân tích -

Độc chất đã đóng góp ý kiến, tận tình sửa chữa giúp em hoàn thành khóa luận này

Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Nguyễn Thị Hằng - Khoa

Nghiên cứu phát triển - Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, người đã tận tình hướng dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong Viện Pháp Y Quốc Gia, Khoa Nghiên cứu phát triển, Khoa Vật lý đo lường Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã

hỗ trợ em trong quá trình nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy em suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2016

Trần Thị Hiền

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về cúc hoa vàng 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2 Phân bố 3

1.1.3 Thành phần 4

1.1.4 Tác dụng của Cúc hoa vàng 5

1.2 Tổng quan về Apigenin 5

1.2.1 Tính chất 5

1.2.2 Tác dụng của Apigenin 6

1.3 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao 7

1.3.1 Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao 7

1.3.2 Máy HPLC 7

1.3.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký 8

1.3.4 Ứng dụng của HPLC 9

1.3.5 Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) 11

1.3.6 Một số nghiên cứu đã thực hiện về Cúc hoa vàng và Apigenin 12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng, nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu 14

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử 15

2.3.2 Pha dung dịch chuẩn 15

2.3.3 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 15

2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích theo tiêu chuẩn AOAC 16

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 19

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký và chuẩn bị các dung dịch tiêm sắc ký 21

3.1.1 Chiết xuất 21

3.1.2 Pha dung dịch thử 22

3.1.3 Pha dung dich chuẩn 22

3.1.4 Lựa chọn cột sắc ký 22

3.1.5 Lựa chọn bước sóng phát hiện 22

3.1.6 Lựa chọn tốc độ dòng 23

3.1.7 Lựa chọn pha động 23

3.2 Thẩm định phương pháp định lượng Apigenin trong Cúc hoa vàng theo tiêu chuẩn AOAC 27

3.2.1 Độ đặc hiệu 27

3.2.2 Độ tương thích của hệ thống sắc ký 28

3.2.3 Độ lặp lại của phương pháp 29

3.2.6 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 33

3.3 Xác định hàm lượng Apigenin trong Cúc hoa vàng 35

3.4 Bàn luận 36

3.4.1 Lựa chọn phương pháp 36

3.4.2 Điều kiện xử lý mẫu 37

3.4.3 Xây dựng phương pháp định lượng 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

Chromatography)

Bảng Tên bảng Trang

Hình Tên ảnh, sơ đồ Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là trong lĩnh vực

y, dược học, ngày càng có nhiều nghiên cứu các thành phần hoạt chất mang hoạt tính sinh học trong dược liệu có tác dụng phòng, chữa bệnh, mang lại tiềm năng rất lớn cho việc sử dụng dược liệu làm nguyên liệu làm thuốc chữa các bệnh nan y Xu thế tất yếu

là kết hợp hai nền y học cổ truyền và y học hiện đại nhằm giải quyết những khó khăn của Y học Trong những năm gần đây, xu hướng quay trở lại sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng và điều trị bệnh đang ngày càng trở nên thịnh hành trên thế giới

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong dược liệu có tác dụng chống oxy hóa và các gốc tự do Apigenin là một flavonoid thiên nhiên có hoạt tính sinh học được chiết xuất từ cúc hoa vàng Các nghiên cứu gần đây cho thấy apigenin là một chất chống oxy hóa, có đặc tính chống viêm và chống ung thư [13], [18] Nó có thể ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư bằng cách bắt giữ các chu kỳ tế bào ở giai đoạn G2/M Apigenin có khả năng gây ảnh hưởng trên nhiều loại phân tử Hầu hết tác dụng qua trung gian ức chế nitric oxid synthase-2 (NOS2), yếu tố cảm ứng tăng áp oxy (hypoxia inducible factor 1α HIF-1α), lipoxygenase, cyclooxygenase-2 (COX-2) và yếu tố tăng sinh mạch máu (vascular endothelial growth factor - VEGF) [5], [18] Cây cúc hoa vàng được trồng nhiều ở nước ta từ hàng nghìn năm trước lấy hoa dùng chữa các chứng nhức đầu, đau mắt, chảy nước mắt, cao huyết áp, sốt… [6], [13], [17] Ngoài ra, cúc hoa vàng được sử dụng kết hợp trong cái bài thuốc chữa hư nhược thần kinh, chữa đinh râu, viêm màng tiếp hợp dị ứng… [6] Trong DĐVN, DĐTQ cũng có chuyên luận riêng về cúc hoa vàng, tuy nhiên lại không đề cập đến thành phần apigenin Hiện nay, nguồn gốc và chất lượng dược liệu đang rất khó quản lý do còn gặp rất nhiều khó khăn, thiếu những dữ liệu chuẩn làm cơ sở nhận biết, xác định dược liệu

Để góp phần bổ sung bộ dữ liệu chuẩn dược liệu cho Dược điển Việt Nam phục

vụ công tác kiểm nghiệm thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khảo sát

hàm lượng Apigenin trong Cúc hoa vàng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” nhằm các mục tiêu:

1 Khảo sát và thẩm định phương pháp định lượng Apigenin bằng HPLC

2 Khảo sát sơ bộ hàm lượng Apigenin trong các mẫu Cúc hoa vàng trên thị trường hiện nay

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cúc hoa vàng

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Tên khác: kim cúc, hoàng cúc, dã cúc, cam

cúc, khổ ý, bioóc kim (Tày)

Tên khoa học: Chrysanthemum indicum L

Tên đồng nghĩa: Chrysanthemum procumbens

Lour

Họ: Cúc (Asteraceae)

Đặc điểm thực vật: Cây thảo, sống hàng

năm hay sống dai, cao 20-50 cm Thân mọc

thẳng, nhẵn, có khía dọc, phân cành ở ngọn

Lá thơm, mọc so le, hình bầu dục, có thùy sâu, không lông, mép có răng cưa nhọn, không đều, mặt trên màu lục đen sẫm, mặt dưới nhạt, cuống lá ngắn, có tai ở gốc Cụm hoa hình đầu, màu vàng hơi nâu, đôi khi còn đính cuống; đường kính 0,5

cm đến 1,2 cm Tổng bao gồm 4 đến 5 hàng lá bắc, mặt ngoài màu xanh hơi xám hoặc nâu nhạt, ở giữa hai bên mép rất nhạt và khô xác Có 2 loại hoa: Hoa hình lưỡi nhỏ một vòng, đơn tính, không đều ở phía ngoài; nhiều hoa hình ống, đều, mẫu năm, lưỡng tính ở phía trong Chất nhẹ, mùi thơm, vị đắng Quả bế trụi Hoa thu hái vào đầu tháng 10 đến tháng 1-2 năm sau Hoa hái về đem đổ rồi phơi 3 - 4 nắng đến khô Nếu trời râm, phải sấy than hoặc lửa nhẹ [3], [5], [6], [18]

1.1.2 Phân bố

Cúc hoa vàng phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ẩm và cận nhiệt đới Bắc bán cầu: Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lào, Thái Lan, Ấn Độ, Cúc hoa vàng được trồng làm cây cảnh, và từ lâu được trồng làm thuốc ở Trung Quốc, Nhật Bản [16], [22]

Hình 1.1: Cúc hoa vàng

Ở Việt Nam, Cúc hoa vàng đƣợc trồng từ lâu đời Cúc hoa vàng đƣợc dùng làm thuốc hay ƣớp chè, nấu rƣợu và đƣợc trồng nhiều ở các làng Nghĩa Trai (Hƣng Yên), Nhật Tân và Tế Tiêu (Hà Nội)… [16], [17]

α Thành phần chủ yếu tinh dầu cúc hoa vàng một số vùng Trung Quốc: 1,8α cineol (0,62-7,34%), (+)-(1R,4R)-camphor (0,17-27,56%), caryophyllen oxid (0,54-5,8%), beta-phellandren (0,72-1,87%), (-)-(1S,2R,4S)-borneol acetat (0,33-8,46%), 2-methyl-6-(p-tolyl)hept-2-en (0,3-8,6%), 4,6,6-trimethylbicyclo[3.1.1]hept-3-en-2-ylacetat (0,17-26,48%) và hexadecanoic acid (0,72-15,97%) [13], [17]

- Carotenoid: chrysanthemoxanthin [13], [17]

- Sesquiterpen: arteglasin A, yejuhua lacton, handelin, chrysetunon, cumambrin A, angeloylajadin, tuncfulin [17]

- Flavonoid: luteolin, quercetin, apigenin, luteolin-7-O-beta-D-glucopyranosid,

acacilin, baicalin, luteolin-7-O-β-D-glucopuranosid, glucopyranosid, cyanidin-3-O-(6-O-malonyl-β-D-glucopyranosid) [17]

4’-methoxyluteolin-7-O-β-D Acid phenol: acid clorogenic, acid quinic4’-methoxyluteolin-7-O-β-D 44’-methoxyluteolin-7-O-β-D O4’-methoxyluteolin-7-O-β-D cafeciat, acid quinic4’-methoxyluteolin-7-O-β-D 3,44’-methoxyluteolin-7-O-β-D di4’-methoxyluteolin-7-O-β-D O4’-methoxyluteolin-7-O-β-D cafciat [17]

quinic-3,4-di-O Acid amin: adenin, cholin, stachydrin [17]

- Thành phần khác: indicumenon, β- sitosterol, α- amyrin, friedelin, sesamin, adenin, cholin, stachydrin và vitamin A [17]

1.1.4 Tác dụng của Cúc hoa vàng

Cúc hoa vàng có vị ngọt, hơi đắng, tính bình hơi mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải cảm, tán phong thấp, giáng hỏa, giải độc [6] Cúc hoa vàng có nhiều tác dụng dược lý như tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, chống gốc tự do, kháng khuẩn,

hạ huyết áp và có hoạt tính gây phản vệ [6], [10] Cúc hoa vàng có tác dụng chống viêm thực nghiệm trên chuột cống trắng [10] Dịch chiết ethanol cúc hoa vàng có tác dụng chống viêm, điều hòa miễn dịch dịch thể và tế bào và hoạt động thực bào

đơn nhân [6]

Cúc hoa vàng có tác dụng hạ huyết áp trên động vật thí nghiệm (chó), cũng như có tác dụng tốt đối với bệnh nhân cao huyết áp Khả năng làm hạ huyết áp của cúc hoa vàng có thể là hiệu quả của tác dụng ức chế phản xạ vận mạch có nguồn gốc trung tâm và tác dụng ức chế adrenalin [6]

Bài thuốc chứa cúc hoa vàng cũng được dùng để điều trị cho bệnh nhân suy nhược thần kinh loại hưng phấn tăng, đa số có nguyên nhân do sang chấn tinh thần Phương pháp chữa là hạ hưng phấn, an thần, phối hợp với châm cứu đã đạt kết quả tốt [6]

Cúc hoa vàng thường được dùng để chữa: phong cảm lạnh, cúm, viêm não, viêm mủ da, viêm vú, chóng mặt, cao huyết áp, đau mắt đỏ, chảy nhiều nước mắt, viêm gan Dùng ngoài chữa trị đinh nhọt, rắn cắn, chấn thương bầm dập [5], [6]

1.2 Tổng quan về Apigenin

1.2.1 Tính chất

Công thức phân tử C15H10O5Phần trăm thành phần: C 66,67%, H 3,73%, O 29,60% [13]

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-

5,7-Hình 1.2: Công thức cấu tạo Apigenin

benzopyran-4-on [13]

Tên khác: 4',5,7-Trihydroxyflavon; 2-(p-hydroxyphenyl) -5,7- dihydroxychromon Trọng lượng phân tử: 270,24

Điểm nóng chảy: 345-350°C Điểm sôi: 555,51°C ở 760 mmHg

Hấp thụ tối đa: UV tối đa (Ethanol): 340 nm

Apigenin (4',5,7-trihydroxyflavon) là một flavonoid tự nhiên, thuộc nhóm flavon được tìm thấy trong nhiều loài thực vật, nhưng rau mùi tây, cần tây và cúc hoa là những nguồn phổ biến nhất Nó là một chất rắn kết tinh màu vàng [6], [17], [18]

Độ hòa tan: Hòa tan trong dimethylsulfoxid (27 mg/ml) hoặc dung dịch KOH 1M (50mg/ml) Thực tế không tan trong nước, tan vừa phải trong rượu nóng Hệ số phân bố (log K) được tính từ tỷ lệ hòa tan của apigenin trong n-octanol và nước là 2,87 [6], [17], [18]

Một số glycosid tự nhiên hình thành bởi sự kết hợp của apigenin với đường bao gồm: Apiin, Apigetrin (apigenin-7-glucosid), Vitexin (apigenin-8-C-glucosid), Isovitexin (apigenin-6-C-glucosid hoặc homovitexin, saponaretin), Rhoifolin (apigenin-7-O-neohesperidosid) Có thể thu được apigenin từ apiin bằng cách đun sôi với axid, từ apigenin-7-glucosid thủy phân bằng enzyme với emulsin hoặc đun với H2SO4 15% [6], [17], [18]

1.2.2 Tác dụng của Apigenin

Apigenin ức chế sự hoạt động của collagenase liên quan đến viêm khớp dạng thấp (RA) và nội độc tố tạo nitric oxid (NO) trong đại thực bào.Apigenin cũng giảm nội độc tố biểu hiện trên cyclooxygenase-2 (COX-2) Tóm lại, những kết quả cho thấy apigenin có hoạt tính chống viêm quan trọng có liên quan đến ngăn chặn nitric oxide qua trung gian COX-2 và các bạch cầu đơn nhân, apigenin có thể điều trị các bệnh viêm nhiễm [18], [9]

Apigenin có hiệu quả ức chế sự tiến triển ung thư tuyến tiền liệt ở chuột bởi suy giảm IGF-I (Insulin - like growth factors - các yếu tố sinh trưởng tương tự insulin) Nồng độ IGF-I trong máu cao sẽ làm giảm tiết GH qua cơ chế điều hòa

ngược IGF-I đóng vai trò quan trọng đối với việc điều tiết các hoạt động của tế bào không những trong trạng thái sinh lý mà còn trong các quá trình bệnh lý kể cả ung thư [9]

Apigenin hoạt động hoạt hóa vận chuyển monoamin, một trong số ít các chất

có tác dụng này, đã cải thiện nhiều rối loạn bệnh học thần kinh, đặc biệt là phụ thuộc cocain, thông qua cách điều chỉnh các hoạt động vận chuyển oxidase [9], [18] Apigenin cũng có thể kích thích tế bào thần kinh người trưởng thành, bằng cách thúc đẩy sự phân hóa tế bào thần kinh, có thể điều trị các bệnh thần kinh, rối loạn và bị tổn thương, nghiên cứu trên chuột và ảnh hưởng trên người vẫn chưa được chứng minh [9]

1.3 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.3.1 Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân

bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được ghi lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu thành SKĐ với các thông tin về pic của chất phân tích [1]

Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc

ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [1]

1.3.2 Máy HPLC

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đưa mẫu vào pha động, cột sắc ký, detector, máy tính hay máy phân tích hoặc máy ghi [1]

Hình 1.3: Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC

1.3.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

1.3.3.1 Thời gian lưu tR

Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector.Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định, vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các chất [1] Thời gian chết tM là thời gian lưu của chất không bị lưu giữ

Thời gian lưu hiệu chỉnh t’R = tR– tM

1.3.3.3 Hệ số chọn lọc α

Hệ số chọn lọc  đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B

 = k'2k'1 = ttR2 - tMR1 - tM Thường chọn  dao động từ 1,05 – 2 Nếu  quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài [1]

Hệ thống cấp

Bộ phận tiêm mẫu

Cột sắc ký

Hệ thu nhận xử lý dữ

liệu (máy ghi, máy tính) Detector

Thải

Trong đó: RS: độ phân giải

tR,A , tR,B: thời gian lưu chất A, B

WA, WB: lần lượt là độ rộng pic A, B ở các đáy pic

RS  1,5 thì 2 pic coi như tách nhau hoàn toàn

1.3.3.5 Hệ số bất đối AF

Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, được tính theo công thức:

AF = W2a 1/20

Trong đó: W1/20: là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic

a: khoảng cách từ đường hạ vuông góc từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic [1]

Trong định lượng yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ 2

1.3.3.6 Số đĩa lý thuyết

Mỗi cột sắc ký có thể phân thành nhiều lớp mỏng xếp sát nhau gọi là đĩa lý thuyết Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa pha tĩnh và pha động Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký [1]

N = 16 [W ]tR 2= 5,54 [ WtR

1/2]2 Trong đó: W: là chiều rộng pic ở đáy pic

W1/2: là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic

1.3.4 Ứng dụng của HPLC

1.3.4.1 Định tính

Người ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau:

 So sánh thời gian lưu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời gian lưu của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký [1]

 So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm chuẩn đối chiếu [1]

 So sánh phổ (chồng phổ) UV-VIS của chất thử với chất chuẩn trên detector DAD (có hệ số match  0,995) [1]

(IR) hoặc số khối (MS) [1]

1.3.4.2 Định lượng

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng

độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó

Có 3 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký:

- Phương pháp chuẩn ngoại

- Phương pháp chuẩn nội

- Phương pháp thêm chuẩn

Trong khuôn khổ khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phương phápthêm chuẩn

Ưu điểm của phương pháp thêm chuẩn là có độ chính xác cao vì nó loại trừ được sai số do các yếu tố ảnh hưởng, đặc biệt là ảnh hưởng của quá trình xử lý mẫu (chiết xuất, tinh chế các chất từ dạng bào chế…) [1]

Tiến hành :

Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký

Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện Nồng độ chưa biết CX của mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ

ΔC (lượng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng của diện tích (hoặc chiều cao) pic ΔS theo công thức :

CX = SX ΔC

ΔS

Có thể tính toán nồng độ CX của mẫu thử theo một công thức khác: Tiến hành sắc ký một mẫu thử và mẫu thử đã được thêm chuẩn như trên.Sử dụng một pic không muốn định lượng của mẫu thử như là một chuẩn nội [1]

1.3.5 Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector)

Detector mảng diod (DAD) là một loại detector hấp thụ UV – VIS, được dùng phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV – VIS (trong khoảng 190 – 800 nm) của các chất phân tích Tế bào đo ở trong detector là một ống hình trụ đường kính 1 mm, chiều dài 10 mm Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu, sau

đó được tách ra thành các bước sóng đơn Detector có mảng diod để nhận bức xạ đã tán sắc từ một cách tử kẻ vạch bằng laser.Mỗi diod nhạy với một bước sóng nhất định, do đó detector DAD cho phép đo nhiều bước sóng khác nhau cùng một lúc Thông thường, chỉ có một hoặc hai bước sóng được theo dõi trong quá trình chạy sắc ký Theo dõi hai pic có thể cung cấp thông tin về độ tinh khiết của pic [1]

Hình 1.4: Cấu tạo detector mảng diod (DAD)

Quang phổ và sắc ký đồ có thể được biểu thị trên màn hình nhờ phần mềm của hệ thống xử lý tín hiệu bằng máy tính Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên cạnh detector đo ở bước sóng cố định hoặc thay đổi Mặt khác, hệ thống này có thể cho

đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng và thời gian [1]

Ứng dụng: Đầu dò DAD cho phép lựa chọn bước sóng phù hợp nhất cho phân tích, có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất, ngoài ra detector DAD dùng để xác định độ tinh khiết của pic [1]

1.3.6 Một số nghiên cứu đã thực hiện về Cúc hoa vàng và Apigenin

- Các nghiên cứu đã thực hiện:

xuất, phân lập, tinh

chế Linarin trong

Cúc hoa vàng

- Chiết xuất bằng EtOH

- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng với pha động khai triển Cloroform:

MeOH: H20 (5 : 1 : 0,1)

- Phân lập: bằng sắc ký cột

- Tinh chế: bằng phương pháp kết tinh

xuất Flavonoid toàn

- Hàm lượng flavonoid toàn phần đạt 12,54 mg/g

[8]

15 kV, thời gian tiêm mẫu 2 s, nhiệt

độ cột mao quản 25oC, thời gian điện

di 15 phút

- λ = 268 nm

- Hàm lượng Apigenin: 1,80 – 3,10 mg/g

[9]

Hiện nay các tài liệu dược điển: Việt Nam, Trung Quốc, Mỹ, Nhật…chúng tôi nhận thấy chưa có tài liệu nào công bố bổ sung phương pháp định lượng Apigenin trong Dược liệu Vì vậy cần thực hiện khảo sát để có phương pháp định lượng phù

hợp, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn Dựa trên nghiên cứu “Định lượng Apigenin

trong Cúc hoa vàng bằng HPLC” của nhóm tác giả Nguyễn Minh Chính, Nguyễn

Trọng Điệp, Đào Văn Đôn, Hoàng Việt Dũng, Nguyễn Văn Long, Đoàn Cao Sơn [5] vừa là tiền đề vừa làm cơ sở cho chúng tôi phát triển và mở rộng nội dung của nghiên cứu này Chúng tôi khảo sát hàm lượng Apigenin trong Cúc hoa vàng ở các mẫu đang lưu hành trên thị trường Hà Nội bằng các điều kiện sắc ký khác nhau Từ

đó, có thể thu được kết quả chính xác, có ý nghĩa thực tiễn để bổ sung vào tiêu chuẩn định lượng Apigenin trong chuyên luận Cúc hoa vàng của DĐVN

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu: Hoa của cây Cúc hoa vàng (Chryranthemum indicium Lour)

đã được phơi khô Nguyên liệu được bảo quản nơi khô ráo, được định tính về hóa học và sơ bộ kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn DĐVN IV, sau đó được nghiền thành bột thô mịn hoặc bột nửa mịn theo quy định của DĐVN IV trước khi tiến hành chiết lấy Apigenin Các mẫu được mua tại cơ sở chế biến dược liệu An Bình, cơ sở Nguyễn Thế Viễn – Huyện Văn Lâm Hưng Yên và tại các cửa hàng khác nhau trên phố Lãn

Ông – Hà Nội vào tháng 03/2016

2.1.2 Hóa chất, dung môi

Các hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn độ tinh khiết phân tích hoặc HPLC

- Dung môi và hóa chất: ethanol, methanol, aceton, nước cất, acetonitril, acid phosphoric…

- Chất chuẩn: chuẩn làm việc Apigenin – hàm lượng 98,5% (do Viện Hóa sinh biển thiết lập)

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị

- Nồi cách thủy

- Máy li tâm EBA 21

- Máy chiết siêu âm Elma

- Máy cất thu hồi dung môi

- Cân phân tích Sartorius 0,1 mg

- Máy lọc hút chân không, màng lọc 0,45 µm

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1200 series kết nối DAD/FLD

- Tủ sấy, phễu lọc thủy tinh, giấy lọc

- Pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, lọ đựng mẫu, bơm tiêm

- Bộ lọc dung môi hút chân không, màng lọc 0,45 µm

- Bình định mức các loại: 10 ml, 20 ml, 25 ml, 100 ml, 1000 ml

- Cốc có mỏ các loại: 50 ml, 100 ml, 200 ml, 1000 ml

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn Apigenin với các hợp chất khác trong dịch chiết Cúc hoa vàng

- Thẩm định các điều kiện định lượng Apigenin trong các mẫu Cúc hoa vàng

- Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lượng Apigenin có trong các mẫu Cúc hoa vàng trên thị thường

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử

2.3.1.1 Chiết xuất

Vì Apigenin tan tốt trong MeOH nên chúng tôi quyết định chọn MeOH làm dung môi chiết và pha mẫu chuẩn, mẫu thử

Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp xử lý mẫu khác nhau, chúng tôi chọn xử

lý mẫu theo phương pháp chiết siêu âm

2.3.1.2 Pha dung dịch thử

Bổ sung MeOH vào cốc có mỏ chứa cắn sau khi bốc hơi dung môi, sau đó chuyển sang bình định mức bổ sung MeOH vừa đủ tới vạch

2.3.2 Pha dung dịch chuẩn

Pha dung dịch chuẩn gốc Apigenin, từ chuẩn gốc pha dung dịch chuẩn Apigein

ở nồng độ phù hợp, pha các dung dịch chuẩn thứ cấp từ dung dịch chuẩn gốc để

thẩm định độ tuyến tính

2.3.3 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký

2.3.3.1 Dung môi chạy pha động

Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký, nó quyết định thời gian lưu giữ của chất phân tích và hiệu quả tách sắc ký

Cặp dung môi được sử dụng phổ biến nhất trong sắc ký pha đảo là MeOH :

H2O; ACN : H2O Mặt khác Apigenin có 2 nhóm –OH gắn vào nhân benzo - γ - pyron ở vị trí 5, 7 và một nhóm –OH phenol nên Apigenin có tính acid Do đó, để định lượng tốt thì pha động cần bổ sung thêm acid (H3PO4) sẽ giảm thiểu được hiện tượng kéo đuôi

2.3.3.2 Chọn cột sắc ký

Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phương pháp được sử dụng phổ biến với nhiều tính ưu việt Dựa trên tính chất của các hợp chất phân lập được từ Cúc hoa vàng, đồng thời qua tham khảo tài liệu nghiên cứu về phương pháp tách chiết, định lượng một số thành phần trong Cúc hoa vàng, chúng tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố pha đảo trong nghiên cứu này

Trong định lượng sắc ký pha đảo, cột thường dùng là C8 và C18, có kích thước hạt nhồi là 5 µm hoặc 10 µm, với chiều dài cột là 15 cm hoặc 25 cm Chúng tôi tiến hành khảo sát trên các loại cột trên

2.3.3.3 Chọn tốc độ dòng

Qua các tài liệu tham khảo [5], [6], [9], [10], [21] chúng tôi thường thấy tốc độ dòng được khảo sát là 0,8 ml/phút và 1,0 ml/phút Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát trong khoảng 0,7 - 1,2 mL/phút để xác định tốc độ dòng phù hợp cho một thời gian lưu tối ưu

2.3.3.4 Chọn bước sóng phát hiện

Do cấu trúc Apigenin có vòng thơm nên có khả năng hấp thu quang phổ tử ngoại Xác định cực đại hấp thụ dựa vào phổ UV trong khoảng 190 – 800 nm

2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích theo tiêu chuẩn AOAC

Phép định lượng các hợp chất phân lập được từ Cúc hoa vàng bằng phương pháp HPLC được thẩm định thông qua các chỉ tiêu:

- Độ đặc hiệu

- Độ tương thích hệ thống sắc ký

- Độ lặp lại của phương pháp

- Độ tuyến tính và khoảng xác định

Cách xác định: tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn và mẫu thử Ghi lại các thông

số về thời gian lưu và diện tích pic

Yêu cầu: thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu thử phải tương đương nhau Hình ảnh chồng phổ của 2 mẫu phải có hình dạng giống nhau về số đỉnh cực đại hấp thụ

2.3.4.2 Độ tương thích của hệ thống sắc ký

Độ tương thích của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác

định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý xong

Cách xác định: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bịở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic Độ tương thích của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích

Yêu cầu: RSD  2,0 %

2.3.4.3 Độ lặp lại

Độ lặp lại của một phương pháp phân tích (độ chính xác của tổng thể quy trình phân tích) là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu thử nhưng các lần lặp lại phải được thực hiện từcông đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu ) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích

Cách tiến hành: Pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại nhiều lần, lấy giá trị trung bình Độ lặp lại được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích

Hàm lượng Apigenin trong Cúc hoa vàng được tính theo công thức:

X% =

(*)Trong đó:

St, Sc là diện tích pic mẫu thử và mẫu chuẩn

mt, mc là khối lượng của mẫu thử và mẫu chuẩn

HL % là hàm lượng thực của Apigenin trong mẫu chuẩn (= 98,5 %)

Yêu cầu: RSD  2,0 %

2.3.4.4 Độ tuyến tính và khoảng xác định

Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định Nó được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ sốtương quan R

Khoảng xác định: Là khoảng nồng độ đã được khảo sát đảm bảo tuyến tính (gọi là khoảng tuyến tính) Khảo sát nồng độ từ 50 % đến 150 % nồng độ lý thuyết của mẫu

Cách xác định: Chuẩn bị một dãy chất chuẩn gồm 6 mẫu có nồng độ tăng dần trong khoảng xác định Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phương trình hồi quy tuyến tính

của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát Độ đúng sẽ được tính bằng

tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất đối chiếu tìm được so với lượng chất đối chiếu thêm vào

Yêu cầu: Độ tìm lại nằm trong khoảng 98,0 – 102,0 %

2.3.4.6 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

LOD: Là nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N = 3/1)

LOQ: Là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu đường nền (S/N = 10/1)

Cách xác định: Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N) Pha loãng dung dịch chuẩn từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được bằng sắc ký Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng (B) và mẫu thử (S) Thiết lập tỷ số S/N

Yêu cầu: RSD diện tích pic LOD < 10,0 %

- Tính độ lệch chuẩn tương đối:

%100





X S RSD

- Phương tình hồi quy tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc

ký và nồng độ chất phân tích: y = ax + b, sử dụng phần mềm Microsoft Excel

để xử lý và vẽ đồ thị

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký và chuẩn bị các dung dịch tiêm sắc ký

3.1.1 Chiết xuất

Dựa vào các tài liệu tham khảo [7], [8], [10], [21], chúng tôi thấy các nghiên cứu đều sử dụng dung môi MeOH để chiết xuất Apigenin Vì vậy, chúng tôi lựa chọn MeOH làm dung môi chiết các mẫu thử trong đề tài này

Cân 5 mẫu cúc hoa riêng biệt, mỗi mẫu cân 3 lần, để tính hàm lượng trung bình của Apigenin trong mỗi mẫu

Bảng 3.1: Khối lượng các mẫu thử Cúc hoa vàng

5,0135 5,0093

5,0092 5,0308

4,9885 5,1023

4,9455 5,0541

5,0013 5,1089 Cho các mẫu thử vào ống ly tâm khác nhau Bổ sung lần lượt mỗi ống khoảng 40,0 ml MeOH, chiết siêu âm lần 1 với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút, thu