Xây dựng phương pháp định lượng acid shikimic trong đại hồi bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang

Thẩm định phương pháp định lượng bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang TLC-Scanning .... Áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang định lượng acid shikimic trong

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Văn Hân

2 ThS Ngô Quang Trung

Nơi thực hiện:

1 Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc gia

2 Bộ Môn Công Nghiệp Dược

Trường Đại Học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN !

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, trước tiên, em xin gửi lời cảm

ơn chân thành tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Hân, ThS Ngô Quang Trung,

DS Trần Trọng Biên những người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tính

và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Và em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại Học

Dược Hà Nội, những người đã dạy dỗ và chỉ bảo em tận tình trong suốt những

tháng năm học tập tại trường

Cuối cùng, với long biết ơn vô hạn, em xin phép được gửi lời cảm ơn

tới giá đình, người thân, bạn bè đã động viên và hỗ trợ em trong suốt thời

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về cây hồi 2

Vị trí phân loại và phân bố 2

Đặc điểm thực vật 2

Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 3

Thành phần hóa học và công dụng 3

1.2 Tổng quan về acid shikimic 4

Công thức hóa học và tính chất 4

Nguồn gốc acid shikimic 5

Vai trò acid shikimic 5

Kỹ thuật phân tích acid shikimic 6

Một số nghiên cứu định lượng acid shikimic bằng TLC-scanning 8

1.3 Tổng quan về sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC Scanning) 9

Sắc ký lớp mỏng 9

Sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC Scanning) 12

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu 14

2.1.1 Nguyên liệu 14

2.1.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng 16

2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng 18

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Khảo sát điều kiện triển khai sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Sanning) 22

3.1.1 Khảo sát phương pháp hiện màu bản mỏng 22

3.1.2 Khảo sát nồng độ thuốc thử hiện màu 23

3.2 Thẩm định phương pháp định lượng bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning) 25

3.2.1 Độ đặc hiệu 25

3.2.2 Độ thích hợp hệ thống 26

3.2.3 Độ tuyến tính 27

3.2.4 Độ lặp lại 28

3.2.5 Độ đúng 28

3.3 Áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang định lượng acid shikimic trong mẫu quả Đại hồi 30

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

Kết luận: 32

Đề nghị: 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Vị trí phân loại của cây hồi (Illicium verum Hook f.) 2

Bảng 1.2: Một số thuốc thử hiện màu acid shikimic 6

Bảng 2.1: Hóa chất…….……… 14

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát độ thích hợp hệ thống 27

Bảng 3.2: Nồng độ acid shikimic chuẩn và diện tích pic đáp ứng 27

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ lặp lại 28

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát độ đúng 28

Bảng 3.5: Kết quả định lượng acid shikimic trong nguyên liệu Đại hồi 30

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Công thức hóa học của acid shikimic 4Hình 2.1: Nguyên liệu Đại hồi 14Hình 3.1: Hình ảnh bản mỏng sau khi hiện màu bằng cách nhúng và phun thuốc thử Hình 1 bằng cách phun, hình 2 bằng cách nhúng 22Hình 3.2: Hình ảnh bản mỏng khi hiện màu bằng thuốc thử KMnO4 ở các nồng

độ khác nhau 23Hình 3.3: Hình ảnh bản mỏng sau hiện màu ở những thời điểm khác nhau 24 Hình 3.4: Bản mỏng sau khi hiện màu ……….25 Hình 3.5:Sắc ký đồ (1.Mẫu chuẩn 2 Mẫu thử) 26

Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích và nồng độ acid shikimic

27

Hình 3.7: Bản mỏng xác định LOD……….29 Hình 3.8: Hình ảnh sắc ký đồ LOD.………30

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

HPLC ( High-Performance Liquid

Chromatography)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

GLC ( Gas Liquid Chromatography) Sắc ký khí lỏng

NMR (Nuclear Magnetic Resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt

nhân

RP-HPLC (Reversed-Phase

High-Performance Liquid Chromatography)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo

GC (Gas Chromatography) Sắc ký khí

GC-MS (Gas Chromatography–Mass

Spectrometry)

Sắc ký khí khối phổ

SIM (Selected Ion Monitoring) Giám sát ion chọn lọc

HPTLC (High-Performance Thin Layer

Chromatography)

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

TLC (Thin Layer Chromatography ) Sắc ký lớp mỏng

TLC-Scanning (Thin Layer

Chromatography-Scanning)

Sắc ký lớp mỏng kết hợp

đo mật độ quang

LOD (Limit of Detection) Giới hạn phát hiện

LOQ (Limit of Quantitation) Giới hạn định lượng

R f (Retention Fector) Hệ số lưu giữ

RSD (Relative Standard Deviation) Độ lệch chuẩn

ĐẶT VẤN ĐỀ

Acid shikimic từ lâu được biết đến là một hợp chất trung gian quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp một số acid amin thơm như phenylalanin, tyrosin, tryptophan; và một số hợp chất alcaloid Acid shikimic có thể được phân lập từ

vi khuẩn như E coli hay từ một số loài thực vật

Trong những năm gần đây, acid shikimic còn được biết đến với vai trò quan trọng mới, nó là nguyên liệu dùng để tổng hợp Oseltamivir – hoạt chất chính của Tamiflu, thuốc có tác dụng điều trị bệnh cúm gia cầm H5N1 Hiện nay, acid shikimic dùng để tổng hợp Tamiflu được chiết xuất chủ yếu từ quả của cây Hồi - đây là nguồn cung cấp nguyên liệu chủ yếu cho sản xuất thuốc phòng chống cúm gia cầm

Có một số nhà khoa học đã thực hiện nghiên cứu định lượng acid shikimic trong các loài thực vật chính là cây Hồi bằng phương pháp khác nhau

Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng acid Shikimic trong Đại Hồi bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning )” nhằm đánh giá chất lượng của phương pháp định lượng

acid shikimic trong các dược liệu có chứa acid shikimic

Đề tài của chúng tôi bao gồm các nội dung sau:

1 Khảo sát và xây dựng được phương pháp định lượng acid shikimic trong Đại Hồi bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC- Scanning)

2 Thẩm định phương pháp định lượng acid shikimic bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning)

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây hồi

Vị trí phân loại và phân bố

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan, cây hồi (Illicium verum

Hook f.) có vị trí phân loại khoa học được thể hiện trong bảng dưới đây [3]

Bảng 1.1: Vị trí phân loại của cây hồi (Illicium verum Hook f.)

Chi Hồi (Illicium) có khoảng trên 40 loài, phân bố chủ yếu ở Đông Nam

Á, Đông Á và Bắc Mỹ

Không phân hạng Nhóm thực vật có hoa - Angiospermae

Bộ Mộc lan dây - Austrobaileyales

Ở Việt Nam chi Hồi có 16 loài [9] Cây hồi (Illicium verum Hook f.) là

một loại cây xanh quanh năm, phần lớn ở Trung Quốc và Đông Bắc Việt Nam

Nó còn có tên gọi khác là cây đại hồi, bát giác hồi hương, hồi hương, hồi sao, mác chác, mác hồi (Tày), pít cóc (Dao),….[4]

Hoa mọc riêng lẻ hoặc 2-3 cái ở kẽ lá; đài 5 răng, dễ rụng, mép viền hồng, cánh hoa 5-6, đều nhau, màu hồng sẫm dần về phía giữa; nhị thụt, nhẵn, chỉ nhị rộng, mập, trung đới dày [3], [4]

Quả thường cấu tạo bởi 8 đại đều và rời nhau, có khi 9-12 đại (nhưng hiếm), các đại hình thoi xếp tỏa tròn thành hình sao hay hình nan hoa, khi non màu lục sau chuyển sang màu nâu sẫm, phần đính vào cuống rộng bản và dẹt, đầu có mũi nhọn, ngắn, thẳng, khi chín nứt ở mặt trên; hạt hình trứng nhẵn bóng, màu nâu Toàn cây, nhất là quả có mùi thơm [3], [4]

Bộ phận dùng, thu hái và chế biến

 Bộ phận dùng

Đại hồi (quả) – Fructus Illicium veri là quả chín đã phơi khô của cây hồi

- Illicium verum Hook f (họ Hồi – Illiciaceae)

 Thu hái và chế biến

Hàng năm cây ra hoa kết quả theo 2 vụ, vụ chính thu hoạch vào tháng

8-10 (vụ mùa), vụ muộn thu hoạch vào tháng 2-4 năm sau (vụ tứ quý) Vụ muộn cho năng suất thấp hơn Cây trồng sau 5-6 năm bắt đầu cho thu hoạch Sau 15 năm mỗi cây có thể cho 10-20kg quả tươi/năm, sau 20 năm, năng suất tương đối ổn định ở mức 20-30kg/năm [4]

Thành phần hóa học và công dụng

 Thành phần

- Tinh dầu: hàm lượng 3-3,5 % trong quả tươi, 9-10 % trong quả khô Chứa 80-90 % trans-anethol, ngoài ra còn có linalol, estragol, terpineol, anysaldehyd… [9], [13]

- Acid hữu cơ: acid shikimic, protocatechic, anisatinic, isoanisatinic

Trong đó quan trọng nhất là acid shikimic [4], [9]

- Ngoài ra còn 1 số chất thuộc nhóm flavonoid, tannin, sesquiterpen, sesquiterpen lacton, sesquilignan, sesqui-neoliganan; dầu béo chủ yếu chứa trong hạt [9], [6]

1.2 Tổng quan về acid shikimic

Công thức hóa học và tính chất

Acid shikimic có công thức hoá học và các tính chất cụ thể như sau [25], [32]:

Công thức cấu tạo:

Tên khoa học: acid (3R,4S,5R) – 3,4,5 – trihydroxy -1-cyclohexen -1-

carboxylic

Công thức phân tử: C7H10O5

Trọng lượng phân tử: 174,15

Tính chất: Acid shikimic là một chất kết tinh màu trắng, rất dễ tan trong nước

(18%), tan trong ethanol tuyệt đối (2,25%), trong methanol, không tan trong các dung môi ít phân cực ethyl acetat, aceton, cloroform, benzen, ether dầu hỏa

Nhiệt độ nóng chảy: 183,0 - 184,5 oC

Năng suất quay cực: []18= -183,8 (c = 4,03% trong nước)

Cực đại hấp thụ: Dung dịch acid shikimic trong ethanol có cực đại hấp thụ ở

213 nm

Nguồn gốc acid shikimic

Acid shikimic được Eykman F và cộng sự phân lập lần đầu tiên vào năm

1885 từ một loài hồi Nhật Bản (Illicium anisatum) Đến 50 năm sau cấu trúc

hóa học của acid shikimic mới được xác định [30] Acid shikimic có trong nhiều

loài thực vật như đại hồi (Illicium verum), bạch quả (Gingko biloba), quyển bá trường sinh (Selaginella tamariscina, Hoselaginellaceae), kha tử (Terminalia chebula), chuối tiêu (Musa sapientum), hướng dương (Heliantus annus), tiểu hồi (Foeniculum vulgare)… [33] Nhưng hiện nay đại hồi vẫn là nguyên liệu

quan trọng để chiết xuất, bởi hàm lượng acid shikimic trong quả hồi tương đối cao (5%-10%) [9]

Acid shikimic còn có nguồn gốc từ tổng hợp hoặc bán tổng hợp Raphael (1960) và Smissman (1959) đã tổng hợp acid shikimic từ 1,3-butadien-1,4-diyl diacetate qua phản ứng Diels Alder Grewe (1964) và cộng sự tổng hợp acid shikimic từ 1,3-butadien Ngoài ra, acid shikimic có thể được tổng hợp từ benzen, bán tổng hợp từ acid quinic và D-manose [19]

Vai trò acid shikimic

 Trong sinh học nói chung, acid shikimic đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp các acid amin thơm như phenylalanin, tryptophan, tyrosin; các alcaloid, hợp chất phenolic, các phenyl propanoid [34] Nó là chất trung gian hóa học quan trọng của các quá trình chuyển hóa trong thực vật và vi sinh vật (con đường shikimat) [27], [28]

 Về tác dụng dược lý, acid shikimic có tác dụng chống viêm, giảm đau, có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu và bệnh tắc nghẽn động mạch do tác động

của acid arachidonic [30] Các nhà khoa học đã chứng minh acid shikimic có tác dụng giảm đau, chống viêm, chống co giật, chống oxy hóa, kìm hãm phát triển tế bào ung thư[4]

 Trong lĩnh vực tổng hợp hóa dược, acid shikimic được biết đến là nguyên liệu tổng hợp (-)zeylenon, hoạt chất có hoạt tính kháng sinh, có tác dụng chống virus, chống ung thư và được sử dụng cho bệnh nhân ung thư trước khi tiến hàn [18]

Kỹ thuật phân tích acid shikimic

D.V Bochkov et al (2012) đã trình bày các kỹ thuật phân tích acid shikimic trong bài tổng quan về hợp chất này [23] Các kỹ thuật được nêu ra gồm có:

 Sắc ký giấy: Đây là kỹ thuật đơn giản được sử dụng để nghiên cứu acid

shikimic và các dẫn xuất Với kỹ thuật này, Perkins và Aronoff xác định và tinh chế acid shikimic tinh khiết từ các tạp chất trong dịch chiết Pha tĩnh được các tác giả đã sử dụng là giấy Whatman 3MM

 Phản ứng màu: Acid shikimic không có màu dưới ánh sáng nhìn thấy và

không phát sáng dưới ánh sáng tử ngoại Một số thuốc thử thường dùng để

tạo màu acid shikimic được liệt kê trong Bảng 1-2

Bảng 1.2 : Một số thuốc thử hiện màu acid shikimic

Thuốc thử Màu

Kali periodat + natri borat/tinh bột Vết trắng trên nền xanh

Xanh bromocresol Màu vàng với các acid

Natri metaperiodat + natri

nitroprussid và piperazin Màu vàng xanh

Acid iodic trong aceton Màu hồng

Kali permanganat trong aceton Màu vàng nhạt

 Kỹ thuật phân tích định lượng: Một số kỹ thuật phân tích định lượng acid

shikimic đã được nghiên cứu, đa số nhờ phản ứng oxy hóa bởi acid iodic ở bước đầu, sản phẩm phân hủy glycol sau đó được xử lý với thuốc thử chromogenic, và nồng độ acid shikimic được định lượng bằng cách phân

tích so màu

Kỹ thuật đầu tiên là của Yoshida và Hasegawa (1957 ): Mẫu được oxy hóa trong đệm acetat (pH 4,7), các sản phẩm oxy hóa được xử lý với anilin tạo sản phẩm chất màu polymethin Độ hấp thụ được đo tại bước sóng 510 nm, khoảng nồng độ tuyến tính được xác định là 40-200 mg/ml Acid shikimic

Gaitonde and Gordon (1958) nhận thấy khi thêm natri hydroxyd hay bari hydroxyd vào hỗn hợp phản ứng của acid shikimic và acid iodic làm tăng màu vàng của sản phẩm Tuy nhiên, màu vàng này có thể được ổn định khi thêm glycin Mật độ quang được đo tại bước sóng 380 nm trong 10 phút sau khi thêm glycin Sau thời gian đó, giá trị mật độ quang giảm Giới hạn phát hiện của kỹ thuật này ở nồng độ acid shikimic khoảng 0,3 μg/ml

Có một số kỹ thuận phân tích định lượng khác như :

- Phương pháp HPLC với detector UV: Phương pháp này được áp dụng dựa vào việc xác định đường chuẩn của acid shikimic chuẩn, phát hiện acid shikimic ở bước sóng 210nm

- Phương pháp sắc ký khí lỏng (GLC): Phương pháp này được tiến hành bằng cách tạo dẫn xuất trimethylsilyl Sử dụng cafein làm chất chuẩn nội, cột

IO và 200 mesh gas – chrom Q với detector FID, nhiệt độ buồng tiêm mẫu và buồng cột lần lượt là 210 và 1850C

- Phương pháp chuẩn độ: Acid shikimic sau khi được tách cột Dowex-1x 8 column, chuẩn độ bằng NaOH loãng

 Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Acid shikimic dễ dàng xác định bằng

máy quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) sử dụng dung môi như D2O,

deuterium methanol tetra, và acetone-d6

 Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo: Acid hữu cơ được xác định theo điều

kiện của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) Trình

tự tách rửa của acid hữu cơ trong điều kiện RP-HPLC như sau: acid tartaric

<acid quinic <acid succinic <acid hydroxycitric <acid malic <acid isocitric

<acid shikimic <acid ascorbic <acid fumaric <acid citric

 Phương pháp sắc ký lớp mỏng : Được sử dụng để định tính acid shikimic

từ những năm 1960 Sử dụng hệ dung môi thích hợp để chấm sắc ký so sánh chất thử với acid shikimic chuẩn Một mẫu có acid shikimic dương tính nếu

có vết cùng Rf và cùng màu sau khi phun thuốc thử với acid shikimic chuẩn

 Phương pháp HPLC: Gần đây HPLC là phương pháp phổ biến để định

lượng các chất trong đó có acid shikimic

 Một số kỹ thuật phân tích khác: Sắc ký khí (GC) và sắc ký khí khối phổ

(GC-MS) GC-MS với giám sát ion chọn lọc (SIM) đã trở thành một trong những phương pháp hiệu quả nhất cho việc phân tích định lượng của tác phẩm thực vật

Một số nghiên cứu định lượng acid shikimic bằng TLC-scanning

 Saraswathy Ariamuthu, Vidhya Balakrisnan và Amala Kesavan (2012)

đã nghiên cứu đánh giá acid shikimic từ quả cảu Illicium griffithii Hook.f & Thoms và Illicium verum Hook.f [31] Đưa ra giấy nghiên cứu liên quan đến phương pháp ước tính định lượng acid shikimic từ quả cây của Illicium griffithii Hook.f & Thoms và Illicium verum Hook.f qua phương pháp sắc ký lớp mỏng

hiệu năng cao ( HPTLC) Bản sắc ký (E Merck) đã quét với silica gel 60 F254 được dùng làm pha tĩnh và hỗn hợp pha động là: Chloroform: MEthanol : acid

formic (7:3:0.5, v/v) Bản mỏng sắc ký TLC đã được phun với thuốc thử acid vanillin sulphuric và đun nóng ở nhiệt độ 105 ºC trên một bếp điện cho đến khi xuất hiện màu của các vết và quét ở bước sóng λ=210 nm sử dụng đèn deuterium Đường chuẩn đã được xây dựng có độ tuyến tính giữa 3mg và 18mg Phương pháp này có thể sử dụng cho việc kiểm tra nhanh các hoạt chất của thuốc Dấu vân tay có thể hữu ích trong nhân biệt và thẩm định của cả hai loài Illicium Hàm lượng acid shikimic có trong Illicium griffithi và Illicium verum lần lượt là 1,66 %và 5,48%.

1.3 Tổng quan về sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC Scanning)

Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng đã được xây dựng, phát triển và ứng dụng

từ lâu Tuy nhiên hiện nay sắc ký giấy ít được sử dụng Phổ biến nhất hiện nay

là sắc ký lớp mỏng Ở nước ta phương pháp sắc ký lớp mỏng đã được sử dụng rộng rãi, đã có nhiều tài liệu, chuyên gia có kinh nghiệm về phương pháp này

Trong sắc ký mặt phẳng, quá trình sắc ký được tiến hành trên một tờ giấy hay một lớp bột rải đều và được giữ trên mặt một tấm kính, chất dẻo hay kim loại, ví dụ nhôm Bản thân lớp mỏng có thể là pha tĩnh hoặc chỉ là chất mang

để giữ pha tĩnh trên đó Pha động là chất lỏng sẽ thấm và chạy trên lớp mỏng

do tác dụng của lực mao dẫn và đôi khi cả trọng lực và điện thể [1], [21]

 Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng

Cùng như tất cả các phương pháp sắc ký khác, quá trình tách hỗn hợp các chất bằng SKLM xảy ra khi cho pha động chuyển động qua pha tĩnh Trong SKLM, pha tĩnh được rãi thành một lớp mỏng trên một giá đỡ phẳng Dưới tác dụng của lực mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất phát - nơi hỗn hợp chất cần phân tích đã được đưa lên bản mỏng Trong quá trình di chuyển của pha động qua lớp mỏng chất hấp phụ (pha tĩnh), nhờ các quá trình

hấp phụ và giải hấp phụ được lặp lại và do hệ số phân bố khác nhau mà những chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động của pha động với các tốc độ khác nhau Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp phân tích có thể sẽ được tách riêng ra ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng [20] Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hào tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký nhờ lực mao dẫn tách dung dịch thí nghiệm dựa trên độ phân cực của các thành phần trong dung dịch [20], [21]

Đại lượng đặc trưng cho mức di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách di chuyển của pha động:

𝑅𝑓 = 𝑑𝑅𝑑𝑀dR: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tấm vết phân tích

dM: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động( đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Rf : có giá trị dao động từ 0-1 [1]

Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10-30µm được rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250µm trên giá đỡ hình vuông Bản mỏng có sẵn trên thị trường có kích thước khác nhau thường 5÷20cm, nhiều khi có đưa thêm chất huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân tích Chất hấp phụ thường dùng nhất là silicagel [17], [29]

Pha động dùng cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký Để tang cường rửa giải thường dung 2 dung môi Nguyên lý chia tách dựa vào hệ

số phân bố giữa 2 pha Tuy nhiên, lựa chọn tối ưu hóa sắc ký chủ yếu dựa vào kinh nghiêm [1]

 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

 Đưa chất phân tích lên bản mỏng

Lượng hỗn hợp các chất được đưa lên bản mỏng có ý nghĩa rất quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, ảnh hưởng đến giá trị Rf, lượng mẫu đưa lên bản mỏng khoảng 0.1-50 µg được pha trong dung môi thích hợp Thể tích dung dịch chấm 1-5 µL đối với sắc ký phân tích và 0,1-0,2 µL đối với sắc ký điều chế

Đường xuất phát cách mép bản mỏng khoảng 1,5-2,0 cm và cách bề mặt dao động 0,8-1,0 cm

 Khai triển sắc ký

Sau khi chấm sắc ký, bản đã được sấy khô được cho vào bình sắc ký đã bão hòa pha động Mép dưới bản mỏng được nhúng vào pha động nhưng vết chấm còn cách bề mặt pha động khoảng 1 cm

 Dùng densitometer: thiết bị này cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng

khi soi dưới đèn UV-VIS Chất phân tích hấp phụ bức xạ được ghi lại thành pic sắc ký [20], [21], [29]

 Ứng dụng của sắc ký lớp mỏng trong phân tích kiểm nghiệm

- Phân tích định tính

- Thử tính khiết

- Bán định lượng

- Định lượng [2], [24]

Sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC Scanning)

Sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning) là một hình

thức tân tiến nhất của công cụ TLC TLC-Scanning với dụng cụ tinh vi được điều khiển bơi một phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng, độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất của các số liệu đưa ra Trong phân tich TLC-Scanning, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó lặp lại được độ lặp lại cao Các bước của quá trình phân tích bào gồm phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bán tự động, giảm thiểu tối đa các sai số có thể gặp phải Quá trình phun mẫu được tiến hành bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, tốc độ phun và không có nguy cơ hỏng cơ học bản mỏng Trong quá trình khai triển, điều kiện khai triển về nhiệt độ và

độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ và ghi lại đầy đủ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành tại các phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng

 Thiết bị của TLC-Scanning

 Thiết bị chấm mẫu bản tự động

 Thiết bị phát triển tự động

 Buồng chụp ảnh TLC được điều khiển thông qua phân mềm winCAT và phần mềm Video Scan trên máy tính : quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh, nhất là camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận

hình ảnh của vét sắc ký Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính [2], [28]

Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta đưa vào thị trường bản mỏng hiệu năng cao (high-performance plates) Bản này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn (dày khoảng 100 µm) với bột mịn có kích thước hạt 5 µm độ đồng đều cao hơn Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân tích được tăng lên bởi vì:

- Vết sắc ký nhỏ hơn

- Thời gian sắc ký ngắn hơn

- Lượng dung môi ít hơn

Pha tĩnh dùng silica và pha liên kết siloxan cho sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) có sẵn trên thị trường Tuy vậy trong kỹ thuật này kể cả HPTLC sai số của phương pháp dao động trong khoảng 5-10 % [22], [23], [31]

 Ưu điểm của TLC-Scanning

 Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng

 Trong một lần triển khai sắc ký có thể phân tích đồng thời rất nhiều mẫu một lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao

 Các mẫu phân tích và các dung dịch chuẩn được chấm trên cùng 1 bản mỏng sắc ký, khai triển cùng một điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sử tác động của môi trường giữa các lẫn phân tích [26]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

Đại hồi thu mua từ tỉnh Lạng Sơn

Hình 2.1 Nguyên liệu Đại hồi

2.1.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ

 Hóa chất

Bảng 2.1: Hóa chất

STT TÊN HÓA CHẤT TIÊU CHUẨN, XUẤT XỨ