khảo sát vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh ở cây ngô trồng tại đông nam bộ

Moody và Phan Thị Công 2008 trong báo cáo về “Các nhóm đất chính và những mặt hạn chế của đất ảnh hưởng đến sản lượng cây trồng cạn – vùng Đông Nam Bộ”, việc bón vôi và phân xanh cho đất

Chương I

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ngô (Bắp), Mía và Lạc (Đậu phộng) là những cây trồng ngắn ngày chủ yếu đối với những hộ nông dân sản xuất nhỏ ở 6 tỉnh thành Đông Nam Bộ (P.W Moody và Phan Thị Công, 2008) Diện tích trồng Ngô ở vùng này đạt 81,3 nghìn ha; trong đó Đồng Nai có diện tích gieo trồng Ngô cao nhất (47,7 nghìn ha), kế đến là Bà Rịa – Vũng Tàu (19,6 nghìn ha) và Tây Ninh (5,8 nghìn ha) Năng suất bình quân của vùng là 52,0 tạ/ha và sản lượng đạt 422,7 nghìn tấn (Trung tâm khuyến nông Quốc gia, 2010) Ở Đồng Nai, Ngô là cây trồng chính và được trồng nhiều trên loại đất đen (luvisols) Trong khi đó, tại Bà Rịa – Vũng Tàu có nhiều huyện trồng Ngô trên đất đỏ (ferralsols) và đất trồng Ngô tại Tây Ninh cũng là loại đất đặc trưng của vùng chính là đất xám (acrisols)

Ở vùng Đông Nam Bộ, những hạn chế khá phổ biến ở đất đỏ là tính chua của đất, khả năng giữ cation thấp và cố định lân cao Trong khi đó, hạn chế của đất xám lại là hàm lượng chất hữu cơ ở mức trung bình - thấp; lượng kali dự trữ thấp, đặc biệt ở các tầng đất bên dưới; đất thường có hiện tượng bị đóng váng và dí dẻ chặt Khả năng chống chịu của các loại cây trồng đối với các mặt hạn chế của đất

là khác nhau Do đó, các biện pháp kỹ thuật canh tác riêng cho mỗi loại cây trồng nhằm cải thiện hoặc giảm thiểu ảnh hưởng của đất đến sản lượng nông phẩm cũng phải thay đổi theo Theo P.W Moody và Phan Thị Công (2008) trong báo cáo về

“Các nhóm đất chính và những mặt hạn chế của đất ảnh hưởng đến sản lượng cây trồng cạn – vùng Đông Nam Bộ”, việc bón vôi và phân xanh cho đất đỏ là cần thiết đối với tất cả các loại cây trồng; trong khi đó cần cải thiện khả năng thoát nước, duy trì thảm thực vật che phủ bề mặt và bón phân xanh khi gieo trồng trên đất xám Khảo sát trên không bao hàm ảnh hưởng của các vi sinh vật có quan hệ tích cực đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, trong đó có vi khuẩn sinh vật nội sinh thực vật (endophytic bacteria) và vi khuẩn vùng rễ (rhizobacteria) Mà như đã biết, bộ ba “đất, thực vật và vi sinh vật đất” có quan hệ tương tác chặt chẽ

Trong đó, vi sinh vật đất cùng biện pháp canh tác có ảnh hưởng quan trọng đến cấu tượng đất và năng suất cây trồng

Vi sinh vật vùng rễ, nhất là vi khuẩn vùng rễ đã mang lại nhiều lợi ích cho cây trồng, đặc biệt là kích thích sự tăng trưởng của thực vật Chính vì vậy, những

vi khuẩn này được gọi chung là vi khuẩn rễ thúc đẩy sự tăng trưởng của thực vật Plant Growth Promoting Rhizobacteria, gọi tắt là PGPR Vùng rễ còn là nơi xuất

-phát của nhiều vi khuẩn sống nội sinh thực vật như Acetobacter,

Gluconacetobacter, Azospirillium, Azotobacter, Bacillus, Burkholderia, Herbaspirillium và Pseudomonas Trong đó, có những dòng đã được chứng minh

là có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan, phân giải kali, tổng hợp các chất sinh trưởng thực vật, v.v Một số dòng ưu việt đã được tuyển chọn để đưa vào sản xuất phân bón sinh học (Cao Ngọc Điệp, 2011)

Đề tài: “KHẢO SÁT VI KHUẨN VÙNG RỄ VÀ VI KHUẨN NỘI SINH Ở CÂY NGÔ (Zea mays) TRỒNG TẠI ĐÔNG NAM BỘ” đượcthực hiện nhằm bước đầu phân lập và khảo sát đặc điểm của một số vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây Ngô trồng tại các loại đất chính của Đông Nam Bộ như đất đỏ, đất xám, đất đen Trong đó, đặc biệt quan tâm đến khả năng cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng thu được Nghiên cứu này góp phần bổ sung vào sự đánh giá quan hệ “đất – vi sinh vật – cây trồng” ở các loại đất trồng chính của vùng Đông Nam Bộ Nghiên cứu này còn cung cấp một bộ sưu tập giống cho các khảo sát sâu hơn về các đặc tính quý khác của các vi sinh vật vùng rễ và vi sinh vật nội sinh cây Ngô nhằm có thể ứng dụng vào thực tiễn sản xuất phân bón vi sinh hoặc các chế phẩm thuộc các lĩnh vực khác như Kiểm soát Sinh học (Biological Control) hay Phục hồi Sinh học (Bioremediation/ Phytoremediation) , v.v

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu nhằm hai mục tiêu chính là:

- Xác định mật số vi khuẩn đất vùng rễ Ngô

- Bước đầu tuyển chọn các vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trong cây Ngô có khả năng cố định đạm và hòa tan lân khó tan

1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu bao gồm các vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội

sinh trong cây Ngô thuộc các giống Ngô nếp (Zea mays var Ceratina), Ngô tẻ (Zea

mays var Indurata), Ngô ngọt (Zea mays var Rugosa, Zea mays var Saccharata)

và các giống Ngô lai được trồng phổ biến tại ba loại đất chính là đất đỏ, đất xám và

đất đen của vùng Đông Nam Bộ, Việt Nam

Nghiên cứu tập trung vào hai khả năng của các dòng vi khuẩn thu được: cố định đạm và hòa tan phosphorite

1.4 Thời gian nghiên cứu

- Từ tháng 3/ 2012 đến tháng 4/ 2013: Thu mẫu, thực nghiệm, lặp lại nghiệm thức

- Từ tháng 4/ 2013 đến tháng 7/ 2013: Hoàn tất báo cáo và nghiệm thu kết quả đề tài

Chương II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây Ngô

2.1.1 Đặc điểm của cây Ngô

Cây Ngô (còn gọi là Bắp) có tên khoa học là Zea mays L., do Linnaeus đặt vào năm 1737 Ngô là loài duy nhất của chi Zea Các giống Ngô trồng hiện nay là các phân loài của Zea mays và các giống Ngô lai giữa các phân loài này

a: Rễ khí sinh b: Rễ chùm c: Thân d: Lá

e: Phát hoa đực f: Hoa đực g: Phát hoa cái

h: Hoa cái i: Bắp Ngô j: Hạt Ngô

Hình 2.1 Hình thái – giải phẫu của cây Ngô (Zea mays L.)

(Nguồn: Thomas Schoepke – http://www.plant-pictures.com/)

Chu k sinh trưởng của cây Ngô từ khi hạt bắt đầu nảy mầm cho đến khi trái chín hoàn toàn vào khoảng 90 – 160 ngày Ngô ưa thời tiết ấm, nhiệt độ thích hợp nhất cho Ngô vào khoảng 21 – 27oC Tuy nhiên, mỗi giai đoạn sinh trưởng cần một nhiệt độ tối thích khác nhau Năng suất phần nào phụ thuộc tỷ lệ thụ phấn, do

đó khi gieo trồng cần chú ý đến yếu tố mùa vụ sao cho nhiệt độ không được thấp hơn 18oC hoặc vượt quá 35oC khi cây trổ (Dương Minh, 1999; Nguyễn Đức Cường, 2010)

Cây Ngô có thể thích ứng với nhiều loại đất, tốt nhất là đất thịt hay thịt pha cát, xốp, giàu hữu cơ, thoáng và giữ nước tốt Ngô cần đất ẩm, nhưng khả năng chịu úng kém Cần chú ý chế độ tưới tiêu cho cây vì có ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng Bình quân cả vụ Ngô cần khoảng 2.000 – 3.000 m3 nước/ ha (200 – 300

mm nước mưa) pH đất tốt nhất cho cây phát triển là 5,5 – 7,2 Nếu đất chua cần phải bón vôi hay bột đá vôi để tạo môi trường thích hợp cho cây phát triển Đất quá chua thì không thích hợp để trồng Ngô (Dương Minh, 1999; Nguyễn Đức Cường, 2010)

Thân lá Ngô chứa một nguồn dinh dưỡng rất quý cho trâu bò, nên thường được lấy đi khỏi đồng ruộng để làm thức ăn cho gia súc Với đặc điểm trên, việc bón phân để bù đắp lại lượng dinh dưỡng cây lấy đi từ đất là cần thiết Cơ cấu dinh dưỡng cho Ngô sẽ là N: P2O5: K2O theo tỷ lệ 2: 1: 2 Tuy nhiên, liều lượng phân bón lại tùy thuộc vào chất đất, giống trồng, thời tiết trong vụ và năng suất cây trồng định đạt tới Có thể luân canh cho cây Ngô, tốt nhất là với cây họ Đậu, vì luân canh sẽ làm giảm nguồn sâu bệnh, làm giảm ảnh hưởng xấu của của việc khai thác dinh dưỡng giống nhau của nhiều vụ liên tiếp Hơn nữa cây họ Đậu sẽ tích lũy đạm cho Ngô ở vụ sau (Nguyễn Đức Cường, 2010; Ngân hàng kiến thức trồng Ngô, 2012)

2.1.2 Giá trị dinh dƣỡng và công dụng của cây Ngô

Ngô là loại lương thực có hàm lượng protein và lipid cao hơn hạt gạo Theo Hruska (1962), trong hạt Ngô có chứa 66 – 73% carbohydrate, 6 – 21% protein, 3,5 – 7,0% lipid, 1,3% khoáng và các loại vitamin Tuy nhiên, nhược điểm của hạt Ngô là có hàm lượng một số loại vitamin rất thấp, chẳng hạn như B2, B3, B6, PP,

C, D, v.v , và thiếu hai loại amino acid quan trọng là lysine và tryptophan nên cần phối hợp sử dụng với các loại lương thực - thực phẩm khác để đảm bảo có một

khẩu phần ăn hợp lý, đầy đủ các chất dinh dưỡng cho cơ thể (Dương Minh, 1999)

Theo Nguyễn Đức Cường (2010), từ cây Ngô có thể chế biến tạo thành trên

670 sản phẩm chính và các sản phẩm phụ Tất cả các bộ phận của cây Ngô từ hạt, thân, lá đều có công dụng Ngô được dùng làm lương thực, thực phẩm nuôi sống khoảng 1/3 dân số thế giới Có đến 70% tổng sản lượng Ngô trên thế giới được dùng làm thức ăn cho gia súc dưới dạng thức ăn tươi hoặc ủ chua Trong thức ăn dạng hỗn hợp dùng cho chăn nuôi, Ngô chiếm tới 40 – 60% khối lượng Khoảng 20% tổng sản lượng Ngô trên thế giới được dùng trong sản xuất công nghiệp (Dương Minh, 1999)

Trong Đông y, râu Ngô có tên thuốc là "ngọc mễ tu", có vị ngọt, tính bình, quy vào kinh thận, bàng quang, có công năng lợi tiểu, tiêu thũng, thông mật, lợi mật, thanh huyết nhiệt, bình can, thoái hoàng, chỉ huyết (http://suckhoedoisong.vn, 20/12/2012) Theo Tây y, Ngô chứa hàm lượng kali cao có tác dụng làm tăng bài tiết mật, giảm billirubin trong máu Thức ăn chứa nhiều hạt Ngô hoặc các loại mễ cốc khác giúp làm giảm nguy cơ ung thư vú, tiền liệt tuyến, ruột kết của con người; chống bệnh hoại huyết; tăng cường sức đề kháng, chống lại các bệnh nhiễm trùng (http://vietbao.vn , 28/4/2012)

2.2 Hiện trạng sản xuất Ngô của vùng Đông Nam Bộ

2.2.1 Đặc điểm khí hậu, thổ nhƣỡng vùng Đông Nam Bộ

Đông Nam Bộ trải dài từ 105o 49’ đến 107o

35’ kinh độ Đông và từ 10o 20’ đến 12o

17’vĩ độ Bắc Tổng diện tích vùng khoảng 2,34 triệu ha (chiếm khoảng 20,3% tổng diện tích đất Việt Nam) Phía Bắc và phía Tây Bắc của Đông Nam Bộ giáp với Cambodia; phía Tây Nam giáp với Đồng bằng sông Cửu Long; phía Đông

- Đông Nam giáp với biển Đông và Đồng bằng sông Cửu Long; phía Đông giáp Tây nguyên và Duyên hải Nam Trung Bộ Về đơn vị hành chính, vùng Đông Nam

Bộ gồm 6 tỉnh thành: Bình Phước, Bình Dương, Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Vũng Tàu và Thành phố Hồ Chí Minh

Rịa-(http://vi.wikipedia.org/wiki/Đông_Nam_Bộ_(Việt_Nam), 30/5/2013)

Hình 2.2 Bản đồ hành chính vùng Đông Nam Bộ, Việt Nam

(Nguồn:

Đông Nam Bộ là vùng nhận bức xạ mặt trời ở mức cao nhất Việt Nam (hơn

130 Kcal/cm2/năm) Nhiệt độ trung bình hàng năm đạt 26 - 27oC và ổn định Lượng mưa trung bình hàng năm cao (từ 1800 - 2400 mm), tập trung vào mùa mưa (từ tháng 5 đến tháng 11, 200 - 300 mm/tháng) Lượng bốc hơi trung bình hàng năm khoảng 1200 - 1400 mm Nhìn chung, khí hậu của vùng khá thuận lợi cho sản xuất nông nghiệp (P.W Moody và Phan Thị Công, 2008)

và chủ yếu có màu xám Kích cỡ của các hạt bao gồm từ cát thô đến sét Dựa vào tiến trình hình thành, đất phù sa cổ bị phong hóa thành 2 nhóm đất khác nhau: đất xám bạc màu (Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, Tây Ninh

và Bình Phước) và đất nâu vàng (Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, Tây Ninh và Bình Phước) Những vật chất đá mẹ khác gồm đá granite (núi Bà Đen - tỉnh Tây Ninh; núi Bà Rá - tỉnh Bình Phước) và đá phiến vùng núi thuộc huyện Tân Uyên (Bình Dương), và huyện Đồng Phú, Phước Long (tỉnh Bình Phước) (P.W Moody và Phan Thị Công, 2008)

2.2.2 Đặc điểm vùng Ngô Đông Nam Bộ

Từ đầu những năm 1990 đến nay, do việc tạo được các giống Ngô lai, mở rộng diện tích gieo trồng, kết hợp áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác theo nhu cầu của giống mới, ngành sản xuất Ngô nước ta thực sự có những bước tiến nhảy vọt Nếu năm 1991, diện tích trồng Ngô lai chưa đến 1% trên 430.000 hecta trồng Ngô thì đến năm 2006, các giống lai đã chiếm khoảng 90% diện tích trong hơn 1 triệu hectar cả nước Trong đó giống do các cơ quan nghiên cứu trong nước chọn tạo và sản xuất chiếm từ 58 - 60% thị phần, số còn lại là của các công ty liên doanh với nước ngoài Một số giống Ngô lai nổi bật do Viện nghiên cứu (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) tạo ra có thể kể đến như là: LVN10, LVN99, LVN4, LVN9, VN8960, LVN885, LVN66… Các giống này có năng suất và chất lượng tương đương các giống của các công ty liên doanh với nước ngoài nhưng giá bán chỉ bằng 65 - 70%, góp phần tiết kiệm chi phí cho người trồng Nhờ vậy, người trồng cũng đã chủ động được hạt giống cho sản xuất, bớt lệ thuộc vào giống nhập khẩu (Dương Minh, 1999; Ngân hàng Kiến thức trồng Ngô, 2012)

Hiện nay, căn cứ vào các điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng đất đai, tập quán canh tác, mùa vụ, người ta chia vùng trồng Ngô nước ta làm 8 vùng chính: Vùng Ngô đồng bằng Bắc Bộ (đồng bằng sông Hồng), vùng Ngô Đông Bắc Bắc Bộ, vùng Ngô Tây Bắc Bắc Bộ, vùng Ngô Bắc Trung Bộ, vùng Ngô Nam Trung Bộ, vùng Ngô Tây Nguyên, vùng Ngô Đông Nam Bộ, vùng Ngô đồng bằng sông Cửu Long Trong đó, vùng Ngô Đông Nam Bộ có tổng diện tích là 89.500 ha Đây là vùng Ngô hàng hoá giàu tiềm năng, nhất là tỉnh Đồng Nai có sản lượng Ngô đứng thứ hai trong cả nước Vùng có điều kiện khí hậu thuận lợi cho trồng Ngô, lượng mưa 1500 – 2000 mm/năm, nhiệt độ trung bình 23 - 24oC và ít khi xuống dưới

20oC, số giờ nắng nhiều Vụ đông xuân nằm gọn trong mùa khô, từ tháng 12 trở đi lượng mưa rất ít Lượng nước thiếu hụt trong thời k này khoảng 100 - 120 mm/tháng Nếu giải quyết được thì năng suất sẽ cao và ổn định do điều kiện khí hậu rất thuận lợi cho sưh sinh trưởng và phát triển của cây ngô Hai vụ Ngô chính

là vụ Xuân - H và vụ H – Thu, liên tiếp trong mùa mưa từ cuối tháng 4 đến tháng 11 Trong đó vụ Xuân – H , từ cuối tháng 4 đến đầu tháng 8, đạt năng suất

cao nhất Vụ thứ 2, H – Thu, từ trung tuần tháng 8 đến đầu tháng 12, thường trồng các giống Ngô ngắn ngày Ngoài ra, trên các chân đất đảm bảo nước tưới thì

có thể trồng thêm một vụ Đông Xuân, từ tháng 12 đến tháng 3, cũng cho năng suất khá cao (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam; Ngân hàng kiến thức trồng Ngô, 2012)

Đất trồng Ngô ở Đông Nam Bộ chủ yếu là đất basalt, đất phù sa và đất xám Đất đỏ (ferralsols) có diện tích lớn nhất, chiếm hơn 43% tổng diện tích vùng Đông Nam Bộ Nhóm đất này gồm đất nâu đỏ, nâu vàng trên đá basalt và đất nâu vàng trên phù sa cổ; phân bố thành khối tập trung ở phía Đông và Đông Bắc của vùng như ở Bình Long, Đồng Phú, Phước Long, Bù Đăng (tỉnh Bình Phước), Tân Phú, Định Quán, Long Khánh, Thống Nhất, Xuân Lộc (tỉnh Đồng Nai), Tân Thành, Xuyên Mộc, Đất Đỏ, Long Đất (tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu) Đất nâu đỏ và nâu vàng trên đá basalt có tầng đất dày 8 – 10m, chiếm 55% diện tích nhóm đất đỏ Đất chua, ngh o kali và ngh o các cation kiềm trao đổi, cấu tượng viên hạt, giàu mùn đạm và rất giàu lân (Phạm Quang Khánh, 1995; Lê Huy Bá, 2009)

Đất xám (acrisols) có diện tích lớn thứ hai, chiếm gần 32% tổng diện tích tự nhiên của vùng Đông Nam Bộ Đất xám phân bố chủ yếu ở tỉnh Tây Ninh và rải rác ở một số huyện Long Thành, Vĩnh Cửu, Nhơn Trạch (tỉnh Đồng Nai); Bến Cát, Tân Uyên, Thị xã Thủ Dầu Một (tỉnh Bình Dương); Bình Long, Chơn Thành, Đồng Phú (tỉnh Bình Phước); Hóc Môn, Gò Vấp, Củ Chi (Tp Hồ Chí Minh); xã Suối Rao, xã Đá Bạc, huyện Châu Đức (tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu) Đất xám được chia làm 3 đơn vị: Đất xám trên phù sa cổ (638.914 ha), đất xám đọng mùn gley (51.588 ha) và đất xám trên đá granite (54.150 ha) Đất xám nói chung có thành phần cơ giới nhẹ (cát, cát pha) Đất xám trên phù sa cổ có tỉ lệ cấp hạt cát trung bình và mịn từ 40 – 45 %, cấp hạt sét chiếm 20 – 25 % và gia tăng theo chiều sâu Đất xám có tầng loang lổ và đất xám bạc màu có đặc tính chua, khả năng trao đổi ion (CEC) rất thấp, ngh o đạm tổng số, ngh o cả lân và kali dễ tiêu cũng như Ca2+

và Mg2+ (Phạm Quang Khánh, 1995; Lê Huy Bá, 2009)

Đất đen (luvisols) có diện chiếm hơn 4% tổng diện tích tự nhiên của vùng, phân bố tập trung ở những vùng đất có nhiều họng núi lửa như Định Quán, Tân

Phú, Thống Nhất, Long Khánh (tỉnh Đồng Nai), Châu Thành, Xuyên Mộc (tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu) Đất này có độ phì nhiêu cao, các chất dinh dưỡng rất cân đối ngoại trừ kali, cấu trúc đoàn lạp tơi xốp Tuy nhiên tầng đất này thường rất mỏng, lẫn nhiều đá và kết von, nhiều đá lộ đầu Điểm nổi bật của loại đất này là lân tổng

số cao nhưng lân dễ tiêu chỉ ở mức trung bình, giàu calcium, rất ngh o kali; cation trao đổi cao, CEC cao và độ no base rất cao (Phạm Quang Khánh, 1995; Lê Huy

Bá, 2009)

Bảng 2.2 Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lượng Ngô ở các t nh thành vùng Đông Nam Bộ, năm 2010

(Nguồn: Tổng cục thống kê Việt Nam, 2010)

Địa phương Diện tích

(nghìn ha)

Năng suất (tạ/ ha (nghìn tấn Sản lượng

thuận lợi, chế độ canh tác tốt, mật độ trồng hợp lý giúp vụ này đạt năng suất cao nhất (có thể đạt 100 tạ/ ha với giống C919) Vụ H Thu và Thu Đông cũng cho năng suất cao, khoảng 60 tạ/ ha Bà Rịa – Vũng Tàu là tỉnh sản xuất Ngô đứng hàng thứ hai của vùng Đông Nam Bộ; trong đó có Châu Đức là một huyện trồng Ngô trọng điểm Diện tích trồng Ngô của huyện là 12.745 ha, năng suất trung bình đạt 43 tạ/ha Đa số nông hộ canh tác Ngô ở hai vụ H Thu và Thu Đông, nước tưới chủ yếu nhờ nước trời Tây Ninh là tỉnh có sản lượng Ngô xếp thứ ba trong vùng

và là nguồn cung cấp Ngô giống cho khu vực Đây cũng là nơi phân bố chủ yếu của đất xám Đông Nam Bộ (tiểu vùng đất xám bạc màu Tây Ninh) Hai huyện trồng Ngô lớn của tỉnh là Gò Dầu và Trảng Bàng Huyện Gò Dầu có 8 xã và một thị trấn, tất cả đều canh tác Ngô Huyện Trảng Bàng là huyện sản xuất Ngô trọng điểm, với diện tích 2.813 ha, năng suất 68 tạ/ha, sản lượng 19.128 tấn Đất ở hai huyện nói trên chủ yếu là đất xám (83,7 %), ngh o dinh dưỡng và thiếu nước vào mùa khô

Hình 2.3 Mô hình thâm canh cây Ngô lai thí điểm tại t nh Đồng Nai

(Nguồn: Lê Văn)

dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật vào sản xuất để giảm tối đa chi phí đầu tư, nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm, bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm và hạn chế các tác động gây ảnh hưởng đến môi trường

Vùng rễ hay hệ rễ (rhizosphere) là vùng bao quanh bộ rễ của thực vật Mặc

dù khái niệm về hệ rễ đã được Hiltner đề xuất từ năm 1904 nhưng cho đến nay vẫn chưa có một phương pháp thống nhất nào nhằm xác định phạm vi của hệ rễ Khi quan sát một rễ non, người ta nhận thấy quanh đầu rễ có một vùng chứa các chất

do đầu rễ và các vi sinh vật sống trong vùng đó tiết ra Phân tích thành phần các chất tiết này thấy có các chất hữu cơ cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của

vi sinh vật như đường, amino acid, acid hữu cơ, vitamin, v.v… Chính vì vậy, vi sinh vật có xu hướng tập trung quanh rễ cây cũng là một điều dễ hiểu (Phạm Văn Kim, 1999) Bộ rễ còn góp phần giữ được độ ẩm đất Mỗi loại cây trồng tiết qua bộ

rễ những chất khác nhau và khi rễ chết đi cũng phân hủy thành các thành phần hợp chất khác nhau Do đó loại cây trồng cũng quyết định số lượng và thành phần vi sinh vật sống trong vùng rễ đó Số lượng và thành phần vi sinh vật còn thay đổi theo các giai đoạn phát triển của cây trồng, phù hợp với hàm lượng các chất tiết qua bộ rễ Số lượng vi sinh vật đạt cực đại ở giai đoạn cây sinh trưởng mạnh (Lúa

đẻ nhánh, Ngô trổ bông…) và đạt cực tiểu ở thời k thu hoạch (hạt chín) (Trần

Cẩm Vân, 2009)

Hình 2.4 Sơ đồ mô hình tập đoàn hạt của đất và vi sinh vật trong hạt

(Nguồn: Phạm Văn Kim, 1999)

Vi khuẩn vùng rễ kích thích sự tăng trưởng của thực vật PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) có lịch sử nghiên cứu hàng thế kỷ Kinh nghiệm thực tế của nông dân trong việc luân canh với cây họ Đậu giúp tăng năng suất cây trồng Cuối thế kỷ XIX, việc trộn hạt giống với vi khuẩn có ích đã được khuyến cáo rộng rãi ở Hoa K Sau đó, chế phẩm Nitragin ra đời, là sự ứng dụng khả năng cố định

đạm của Rhizobium sp (Smith, 1992) Vào những năm 1950, ở Liên xô cũ, hơn 10

triệu ha đất nông nghiệp được xử lý với hỗn hợp vi khuẩn cố định đạm và hòa tan

lân, chủ yếu là Azotobacter chroococcum và Bacillus megaterium Trong những thí

nghiệm này, khoảng 60 % số lần thí nghiệm cho thấy năng suất của các loại cây

trồng khác nhau đã tăng khoảng 10 – 20 % Những năm 1970, Azospirillum được

phát hiện có khả năng tác động tích cực đến sự sinh trưởng của các cây không thuộc bộ Đậu thông qua quá trình hô hấp của thực vật (Bashan Holguin, 1997)

Hai loài Pseudomonas là P fluorescens và P putida, ngoài chức năng cung cấp

dinh dưỡng cho cây trồng, còn được ứng dụng như là các tác nhân phòng trừ sinh học (Glick, 1995) Nhiều loài vi khuẩn vùng rễ khác nhau đã được nghiên cứu và

đánh giá như Bacillus, Flavobacterium, Acetobacter, Azospirillum, v.v (Tang

&Yang, 1997)

PGPR được Kloepper và Schroth (1978) định nghĩa như là những vi khuẩn

có khả năng sống quanh vùng rễ và bám vào hạt giống, sau đó giúp cho sự tăng trưởng của thực vật Tiến trình phát triển của chúng qua các giai đoạn: phát tán từ

hạt giống và nhân nhanh mật số trong vùng rễ, bám vào bề mặt rễ và phát triển trong hệ thống rễ cây (Kloepper, 1993) Sự giảm tác dụng của PGPR trong các thử nghiệm ngoài đồng thường là do thiếu khả năng bám trụ của vi khuẩn vào rễ cây (Bloemberg et al., 2000; Benizri et al., 2001) Có một số gene chuyên trách cho quá trình này; tuy nhiên, chỉ có một số ít gene được xác định (Benizri et al., 2001; Lugtenberg et al., 2001) Chúng bao gồm gene chi phối các khả năng di động, sản phẩm của tiêm mao hay roi, khả năng sản sinh những chất đặc biệt trên bề mặt rễ cây, khả năng sản sinh các chất cảm ứng Biểu hiện gene của các thế hệ đột biến giúp chúng ta hiểu r hơn về quy luật của tiến trình định cư ở rễ (Lutenberg et al., 2001) Sự ngh o nàn về mật số của PGPR trong đất vùng rễ xảy ra khi trong quá trình phát triển thực vật gặp phải các điều kiện bất lợi như pH thấp, nhiệt độ cao, lượng mưa thấp (Frommel et al., 1993) Đối với cây trồng, những điều kiện canh tác không mong muốn cũng là nguyên nhân làm giảm mật số vi sinh vật trong đất (Dobbelaere et al., 2001) Sự khác biệt về nhiệt độ cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của PGPR (Okon và Labandera-Gonzalez, 1994)

ISR: Induction of Systemic Resistance of host plant by PGPR

Hình 2.5 Các cơ chế kích thích sự tăng trưởng thực vật bởi PGPR

(Nguồn: Kumar et al., 2011)

Vi khuẩn vùng rễ làm tăng sự phát triển của cây trồng thông qua các cơ chế gián tiếp và trực tiếp nhưng cơ chế chuyên biệt vẫn chưa được hiểu r (Glick, 1995; Kloepper, 1993) PGPR kích thích trực tiếp sự phát triển của thực vật thông qua sự cố định đạm, hòa tan lân khó tan, phân giải kali, sản sinh chất điều hòa sinh trưởng, v.v… (Glick,1995, Qi-mei et al., 2002; Zhao et al., 2008) Cơ chế tăng trưởng của thực vật trực tiếp thông qua việc hấp thụ kim loại và các ion trên bề mặt rễ cây cũng đã được báo cáo (Bashan và Levanony., 1991; Bertrand et al., 2000) PGPR tác động tốt đến cây trồng một cách gián tiếp, thông qua sự khống chế các vi sinh vật gây bệnh Các cơ chế có thể kể đến là cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh các nguyên tố kẽm, sắt với vi sinh vật gây bệnh; tổng hợp các chất kháng khuẩn; tiết enzyme phân hủy màng tế bào nấm; sản sinh hydrogen cyanide khống chế nấm gây hại; v.v (Glick, 1995; Persello-Cartieaux et al., 2003; Glick

và Pasternak, 2007)

2.3.2 Vi khuẩn nội sinh thực vật (endophytic bacteria

Vùng rễ cây trồng là nơi xuất xuất phát của nhiều vi khuẩn sống nội sinh thực vật (Mano và Morisaki, 2008) Khái niệm về vi khuẩn nội sinh có thể được hiểu là các vi khuẩn tập trung trong mô thực vật mà không gây bệnh hoặc những hậu quả tiêu cực khác đối với cây chủ (Schulz và Boyle, 2005) Vi khuẩn nội sinh trải qua phần lớn vòng đời trong cây chủ (Quispel, 1992) Có hơn 300.000 loài thực vật được biết trên Trái đất mà hầu hết mỗi loài đều có một hay một số loài vi khuẩn sống nội sinh (Strobel et al., 2004) Tuy nhiên chỉ một số ít cây trồng được nghiên cứu tường tận vì hiệu quả kinh tế của chúng và qua đó tìm thấy nhiều loài

vi khuẩn nội sinh với các đặc tính tốt (Ryan et al., 2008)

Qua nhiều kết quả nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trên nhiều đối tượng thực

vật như Lúa mì, Bông vải, Ngô, Cải Canola (Brassica napus L hay Brassica

campestris) các tác giả đều cho rằng chúng bắt nguồn từ đất Hạt giống và cây

con mang theo chúng và theo đó phân phát đến các vùng khác nhau Tại đây, chúng nhanh chóng phát triển trong đất vùng rễ hay bề mặt rễ, nhân mật số và di chuyển vào trong mô thực vật bằng nhiều con đường khác nhau Theo Hallmann (2001), vi khuẩn nội sinh thường được thu hút đến cây chủ bằng cơ chế hóa hướng

động (chemotaxis) hay di chuyển ngẫu nhiên Rễ cây tiết ra một số hợp chất thu hút vi khuẩn nội sinh đến và quần tụ (colonization) trên bề mặt rễ (Bashan, 1986) Một hợp chất trung gian để gắn chặt vi khuẩn vào bề mặt rễ được các nhà khoa học giả định là lectin Duijff et al (1997) đã chứng minh vi khuẩn nội sinh dòng WCS417r đến bề mặt rễ do một hợp chất lipopolysaccharide Ngoài ra, sự tiếp xúc ngẫu nhiên của vi khuẩn với lông hút của rễ non khi rễ phát triển để tìm nguồn nước hay dưỡng chất cũng là một cơ hội quan trọng

Trước khi xâm nhập vào mô thực vật, vi khuẩn phải phân cắt hay sinh sản để tăng mật số vì sự tập trung của chúng tại các địa điểm có khả năng xâm nhập tương đối thấp, chỉ từ 1.000 đến 100.000 tế bào/g mô thực vật (Hallmann, 2001)

Sự xâm nhập của vi khuẩn nội sinh vào mô thực vật có thể diễn ra qua các con đường sau: Qua các lỗ tự nhiên như thủy khổng, khí khổng, bì khổng; qua vi lỗ hiện diện khi bắt đầu sự hình thành lông hút; qua vị trí hình thành các rễ ngang (lateral root); qua các vết thương do tác động vật lý hay qua các vết bệnh Trong số

đó, vi lỗ và vết thương là các cửa ng quan trọng vì đây là lớp tế bào non dễ xâm nhập Vết bệnh do tuyến trùng (Hallmann et al., 1997) hoặc do nấm bệnh (Mahafee và Kloepper, 1997) cũng là cửa ng cho vi khuẩn nội sinh xâm nhập

(EC: Tế bào biểu bì; h: Lông hút; b: Vi khuẩn; Bar = 1  m)

Hình 2.6 Ảnh hiển vi điện tử quét về sự dòng hóa

trên vùng lông hút rễ Lúa của Burkholderia kururiensis

(Nguồn: Mattos et al., 2008)

Sau khi xâm nhập vào nhu mô, vi khuẩn nội sinh di chuyển đến các bó mạch gỗ để theo nước di chuyển đến các bộ phận khác của cây Thí nghiệm của Mattos et al (2008) cho thấy quá trình dòng hóa quanh vùng có lông hút của rễ

Lúa, xâm nhập vào bên trong và di chuyển đến mạch gỗ của Burkholderia

kururiensis Các thí nghiệm về sự dòng hóa của Herbaspirillum sp A46 trên các

giống Lúa ( ndo, 2003) hay của Gluconacetobacter diazotrophicus trên Cà chua

(Luna et al., 2012) cũng cho thấy sự tiếp cận rễ (rễ ngang hoặc lông hút), xâm nhập và di chuyển lên thân, lá của vi khuẩn nội sinh Beatle và Lindow (1995) cho rằng vi khuẩn nội sinh cũng có khả năng xâm nhập trực tiếp vào bên trong mô lá qua khí khổng để đi đến tế bào nhu mô lá (Hallmann, 2001) Ở đấy, chúng có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí ở một khoảng không với một lượng oxy cần thiết tương tự như khoảng không chứa khí ở nhu mô rễ mà Rheinold et al (1986)

đã phát hiện trên vi khuẩn nội sinh rễ Lúa

Vi khuẩn nội sinh giúp tăng cường dinh dưỡng cho cây bằng nhiều cơ chế trực tiếp hay gián tiếp Nhiều vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, có vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn nitrogen, bổ sung nguồn đạm cho đất và cây trồng, ổn định năng suất cây trồng, giúp phát triển sinh thái bền vững (Persello-Cartieaux et al., 2003) Thí nghiệm trên Mía tại Brazil cho thấy vi khuẩn nội sinh

có thể cung cấp 80 kg N/ha/năm (Boddey et al.,1995) Khi nghiên cứu ở 4 loài Lúa trồng khác nhau ở Ấn Độ, người ta đã xác định được vi khuẩn nội sinh

Gluconacetobacter diazotrophicus có khả năng cố định đạm nhờ vào gen nif

(Muthukumarasamy et al., 2005) Có 32 dòng thuộc các chi Pantoea,

Pseudomonas, Burkholderia, Acinetobacter và Ralstonia đã được phân lập từ hai

loại cây trồng phổ biến ở Trung Quốc là Ngô và Cải Tất cả các dòng đều có khả năng hòa tan tricalcium phosphate và làm giảm pH môi trường, đồng thời có hơn 60% tổng số dòng còn có khả năng sản sinh indoleacetic acid và siderophore (Huang et al., 2010) Nhiều nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn nội sinh như

Enterobacter cloacae, Azospirillum brasilense, Azotobacter, v.v có khả năng

tổng hợp I từ tiền chất L-tryptophan (Koga et al., 1999; Ahmad et al., 2005; Somers et al., 2005) Các khám phá mới về khả năng chống lại các tác nhân gây

bệnh cho cây thông qua các tác nhân đối kháng sinh học hay khả năng tổng hợp các hợp chất giúp phân hủy thuốc bảo vệ thực vật hay các dung môi hữu cơ của các vi khuẩn nội sinh cũng đã được thông báo (Nelson, 2004; Berg et al., 2005; Siciliano et al., 2001; Germaine et al., 2006)

Các công trình nghiên cứu trong nước về các đặc tính quý của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh thực vật phân lập từ nhiều loại thực vật khác nhau cũng đang gia tăng nhanh chóng và đem lại nhiều kết quả khả quan (Lăng Ngọc Dậu et al., 2007; Nguyễn Hữu Hiệp, 2008; Nguyễn Thị Thu Hà et al., 2009; Vũ Văn Định, 2009; Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2011; Nguyễn Thị Ngọc Trúc, 2012) Các kết quả này có thể được ứng dụng trong các lĩnh vực như phân bón vi sinh, đối kháng sinh học, khử độc môi trường, v.v nhằm tiến tới một nền sản xuất Nông nghiệp phát triển bền vững

2.3.3 Cơ chế cố định đạm, hòa tan lân khó tan của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh thực vật

2.3.3.1 Cơ chế cố định đạm

Đạm giữ vai trò quan trọng đối với sinh vật Đạm là nguyên tố tham gia cấu tạo của protein, acid nucleic và các thành phần cấu tạo của tế bào Nguồn dự trữ đạm trong tự nhiên là rất lớn Chỉ tính riêng trong không khí, N2 chiếm khoảng 78,16% thể tích Người ta ước tính trong bầu không khí bao trùm lên một ha đất đai chứa khoảng 8 triệu tấn khí nitơ, lượng nitơ này có thể cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng trong 80 triệu năm Tuy nhiên, trong thực tế cây trồng không có khả năng đồng hóa trực tiếp nguồn nitơ này bởi vì giữa hai nguyên tử nitơ có liên kết

ba tạo nên tính trơ của phân tử Nguồn đạm mà cây trồng sử dụng được phải ở dạng NH4+ hoặc NO3- Vì vậy, cần phải có quá trình biến đổi N2 trong khí quyển thành dạng mà sinh vật có thể dễ dàng hấp thụ được (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007)

Quá trình cố định đạm sinh học là một quá trình được thực hiện bởi vi khuẩn, trong đó nitrogen phân tử được biến đổi thành dạng đạm vô cơ (phân tử

NH3) Tiếp đó, vi khuẩn sẽ chuyển hóa tiếp một phần thành dạng hữu cơ (acid amin) để chúng sử dụng Khả năng cố định đạm được cho rằng có được là do sự

xúc tác của hệ enzyme nitrogenase (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007)

2.3.3.2 Cơ chế hòa tan lân khó tan

Lân là nguyên tố dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng nói riêng và sinh vật nói chung Lân tham gia vào cấu tạo các acid nucleic, coenzyme, adenosine triphosphate (ATP), v.v… Đây là những hợp chất quan trọng nhất trong sự phân chia tế bào, tạo mới các bộ phận của cơ thể Ngoài

ra lân còn có vai trò tạo môi trường đệm, ảnh hưởng đến khả năng hút khoáng chất khác của cây

Lượng lân trong tự nhiên rất lớn nhưng phần lớn cây trồng không hấp thụ được Chỉ một lượng nhỏ lân ở dạng dễ hòa tan được cây hấp thụ, chủ yếu ở dạng HPO42- hoặc H2PO4- Tuy nhiên, dạng hòa tan trong đất này thường rất thấp, ở mức 1 ppm hoặc ít hơn (Goldstein, 1994) Dạng phổ biến của lân hiện diện trong đất là apatite, hydroxyapatite và oxyapatite không hòa tan, thường được tìm thấy trong đá Phosphate vô cơ còn có thể được tìm thấy dưới dạng kết hợp với Fe, l,

Mn, cũng khó hòa tan và đồng hóa Đây chính là một đặc điểm của đất ferralsols;

sự chuyển hóa hydrate hóa và sự tích tụ hydrated oxide và hydroxide của Fe xảy

ra, làm tăng khả năng cố định phospho Ngoài ra, một lượng lớn phosphate vô cơ hòa tan cung cấp cho đất dưới dạng phân bón hóa học cũng thường nhanh chóng bị

cố định và trở thành dạng khó sử dụng đối với cây Hiện tượng cố định và kết tủa lân trong đất thường phụ thuộc vào pH và dạng đất Trong đất acid, lân bị cố định bởi oxide và hydroxide của nhôm và sắt; trong đất kiềm, lân bị cố định bởi calcium Nhiều loài vi khuẩn có khả năng chuyển hóa dạng lân khó tan trong đất như calcium monohydrogen phosphate (CaHPO4), calcium monohydrogen dihydrate phosphate (CaHPO4.2H2O), calcium orthophosphate (Ca3(PO4)2 thành dạng lân dễ tan để cây trồng sử dụng Cơ chế giải thích sự hòa tan lân khó tan bao gồm: sự giảm pH do sản sinh các acid hữu cơ như acid lactic, acid citric, acid gluconic, acid sucinic, acid fumaric, acid acetic, acid oxalic v.v (McGill và Christie, 1983; Welch et al., 2002; Rashid et al., 2004; Lin et al., 2006); sự tạo phức và các phản ứng trao đổi ion (Moghimi và Tate, 1978)

Ngoài ra, trong quá trình sống, vi khuẩn nitrate hóa và vi khuẩn sulfate hóa tiết ra acid HNO3 và H2SO4, cũng tham gia tích cực vào việc phân giải lân khó tan

Ca3(PO4)2 + 4HNO3 → Ca(H2PO4)2 + 2Ca(NO3)2

Ca3(PO4)2 + 2H2SO4 → Ca(H2PO4)2+ 2CaSO4 Thành phần chính thứ hai của lân trong đất là dạng hữu cơ Trong hầu hết các loại đất, lân hữu cơ có thể chiếm đến 30 – 50% tổng số lân Lân hữu cơ trong đất chủ yếu ở dạng inositol phosphate (phytate đất) Các dạng lân hữu cơ khác gồm: phosphomonoester, phosphodiester, phosphotriester Sự khoáng hóa các hợp chất này được thực hiện bởi hoạt động của nhiều phosphatase (còn được gọi là phosphahydrolase) Những phản ứng khử phosphoryl này liên quan đến sự thủy phân cầu nối phosphoester hoặc phosphoanhydride Khác với phosphatase kiềm, phosphohydrolase acid hoạt động xúc tác tối ưu ở giá trị pH từ acid đến trung tính Ngoài ra, chúng còn được phân ra làm hai loại, phosphatase acid đặc hiệu và phosphatase acid không đặc hiệu Phosphohydrolase đặc hiệu với những hoạt tính khác nhau, bao gồm 3’- nucleotidase, 5’- nucleotidase, hexose phosphatase và phytase Một nhóm đặc hiệu khác có thể cắt cầu nối C-P từ phosphonate hữu cơ, giải phóng phosphite (Rossolini et al., 1998)

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cho thấy có nhiều loài vi khuẩn đất vùng rễ và

vi khuẩn nội sinh vừa có khả năng cố định đạm, vừa hòa tan được lân khó tan,

thậm chí là phân giải các hợp chất chứa kali như kaolinite, illite, montmorilonite, v.v (Qi-mei et al., 2002; Zhao et al., 2008) Các loài vi khuẩn này vừa có thể bổ sung nguồn dinh dưỡng cơ bản cho cây lại vừa thân thiện với môi trường

Hình 2.7 Sơ đồ về các dạng lân trao đổi trong đất

(Nguồn: Ohtake et al., 1996)

Chương III

Các nghiên cứu được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật - Sinh hóa, trường Đại học Sài Gòn và Phòng thí nghiệm Vi sinh vật - Sinh hóa, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu, hóa chất

Vật liệu:

45 mẫu đất vùng rễ và mẫu Ngô thu thập tại:

- Các xã Long Tân, Phước Thạnh, Long Mỹ, huyện Đất Đỏ, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu (loại đất đỏ)

- Xã Truông Mít, huyện Dương Minh Châu; xã Gia Bình, huyện Trảng Bàng; phường 4, thị xã Tây Ninh, tỉnh Tây Ninh (loại đất xám)

- Ấp 2, ấp 3, ấp Suối Tiên, xã Sông Trầu, huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai (loại đất đen)

Hóa chất:

Các hóa chất dùng trong thí nghiệm (xem phụ lục)

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ có trong các Phòng thí nghiệm nêu trên

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thu thập và xử lý mẫu

Thu mẫu và chuẩn bị mẫu là khâu quan trọng quyết định độ chính xác của việc phân tích Mẫu phải có tính đại diện, điển hình, phản ánh đúng thực trạng cây trồng tại hiện trường Xử lý mẫu và bảo quản mẫu phải giữ được các thành phần, tính chất quan trọng của mẫu

3.2.1.1 Thu thập mẫu đất và mẫu Ngô

Việc thu mẫu được tiến hành tại các ruộng thuộc các địa phương nêu trên Tùy

theo hình dáng và địa hình của mảnh đất, lấy ít nhất tại 5 điểm phân bố đều trên toàn diện tích theo quy tắc lấy theo đường chéo (hình 2.1a), đường zig zag (hình 2.1b) hay hình vuông (hình 2.1c) Tránh lấy mẫu ở các vị trí đặc thù như nơi đổ phân, vôi, gần bờ, vị trí quá trũng hay quá cao (Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa, 1998)

Chọn cây Ngô đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh (vừa trổ cờ) Hớt bỏ lớp đất bề mặt (1 - 3 cm) quanh gốc Thu toàn bộ đất vùng rễ và cây Ngô (cắt bỏ thân

và lá từ độ cao trên 20cm) cho vào túi nylon, ghi và dán nhãn bao gồm ký hiệu mẫu, thời gian, địa điểm, người lấy mẫu Mẫu sau khi thu được đem ngay tới phòng thí nghiệm để xử lý (trong vòng 24 giờ)

Hình 3.1 Cách thu mẫu ngẫu nhiên

(Nguồn: Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa, 1998)

3.2.1.2 Xử lý mẫu đất và mẫu Ngô

Đối với đất vùng rễ:

- Giũ mạnh bộ rễ Ngô để thu đất xa rễ (cách rễ > 1cm) Nhặt sạch rễ khô, sỏi, sạn Dùng cối chày nghiền mịn và cho vào lọ đậy kín Đất này được dùng để phân tích

lý - hóa đất

- Dùng dụng cụ vô trùng gạt lấy đất vùng cạnh rễ và vùng xung quanh rễ (cách rễ 0

- 1cm) cho vào lọ chứa đã tiệt trùng, bảo quản lạnh (4 - 5oC) (Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa, 1998)

Đối với mẫu Ngô:

Chọn các bộ phận (rễ, thân) không có dấu hiệu bệnh Cắt mẫu thành từng đoạn ngắn (3 - 4 cm); rửa thật sạch dưới vòi nước mạnh để loại bỏ đất, bụi bẩn; để ráo

tự nhiên Để riêng từng loại mẫu trong bọc nylon sạch có ghi nhãn, bảo quản trong

tủ lạnh (4-5oC) nếu chưa tiến hành phân lập (Cao Ngọc Điệp, 2011)

3.2.2 Phân tích một số ch tiêu nông hóa đất

(Theo Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa, 1998)

3.2.2.1 Xác định pH H2O , pH KCl và pH NaF của đất

- pH = -lg aH+, là đại lượng biểu thị hoạt độ H+ trong môi trường đất Ðó là chỉ tiêu đơn giản đầu tiên về độ chua thường được xác định nhất, nó có ý nghĩa rất lớn trong việc đánh giá tính chất đất

- Có 3 loại pH thường được xác định:

+ pHH2O (pH nước) là pH được đo khi tác động đất với nước

+ pH muối trung tính là pH được đo khi tác động đất với muối trung tính như dung dịch KCl 1M, dung dịch KCl2 0,01 M, thường sử dụng nhất là dung dịch KCl 1M gọi tắt là pHKCl

+ pHNaF là pH được đo khi tác động đất với dung dịch NaF 1M là một loại muối thủy phân có môi trường kiềm

- Phép đo thông dụng và tiêu chuẩn hiện nay là phép đo điện thế bằng pH kế điện cực thủy tinh

Xác định pH H2O và pH KCl

- Cân 20g đất mịn khô không khí cho vào bình có dung tich 100ml miệng rộng

- Thêm 50ml dung dịch KCl 1M (hay nước cất)

- Loắc xoáy bằng tay cho phân tán đất và tiếp tục lắc trên máy 30 phút Để yên khoảng 2 giờ trở lên (không được quá 3 giờ)

- Loắc xoáy lại 2 - 3 lần bằng tay cho phân tán huyền phù

- Sau đó đo ngay bằng pH kế Vị trí bầu điện cực ở vị trí trung tâm và trung điểm

độ sâu của dung dịch trong huyền phù

- Ðọc số đo sau khi kim chỉ ổn định 30 giây

Xác định pH NaF

- Cân một khối lượng đất mịn khô Tương ứng với 1g đất khô tuyệt đối cho vào

bình

- Thêm 50ml dung dịch NaF 1M, bấm đồng hồ Khuấy 1 phút bằng đũa thủy tinh

- Cho điện cực vào dung dịch đất

- Ðọc độ pH tại thời điểm sau khi cho NaF 1M 2 phút

- Ðọc pH một lần nữa sau 60 phút

3.2.2.2 Xác định độ ẩm và tính hệ số khô kiệt của đất

Các kết quả phân tích được tính trên cơ sở đất khô tuyệt đối (sau khi sấy) Vì

vậy cần xác định độ ẩm của mẫu đất, từ đó xác định hệ số khô kiệt để tính kết quả

phân tích

Nguyên tắc của phương pháp là sấy khô mẫu ở 100 - 105OC cho đến khi khối

lượng không thay đổi, trên cơ sở đó tính khối lượng nước bay hơi và từ đó suy ra

hệ số khô kiệt của mẫu

Xác định độ ẩm A( :

- Cân chính xác đúng 5g đất, cho vào hộp lồng Petri

- Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 100 - 105oC trong khoảng 4 giờ

- Lấy ra, cân khối lượng lần thứ nhất

- Tiếp tục sấy ở 100 - 105oC thêm khoảng 2 giờ Lấy ra và cân khối lượng lần thứ

hai Tiếp tục làm như vậy cho đến khi thấy khối lượng lần cân sau không thay đổi

hoặc thay đổi không quá 0,0010g so với lần trước

- Tính phần trăm độ ẩm theo công thức:

P1 – P2

A(%) = x 100 P2 – P3

Trong đó: + P1: Khối hộp có đất trước sấy (g)

+ P2: Khối lượng hộp có đất sau sấy (g)

+ P3: Khối lượng hộp không có đất (g)

3.2.2.3 Xác định N tổng số theo phương pháp Kjendahl

Nguyên lý là máy vô cơ hóa mẫu sẽ chuyển toàn bộ N có trong hợp chất hữu

cơ thành muối ammon bằng cách công phá với H2SO4 đậm đặc (với K2SO4 tăng nhiệt độ sôi và CuSO4 và Se xúc tác) Chuyển mẫu sang hệ thống chưng cất đạm,

NH3 được sản sinh ra khi cho muối ammon tác dụng với NaOH Thu NH3 bằng dung dịch acid boric và chuẩn độ borate ammon bằng dung dịch acid mạnh (ví dụ như H2SO4 chuẩn hay HCl chuẩn)

cid boric là một acid rất yếu, dung dịch 0,65M có pH = 4,7 Khi trung hòa hết 20% H+

ở nấc điện ly thứ nhất thì đã tăng lên pH = 8,6 (25ml dung dịch có thể tương đương 48mg N) Khi chuẩn độ bằng một acid mạnh, loãng, tại điểm đổi màu

pH = 4,5 cho phép kết thúc định phân

Hỗn hợp chỉ thị màu methyl đỏ (khoảng đổi màu pH = 4,4 - 6,2 chuyển từ đỏ sang vàng) và với bromocresol xanh (khoảng đổi màu pH = 3,8 - 5,4 chuyển từ vàng sang xanh dương) là để mở rộng khoảng đổi màu và phối màu để nhận biết

sự đổi màu r rệt hơn

Vô cơ hóa mẫu (Công phá mẫu bằng máy tự động:

- Cân 0,5 - 1g đất (hoặc mẫu vật rắn khác) cho vào bình công phá thể tích 50 - 100ml

100 + A

K =

100

- Thêm 1g chất xúc tác (K2SO4:CuSO4:Se theo tỉ lệ 100:10:1) và 5 - 10 ml H2SO4đậm đặc

- Đưa bình vào máy nung đặt trong tủ Hotte, tiến hành vô cơ hóa mẫu trong 1 giờ

- Máy sẽ tự động nạp các hóa chất theo đúng trình tự và tính toán lượng đạm tổng

số, hiển thị kết quả trên màn hình

Công thức tính N tổng số (trên 1g mẫu khô :

Với a: Thể tích dung dịch acid tiêu chuẩn tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu (ml) b: Thể tích dung dịch acid tiêu chuẩn tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng (ml) V: Thể tích toàn bộ dung dịch đã vô cơ hóa (ml)

v: Thể tích dung dịch trích chuẩn độ (ml)

N: Nồng độ đương lượng dung dịch chuẩn acid

m: Khối lượng mẫu phân tích (g)

K: Hệ số khô kiệt

(a-b) N 14 V 100 K N% =

1000 v m

3.2.2.4 Xác định P dễ tiêu theo phương pháp Oniani

Hòa tan các dạng hợp chất chứa P trong đất bằng dung dịch H2SO4 0,1N với tỉ

lệ đất: dung môi bằng 1: 25, lắc trong 3 phút Hàm lượng P trong dung dịch được xác định bằng phương pháp trắc quan với màu xanh molybden

Phương pháp này phù hợp với các loại đất chua không carbonate và thành phần lân khoáng chủ yếu là nhôm, sắt phosphate

Tạo màu và so màu

- Lấy 2,5 ml các dung dịch tiêu chuẩn, các mẫu và mẫu trắng đã qua chuẩn bị cho vào bình định mức (Xem lưu ý)

- Cho thêm 7,5 ml dung dịch H2SO4 0,1N và nước cất đến khoảng 15 - 20ml

- Thêm từ burette 4ml hỗn hợp tạo màu (dung dịch B)

- Thêm nước cất cho đến vạch định mức Lắc trộn đều Để ổn định 10 - 20 phút

- Đo màu trên quang phổ kế tại bước sóng 880 nm

Lưu ý: Cách lấy dung dịch mẫu thay đổi theo hàm lượng P dễ tiêu trong đất:

+ P dễ tiêu < 20ppm, lấy 10ml dung dịch mẫu

+ P dễ tiêu từ 20 - 35ppm, lấy 5ml dung dịch mẫu và thêm 5ml dung dịch H2SO40,1N

+ P dễ tiêu từ 35 - 80ppm, lấy 2,5ml dung dịch mẫu và thêm 7,5ml dung dịch

H2SO4 0,1N

+ P dễ tiêu từ >80ppm, cần pha loãng dung dịch mẫu 2 - 3 lần bằng dung dịch

H2SO4 0,1N; rồi lấy 2,5ml dung dịch mẫu và thêm 7,5ml dung dịch H2SO4 0,1N

3.2.2.5 Xác định K trao đổi bằng quang kế ngọn lửa

Kali trong đất chia làm 4 dạng:

- Kali hữu hiệu trực tiếp (immediately avaiable) là K+ hòa tan và trao đổi

- Kali hữu hiệu chậm hay bán hữu hiệu (morderately available) có thể xem như loại đã được cố định, không thể trao ngay do K+ chui sâu vào và bị giữ chặt trong các cấu trúc của khoáng hoặc phức hệ hữu cơ - khoáng nhưng có thể điều động dần cho cây trồng

- Phần chủ yếu của kali trong đất nằm sát ngoài lưới tinh thể silic (lattic-bound), là nguồn dự trữ kali lâu dài Dạng này phải trải qua quá trình tác động vô cùng lâu dài của nước, khí hậu và môi trường đất mới có thể cung cấp kali hữu hiệu cho đất

- Kali trong lưới tinh thể silic là dạng kali xem như không có khả năng điều động,

có tỉ lệ thay đổi do quá trình phong hóa và rửa trôi

Kali tổng số là tổng của 4 dạng trên

Xác định K trao đổi trong đất bằng ammonium acetate 1M (tỉ lệ chiết rút là 1: 10)

Chuẩn bị mẫu:

- Cân 1g đất trong ống ly tâm 50ml, thêm 10ml ammonium acetate 1M (pH = 7), lắc trong 1 giờ, ly tâm và lọc trích dung dịch vào bình chứa 25ml

- Chuẩn bị tương tự với mẫu trắng

Lập dãy tiêu chuẩn:

Lập dãy tiêu chuẩn bằng dung dịch ammonium acetate 1M có nồng độ 0 - 60ppm

K

Tạo màu và so màu:

- Hút 2ml dung dịch tiêu chuẩn hoặc dịch trích mẫu (hoặc mẫu trắng) cho vào ống nghiệm Thêm vào 2ml dung dịch chứa CsCl (0,2% Cs) và l(NO3)3 (0,36% Al)

- Đo K trao đổi bằng quang kế phát xạ ngọn lửa tại bước sóng 768nm

Walkley-Thuật ngữ "Chất hữu cơ" bao gồm toàn bộ phần không phải khoáng của đất

Đó là nguồn cung cấp nhiều chất dinh dưỡng cho cây, tăng lượng và chất của CEC, cải thiện tính chất vật lý và khả năng giữ ẩm của đất

Nguyên lý: Oxide hóa chất hữu cơ bằng K2Cr2O7 N/3 trong H2SO4 25N tại nhiệt độ hòa tan H2SO4 đậm đặc vào dung dịch K2Cr2O7 1N Chuẩn độ lượng dư

K2Cr2O7 bằng dung dịch muối Fe II

- Thêm 100ml nước và 10ml H3PO4, để thật nguội

- Thêm 0,5ml chất chỉ thị màu (ferroin) và chuẩn độ dicromate dư bằng muối Fe II ammonium sulfate (muối mhor)

- Tới gần điểm kết thúc, màu trở nên tím đậm Cần thiết nhỏ từ từ từng giọt muối mhor và cẩn thận lắc đều cho đến khi màu đột ngột chuyển sang xanh lá cây là kết

m: Khối lượng mẫu phân tích (g)

K: Hệ số khô kiệt

Hệ số chuyển đổi từ carbon hữu cơ sang chất hữu cơ là 1,724

3.2.3 Phân lập và đếm mật số vi khuẩn đất vùng rễ Ngô

Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu

và đưa về dạng thuần khiết

- Tách rời các tế bào vi sinh vật bằng kỹ thuật cấy ria hoặc trang

- Nuôi các vi khuẩn trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng

Đếm mật số tế bào có trong dịch đất gián tiếp thông qua đếm khuẩn lạc

3.2.3.1 Pha loãng dịch đất và tạo hộp trải

- Cân 1g mẫu đất vùng rễ ngô, dùng cối chày vô trùng nghiền mịn

- Cho đất vào bình tam giác với 99 ml nước cất đã được khử trùng, lắc 12 giờ với tốc độ 200 vòng/phút cho các hạt đất rời ra và vi khuẩn phân tán đều trong nước Bình này chứa dịch huyền phù tế bào có độ pha loãng 100 lần, mật độ tế bào ứng với 10-2

Hình 3.3 Sơ đồ pha loãng dịch đất và tạo hộp trải

(Nguồn: http://www.physics.csbsju.edu/stats/serial_dilution.gif)

Tiến hành pha loãng dịch đất thành 8 bậc liên tiếp tiếp theo (mật độ tế bào tương

ứng với 10-3 - 10-10) như sau:

- Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng được đánh số từ (-3) đến (-10)

- Dùng pipetman và đầu tip vô trùng hút 1 ml dịch từ bình tam giác (-2) cho vào ống nghiệm (-3) Ðậy nắp, trộn đều bằng máy vortex (ống -3 chứa huyền phù tế bào có độ pha loãng 103

lần, mật độ tế bào ứng vói10-3 )

- Tiếp theo, dùng pipetman và đầu tip vô trùng hút 1 ml dịch từ ống (-3) cho vào

ống (-4) Ðậy nắp, trộn đều bằng máy vortex (ống -4 chứa huyền phù tế bào có độ

pha loãng 104 lần, mật độ tế bào ứng vói10-4 )

- Thực hiện tương tự để có các huyền phù tế bào với các độ pha loãng 105 đến

1010 Thông thường, qua khảo sát thấy mật số tế bào ở các bậc từ 10-6 đến10-8 là

thích hợp cho việc đếm khuẩn lạc: 25 - 250 khuẩn lạc/1 đĩa Petri (theo Trần Linh

Thước, 2007)

- Ứng với các nồng độ được pha loãng, dùng pipetman và đầu tip vô trùng hút 0,1

ml dịch huyền phù có độ pha loãng 106, 107 và 108 lần tuần tự cho vào 3 hộp Petri

môi trường LB/ 1 độ pha loãng

- Dùng que gạt thủy tinh trải đều dịch chứa tế bào lên bề mặt môi trường

- Ủ ở 30oC trong 24 – 48 giờ

3.2.3.2 Tính mật số tế bào tương ứng với các độ pha loãng khác nhau

- Ðếm số khuẩn lạc xuất hiện ở mỗi hộp Petri Sử dụng số liệu của độ pha loãng để

tính mật độ tế bào

- Đếm số lượng tế bào thông qua khuẩn lạc (CFU/ml) theo Trần Linh Thước

(2007): Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ Chọn các đĩa có số

đếm từ 25 - 250 khuẩn lạc để tính kết quả

- Mật số vi khuẩn được tính theo công thức sau:

Trong đó: : Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml) trong 1ml mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng i

V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

fi: Độ pha loãng tương ứng

N

A = (CFU/ml)

n1Vf1 + + niVfi

3.2.4 Phân lập và làm thuần vi khuẩn nội sinh cây Ngô

3.2.4.1 Khử trùng bề mặt mẫu Ngô (theo Cao Ngọc Điệp, 2011)

- Cắt mẫu rễ (thân) Ngô đã qua xử lý thành từng đoạn nhỏ 1cm, cho vào bình tam giác 250 ml

- Cho cồn 96o vào bình tam giác vừa ngập mẫu, lắc nhẹ trong thời gian 10 phút Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần (5 phút/lần)

- Cho calcium hypochloride 2% hoặc nước javen, lắc nhẹ trong 10 phút Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 4 lần (5 phút/lần)

- Lấy 100 - 200 µl của nước rửa lần thứ 4 chủng trên các đĩa chứa môi trường TYG , ủ ở 30o

C

- Sau 24 - 48 giờ, nếu trên các đĩa môi trường này không xuất hiện khuẩn lạc thì mẫu đã đạt yêu cầu khử trùng

3.2.4.2 Ly trích dịch từ mẫu Ngô và chủng vào môi trường bán đặc

- Mẫu khử trùng đạt yêu cầu được cho vào cối chày vô trùng, giã nhuyễn

- Cho thêm 0,5 - 1 ml nước cất vô trùng vào cối, khuấy đều và hút 500µl dịch trích mẫu chủng vào các ống nghiệm chứa môi trường LB/LGI bán đặc (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần)

- Đậy kín các ống nghiệm, đem ủ ở 30oC khoảng 2 - 4 ngày

- Đối chứng âm: nước cất + môi trường LB/LGI bán đặc

3.2.4.3 Cấy chuyền và làm thuần các dòng vi khuẩn nội sinh

- Sau 2 - 4 ngày, quan sát ống nghiệm chứa môi trường LB bán đặc, nếu thấy có một lớp màng mỏng (pellicle) gần bề mặt môi trường thì chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh trong dịch trích mẫu Ngô

- Trải lớp môi trường LB bán đặc có chứa vi khuẩn nội sinh sang môi trường LB đặc, ủ ở 30oC Có thể pha loãng nếu thấy mật độ khuẩn quá lớn

- Sau 24 – 48 giờ, lấy các khuẩn lạc khác nhau mọc trên bề mặt môi trường tiếp tục cấy chuyền sang các đĩa môi trường LB đặc vài lần đến khi các khuẩn lạc xuất

hiện trên đường cấy rời nhau và hình thái khuẩn lạc có vẻ thuần nhất

- Kiểm tra độ ròng bằng cách quan sát dưới kính hiển vi bằng phương pháp giọt

ép

- Khi thấy vi khuẩn đã thật sự ròng (thuần nhất) thì cấy chuyển sang ống nghiệm chứa môi trường LB đặc để trữ ở 4°C và được xem như một chủng (isolate) thuần

3.2.5 Bảo quản các dòng vi khuẩn thu được

- Các dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây Ngô và các dòng vi khuẩn sống nội sinh trong cây Ngô được bảo quản để dùng cho các phân tích tiếp theo Phương pháp bảo quản giúp đảm bảo được sức sống, ngăn ngừa những thay đổi về di truyền và sinh

lý của giống

- Sử dụng phương pháp cấy chuyền (Trần Linh Thước et al., 2001): Vi sinh vật hiếu khí được cấy chuyền và giữ trong ống thạch nghiêng Ở nhiệt độ phòng, phương pháp này chỉ giúp giữ giống ngắn hạn, cần phải cấy chuyền lại sau vài tuần Muốn kéo dài thời gian bảo quản từ 3 – 5 tháng, cần trữ ống giống trong tủ lạnh (ở nhiệt độ khoảng 0 - 5o

C)

3.2.6 Mô tả đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn thu được

3.2.6.1 Mô tả đặc điểm khuẩn lạc

- Đo kích thước khuẩn lạc

- Mô tả hình thái khuẩn lạc, bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi, dạng bìa khuẩn lạc (Cao Ngọc Điệp, 2011)

3.2.6.2 Mô tả hình thái, khả năng chuyển động và nhuộm Gram

Quan sát hình thái và khả năng chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép

- Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên lame sạch

- Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đ n cồn và để nguội

- Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên lame sạch

- Đậy lammelle lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của lammelle tiếp xúc với lame một góc 45o rồi hạ xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002)

- Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 - 1000 lần

Nhuộm Gram vi khuẩn (Nguyễn Đức Lượng et al., 2003)

- Chuẩn bị vết bôi: Lấy 1 giọt nước cất nhỏ lên lame Dùng que cấy đã khử trùng

lấy một ít khuẩn lạc trải mỏng lên lame Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên ngọn lửa đ n cồn

- Nhuộm tiêu bản: Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi, nhuộm tiêu bản bằng thuốc tím tinh thể trong 1 phút Nhuộm lugol trong 1 phút Rửa nước Tẩy cồn trong 30 giây bằng cách để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu Rửa nước Nhuộm bổ sung bằng Fuchsin từ 10 – 30 giây Rửa nước, để khô

- Soi tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính 100X Mẫu bắt màu tím: Gram dương Mẫu bắt màu hồng: Gram âm

- Lưu ý: Vi khuẩn Gram dương có thể xuất hiện dưới dạng Gram âm do khử màu quá mức bởi cồn hoặc mất màu tím khi về già nên tránh khử cồn quá lâu và chỉ nuôi tế bào tế bào qua đêm rồi nhuộm Nếu vết bôi quá dày thì thuốc nhuộm thấm vào các tế bào không đồng đều

* Có thể test Gram các vi khuẩn bằng phương pháp "KOH string test" với KOH 3% như là một phương pháp bổ trợ (von Graevenitz và Bucher, 1983) KOH String Test được chứng minh hiệu quả với các vi khuẩn thực phẩm (Powers 1995), và với

Bacillus spp (Carlone et al., 1983; Gregersen, 1978), mặc dù có thể gặp vấn đề với

vi khuẩn yếm khí (Carlone et al., 1983; Halebian et al., 1981)

3.2.7 Khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng thu được

3.2.7.1 Xác định dòng có khả năng cố định đạm

Có nhiều môi trường không đạm có thể dùng để phân lập các vi khuẩn hiếu khí có khả năng cố định đạm như môi trường Thornton (Thornton, 1940), môi trường Burk (Park et al., 2005) để phân lập các PGPR cố định đạm; môi trường LGI (Cavalcante và Dobereiner, 1988), NFb (Kireg và Dobereiner, 1984), v.v… để dùng cho vi khuẩn nội sinh

Tuy nhiên, sau khi phân lập được các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm trên các loại môi trường không đạm khác nhau, các tác giả cũng cấy chuyển các dòng này vào môi trường Burk đặc, sau đó chuyển sang môi trường Burk lỏng

để đem đi định lượng đạm mà vi khuẩn tổng hợp được Chính vì vậy, để giảm bớt

số lượt thí nghiệm, nghiên cứu này chọn Burk là môi trường chung để xác định các dòng có khả năng cố định đạm Thực hiện như sau:

- Cấy chuyền tất cả các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây Ngô lên bề mặt môi trường Burk đặc (pH = 7,0), và ủ ở 30oC

- Quan sát, ghi nhận thời gian xuất hiện khuẩn lạc và khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trong 1 – 3 ngày Dòng nào phát triển được trên môi trường Burk chứng tỏ chúng có khả năng cố định đạm

3.2.7.2 Khảo sát khả năng phát triển trên các loại môi trường không đạm khác nhau

Thí nghiệm nhằm tìm hiểu sự khác biệt về khả năng mọc trên các loại môi trường không đạm khác nhau về thành phần hoác học và độ pH

Giới hạn nghiên cứu: Trên một số dòng có khả năng phát triển mạnh trên môi trường Burk thu được sau thí nghiệm 3.2.7.1

- Cấy chuyền tất các dòng vi khuẩn lên bề mặt môi trường LGI, Thornton đặc có

bổ sung chất chỉ thị bromothymol blue (pH = 6,8 ) và ủ ở 30o

C Đối chứng với LGI không bổ sung chất chỉ thị màu (pH = 5,5)

- Quan sát, ghi nhận thời gian xuất hiện khuẩn lạc và khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trong 1 – 3 ngày, đồng thời với sự chuyển màu của chất chỉ thị pH

Danh pháp: 3', 3''-dibromothymolsulfonephtalein Kiểu phản ứng: HIn + H2O In- + H3O+

pK: 7,30 Phổ pH làm thay đổi màu: 6,0 – 7,6 Màu do acid: Vàng

Màu do base: Xanh dương

Hình 3.4 Phổ màu theo pH của bromothymol blue

(Nguồn: http://antoine.frostburg.edu/chem/senese/101/acidbase/indicators.shtml)

3.2.8 Khảo sát khả năng hòa tan lân của các dòng thu được

3.2.8.1 Xác định dòng có khả năng hòa tan lân

- Cấy chuyền tất cả các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây Ngô thu được lên bề mặt môi trường NBRIP đặc (pH = 7,0) chứa calcium orthophosphate (Nautiyal, 1998) và ủ ở 30oC

- Quan sát, ghi nhận thời gian xuất hiện khuẩn lạc và khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trong 1 – 3 ngày Dòng nào phát triển được trên môi trường NBRIP chứng tỏ chúng có khả năng hòa tan lân khó tan

3.2.8.2 Khảo sát khả năng tạo vòng halo (halozone trên môi trường NBRIP đặc có bổ sung bromothymol blue

Nhiều tác giả đã giải thích về sự hòa tan lân trong đất là do sự tiết các acid hữu cơ, làm giảm pH đất khiến lân khó tan chuyển thành dạng dễ tan mà cây trồng

có thể hấp thụ được (Kucey et al., 1989; Rashid et al., 2004) Thí nghiệm này nhằm tìm hiểu xem các dòng vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh hòa tan lân thu được có thông qua cơ chế bài tiết acid làm giảm pH môi trường hay không

Giới hạn nghiên cứu: Trên các dòng có khả năng hòa tan lân tốt thu được sau thí nghiệm 3.2.8.1