Nghiên cứu xác định một số thuốc chống viêm giảm đau trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tuy nhiên, những năm gần đây hệ thống Kiểm nghiệm cũng như các cơ quan công an, quản lý thị trường và thanh tra đã phát hiện khá nhiều thuốc đông dược, thực phẩm chức năng có nguồn gốc t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC CHỐNG VIÊM GIẢM ĐAU TRỘN LẪN TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG

CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ

THUỐC CHỐNG VIÊM GIẢM ĐAU TRỘN LẪN TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị

Kiều Anh, người đã hướng dẫn và chỉ bảo tôi tận tình trong suốt quá trình

nghiên cứu, hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn NCS.Ths Đào Thị Cẩm Minh – giảng viên

khoa Dược trường đại học Y - Dược Huế, người đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cám ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học,

Bộ môn Hóa Phân tích – Độc chất, Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và làm luận văn

Cuối cùng tôi xin dành lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn khích lệ, tạo động lực cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, tháng 3 năm 2016 Học viên

Nguyễn Thị Hà

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN………3

1.1 Tổng quan về tình hình chất lượng sử dụng chế phẩm đông dược, thuốc có nguồn gốc từ thảo dược ở trong nước và trên thế giới 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Tại Việt Nam 4

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 6

1.2.1 Cấu trúc, tính chất lý hóa của paracetamol, diclofenac 6

1.2.2 Tác dụng và tác dụng không mong muốn của các thuốc thuộc nhóm chống viêm không steriod 7

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 9

1.3.1 Sắc kí lớp mỏng 9

1.3.2 Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao 10

1.3.3 Sắc kí lỏng hiệu năng cao 11

1.4 Một số nghiên cứu định tính, định lượng nhóm thuốc chống viêm không steroid 15

1.5 Một số quy trình xử lý mẫu thuốc tân dược dạng viên nén, viên nang chiết từ thuốc đông dược 18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 19

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 19

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 20

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp HPTLC 21

2.2.2 Phương pháp HPLC 23

2.2.3 Ứng dụng phân tích mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường 24

2.3 Phương pháp xử lí số liệu 24

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ………25

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC 25

3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện HPTLC 25

3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lí mẫu HPTLC 30

3.1.3 Thẩm định phương pháp HPTLC 34

3.2 Xây dựng phương pháp HPLC 44

3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc kí 44

3.2.2 Thẩm định quy trình 46

3.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC và HPLC để phân tích mẫu chế phẩm thuốc đông dược trên thị trường 49

3.3.1 Kết quả phân tích mẫu bằng phương pháp HPTLC 49

3.3.2 Kết quả phân tích mẫu bằng phương pháp HPLC 52

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN………55

4.1 Xây dựng quy trình kĩ thuật 55

4.1.1 Lựa chọn phương pháp phân tích 55

4.1.2 Lựa chọn xử lí mẫu 55

4.2 Xây dựng phương pháp định lượng 56

4.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng HPTLC 56

4.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng HPLC 57

4.3 Thẩm định phương pháp 58

4.4 Ứng dụng phương pháp HPTLC và HPLC để phân tích mẫu chế phẩm thuốc đông dược trên thị trường 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

CTAB Cetyltrimethyl amoni bromid

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography) HPTLC Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức

(Association of Official Analytical Chemists)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết paracetamol, diclofenac natri trong

mẫu chế phẩm đông dược theo dung môi chiết 31

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống của phương pháp HPTLC 37

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của paracetamol, diclofenac natri 39

Bảng 3.4 Kết quả xác định LOD của paracetamol, diclofenac natri 42

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại, độ thu hồi của paracetamol 43

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ lặp lại, độ thu hồi của diclofenac natri 44

Bảng 3.7 Kết quả phân tích giới hạn phát hiện của paracetamol, diclofenac natri 48

Bảng 3.8 Kết quả phân tích 6 mẫu chế phẩm bằng phương pháp HPLC 54

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Kết quả khảo sát pha động đối với sắc kí lớp mỏng hệ 1 (cloroform :

methanol : amoniac 25% (18 :15 :5) 25

Hình 3.2 Kết quả khảo sát pha động đối với sắc kí lớp mỏng hệ 2 (Toluen : n-propanol : acid formic (5 : 4 : 1)) 26

Hình 3.3 Kết quả khảo sát pha động đối với sắc kí lớp mỏng hệ 3 26

Hình 3.4 Kết quả khảo sát pha động đối với sắc kí lớp mỏng hệ 4 27

Hình 3.5 Kết quả khảo sát thành phần tỉ lệ pha động của HPTLC 29

Hình 3.6 Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi chiết 32

Hình 3.7 Sơ đồ xử lí mẫu phân tích 33

Hình 3.8 Sắc kí đồ đánh giá độ chọn lọc HPTLC 34

Hình 3.9 Sắc kí đồ xác định tính chọn lọc của phương pháp HPTLC với paracetamol 35

Hình 3.10 Sắc kí đồ xác định tính chọn lọc của phương pháp HPTLC với diclofenac natri 36

Hình 3.11 Sắc kí đồ 3D khoảng tuyến tính 38

Hình 3.12 Đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của paracetamol (phương pháp HPTLC) 39

Hình 3.13 Đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của paracetamol (phương pháp HPTLC) 40

Hình 3.14 Sắc kí đồ LOD của paracetamol trên 4 nền mẫu 41

Hình 3.15 Sắc kí đồ analog xác định LOD của paracetamol trên nền HC06 41

Hình 3.16 Sắc kí đồ xác định LOD của diclofenac natri trên 4 nền mẫu 41 Hình 3.17 Sắc kí đồ analog xác định LOD của diclofenac natri trên nền HC0642 Hình 3.18 Sắc kí đồ đánh giá độ chọn lọc của paracetamol, diclofenac natri 47

Hình 3.19 Sắc kí đồ kết quả mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường bằng HPTLC 50Hình 3.20 Sắc kí đồ kết quả phân tích mẫu VN07, HC03, HC08 (phương pháp HPLC) 52Hình 3.21 Hình ảnh chồng phổ chuẩn paracetamol và mẫu thử HC03, HC08 53

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, do những tác dụng bất lợi khi sử dụng thuốc hóa dược, con người có xu hướng quay về tìm kiếm thuốc có nguồn gốc tự nhiên Do đó, các thuốc đông dược, thực phẩm chức năng có nguồn gốc tự nhiên đang là mục tiêu mà các nhà sản xuất và người tiêu dùng trong nước cũng như trên thế giới quan tâm Thuốc đông dược, thực phẩm chức năng và thuốc theo đơn của lương y được sử dụng để bổ trợ hoặc điều trị bệnh thần kinh-cơ, bệnh tiêu hóa-gan mật, hô hấp, tiết niệu, tim mạch, ngoài ra còn có tác dụng điều kinh, bổ dưỡng, bổ sung vitamin, khoáng chất Tuy nhiên, những năm gần đây hệ thống Kiểm nghiệm cũng như các cơ quan công an, quản lý thị trường và thanh tra đã phát hiện khá nhiều thuốc đông dược, thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ dược liệu trộn trái phép thuốc tân dược (thành phần có hoạt chất tân dược nhưng không công bố trên nhãn) Các tân dược được trộn lẫn gồm nhiều nhóm hợp chất khác nhau, trong đó các nhóm được

sử dụng nhiều là nhóm thuốc glucocorticoid [9]; thuốc chống viêm không steroid (Nonsteroidal anti-inflammatory drugs: NSAIDs)[6][13]; thuốc hạ glucose máu [20], [31]; thuốc hạ huyết áp [16]; thuốc giảm béo [21]; thuốc

ức chế phosphodiestarase-5 [8] Những tác hại do thuốc đông dược có trộn tân dược gây ra có thể là: loét dạ dày, gây xốp xương, phù, tăng huyết áp, rậm lông (nếu thuốc có các hoạt chất chống viêm corticoid), loét đường tiêu hoá, xuất huyết, dị ứng (thuốc có hoạt chất chống viêm không steroid), suy gan (thuốc có paracetamol)

Hiện nay đã có một số nghiên cứu phát hiện các thuốc tân dược trộn lẫn trong thuốc đông dược, thực phẩm chức năng được triển khai như sắc ký lớp mỏng [32]; sắc ký lỏng hiệu năng cao [7], [9]; sắc ký lỏng khối phổ [13]; Trong đó, phương pháp sắc kí lớp mỏng được sử dụng để phát hiện nhanh và

có thể định lượng các thuốc tân dược trộn trong đông dược [19], còn phương

2

pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao được sử dụng để xác nhận lại kết quả tìm được

Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong

thuốc đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xác định một số

thuốc chống viêm giảm đau trộn lẫn trong chế phẩm thuốc đông dược bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và sắc kí lỏng hiệu năng cao”

Với mục tiêu:

1 Xây dựng qui trình định tính, định lượng paracetamol, diclofenac natri trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

2 Ứng dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao để xác định paracetamol, diclofenac natri trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược

Từ đó, so sánh khả năng ứng dụng của phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao trong phân tích các đối tượng này

3

1.1 Tổng quan về tình hình chất lượng sử dụng chế phẩm đông dược, thuốc có nguồn gốc từ thảo dược ở trong nước và trên thế giới 1.1.1 Trên thế giới

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có đến 80% của những người sống ở các nước đang phát triển vẫn dựa chủ yếu vào các loại thuốc truyền thống

để chăm sóc sức khỏe của họ Ví dụ như dân số sử dụng thuốc đông dược để điều trị ban đầu chiếm 90% dân số của Ethiopia, chiếm 75% dân số của Mali, chiếm 70% ở Myannar, chiếm 70% ở Rawanda, chiếm 60% ở Tanzania, chiếm 60% ở Uganda [20] Mặc dù thuốc đông dược đã sử dụng

từ lâu, nhưng người sử dụng có rất ít kiến thức về an toàn và hiệu quả của

nó Thuốc đông dược được tự do bán trong cửa hàng thực phẩm sức khỏe, trong siêu thị, và được tiếp thị tràn lan trên các trang mạng Do quy định ít chặt chẽ, có nhiều thuốc thảo dược kém chất lượng và có tình trạng trộn với thuốc tổng hợp (tân dược) không khai báo Tuy nhiên một số hướng dẫn của WHO đóng một vai trò quan trọng trong việc giám sát sự an toàn của các loại thuốc thảo dược và củng cố cơ quan quản lý thuốc của các nước thành viên khác nhau

Ở Châu Âu, nước Anh đã ghi nhận các trường hợp người bệnh nhập viện điều trị các tác dụng phụ của thuốc đông dược có trộn lẫn hydrocortison, clobetason butyrat, betamethason valerat, clobetasol propionat trong các sản phẩm kem dược liệu [17] Tuy nhiên, trong nhiều năm gần đây có nhiều báo cáo cho thấy tình trạng trộn lẫn các thuốc tân dược trong đông dược ở các nước này khá nhiều và đã gây ra nhiều tác dụng phụ nguy hiểm cho người

sử dụng Trong đó, các nhóm thuốc tân dược trộn lẫn trong đông dược bao gồm nhóm corticoid, nhóm NSAIDs (Paracetamol, Diclofenac, Indomethacin, Aspirin), thuốc chống co giật, thuốc rối loạn chức năng

4

cương dương, thuốc hạ đường huyết [15] Do đó, tại các nước này đã phát triển khá mạnh các phương pháp định tính, định lượng và phát hiện được rất nhiều các nhóm thuốc tân dược được trộn lẫn trong thuốc đông dược, thực phẩm chức năng như LC-MS/MS, UPLC-MS/MS Đặc biệt khu vực Đông Nam Á, các nước như Thái Lan, Indonesia cũng tích cực trong việc xây dựng phương pháp phát hiện các thuốc tân dược được trộn lẫn [18] Ngay cả nước phát triển là Nhật Bản vẫn phát hiện trộn lẫn các thuốc trị tiểu đường nhóm sulfylure trong thực phẩm chức năng [20]

Các hoạt chất tân dược được dùng để trộn lẫn bao gồm nhiều nhóm hợp chất khác nhau, trong đó đáng chú ý là: Nhóm hoạt chất tăng cường khả năng sinh lý (Sildenafil và dẫn chất) [7] Nhóm Corticoid (Dexamethason, Prednisolon, Betamethason) [13] Nhóm thuốc kháng Histamin (Clopheniramin, ) Nhóm thuốc chống viêm phi Steroid (Diclofenac, Ibuprofen, Indomethacin) [13] Nhóm thuốc hạ nhiệt giảm đau (Paracetamol, Piroxicam) [32] Nhóm thuốc an thần gây ngủ (Diazepam) Nhóm thuốc giảm béo (Sibutramin) [6], [21] Nhóm thuốc hạ glucose-huyết (Metformin, Gliclazide, ) [20] Nhóm thuốc hạ huyết áp (Nifedipine, Amlodipine, ) [26]

1.1.2 Tại Việt Nam

Do nhận thức được tính an toàn của các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên nên nhu cầu về sản xuất và sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc thảo dược trong nước ngày càng tăng Mặt khác, nguồn tài nguyên cây thuốc dồi dào và nền y học cổ truyền lâu đời của nước ta cũng là một trong những yếu

tố thuận lợi cho thuốc có nguồn gốc từ thảo dược ngày càng chiếm ưu thế so với các thuốc tân dược Hiện nay, các chế phẩm có nguồn gốc từ thảo dược được phát triển theo nhiều hướng khác nhau như các bài thuốc gia truyền được sản xuất tại các cơ sở sản xuất của các lương y, lương dược; các chế phẩm thuốc đông dược, thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thảo dược

5

Các chế phẩm này thường được sử dụng để điều trị hoặc hỗ trợ phòng và điều trị các bệnh gan, thận, tim-mạch…Nhằm đảm bảo chất lượng dược liệu, thuốc y học cổ truyền, thuốc từ dược liệu (Đông dược) sử dụng trong phòng

và điều trị bệnh, Bộ Y tế đã ban hành nhiều văn bản chỉ đạo tăng cường công tác quản lý chất lượng dược liệu, thuốc y học cổ truyền, thuốc từ dược liệu (Đông dược), đặc biệt là Chỉ thị số 03/CT-BYT ngày 24/02/2012 về việc tăng cường quản lý cung ứng, sử dụng dược liệu, thuốc Y học cổ truyền, thuốc từ dược liệu trong các cơ sở khám chữa bệnh bằng y học cổ truyền với nhiều giải pháp đồng bộ Kết quả kiểm tra đánh giá chất lượng thuốc năm 2013, toàn quốc có 56.179 mẫu thuốc đã được kiểm tra đánh giá chất lượng (cả thuốc tân dược và đông dược), trong đó phát hiện 1004 mẫu thuốc (1,79 %) không đạt chỉ tiêu chất lượng và 08 (0,014%) mẫu thuốc giả;

tỷ lệ thuốc giả và thuốc kém chất lượng là (1,8%) Tỷ lệ thuốc giả và thuốc kém chất lượng năm 2013 (1,8%) giảm so với năm 2012 (3,09%) [11]

Một trong những vấn đề làm thuốc kém chất lượng, thuốc giả đặc biệt với đối tượng là thuốc, thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ dược liệu là việc trộn lẫn nhiều nhóm thuốc tân dược, gây những tác dụng phụ nguy hiểm khi người bệnh sử dụng thuốc lâu dài Các thuốc tân dược thường được trộn lẫn trong đông dược và cả trong thực phẩm chức năng, được phát hiện đơn lẻ hoặc kết hợp nhiều thành phần trong cùng một nhóm hoặc nhiều nhóm có tác dụng dược lý khác nhau nhằm tạo việc tăng tác dụng

Điều đáng nói, việc trộn các tân dược vào đông dược rất khó phát hiện, vì trong đông dược có rất nhiều thành phần, các phương pháp phát hiện đòi hỏi máy móc kiểm nghiệm hiện đại mới chiết tách được thành phần và tốn chi phí nhiều Viện kiểm nghiệm TW và mạng lưới trung tâm kiểm nghiệm (tỉnh, thành) cần có một hệ thống phương pháp phát hiện nhanh chóng, hiệu quả cao và dễ dàng ứng dụng ngay tại các trung tâm kiểm nghiệm trên toàn

6

quốc vì thuốc đông y từ nhập khẩu cho đến sản xuất trong nước nhan nhản, thậm chí cả thực phẩm chức năng, mỹ phẩm

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

1.2.1 Cấu trúc, tính chất lý hóa của paracetamol, diclofenac

Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn đối tượng nghiên cứu là paracetamol và diclofenac natri trộn trong chế phẩm thuốc đông dược

1.2.1.2 Diclofenac natri

Công thức hóa học C14H10CI2NNaO2

1.2.2 Tác dụng và tác dụng không mong muốn của các thuốc thuộc

nhóm chống viêm không steriod

1.2.2.1 Tác dụng và cơ chế tác dụng

Nhóm thuốc này có tác dụng giảm đau, hạ sốt chống viêm ở những mức

độ khác nhau Thuốc ức chế cyclo-oxygenase (COX) là enzym xúc tác việc sản xuất một số chất trung gian, đặc biệt là prostaglandin, một chất gây ra phản ứng đau, sốt, viêm Có hai dạng enzym COX là COX-1 có ở thành dạ dày, thành mạch, thận và COX-2 có ở tổ chức viêm hay tổn thương Do đó thuốc ức chế COX-2 thì có tác dụng điều trị, thuốc tác dụng lên COX- 1 thì gây ra tác dụng phụ Các thuốc chống viêm không chọn lọc ức chế cả hai loại COX-1 và COX-2, bao gồm ibuprofen, indomethacin, naproxen, piroxicam, diclofenac, ketoprofen Sự khác nhau giữa các thuốc chống viêm không steroid chủ yếu là các biểu hiện của tác dụng không mong muốn Các thuốc có tính chọn lọc ít gây các tác dụng phụ, còn tác dụng chống viêm, giảm đau giống như các thuốc không chọn lọc Các thuốc ức chế chọn lọc

8

COX-2 có thể gây các tác dụng phụ ở thận giống như các thuốc không chọn lọc Ngoài ra các thuốc ức chế chọn lọc không có tác dụng ức chế tiểu cầu kết dính, còn các thuốc ức chế không chọn lọc có tác dụng ức chế kết dính

tiểu cầu nhưng có thể hồi phục được, trái với acid acetylsalicylic

Tác dụng hạ nhiệt còn do ức chế trung tâm điều hòa nhiệt ở vùng dưới

đồi, gây giãn mạch ngoại biên, tăng tỏa nhiệt và tăng tiết mồ hôi

Tác dụng giảm đau của nhóm thuốc này chỉ đối với triệu chứng đau nhẹ

do viêm như đau đầu, đau răng, đau dây thần kinh, đau khớp, đau cơ [4] 1.2.2.2 Tác dụng không mong muốn

Các tác dụng phụ do ức chế tổng hợp prostaglandin

Rối loạn dạ dày-ruột: Thuốc chống viêm không steroid với mức độ khác nhau ức chế COX -1 làm giảm tổng hợp prostaglandin ở dạ dày dẫn đến ức chế sản sinh ra chất mucin (yếu tố bảo vệ dạ dày), tạo điều kiện cho HCl và pepsin của dịch vị gây tổn thương cho niêm mạc Ngoài ra các thuốc chống viêm không steroid còn tác động trực tiếp hủy hoại các tế bào biểu mô tiêu hóa, gây thủng ổ loét do phần lớn chúng đều là những acid

Trên hệ tiết niệu: Ức chế prostaglandin ở thận làm tưới máu nuôi thận, giảm mức lọc cầu thận, giải phóng các renin, ảnh hưởng tới việc di chuyển ion và trao đổi nước, gây nên các rối loạn chức năng tiểu cầu thận, viêm thận mô kẽ, suy thận cấp

Trên hệ huyết học: Tăng nguy cơ chảy máu, kéo dài thời gian đông máu,

có thể gây ra hiện tượng xuất huyết dưới da do ức chế ngưng kết tiểu cầu Với thai phụ: Dễ gây quái thai ở 3 tháng đầu, ở 3 tháng cuối có thể làm tăng thời gian mang thai, có thể gây đóng sớm ống động mạch, chảy máu trong tử cung, nguy hiểm cho sản phụ

Với những người bị phù hoặc có xu hướng phù như suy tim, suy thận mạn, suy gan có thể gây tình trạng giữ nước nặng nếu điều trị bằng nhóm thuốc này

9

Các tác dụng phụ không do ức chế tổng hợp prostaglandin

Trên hệ thần kinh: có thể gây ù tai, điếc thoáng qua, say thuốc Ngoài ra thuốc có thể gây dị ứng, gây cơn hen giả vì thuốc ức chế COX nên làm tăng các chất chuyển hóa theo đường lipooxygenase (tăng leucotrien) Rối loạn chức năng gan, rối loạn về máu theo kiểu nhiễm độc tế bào (mất bạch cầu hạt)

Trên hệ tim mạch: các thuốc ức chế COX-2 và liều cao các thuốc chống viêm không steroid truyền thống có nguy cơ gây nhồi máu cơ tim [4]

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

1.3.1 Sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (TLC) trong kiểm nghiệm dược phẩm đã được phát triển

từ lâu Quá trình tách bằng sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên một lớp mỏng gồm các hạt kích thước đồng nhất được kết dính trên một giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh Pha động là chất lỏng gồm một hay nhiều dung môi, pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao dẫn Các chất phân tích sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng, kết quả là chúng được tách riêng có vị trí khác nhau trên bản mỏng Cơ chế tách có thể là phân bố, hấp phụ, trao đổi ion

Một số chất thường dùng làm pha tĩnh là silica, dẫn chất siloxan, cellulose, nhôm oxid, gel sephadex…trong đó được dùng phổ biến nhất là silica (SiO2) và nhôm oxid Pha động trong TLC thay đổi tùy thuộc vào cơ chế sắc kí Để tăng cường sức rửa giải thường kết hợp 2-3 dung môi

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf và nó được tính bằng tỷ lệ giữa quãng đường di chuyển của chất phân tích và quãng đường dịch chuyển của pha động Trị số này dao động từ 0-1

10

Rf = dR /dM

dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích

dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động

Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10-30µm được rải đều thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250µm trên giá đỡ được chế tạo từ các vật liệu như kim loại, thủy tinh, nhựa và có thể có thêm chất huỳnh quang để dễ dàng khi phát hiện chất phân tích Chất hấp phụ thường dùng nhất là silicagel Thành phần pha động dùng cho TLC thay đổi tùy theo cơ chế sắc

kí, bản chất của chất phân tích [8], [13]

TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do có nhiều ưu điểm như: Chi phí cho thiết bị không quá cao, vận hành khá dễ dàng, không đòi hỏi nhiều thao tác quá khó Phương pháp này cho phép bán định lượng nhanh thành phần trong thuốc nên thường dùng để đánh giá nhanh chất lượng của thuốc Bên cạnh đó, TLC có thể phân tích nhiều mẫu cùng 1 thời điểm, cùng điều kiện phân tích, tiết kiệm được thời gian phân tích và giảm sai số trong quá trình phân tích Phương pháp cho phép cung cấp hình ảnh sắc kí đồ làm dấu vân tay cho mỗi thuốc, do đó thích hợp cho việc kiểm tra

độ tinh khiết của thuốc và phát hiện thuốc giả

1.3.2 Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao

Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức nâng cao của TLC HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất các số liệu đưa ra Trong đó, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có

độ lặp lại cao Các bước của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích Quá trình phun mẫu được tiến hành tự động hoặc bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng

11

thời có sấy bằng khí nitơ do đó giảm sự oxi hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng

Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta sử dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates) Bản này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn TLC (dày khoảng 100µm) với bột mịn có kích thước hạt 5µm độ đồng đều cao hơn Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân giải được tăng cường vì vết sắc kí nhỏ, thời gian sắc kí ngắn hơn và lượng dung môi ít hơn so với TLC

Ưu điểm của HPTLC

- Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng

- Trong một lần khai triển sắc kí có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu cùng lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao

- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản mỏng sắc kí, khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt

độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích

Do những ưu điểm trên nên chúng tôi lựa chọn kỹ thuật HPTLC cho nghiên cứu

1.3.3 Sắc kí lỏng hiệu năng cao

Khái niệm chung

Thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao

Hình1.1 Sơ đồ hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao

 Hệ thống cung cấp pha động: pha động trong sắc kí lỏng thường là 2 dung môi hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp

 Bơm dung môi pha động

 Bộ phận tiêm mẫu: tiêm qua vỏng tiêm mẫu (injection loop) hoặc bộ phận tiêm mẫu tự động Cho phép tiêm chính xác thể tích mẫu vào hệ thống sắc kí

 Cột sắc kí: Cột sắc kí thường được chế tạo bằng thép không gỉ hoặc thủy tinh, chất dẻo Hạt nhồi thường có kích thước 5-10µm, chiều dài cột khoảng 10-30cm, đường kính trong 1-10mm

Hệ thống xử lí dữ liệu: Là phần mềm máy tính có khả năng ghi nhận,

lưu giữ, xử lí các thông tin hiệu quả

Lựa chọn điều kiện sắc kí

Để có kết quả phân tích tốt nhất, cần phải tìm được các điều kiện sắc kí phù hợp với chất cần phân tích Các điều kiện đó bao gồm:

 Loại pha tĩnh: thông thường dùng 02 loại cột pha thuận và cột pha đảo

- Cột pha thuận (NP): Silicagel trung tính Loại cột này thường dùng để tách các chất khá phân cực Trên bề mặt của chất tạo cột có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước Pha động dùng cho loại cột này là các dung môi không phân cực hay ít phân cực như: n- hexan, isopropanol, cloroform

14

- Cột pha đảo (RP): (Silicagel đã alkyl hóa) Loại cột này dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có thể tạo cặp ion Trên bề mặt chất tạo cột có các nhóm OH đã bị alkyl hóa tức là thay thể H bằng các mạch carbon thẳng (C8 hay C18) hay các mạch carbon vòng (phenyl) vì nó ít phân cực hay phân cực rất ít Pha động dùng trong loại này là các dung môi phân cực như: methanol, acetonitril, nước hay các dung dịch đệm, hỗn hợp dung môi - dung dịch đệm Sự tách của chất nhồi cột loại này có độ lặp lại cao và được ứng dụng chủ yếu trong phân tích dược phẩm Hiện nay sử dụng loại này là chủ yếu

 Loại pha động: Cần lựa chọn pha động phù hợp để quá trình tách hoàn toàn các chất có trong mẫu, đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn của pic, có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm dung môi, hóa chất, thời gian tiêm mẫu Pha động cần có yêu cầu như phải trơ với pha tĩnh, hòa tan được các chất phân tích, bền về mặt hóa học nhất là trong thời gian phân tích, có độ tinh khiết cao

 Loại detector: Cần chọn detector phù hợp với chất phân tích Ví dụ sử dụng detector UV cho các chất phân tích có khả năng hấp thụ UV tốt

1.3.3.1 Các thông số đặc trưng

Thời gian lưu t R

Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất phân tích đến detector Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

- Bản chất của pha tĩnh

- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

15

- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào pH pha động

Hiệu lực cột và số đĩa lí thuyết N

Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột

2

2 / 1

2

54 , 5

RA RB A

B

RA RB S

W W

t t W

W

t t R

2 / 1 2

/ 1

)(

18,1)(

tRA, tRB: Thời gian lưu pic của chất A và chất B (2 pic liền kề)

WA, WB: Độ rộng của pic đo ở các đáy pic của chất A và chất B

W1/2A, W1/2B: Độ rộng của pic đo ở nửa chiều cao các pic của chất A

16

dicloromethan bằng ethyl acetat và cloroform Dung dịch chuẩn có nồng độ

từ 0,04-0,24mg/ml Các mẫu Jamu được xử lí bằng cách lắc 500mg bột mẫu với 10ml ethanol trong 30 phút, lọc qua màng lọc Whatman No1, pha loãng

5 lần sau đó tiến hành sắc kí Sử dụng thiết bị phân tích là CAMAG TLC Scanner tại λ 254 nm Kết quả cho thấy với hệ pha động cloroform- methanol (9:1) có khả năng tách riêng 05 chất phân tích

Wensheng Pang [31] tiến hành phân tích thuốc tân dược trộn trái phép trên thực phẩm chức năng và các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu bằng phương pháp LC-MS/MS, phân tích theo chế độ MRM Mẫu phân tích ở dạng viên nang, viên nén và dung dịch Mẫu được xử lí bằng cách thêm 10ml dung môi chiết, siêu âm 10 phút, ly tâm 8000 vòng trong 10 phút, thu dịch trong pha loãng 1000 lần rồi tiến hành sắc kí Sử dụng cột C18 (50 mm

× 2,1 mm, 5µm), pha động methanol : nước : TFA (78 :22 :0,1), thể tích tiêm là 20 µl Kết quả đã phát hiện 09 chất trong đó có sildenafil (Viagra), ibuprofen, diazepam Giới hạn phát hiện (LOD) của các chất phân tích dao động trong khoảng 0,05-1,5ng/ml Trong đó, LOD của ibuprofen là 0,2ng/ml

Johannes Wiest [19] tiến hành phát hiện và định lượng các thành phần trong thuốc đông dược của Việt Nam bằng phương pháp LC-MS với cột Nucleodur Sphinx RP (150 × 4,6 mm, 5µm) Các mẫu được xử lý và ly tâm

13000 vòng trong 10 phút Pha động là Gradient nước (A) và acetonitril (B) đều có acid acetic 0,1%, bước sóng phát hiện 254 nm Chương trình rửa giải

là 85:15 (A:B) trong 3 phút, 70:30 (A:B) trong 7 phút và từ 70:30 đến 10:90 (A:B) trong 20 phút, thể tích tiêm là 5µl Kết quả cho thấy đã phát hiện indomethacin, paracetamol trong chế phẩm thuốc đông dược

Kenichi Kumasaka [23] tiến hành phát hiện đồng thời paracetamol, indomethacin, diclofenac, ketoprofen, ibuprofen, aspirin trong huyết tương người bằng HPLC với hệ pha động là methanol : dung dịch đệm phosphat

Ali Mohammad [12] sử dụng phương pháp TLC để phân tích 05 chất là paracetamol, ibuprofen, diclofenac, aspirin, vitamin C trong thu ốc tân dược Pha động triển khai là n-hexan :1% CTAB trong MeOH : ethyl acetat: acid acetic (13:1:4:2) và toluen: 1% CTAB trong MeOH : n-propanol: acid formic (14:1:3:2) Kết quả: Với hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate : acid acetic (7: 2,5: 0,5), Rf của paracetamol, ibuprofen và natri diclofenac lần lượt là 0,50; 0,78; 0,36 Bổ sung 1% CTAB trong MeOH với hệ dung môi trên thì Rf của paracetamol, ibuprofen và diclofenac natri lần lượt là 0,46; 0,81; 0.20 Với hệ dung môi toluen : n-propanol : acid formic (5: 4: 1), giá trị Rf của paracetamol, aspirin và acid ascorbic lần lượt là 0,68; 0,30; 0,05 Việc bổ sung 1% CTAB trong MeOH vào các hệ dung môi trên Kết quả là làm tăng Rf của aspirin (Rf = 0,32) và acid ascorbic (Rf = 0,14), trong Rf của paracetamol giảm (Rf = 0,62)

Akash.A Savaliya [13] triển khai chương trình HPLC sử dụng pha động MeOH : dung dịch đệm amoni acetat theo gradient nồng độ, thể tích tiêm mẫu là 10µl, tốc độ dòng là 1ml/ phút, xử lí mẫu bằng MeOH : nước (80:20) Xây dựng dãy nồng độ định lượng diclofenac natri từ 50-400µg/ml Hiện nay, các nghiên cứu về nhóm thuốc này được trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng tại Việt Nam còn rất ít Từ những tham khảo trên, tiến hành xây dựng các phương pháp phát hiện và định lượng một số thuốc thuộc nhóm này được trộn lẫn tại thị trường Việt Nam

20 phút, gạn dịch trong, pha loãng dịch sau đó tiến hành phân tích

- Đối với dạng dung dịch, sử dụng dung môi chiết là methanol : nước : TFA (78:22:0,1) Quy trình tương tự như với dạng thuốc rắn

Đối với các chế phẩm trong thành phần có chứa đường, mật ong hoặc chế phẩm dạng dung dịch, sử dụng dicloromethan: isopropanol (9:1) để loại bớt đường [22]

Đối với mẫu đông dược dạng rắn: hòa 2g bột trong ethanol 96%, đun đến sôi, lọc Chiết lặp lại như trên 3 lần, gom dịch chiết và cô lấy cắn, hòa tan cắn trong 2ml methanol, lọc, đem phân tích sắc kí [16]

Tùy vào bản chất của chất cần phân tích mà lựa chọn dung môi chiết cho phù hợp Thông thường lựa chọn dung môi chiết là methanol, ethanol, dicloromethan, nước Có thể sử dụng 2 dung môi với tỉ lệ khác nhau để đạt hiệu suất cao hơn

- Methanol của Merck (Đức), loại tinh khiết dùng cho HPLC

20

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

- Hệ thống sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200 (Thụy Sỹ): bộ phận chấm bán tự động, bộ phận khai triển tự động, máy chụp ảnh Phần mềm điều khiển winCAT và phần mềm video Scan của Camag: quét bản mỏng, thu nhận hình ảnh vết sắc kí,

xử lí dữ liệu hình ảnh trên máy tính

- Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent 1260, Mỹ

- Bản mỏng silicagel GF 254 của Merck (Đức)

- Cân phân tích Mettler Toledo (d=0.1 mg) (Thụy Sỹ)

- Máy ly tâm PLC-012 (Đài Loan)

- Tủ sấy Wiseven WOF-105, (Hàn Quốc)

- Máy siêu âm D-78224 Singen/Htw (Đức)

- Máy lắc xoáy LABINCO BV L46

- Máy đo pH

- Các dụng cụ thủy tinh

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu thử: Chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng dạng bào chế viên nén, viên nang cứng, viên hoàn, được sử dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp, giảm đau đang lưu hành tại Việt

Nam

Nền mẫu: Từ 4 loại chế phẩm đông dược sử dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp, giảm đau hạ sốt trên thị trường Việt Nam Tiến hành phân tích bằng HPLC cho kết quả là không có thuốc tân dược loại cần nghiên cứu được trộn lẫn (hàm lượng dưới giới hạn

phát hiện)

Mẫu chuẩn tự tạo: Chất chuẩn trộn cùng nền mẫu với tỉ lệ nhất định

21

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp HPTLC

2.2.1.1 Khảo sát các điều kiện phân tích

Dựa theo các tài liệu tham khảo [32], [12], khảo sát điều kiện phân tích HPTLC như sau :

- Tiến hành pha riêng các dung dịch chuẩn gốc paracetamol và diclofenac natri nồng độ khoảng 5mg/ml methanol

- Pha động : khảo sát các hệ pha động sau đây :

+ Hệ 1: Cloroform : methanol : amoniac 25% (18 : 15 : 5)

+ Hệ 2: Toluen : n-propanol : acid formic (5 : 4 : 1)

+ Hệ 3: N- hexan : ethyl acetat : acid acetic băng ( 7 : 2,5 : 0,5)

+ Hệ 4: Cloroform : methanol (9 : 1)

Lựa chọn pha động cho vết sắc kí gọn, không kéo đuôi, Rf của các chất nằm trong khoảng 0,2-0,8

2.2.1.2 Khảo sát điều kiện xử lí mẫu

Dựa vào khả năng hòa tan của thuốc nghiên cứu và tài liệu tham khảo [19], tiến hành khảo sát khả năng chiết các thuốc nghiên cứu từ nền mẫu đông dược HC06 bằng các hệ dung môi với nhiều tỉ lệ khác nhau theo điều kiện sắc kí đã nêu

23

2.2.2 Phương pháp HPLC

2.2.2.1 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc kí

Dựa theo các tài liệu tham khảo [3], [23], chúng tôi khảo sát điều kiện

tiến hành HPLC như sau :

- Thể tích tiêm mẫu: thay đổi thể tích tiêm 15, 20µl để xác định thể tích tiêm phù hợp cho pic cân xứng, chân pic gọn, thời gian phân tích ngắn

2.2.2.2 Thẩm định phương pháp

- Độ đặc hiệu

- Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

24

2.2.3 Ứng dụng phân tích mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường

Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích 29 mẫu chế phẩm đông dược thu thập trên thị trường có tác dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh xương khớp, cảm cúm

25

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC

3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện HPTLC

Trên thực tế, các chế phẩm dông dược có thể trộn lẫn nhiều nhóm thuốc tân dược khác nhau nên khi khảo sát điều kiện phân tích chúng tôi thực hiện trên 8 chất Tiến hành khảo sát trên các pha động như mục 2.2.1.1 Khảo sát trên bản mỏng Silicagel gel F254 (20×20cm)

Kết quả khảo sát như sau:

a) 1: Diclofenac natri 2: Meloxicam 3:Ibuprofen 4:Paracetamol 5:Indomethacin 6:Tenoxicam 7:Piroxicam 8:Aspirin 9:Hỗn hợp từ 1-8

Hình 3.1 Kết quả khảo sát pha động đối với sắc kí lớp mỏng hệ 1

(cloroform : methanol : amoniac 25% (18 :15 :5)

26

b) 1: Diclofenac natri 2: Meloxicam 3:Ibuprofen 4:Paracetamol 5:Indomethacin 6:Tenoxicam 7:Piroxicam 8:Aspirin 9:Hỗn hợp từ 1,6,7,8 10:Hỗn hợp 2,3,4,5 11:Hỗn hợp từ 1-8

Hình 3.2 Kết quả khảo sát pha động đối với sắc kí lớp mỏng hệ 2

(Toluen : n-propanol : acid formic (5 : 4 : 1))

d) 1: Diclofenac natri 2: Meloxicam 3: Piroxicam 4: Paracetamol 5: Indomethacin 6: Tenoxicam 7: Ibuprofen 8: Aspirin 9: Hỗn hợp 3,4,7,6 10: Hỗn hợp từ 1,2,5,8

11: hỗn hợp 1-8

Hình 3.3 Kết quả khảo sát pha động đối với sắc kí lớp mỏng hệ 3

(Cloroform : methanol (9 : 1)

27

c) 1: Diclofenac natri 2: Meloxicam 3:Ibuprofen 4:Paracetamol 5:Indomethacin 6:Tenoxicam 7:Piroxicam 8:Aspirin 9:Hỗn hợp 3,4,6,7 10:Hỗn hợp 1,2,5,8 11:Hỗn hợp từ 1-8

Hình 3.4 Kết quả khảo sát pha động đối với sắc kí lớp mỏng hệ 4 (n- hexan : ethyl acetat : acid acetic băng ( 7 : 2,5 : 0,5))

Từ các kết quả trên có nhận xét như sau:

- Hệ pha động 1 không có khả năng tách được các chất phân tích ra khỏi hỗn hợp Trên SKĐ chỉ có aspirin được tách với Rf lớn

- Hệ pha động 2 tách được 4 chất là indomethacin, piroxicam, tenoxicam, paracetamol, quãng đường khai triển dài

- Hệ pha động 3 tách được 4 chất là paracetamol, indomethacin, piroxicam, aspirin

- Hệ pha động 4 tách được 6 chất là paracetamol, indomethacin, piroxicam, tenoxicam, diclofenac natri, meloxicam Hệ cho các vết gọn, đẹp, không bị nhòe, tách tốt

Từ kết quả trên, lựa chọn hệ pha động tách được nhiều chất phân tích nhất

đó là hệ n- hexan : ethyl acetat : acid acetic băng (7 :2,5 : 0,5) Tiến hành thay đổi tỉ lệ thành phần pha động đã chọn để tìm pha động tối ưu nhất đồng thời khảo sát trên bản mỏng silicagel gel F254 (20×10cm) Khảo sát thành

28

phần pha động gồm n-hexan : ethyl acetat : acid acetic băng với tỉ lệ thay

đổi như sau:

+ Hệ A: (7 :2,5 : 0,5) + Hệ B: (5:2,5 :2) + Hệ C: (6 :2,5 :1,5) + Hệ D: (6,5 :2,5 :1)

Kết quả như sau:

Hệ A

Hệ B

29

Hệ C

Hệ D

Hình 3.5 Kết quả khảo sát thành phần tỉ lệ pha động của HPTLC

Trong đó: 1: Meloxicam; 2: Aspirin; 3: Paracetamol; 4: Piroxicam; 5: Hỗn hợp của 1,2,3,4,6,7,8; 6: Indomethacin; 7: Diclofenac natri; 8: Ibuprofen

Kết quả trên cho thấy:

Hệ pha động n-hexan: ethyl acetat: acid acetic băng (6 :2,5 :1,5) có khả năng tách các chất phân tích tốt nhất và có thể phân tích trên bản mỏng silicagel gel F254 (20 × 10cm) để tiết kiệm chi phí và thời gian phân tích

30

3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lí mẫu HPTLC

Với 5 hệ dung môi chiết theo mục 2.2.1.2 đã dược khảo sát để lựa chọn ra dung môi phù hợp nhất cho việc chiết từ nền mẫu chế phẩm đông dược dạng rắn Với mẫu chuẩn tự tạo gồm mẫu thử là chế phẩm đông dược HC06 và hỗn hợp chuẩn của chất nghiên cứu, tiến hành xử lí bằng cách chiết lần lượt với các hệ dung môi trên và phân tích bằng các điều kiện HPTLC đã chọn Lựa chọn tiến hành phân tích đồng thời paracetamol và diclofenac natri do

02 chất này có khả năng được trộn nhiều trong thuốc đông dược, có khả năng tách hoàn toàn khỏi hỗn hợp các NSAIDs còn lại

Khảo sát dung môi chiết

Tiến hành chiết chất phân tích trong mẫu chuẩn tự tạo bằng các dung môi chiết theo quy trình đã nêu tại mục 2.2.1.2 và phân tích bằng phương pháp TLC Tính tỉ lệ đáp ứng phân tích (diện tích pic) và khối lượng mẫu thử (A/m) Kết quả như sau:

31

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết paracetamol, diclofenac natri

trong mẫu chế phẩm đông dược theo dung môi chiết

Dung môi khai

triển

Khối lượng (g)

(x 104)

Khối lượng (g)