NGHIÊN cứu PHÁT TRIỂN kỹ THUẬT THU NHẬN và TÁCH DÒNG TRỌN vẹn các PHÂN đoạn HA, NA và m của VIRUS cúm AH5N1

TÓM TẮT Các biến đổi di truyền trên các phân đoạn HA, NA và M của virus cúm AH5N1 có thể làm thay đổi các đặc tính kháng nguyên, khả năng lây nhiễm, tính kháng thuốc, độc lực và khả năng gây bệnh của virus. Nghiên cứu này trình bày một phương pháp mới để khuếch đại và tách dòng trọn vẹn các phân đoạn HA, NA và M của virus cúm AH5N1. Mẫu RNA của virus cúm AH5N1 được sử dụng để khuếch đại trọn vẹn các phân đoạn HA, NA và M bằng kỹ thuật RTPCR (reverse transcription polymerase chain reaction) hai bước. Kỹ thuật được thực hiện với 3 cặp mồi đặc hiệu được thiết kế trên vùng 3’UTR và 5’UTR không mã hóa (UTR untranslated region) của các phân đoạn tương ứng. Sản phẩm khuếch đại được điện di kiểm tra và tinh sạch từ thạch agarose, sau đó được gắn với vector pJET1.2blunt để tạo plasmid tái tổ hợp chứa trình tự DNA của chủng virus AH5N1 nghiên cứu. Mười một mẫu bệnh phẩm virus AH5N1 thu thập từ gia cầm và người được tách RNA làm khuôn thử nghiệm để đánh giá độ tin cậy của phương pháp. Sau khi tối ưu hóa, kỹ thuật RTPCR đã được ứng dụng để khuếch đại các phân đoạn HA, NA và M từ 11 mẫu khuôn RNA của virus cúm AH5N1. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm khuếch đại của mỗi phân đoạn của hệ gen là một băng đơn nhất có thể quan sát rõ ràng trên thạch agarose. Sau khi tinh sạch, sản phẩm RTPCR được gắn vào vector pJET1.2blunt và chọn lọc tái tổ hợp. Kết quả giải trình tự cho thấy tất cả các trình tự nucleotide đã tách dòng có độ tương đồng cao với trình tự của phân đoạn tương ứng của virus AH5N1. Kỹ thuật khuếch đại và tách dòng trọn vẹn các phân đoạn HA, NA và M của virus cúm AH5N1 phân lập từ người và gia cầm đã được xây dựng thành công và có thể ứng dụng trong các nghiên cứu về virus cúm AH5N1 ở mức độ phân tử.

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT THU NHẬN VÀ TÁCH DỊNG TRỌN VẸN CÁC PHÂN ðOẠN HA, NA VÀ M CỦA VIRUS CÚM A/H5N1

Nguyễn Nam Thắng 1 , Phạm Ngọc Khái 1 , ðinh Duy Kháng 2 , Lương Xuân Hiến 1

1 Trường ðại học Y Thái Bình

2 Viện Cơng nghệ sinh học

TĨM TẮT

Các biến đổi di truyền trên các phân đoạn HA, NA và M của virus cúm A/H5N1 cĩ thể làm thay đổi các đặc tính kháng nguyên, khả năng lây nhiễm, tính kháng thuốc, độc lực và khả năng gây bệnh của virus Nghiên cứu này trình bày một phương pháp mới để khuếch đại và tách dịng trọn vẹn các phân đoạn HA, NA và M của virus cúm A/H5N1 Mẫu RNA của virus cúm A/H5N1 được sử dụng để khuếch đại trọn vẹn các phân đoạn

HA, NA và M bằng kỹ thuật RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction) hai bước Kỹ thuật được thực hiện với 3 cặp mồi đặc hiệu được thiết kế trên vùng 3’UTR và 5’UTR khơng dịch mã (UTR - untranslated region) của các phân đoạn tương ứng Sản phẩm khuếch đại được điện di kiểm tra và tinh sạch từ thạch agarose, sau đĩ được gắn với vector pJET1.2/blunt để tạo plasmid tái tổ hợp chứa trình tự DNA của chủng virus A/H5N1 nghiên cứu Mười một mẫu bệnh phẩm virus A/H5N1 thu thập từ gia cầm và người được tách RNA làm khuơn thử nghiệm để đánh giá độ tin cậy của phương pháp Sau khi tối ưu hĩa, kỹ thuật RT-PCR đã được ứng dụng để khuếch đại các phân đoạn HA, NA và M từ 11 mẫu khuơn RNA của virus cúm A/H5N1 Kết quả điện di cho thấy sản phẩm khuếch đại của mỗi phân đoạn của hệ gen là một băng đơn nhất

cĩ thể quan sát rõ ràng trên thạch agarose Sau khi tinh sạch, sản phẩm RT-PCR được gắn vào vector pJET1.2/blunt và chọn lọc tái tổ hợp Kết quả giải trình tự cho thấy tất cả các trình tự nucleotide đã tách dịng

cĩ độ tương đồng cao với trình tự của phân đoạn tương ứng của virus A/H5N1 Kỹ thuật khuếch đại và tách dịng trọn vẹn các phân đoạn HA, NA và M của virus cúm A/H5N1 phân lập từ người và gia cầm đã được xây dựng thành cơng và cĩ thể ứng dụng trong các nghiên cứu về virus cúm A/H5N1 ở mức độ phân tử

Từ khĩa : Cúm gia cầm, A/H5N1, HA, NA, M, RT-PCR, tách dịng

ðẶT VẤN ðỀ

Virus cúm A cĩ hệ gen bao gồm 8 phân đoạn

RNA đơn âm, mã hĩa 11 protein của virus Do cĩ

hệ gen là RNA và tính chất phân đoạn của hệ gen,

nên virus cúm A nĩi chung và A/H5N1 nĩi riêng

cĩ tần suất đột biến cao và khả năng biến đổi

kháng nguyên nhanh chĩng (Drake, 1993) Hiện

tượng biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A/H5N1

là hệ quả của các quá trình biến đổi đột biến điểm,

tái tổ hợp di truyền và sự trao đổi vật liệu giữa các

phân typ virus cúm A/H5N1 với nhau (Baigent,

McCauley, 2001; Bouvier, Palese, 2008) Sự biến

đổi di truyền nhanh chĩng của virus cúm A/H5N1

đã gây khĩ khăn cho việc chẩn đốn phát hiện

virus, lựa chọn chủng virus để sản xuất vaccine

cũng như cơng tác phịng chống, kiểm sốt bệnh

cúm (Chen et al., 2006; Smith et al., 2006)

Trong số 8 phân đoạn của virus cúm A nĩi

chung, các phân đoạn HA, NA và M chịu trách

nhiệm mã hĩa cho các protein mang tính kháng

nguyên của virus Các kháng nguyên này chính là

các đích của kháng thể tham gia đáp ứng miễn dịch đối với virus cúm A và cũng là cơ sở để nghiên cứu các vaccine phịng cúm A cho người và động vật

(Suarez, Schultz-Cherry, 2000; Wu et al., 2008)

Các biến đổi di truyền trên các phân đoạn của hệ gen này (đặc biệt là HA và NA) cĩ thể làm thay đổi các đặc tính kháng nguyên, khả năng lây nhiễm, tính kháng thuốc, độc lực và khả năng gây bệnh của

virus (Bright et al., 2006; Neumann, Kawaoka, 2006; Yamada et al., 2006) Việc thu nhận từng

phân đoạn, tách dịng, lưu giữ nguồn gen của các chủng cúm A/H5N1 gây bệnh để làm nguồn nguyên liệu kiến tạo vaccine thế hệ mới là cần thiết Trong nghiên cứu này, chúng tơi xây dựng phương pháp khuếch đại và tách dịng trọn vẹn các phân đoạn

HA, NA và M của virus cúm A/H5N1 từ một số chủng phân lập tại Việt Nam, nhằm tạo ra các plasmid tái tổ hợp cĩ chứa trình tự gen HA, NA và

M Các plasmid này cĩ thể sử dụng để giải trình tự nhằm tìm hiểu các biến đổi di truyền của virus cúm A/H5N1 và lưu giữ bảo quản lâu dài để sử dụng trong các nghiên cứu khác

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế mồi

Sử dụng trình tự nucleotide của các phân đoạn HA

(H5), NA (N1) và M của virus cúm A/H5N1 đã được

cơng bố trên GenBank và so sánh các trình tự bằng

phần mềm Clustal X 2.0 Sau khi phân tích bằng phần

mềm BioEdit (version 7.0.9.0) và FastPCR (version

5.4.19), các cặp mồi được thiết kế trên vùng 3’ UTR và

vùng 5’ UTR của phân đoạn HA (H5), NA (N1) và M

Khuơn RNA của virus cúm A /H5N1

ðể xây dựng quy trình, chúng tơi sử dụng khuơn

RNA của virus cúm A/H5N1 được lưu giữ tại Viện

Cơng nghệ sinh học - Viện Khoa học và Cơng nghệ

Việt Nam Sau khi hồn thiện, quy trình khuếch đại

trọn vẹn phân đoạn HA, NA và M của virus A/H5N1

được thử nghiệm với 11 mẫu khuơn RNA tách từ

bệnh phẩm cĩ nguồn gốc khác nhau (5 mẫu từ vịt, 4

mẫu từ gà và 2 mẫu từ người) Các mẫu RNA của

virus A/H5N1 ở gia cầm do Trung tâm Chẩn đốn

Thú y Trung ương cung cấp và các mẫu RNA H5N1

ở người do Trung tâm Cúm Quốc gia - Viện Vệ sinh

Dịch tễ Trung ương cung cấp

Tổng hợp cDNA (complementary DNA)

Năm µl RNA tách chiết được sử dụng làm khuơn

để thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA với bộ sinh

phẩm RevertAid™ H Minus First Strand cDNA

Synthesis Kit (Fermentas) theo hướng dẫn của nhà sản

xuất Phản ứng sao mã ngược được thực hiện với mồi

đặc hiệu Uni12: 5’- AGCAAAAGCAGG -3’

(Hoffmann et al., 2001)

Phản ứng khuếch đại phân đoạn HA, NA và M và

kiểm tra

Thực hiện đồng thời với hai hệ thống: PCR Master

mix 2X (Fermentas) và TripleMaster PCR System

(Eppendorf) Phản ứng được thực hiện trong ống 0,2 ml

với tổng thể tích là 50 µl và sử dụng máy luân nhiệt

Mastercycler gradient (Eppendorf) Sau khi xác định

được các điều kiện tối ưu, phản ứng khuếch đại phân

đoạn HA, NA và M của virus A/H5N1 được thực hiện

với 11 mẫu cDNA của các chủng virus cúm A/H5N1

thu thập từ các nguồn khác nhau

Sản phẩm PCR từ khuơn cDNA của các chủng

được điện di trên thạch agarose 0,8%, sau đĩ được phân

lập và tinh sạch từ thạch với bộ sinh phẩm QIAquick

gel extraction kit (Qiagen)

Tạo plasmid tái tổ hợp và biến nạp vào tế bào khả

biến E coli

DNA tinh sạch từ thạch agarose được sử dụng để tạo plasmid tái tổ hợp với bộ sinh phẩm CloneJET PCR Cloning kit (Fermentas) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, mơ tả vắn tắt với các bước như sau:

1 Sử dụng tuýp 0,5 ml và chuẩn bị các thành phần phản ứng như sau: 50 - 100 ng DNA, 10 µl 2X reaction buffer, 1 µl DNA blunting enzyme và bổ sung nước siêu sạch cho đủ 18 µl, vortex và ly tâm nhanh từ 3 - 5 giây

2 Ủ hỗn hợp phản ứng ở 70oC trong 5 phút

3 Bổ sung 1 µl pJET1.2/blunt cloning vector (50 ng/µl) và 1 µl T4 DNA ligase

4 Ủ hỗn hợp phản ứng ở 22oC trong 5 phút Sử dụng 2,5 µl hỗn hợp phản ứng để biến nạp vào tế bào

E coli TOP10 theo phương pháp hĩa học và nuơi

cấy trên thạch LB (Luria-Bertani Broth), qua đêm

Lựa chọn khuẩn lạc, nuơi cấy và tách chiết plasmid

Tiến hành PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony PCR), với cặp mồi pJET1.2 forward và pJET1.2 reverse để lựa chọn các khuẩn lạc cĩ plasmid tái tổ hợp chứa trình tự phân đoạn HA, NA và M Dùng đầu cơn lấy một khuẩn lạc riêng rẽ và hịa tan trong 20 µl hỗn hợp phản ứng gồm: 2 µl 10X HighFidelity buffer, 0,4

µl dNTP (10 mM mỗi loại), 0,2 µl TripleMaster polymerase mix, 4 pmol mồi pJET1.2 forward và reverse mỗi loại Chương trình nhiệt của phản ứng colony PCR giống như phản ứng khuếch đại gen Các khuẩn lạc dương tính được nuơi cấy trong 3 ml mơi trường LB lỏng cĩ bổ sung ampicillin (100 µg/ml) qua đêm, sau đĩ plasmid được tách chiết với bộ sinh phẩm GenJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas)

Giải trình tự và phân tích kết quả

ðể khẳng định plasmid tái tổ hợp cĩ chứa trình

tự gen HA, NA và M của virus H5N1, DNA tái tổ hợp được giải trình tự với bộ sinh phẩm CEQ DTCS Quick Start Kit và điện di mao quản trên hệ thống CEQ 8000 (Beckman Coulter) tại Phịng Thí nghiệm sinh học phân tử, Trường ðại học Y Thái Bình Sau khi phân tích bằng phần mềm CEQ 8000 Genetic Analysis System, các trình tự nucleotide được so sánh với các trình tự gen cĩ sẵn trên GenBank bằng chương trình BLAST

KẾT QUẢ

Thiết kế mồi

Sau khi phân tích các trình tự phân đoạn H5, N1

và M của virus cúm A ñã công bố trên GenBank bằng

các phần mềm chuyên dụng, 3 cặp mồi ñã ñược thiết

kế trên vùng 3’ UTR và vùng 5’ UTR ñể có thể

khuếch ñại trọn vẹn 3 phân ñoạn tương ứng nói trên

Trình tự các mồi ñược trình bày ở bảng 1

Phản ứng PCR

Phản ứng PCR khuếch ñại các phân ñoạn HA,

NA và M của virus H5N1 ñược thử nghiệm ñồng

thời với Mastermix 2X và TripleMaster PCR

System Kết quả thử nghiệm cho thấy hiệu quả

khuếch ñại của TripleMaster PCR System tốt hơn

so với PCR Mastermix 2X Do ñó TripleMaster

PCR System ñược lựa chọn ñể khuếch ñại phân

ñoạn HA, NA và M của virus H5N1 từ các mẫu bệnh phẩm

Sau khi thử nghiệm trong các ñiều kiện khác nhau, thành phần phản ứng và chương trình nhiệt tối

ưu ñã ñược xác ñịnh Thành phần phản ứng bao gồm: 5 µl 10X HighFidelity buffer, 1 µl 10 mM dNTP (deoxyribonucleotide triphosphates), 0,5 µl TripleMaster Polymerase mix, mồi xuôi và mồi ngược mỗi loại 30 pmol, 4 µl cDNA và bổ sung nước siêu sạch cho ñủ thể tích là 50 µl Chương trình nhiệt gồm các bước: biến tính ban ñầu ở 94oC trong

2 phút; tiếp theo là 40 chu kỳ (94oC: 20 giây; 60oC:

20 giây; 72oC: 2 phút 30 giây); giai ñoạn kéo dài chuỗi sau cùng thực hiện ở 72oC trong 10 phút

Bảng 1. Trình tự các mồi ñược dùng ñể khuếch ñại gen HA, NA và M của virus H 5N1

Ký hiệu : M=A/C; R=A/G; S=G/C; Y=C/T; K=G/T; V=A/G/C; H=A/C/T; D=A/G/T; B=C/G/T; N=A/G/C/T; Tm: Nhi ệ ñộ nóng

ch ả y c ủ a m ồ i

Hình 1 Sả phẩm PCR khuếch ñại gen HA, NA và M của virus cúm H5N1 M: thang DNA chuẩn NC: mẫu chứng âm; PC: mẫu chứng dương; 1 - 5: mẫu thu thập ở vịt; 6 - 9: mẫu thu thập ở gà; 10 và 11: mẫu thu thập ở người

kb M NC PC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1776 bp

kb M NC PC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1398 bp

1027 bp

kb M NC PC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0,25 0,75 2,00

0,75

0,75

2,00

2,00

0,25 0,25

Kết quả ñiện di sản phẩm thử nghiệm với 11 mẫu

cDNA của virus H5N1 thu thập từ gia cầm và người

ñược trình bày ở hình 1 Kết quả cho thấy: phản ứng

PCR với 3 cặp mồi do chúng tôi thiết kế ñã khuếch ñại

thành công toàn bộ phân ñoạn HA, NA và M trên cả

11 mẫu cDNA

Tạo plasmid tái tổ hợp chứa các phân ñoạn gen HA,

NA và M

Sau khi ñiện di trên thạch agarose, sản phẩm

DNA ñược tinh sạch từ thạch agarose và ño mật ñộ

quang (optical density - OD) ở bước sóng 260 nm

ñể xác ñịnh nồng ñộ DNA DNA tinh sạch ñược sử

dụng ñể tạo plasmid tái tổ hợp với bộ sinh phẩm

ClonJETTM PCR cloning theo hướng dẫn của nhà

sản xuất

Plasmid tái tổ hợp ñược biến nạp vào tế bào E coli

TOP10 và nuôi cấy trên thạch LB có ampicillin, ở

37oC, qua ñêm Plasmid pJET1.2/blunt có chứa gen

kháng ampicillin nên những tế bào E coli dung nạp

plasmid thì mới có khả năng phát triển trên môi trường

có bổ sung ampicillin Ngoài ra, trên plasmid này còn chứa gen tổng hợp enzyme giới hạn eco47IR gây chết

tế bào vi khuẩn Vị trí gắn với sản phẩm PCR nằm ở giữa gen này Vì vậy, những chủng vi khuẩn có thể phát triển ñược trên môi trường thạch LB có bổ sung ampicillin ñều có plasmid tái tổ hợp

Phản ứng colony PCR ñược thực hiện ñể lựa chọn các khuẩn lạc có plasmid chứa trình tự gen mong muốn ðối với mỗi mẫu, tiến hành kiểm tra từ 5 - 8 khuẩn lạc ñể lựa chọn các khuẩn lạc mang plasmid tái

tổ hợp chứa trình tự DNA cần tách dòng (Hình 2)

Bảng 2. ðộ tương ñồng cao nhất (max identity) của các

trình tự gen ñã tách dòng khi so sánh với trình tự gen của

virus cúm H5N1 trên GenBank bằng chương trình BLAST

Các khuẩn lạc có kết quả colony PCR dương tính ñược nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin, qua ñêm và tách chiết DNA plasmid DNA của tất cả các mẫu plasmid ñều ñược giải trình tự và so sánh với các trình tự gen trên GenBank bằng chương trình BLAST Kết quả so sánh cho thấy tất cả các trình

tự gen ñã tách dòng ñều có ñộ tương ñồng cao với trình

tự gen tương ứng của các chủng virus H5N1 ñã công bố (Bảng 2) Hai mươi bảy trình tự nucleotide của các phân ñoạn gen HA, NA và M của các chủng virus H5N1 thu thập từ gia cầm ñã ñược ñăng ký trên GenBank (các mã số ñăng ký từ CY095680 ñến

CY095706)

BÀN LUẬN Giải trình tự toàn bộ hệ gen là phương pháp tốt nhất ñể có thể hiểu rõ các ñặc ñiểm di truyền của virus H5N1, tuy nhiên phương pháp này khá tốn kém và

Hình 2 Sản phẩm colony PCR ñể lựa chọn các khuẩn lạc có plasmid chứa trình tự gen HA, NA và M của virus cúm H 5N1

Gen NA Gen HA

Gen M

phức tạp Do đĩ hầu hết các nghiên cứu thường chỉ

tập trung vào một hoặc một vài phân đoạn RNA của

virus Virus cúm H5N1 cĩ hệ gen gồm 8 phân đoạn

RNA mã hĩa cho 11 protein Ba phân đoạn gen HA,

NA và M cĩ vai trị quan trọng, quy định các đặc tính

kháng nguyên, khả năng lây nhiễm, tính kháng thuốc,

độc lực và khả năng gây bệnh của virus, do đĩ được

nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu

Các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu (bảng

1) được thiết kế sau khi phân tích các trình tự gen của

virus cúm H5N1 đã đăng ký trên GenBank từ năm

2003 - 2010 Trình tự nucleotide tại các vùng này cĩ

tính bảo tồn cao, tuy nhiên ở một số vị trí vẫn cĩ hiện

tượng đa hình Do đĩ, hầu hết các trình tự mồi được

thiết kế dưới dạng “degenerative primer” để làm tăng

khả năng bắt cặp với cDNA của các chủng H5N1

khác nhau Ngồi ra, các trình tự mồi được thiết kế

đều cĩ số lượng nucleotide khá lớn (22 - 34

nucleotide), như vậy nhiệt độ biến tính của mồi sẽ

tương đối cao (54 - 58oC), đảm bảo tính đặc hiệu của

mồi, hạn chế các sản phẩm phụ khi thực hiện phản

ứng PCR ðể phản ứng khuếch đại gen cĩ hiệu quả tốt

nhất, chúng tơi đã tiến hành thử nghiệm phản ứng ở

các điều kiện khác nhau và đã xác định được chương

trình nhiệt (nhiệt độ, thời gian gắn mồi; thời gian kéo

dài chuỗi; số chu kỳ khuếch đại) và thành phần phản

ứng (nồng độ dNTP; nồng độ mồi; nồng độ enzyme)

tối ưu cho phản ứng

Sau khi điện di và tinh sạch từ thạch agarose,

DNA được gắn vào vector pJET1.2/blunt và biến nạp

vào tế bào E coli TOP10 Vector pJET1.2/blunt cĩ

hiệu quả biến nạp cao với tế bào E coli TOP10 và

sau khi nuơi cấy mỗi tế bào E coli cĩ thể tạo ra 300 -

700 bản sao Việc lựa chọn các khuẩn lạc cĩ chứa

plasmid tái tổ hợp cĩ thể thực hiện bằng phản ứng

colony PCR hoặc sử dụng enzyme giới hạn Các

phân đoạn gen của virus H5N1 cĩ kích thước lớn

(trên 1000 bp) và cĩ độ biến đổi cao nên nếu dùng

enzyme giới hạn thì số lượng sản phẩm của phản ứng

giới hạn cĩ thể thay đổi tùy thuộc vào từng chủng

virus (khơng cĩ, cĩ một hay cĩ nhiều vị trí giới hạn

trên trình tự DNA), gây khĩ khăn cho việc phân tích

Do đĩ chúng tơi đã áp dụng kỹ thuật colony PCR để

lựa chọn các khuẩn lạc cĩ plasmid tái tổ hợp chứa

trình tự gen cần tách dịng Dựa vào kết quả điện di

sản phẩm phản ứng colony PCR (Hình 2) cĩ thể lựa

chọn được các khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp

mong muốn một cách dễ dàng

Tất cả 33 trình tự gen đã tách dịng đều được xác

định trình tự nucleotide trên hệ thống CEQ 8000 và

kiểm tra bằng chương trình BLAST Kết quả cho

thấy các trình tự gen đã tách dịng cĩ độ tương đồng cao (trên 97% - bảng 2) với trình tự gen của virus H5N1 chứng tỏ kỹ thuật khuếch đại và tách dịng các phân đoạn HA, NA và M của virus H5N1 đã thu được các phân đoạn tương ứng Trình tự gen HA,

NA và M của các chủng virus thu thập trên gia cầm

đã được đăng ký trên GenBank với các mã số đăng

ký từ CY095680 đến CY095706

Việc khuếch đại và tách dịng trọn vẹn các phân đoạn gen HA, NA và M của virus cúm H5N1 là tiền

đề cung cấp nguyên liệu gen và trình tự nucleotide cho các nghiên cứu di truyền phân tử liên quan đến đặc tính kháng nguyên, tính kháng thuốc, khả năng lây nhiễm, độc lực, khả năng gây bệnh, sự tiến hĩa

và các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của virus cũng như ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất vaccine, phát triển các sinh phẩm chẩn đốn dựa trên kỹ thuật miễn dịch

KẾT LUẬN

Kỹ thuật RT-PCR hai bước khuếch đại trọn vẹn các phân đoạn HA, NA và M của virus cúm H5N1 với 3 cặp mồi thiết kế trên vùng 3’ và 5’ UTR đã được xây dựng thành cơng Thử nghiệm kỹ thuật trên

11 mẫu RNA của virus cúm H5N1 cho thấy tất cả các phân đoạn HA, NA và M của virus cúm H5N1 đều được khuếch đại trọn vẹn Tất cả các phân đoạn

HA, NA và M của 11 mẫu virus cúm H5N1 thu thập

từ gia cầm và người đều được gắn với vector pJET1.2/blunt, tạo plasmid tái tổ hợp chứa trình tự gen của virus cúm H5N1

Lời cảm ơn: Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ

trợ kinh phí của đề tài hợp tác theo Nghị định thư giữa Việt Nam và Thái Lan “Hợp tác nghiên cứu đặc điểm lưu hành và sự biến đổi gen của virus cúm gia cầm H5N1 ở khu vực phía Bắc Việt Nam” do Trường ðại học Y Thái Bình chủ trì Chúng tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn tới Tiến sĩ Nguyễn Văn Cảm - nguyên Giám đốc Trung tâm Chẩn đốn thú y Trung ương và TS Lê Thị Quỳnh Mai - Giám đốc Trung tâm Cúm Quốc gia đã cung cấp các mẫu RNA của virus A/H5N1

TÀI LIỆU THAM KHẢO Baigent SJ, McCauley JW (2001) Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine

to regulate the growth of avian influenza viruses in

tissueculture Virus Res 79(1-2): 177-185

Bouvier NM, Palese P (2008) The biology of influenza

viruses Vaccine 26 Suppl 4: D49-53

Bright RA, Shay DK, Shu B, Cox NJ, Klimov AI (2006)

Adamantane resistance among influenza A viruses isolated

early during the 2005-2006 influenza season in the United

States JAMA 295(8): 891-894

Chen H, Smith GJ, Li KS, Wang J, Fan XH, Rayner JM,

Vijaykrishna D, Zhang JX, Zhang LJ, Guo CT, Cheung

CL, Xu KM, Duan L, Huang K, Qin K, Leung YH, Wu

WL, Lu HR, Chen Y, Xia NS, Naipospos TS, Yuen KY,

Hassan SS, Bahri S, Nguyen TD, Webster RG, Peiris JS,

Guan Y (2006) Establishment of multiple sublineages of

H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic

control Proc Natl Acad Sci USA 103: 2845-2850

Drake JW (1993) Rate of spontaneous mutation among

RNA viruses Proc Natl Acad Sci USA 90(9): 4171-4175

Hoffmann E, Stech J, Guan Y, Webster RG, Perez DR

(2001) Universal primer set for the full-length

amplification of all influenza A viruses, Arch Virol 146:

2275-2289

Neumann G, Kawaoka Y (2006) Host range restriction and

pathogenicity in the context of influenza pandemic Emerg

Infect Dis 12: 881-886

Smith GJ, Fan XH, Wang J, Li KS, Qin K, Zhang JX, Vijaykrishna D, Cheung CL, Huang K, Rayner JM, Peiris

JS, Chen H, Webster RG, Guan Y (2006) Emergence and

predominance of an H5N1 influenza variant in China Proc

Natl Acad Sci USA 103: 16936-16941

Suarez DL, Schultz-Cherry S (2000) Immunology of avian

influenza virus: a review Dev Comp Immunol 24(2-3):

269-283

Wu WL, Chen Y, Wang P, Song W, Lau SY, Rayner JM, Smith GJ, Webster RG, Peiris JS, Lin T, Xia N, Guan Y and Chen H (2008) Antigenic profile of avian H5N1

viruses in Asia from 2002 to 2007 J Virol 82(4):

1798-1807

Yamada S, Suzuki Y, Suzuki T, Le MQ, Nidom CA, Sakai-Tagawa Y, Muramoto Y, Ito M, Kiso M, Horimoto T, Shinya K, Sawada T, Kiso M, Usui T, Murata T, Lin Y, Hay A, Haire LF, Stevens DJ, Russell

RJ, Gamblin SJ, Skehel JJ, Kawaoka Y (2006) Haemagglutinin mutations responsible for the binding

of H5N1 influenza A viruses to human-type receptors

Nature 444(7117): 378-382

DEVELOPMENT OF AMPLIFYING AND CLONING METHOD FOR FULL-LENGTH

HA, NA AND M SEGMENTS OF INFLUENZA A/H5N1VIRUS

Nguyen Nam Thang 1 , Pham Ngoc Khai 1 , Dinh Duy Khang 2 , Luong Xuan Hien 1, ∗∗∗∗

1 Thaibinh Medical University

2 Institute of Biotechnology

SUMMARY

Genetic variation in HA, NA and M segments of influenza A virus may alter antigenic characteristics,

transmissibility, drug resistibility, virulence, and pathogenicity In this study, a novel method for amplifying and

cloning full-length HA, NA and M segments of influenza A/H5N1 virus is described RNA templates of influenza A/H5N1 virus were used for amplification of full-length HA, NA and M segments by two step RT-PCR method The method was carried out with 3 specific primerpairs designed based on consensus sequences of the 3’ UTR and 5’ UTR by multiple aligment of each segment The DNA amplifications were examined by electrophoresis and eluted from agarose gel, then ligated with pJET1.2/blunt vector to generate recombinant plasmids RNA templates extracted from 11 isolates of H5N1 virus collected from poultry and humans were tested to evaluate the accuracy of the method After optimization, the RT-PCR method was used to amplify all HA, NA and M segments from RNA templates of 11 influenza H5N1 isolates Electrophoresis result showed that all amplifications of HA, NA and M segments were clearly visualized on agarose gel After gel-elution, the amplifications were inserted into pJET1.2/blunt vector Sequencing results indicated that all of the sequences from the clones have high nucleotide identity with the corresponding H5N1 sequences The method for amplifying and cloning full-length HA, NA and M segments of influenza A/H5N1 virus isolated from poultry and humans was

successfully developed and could be applied for study of influenza H5N1 virus at the molecular level

Keywords: A/H5N1, avian influenza, cloning, HA, NA, M segment, RT-PCR

∗ Author for correspondence: Tel: 84-913291360 ; E-mail: hienlx@tbmc.edu.vn