Xây dựng panel lympo và bộ sinh phẩm chẩn đoán kháng nguyên hòa hợp mô lớp 1

Xây dựng panel lympo và bộ sinh phẩm chẩn đoán kháng nguyên hòa hợp mô lớp 1

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y KHOA

MỞ ĐẦU VAI TRỊ CỦA PHÂN TỬ HLA

HLA: (Human Lymphocyte Antigen) hệ hoà hợp

mô chủ yếu ở người, có vai trò chủ yếu:

* Ghép tạng

* Chẩn đoán mối quan hệ huyết thống

* Nhân chủng học

* HLA trong bệnh lý…

MỞ ĐẦU

KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH PHÂN TỬ

HLA & GIÁ THÀNH

 Kỹ thuật Độc tế bào

 PCR

MỞ ĐẦU

CHIẾT TÁCH KHÁNG HUYẾT

THANH KHÁNG HLA

 Phụ nữ mang thai

 Người truyền máu nhiều lần

 Người sau khi ghép tạng…

MỤC TIÊU

* Xác định phân tử HLA lớp I của 150 người tình nguyện hiến mô bằng kỹ thuật PCR-SSO.

* Thiết lập dàn panel HLA lớp I.

* Sử dụng dàn panel để phân tích sự hiện diện của kháng thể kháng HLA lớp I, từ huyết thanh, được chiết tách ở máu sản phụ hứng được sau sổ nhau.

* Phân lập huyết thanh, tạo mẫu huyết thanh đơn đặc hiệu dùng để xác định phân tử HLA lớp I bằng kỹ thuật độc tế bào.

TỔNG QUAN Y VĂN

NHÁNH NGẮN NST 6

HLA nằm trên cánh ngắn NST số 6



HLA TRONG DI TRUYỀN

VAI TRỊ HLA TRONG Y HỌC

 Trong ghép tạng

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Xây dựng dàn Panel:

* Những người tình nguyện hiến mô được

đăng ký và cấp thẻ do phòng TN Vật liệu

sinh học bộ môn Mô Phôi TTĐTBDCBYT

TTĐT, trong lứa tuổi từ 25-40.

* Không phân biệt giới tính, có thể cho máu

bất cứ lúc nào khi cần

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Chiết tách kháng huyết thanh:

Số lượng mẫu huyết thanh lấy được, trong khoảng thời gian 6 tháng từ tháng 9/2004 đến tháng 3/2005 tại BV Từ Dũ và BV Hùng

Vương.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

-ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Tiêu chuẩn loại trừ:

Số lần sanh dưới 3 lần

- Cùng một hôn phối  nhằm loại trừ huyết

thanh có nhiều yếu tố kháng HLA

Sản phụ có kèm bệnh truyền nhiễm theo

đường máu: HIV, VGSVB, giang mai …

(Dựa vào các kết quả xét nghiệm của bệnh viện)

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGHIÊN CỨU MÔ TẢ CẮT NGANG

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để xây dựng dàn Panel:

Quần thể đích, phụ thuộc vào số lượng xét nghiệm PCR – SSO, HLA lớp I do trường đại học Louvain tài trợ.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để phân lập huyết thanh, tạo mẫu huyết thanh đơn đặc hiệu

- Quần thể đích, phụ thuộc số người đến sanh tại BV Từ Dũ và BV Hùng Vương

- Trong khoảng thời gian 6 tháng từ tháng 9/2004 đến tháng 3 / 2005

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

dương tính với HLA lớp I là 20.4%

CÁC BƯỚC TiẾN HÀNH

1 Lấy máu tĩnh mạch

2 Chiết tách tế bào BC bằng kỹ thuật Buffy Coat

3 Bảo quản -80oC.

CÁC BƯỚC TiẾN HÀNH

Chiết tách DNA

Quy trình khuếch đại

Chu trình khuếch đại: 95 o C trong 15 giây

KẾT QUẢ THỰC HIỆN TRÊN CÁC QUE

CÁC BƯỚC TiẾN HÀNH

KHAY TERASAKI

SƠ ĐỒ: QUI TRÌNH KỸ THUẬT

ĐỘC TẾ BÀO

K T T B L Y M P H O C ’ K H O ÂN G G A ÉN L E ÂN T B L

C ’ G A ÉN

PHẢN ỨNG ĐỘC TẾ BÀO DƯỚI

KÍNH HiỂN VI SOI NGƯỢC

AÂM TÍNH

DÖÔNG TÍNH

KẾT QUẢ

HLA–A: A01 A02 A03 A11 A24 A26

A29 A30 A31 A33 A34 A68 A74

KẾT QUẢ

Chiếm tỉ lệ cao nhất là: HLA-A11 (48%)

HLA-A02 (42%) HLA-A24 (9) (31%)

Chiếm tỉ lệ trung bình: HLA-A33 (19) (24%)

HLA-A29 (19) (14,6%)

Chiếm tỉ lệ thấp nhất:

HLA-A01 (5,3%) HLA-A 26 (10) (4,7%) HLA-A03 (3,3%) HLA-A68 (2%) HLA-A30 (19) (1,3%) HLA-A31 (19) (1,3%) HLA-A34 (10) (1,3%) HLA-A74 (19) (1,3%)

KẾT QUẢ

B07, B08, B13, B15, B18, B27, B35, B37, B38, B39, B40, B44, B46, B50, B51, B52, B54, B55, B56, B57, B58, B78.

PANEL LYMPHO

HLA – A*03&33 HLA – B*52&58

HLA – A*02&03 HLA – B*13&55

HLA – A*03&29 HLA – B*07&35

HLA – A*01&11 HLA – B*15&57

HLA – A*01&33 HLA – B*40&57

HLA – A*01&29 HLA – B*15&37

HLA – A*02&11 HLA – B*40&46

HLA – A*24&26 HLA – B*07&35

HLA – A*26&33 HLA – B*27&58

HLA – A*11&26 HLA – B*15&46

PANEL LYMPHO

HLA – A*11&68 HLA – B*13&46

HLA – A*02&68 HLA – B*46&52

HLA – A*24&68 HLA – B*08&15

HLA – A*02&74 HLA – B*15&55

HLA – A*24&30 HLA – B*07&35

HLA – A*24&29 HLA – B*07&18

HLA – A*24 HLA – B*15&18

HLA – A*02 HLA – B*37&46

HLA – A*02&24 HLA – B*35&39

HLA – A*24&26 HLA – B*35&54

PANEL LYMPHO

HLA – A*02&11 HLA – B*46&54

HLA – A*02&11 HLA – B*55&57

HLA – A*11&33 HLA – B*51&55

HLA – A*02&11 HLA – B*40&56

HLA – A*11 HLA – B*39&56

HLA – A*11&24 HLA – B*15&78

HLA – A*11&34 HLA – B*13&38

HLA – A*11&31 HLA – B*51&54

PANEL LYMPHO

HLA – A*11&33 HLA – B*50&58

HLA – A*02&33 HLA – B*50&58

HLA – A*11&33 HLA – B*11&44

HLA – A*11&33 HLA – B*15&44

HLA – A*11&31 HLA – B*38&51

HLA – A*02&03 HLA – B*39&51

HLA – A*24&33 HLA – B*40&51

HLA – A*02&24 HLA – B*46&52

HLA – A*02&68 HLA – B*46&52

HLA – A*11&29 HLA – B*07&54

CHIẾT TÁCH KHÁNG THỂ KHÁNG

HLA

Phân tích 297 mẫu huyết thanh thu được, chúng tôi tìm được các kháng thể kháng HLA lớp I như sau:

- 05 loại kháng thể kháng HLA-A:

HLA-A2, A3, A11, A26, A29

- 15 loại kháng thể kháng HLA-B:

HLA-B07, B15, B27, B35, B37, B39, B40, B44, B46, B51, B52, B54, B55, B56,

B57.

KiỂM CHỨNG KHÁNG THỂ KHÁNG HLA CHIẾT TÁCH

- Với những mẫu huyết thanh có thể dùng để làm kháng

huyết thanh chẩn đoán Chúng tôi tiến hành kiểm

chứng lại độ đặc hiệu

- Việc chọn mẫu để kiểm, dựa trên thành phần các

kháng huyết thanh mà chúng tôi chiết tách được

- Với 5 loại kháng thể kháng HLA-A: HLA-A02, A03,

HLA-B07, B15, B27, B35, B37, B39, B40, B44, B46, B51,

KiỂM CHỨNG KHÁNG THỂ KHÁNG HLA CHIẾT TÁCH

02 HLA-A*11&24; HLA-B*27 & 54

Danh sách 9 mẫu tế bào được chọn từ dàn panel để kiểm chứng

độ đặc hiệu các kháng huyết thanh được chiết tách

BÀN LUẬN

Đặc điểm dàn panel HLA lớp I :

- Trong dàn Panel HLA mà chúng tôi thiết lập, hầu nhưhiện diện đầy đủ các kiểu hình của phân tử HLA lớp I,mà chúng tôi đã có

- Chỉ thiếu 2 kiểu hình HLA, tần suất rất thấp là : A30 vàA36

BÀN LUẬN

SO SÁNH SỐ LƯỢNG KIỂU HÌNH CỦA PHÂN TỬ HLA LỚP I

HLA-A gồm:

* 10 kiểu hình (A01, A02, A03, A09, A10, A11, A19,

A28, A36, A43)

* Và 14 phụ nhóm : A09 (A23, A24); A10 (A25, A26,

A34, A66); A19 (A29, A30, A31, A32, A33, A74 ; A28: A68, A69)

Tổng cộng có 21 khiểu hình tính cả phụ nhóm

BÀN LUẬN

Dàn Panel của chúng tôi thu được số kiểu hình HLA lớp I:

- A01, A02, A03, A09 (A24), A10 (A26), A11, A19

(A29, A30, A31), A28 (A 68)

* Và 9 phụ nhóm:

- A 24, A 26, A 29, A 30, A 31, A 33, A 34, A 68, A 74

BÀN LUẬN

HLA- B:

* 19 kiểu hình:

- B05, B07, B08, B12, B13, B15, B16 (B38, B39), B17 (B57,B58) B18, B21 (B50), B22 (B54, B55) , B27, B35, B37, B39, B40, B46, B51, B78

* Và 10 phụ nhóm:

- B38, B39, B44, B50, B51, B52, B54, B55, B56,

B57, B58

BÀN LUẬN

Về kiểu hình HLA lớp I, dàn panel chúng tôi còn thiếu

một số kiểu hình như sau:

* HLA-A: thiếu 2 kiểu hình là: A36, A43

Phần phụ nhóm thiếu 5 kiểu hình: A23, A25, A32, A66, A69

* HLA-B: Thiếu 10 kiểu hình là: B14, B41, B47, B48, B53, B59, B67, B70, B73

Và phụ nhóm HLA-B chúng tôi thiếu 13 kiểu hình: B45, B49, B60, B61, B62, B63, B64, B65, B71, B72, B75, B76, B77

BÀN LUẬN

HLA-A TỶ LỆ CỦA W/S n=149 [7]

TỶ LỆ THU ĐƯỢC

BÀN LUẬN

So sánh công bố của Workshop (W/S):

• - Tỷ lệ của các HLA-A không khác biệt nhau mấy

• - Một số khác biệt có ý nghĩa như:

HLA-A02, A11, A24, A33 (p<0,05)

Ghi nhận HLA-A 34, 68, 74 không có trong kết quả của W/S, nhưng có xuất hiện trong khảo sát của chúng tôi

Nhưng trong khảo sát của chúng tôi cũng không tìm

Thấy HLA-A 23

BÀN LUẬN

HLA-A Bạch Quốc Tuyên

1981 [12]

Bạch Khánh Hoà 1990 [8]

BÀN LUẬN

HLA-A Bạch Quốc Tuyên

1981 [12]

Bạch Khánh Hoà 1990 [8]

(n=76)

Test Chi 2

Hồ Quang Huy [9]

(n=91)

Test Chi 2

Tỷ lệ thu được (n=150)

BÀN LUẬN

Điểm tương tự : tỷ lệ kiểu hình HLA-A có tần suất

* A11 (chúng tôi 48%, BKH 48,7%, và HQH 49,45%)

* A02 (BQT 45%, BKH 36,8%, chúng tôi 42%).

* A24 (BQT 18%, BKH 21%, chúng tôi 31% và HQH 20,88%).

* A29 (chúng tôi 14,6%, BKH 14,5%, HQH 16,48%).

Nhìn chung tần suất các kiểu hình HLA-A trong kết

qu của chúng tôi so với Bạch Khánh Hòa, Bạch ả của chúng tôi so với Bạch Khánh Hòa, Bạch

Quốc Tuyên, Hồ Quang Huy không khác biệt nhiều

BÀN LUẬN

Một số khác biệt đáng chú ý:

* A33 (chúng tôi 24%, trong khi HQH 4,39% và BQT 4%)

* Đặc biệt A28 xuất hiện với tần suất khá cao trong nghiêncứu của BKH (6,5%), HQH (2,2%),BQT (4%) nhưng không xuất hiện trong khảo sát của chúng tôi

* HLA-A23, A25, A32, A66: không xuất hiện trong kết quảcủa chúng tôi nhưng các tác giả khác lại tìm thấy với tuần suất rất thấp: HLA-A23(2,2%), A25(1,1%), A32(0,55%),A66(1,1%)

*HLA-A68 và A74 có trong kết quả của chúng tôi nhưng Các tác giả khác lại không tìm thấy

BÀN LUẬN

HLA-B

Bạch Quốc Tuyên

[12]

Bạch Khánh Hoà [8]

(n=76)

Test Chi 2

Hồ Quang Huy [9]

(n=91)

Test Chi 2

Tỷ lệ thu được (n=150)

BÀN LUẬN

HLA-B

Bạch Quốc Tuyên

[12]

Bạch Khánh Hoà [8]

(n=76)

Test Chi 2

Hồ Quang Huy [9]

(n=91)

Test Chi 2

Tỷ lệ thu được (n=150)

BÀN LUẬN

HLA-B

Bạch Quốc Tuyên

[12]

Bạch Khánh Hoà [8]

(n=76)

Test Chi 2

Hồ Quang Huy [9]

(n=91)

Test Chi 2

Tỷ lệ thu được (n=150)

Khánh Hoà tương đương nhau và đều tập trung vào một sốcác kiểu hình, mà chúng tôi có được.

So sánh tần suất HLA-B của các tác giả đã làm trên người Việt Nam

Bạch Quốc Tuyên

Bạch khánh

Hoà

Hồ Quang Huy

Bạch Quốc Tuyên

Bạch Khánh Hòa

Hồ quang Huy

Bạch Quốc Tuyên

Bạch Khánh Hòa

Hồ quang Huy

BÀN LUẬN

• So sánh tần suất của HLA-A và HLA-B trong nghiên cứu của chúng tôi và của các tác giả khác trong nước, kết quả phù hợp với nhau khá tốt

Những kiểu hình có trong dàn Panel của chúng tôi đều là

những kiểu hình có trong các nghiên cứu của các tác giả khác trong nước và ngược lại những kiểu hình chúng tôi không có, thì trong nghiên cứu của các tác giả khác cũng không có, hoặc có với tần suất rất thấp

BÀN LUẬN

Qua bảng tổng kết trên, chúng tôi nhận thấy, một số

kiểu hình mà chúng tôi không có được trong mẫu nghiên cứu cũng phù hợp vì:

Tần suất HLA kể trên, xuất hiện ở người da vàng, đại diện là nhóm người Nhật và người Hoa quá thấp Cho nên, khả năng chúng tôi phát hiện chúng cũng rất khó

BÀN LUẬN

Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy:

– Tần suất xuất hiện của những kiểu hình phân tử HLA lớp I của chúng tôi phù hợp với tần

suất xuất hiện của nhóm người da vàng mà

đại diện là người Nhật và người Hoa

- Như vậy, dàn Panel của chúng tôi có thể đáp ứng tương đối đủ về các kiểu hình của phân tử HLA lớp I đặc trưng cho người Việt Nam nói riêng và người da vàng nói chung

BÀN LUẬN

Hy vọng rằng, khi có điều kiện, chúng tôi sẽ tiếp tục cố gắng phát hiện những kiểu hình của phân tử HLA mà chúng tôi còn thiếu (những kiểu hình hiếm ở

người Châu Á), để bổ sung vào danh sách panel, hầu từng bước có được để dàn panel ngày càng hoàn

thiện và đầy đủ hơn

BÀN LUẬN

Tỷ lệ và đặc điểm kháng huyết thanh kháng HLA lớp I:

• * Tỷ lệ kháng thể kháng HLA lớp I trong máu sản phụ là 18.18% (54/297).

* Theo lý thuyết, tỷ lệ xuất hiện kháng thể kháng HLA lớp I ở phụ nữ mang thai lần 1 là 10%, ở phụ nữ mang thai nhiều lần là 30%.[42]

BÀN LUẬN

* Bạch Khánh Hòa (1990) xác định tỷ lệ kháng thể khángHLA lớp I trong máu sản phụ sống ở Hà Nội như sau: ở sản phụ có thai lần 2 là 14.9% và ở sản phụ có thai lần 3 là 28.5%

* Phòng huyết học Blutforschung, Đức (1988), tần suất kháng thể kháng HLA lớp I trên 161 sản phụ là 23%

BÀN LUẬN

Về mặt thống kê để so sánh tỷ lệ huyết thanh dương

tính của chúng tôi với công trình nghiên cứu của phòng

huyết học Blutforchung, Đức, chúng tôi sử dụng phép kiểm:

2 = 1,524; độ tự do = 1; p >0.05

BÀN LUẬN

• Với p>0.05 cho thấy kết quả tỷ lệ huyết thanh dương tính với kháng nguyên HLA lớp I của chúng tôi với phòng huyết học Blutforchung, Đức khác nhau không có ý nghĩathống kê

Nhìn chung, tỉ lệ kháng thể kháng HLA lớp I của chúngtôi với nghiên cứu của Bạch Khánh Hòa, cũng như nghiêncứu của viện huyết học Bludforchung, Đức tương tự nhau

BÀN LUẬN

Dựa vào kết quả trên, chúng ta có thể sử dụng huyếtthanh được chiết tách từ máu sau sổ nhau của sản phu,ï đểtiến hành phân tích và chiết tách kháng thể kháng HLA

 Tạo bộ sinh phẩm xác định phân tử HLA lớp I trên tế bào lympho

30.76 15.38 38.46 7.69 7.69

7 15 27 35 37 39 40 44 46 51 52 54 55 56 57

1 1 2 1 1 1 1 2 1 1 2 1 1 3 2

4.76 4.76 9.52 4.76 4.76 4.76 4.76 9.52 4.76 4.76 9.52 4.76 4.76 14.28 9.52

Tổng 13 100 21 100

Tỷ lệ % các kháng huyết thanh kháng phân tử HLA lớp I

BÀN LUẬN

Trong 297 mẫu huyết thanh, chúng tôi phát hiện được:

* 05 loại kháng thể kháng HLA-A : HLA-A02, A03, A11, A26, A29

* 15 loại kháng thể kháng HLA-B: HLA-B7, B15, B27, B35, B37, B39, B40, B44, B46, B51, B52,B54, B55, B56, B57

BÀN LUẬN

* Kháng thể kháng HLA-A11 chiếm tỷ lệ cao (5/13): trong

13 mẫu có kháng thể kháng HLA-A thì xuất hiện 5 mẫu cókháng thể kháng HLA-A11

* Kế tiếp là kháng thể kháng HLA-A2 (4/13)

BÀN LUẬN

KHTK HLA-A KINH-VIỆTNAM

Kinh-Việt Nam KHTK HLA_A

So sánh tỷ lệ các kháng thể kháng HLA-A tìm được trong 297 mẫu huyết thanh của sản phụ sau sanhcác kiểu hình HLA-A của 91 người Kinh Việt nam

BÀN LUẬN

So sánh tỷ lệ kháng thể kháng HLA-A với các kiể hình HLA-A của người Việt Nam

của các tác giả Bạch Khánh Hòa (BKH), Bạch Quốc Tuyên (BQT)

và 91 người Kinh Việt Nam (KVN)

BÀN LUẬN

Kinh Việt Nam KHTK HLA-B

So sánh tỷ lệ các kháng thể kháng HLA-B tìm được trong 297 mẫu huyết thanh của sản phụ sau sanh các kiểu hình HLA-B của 91 người Kinh Việt Nam

BÀN LUẬN

So sánh tỷ lệ kháng huyết thanh kháng HLA-B với HLA-B của các tác giả

Bạch Khánh Hòa (BKH), Bạch Quốc Tuyên (BQT) và 91 người Kinh Việt Nam (KVN)

BÀN LUẬN

* Về kỹ thuật xét nghiệm:

Kỹ thuật độc tế bào Terasaki: là kỹ thuật miễn dịch tương đối đơn giản, có thể thực hiện khi có bộ huyết

thanh xác định kiểu hình phân tử HLA

Ngược lại, chúng ta cũng có thể áp dụng kỹ thuật này để phát hiện kháng thể kháng HLA trong huyết

thanh khi chúng ta có dàn panel lympho

BÀN LUẬN

Kiểm chứng :

* Từ kết quả kiểm tra độ đặc hiệu và độ nhạy của các kháng huyết thanh mà chúng tôi chiết tách được, với các kiểu hình tương ứng dựa trên 9 mẫu tế bào

lympho được lấy từ dàn panel Kết quả hoàn toàn đúng và tương ứng

* Từ những kết quả kiểm chéo trên những kháng huyết thanh của trường Đại học UCL

BÀN LUẬN

• Kháng huyết thanh chúng tôi tìm được dù không nhiều nhưng đặc hiệu và hoàn toàn tương ứng với các kháng huyết thanh, được làm tại phòng xét nghiệm HLA của trường Đại học Louvain Với độ nhạy của phản ứng cao,

biểu hiện kết quả ở mức điểm 4+ và 5+

KẾT LUẬN

* Bước đầu với kết quả như trên, chúng tôi hy vọng sẽ là tiền đề rất tốt cho những nghiên cứu về sau, trong việcchiết tách huyết thanh có kháng thể kháng HLA trong máusản phụ sau sổ nhau, một nguồn kháng huyết thanh rất cógiá trị, nhưng trong thời gian qua chúng ta đã bỏ đi rất

nhiều

KẾT LUẬN

bằng phương pháp (PCR-SSO) Xây dựng được dàn panel lympho HLA lớp I cho người Việt Nam tại TPHCM.

cứu, nhằm xây dựng bộ panel ngày một hoàn chỉnh và là

tiền đề mở rộng thêm trong các bước nghiên cứu khác như:

dò tìm KT kháng mô nhận sau khi ghép mô nhằm theo dõi

quá trình thải ghép  có thể đề ra biện pháp hữu hiệu để

hạn chế việc thải loại mảnh ghép