Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của klebsiella pneumoniae kháng carbapenem qua cơ chế KPC

pneumoniae với khả năng sinh enzyme  -lactamase phổ rộng ESBL thường kháng đa kháng sinh, và gen mã hóa cho sự đề kháng thường hiện diện trên plasmid.. Gen mã hóa KPC, một gen có khả n

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN NHẬT PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA

KLEBSIELLA PNEUMONIAE

ĐỀ KHÁNG CARBAPENEM QUA CƠ CHẾ KPC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2016

Công trình được hoàn thành tại:

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS TRẦN LINH THƯỚC

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM

- Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

Klebsiella pneumoniae là trực khuẩn gram âm, kị khí tùy ý, không di

động, có nang polysacharide đặc trưng giúp vi khuẩn tránh được các tác nhân gây hại cho tế bào Vi khuẩn này có thể gây bệnh viêm phổi, áp xe phổi, viêm màng phổi và những nhiễm khuẩn khác như viêm ruột, viêm màng não,

nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn đường tiết niệu K pneumoniae với khả

năng sinh enzyme  -lactamase phổ rộng (ESBL) thường kháng đa kháng sinh, và gen mã hóa cho sự đề kháng thường hiện diện trên plasmid

K pneumoniae đề kháng carbapenem hiện nay là một vấn đề thách

thức trong các đơn vị điều trị lâm sàng Cơ chế đề kháng phổ biến nhất ở vi

khuẩn này là sinh enzyme carbapenemase được gọi là Klebsiella

pneumoniae Carbapenemase (KPC) Gen mã hóa KPC, một gen có khả năng

lan truyền rộng rãi tính kháng thuốc cho các vi khuẩn gây bệnh cùng hay

khác loài, hiện diện trên nhân tố di truyền di động là transposon Tn4401, một

cấu trúc có khả năng chuyển vị các bản sao với tần suất cao (4,4 x 10-6

) các

trình tự gen mã hóa enzym này Transposon Tn4401 được chứng minh có

khả năng chèn vào nhiều trình tự khác nhau, trên các plasmid có kích thước khác nhau và trên những nhóm incompatible khác nhau nên ngoài tính kháng mạnh, gen này đã được phát hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới và gây nên nhiều vụ dịch bệnh với tỷ lệ tử vong cao do các liệu pháp điều trị còn rất

hạn chế Nói khác đi, một khi K pneumoniae kháng carbapenem, chúng có

thể sẽ trở thành những vi khuẩn “bất trị”

Tại Việt Nam, nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có sự gia tăng sự

đề kháng carbapenem ở K pneumoniae thông qua đánh giá mức độ kháng

thuốc dựa trên kết quả xác định MIC hay theo các phương pháp kháng sinh

đồ mà chưa nêu bật được các đặc điểm sinh học phân tử của sự đề kháng và

sự lan truyền tính kháng ở vi khuẩn này Đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh

học phân tử của Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem qua cơ chế

KPC” được tiến hành trên các chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem

với các mục tiêu cụ thể như sau:

1 Sàng lọc và thu nhận các chủng vi khuẩn K pneumoniae đề kháng

carbapenem

2 Xác định kiểu gen quy định kiểu hình kháng carbapenem và ESBL

3 Khảo sát đặt tính sinh học phân tử của gen mã hóa KPC

4 Tạo kháng thể xác nhận sự hiện diện của protein KPC

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1 Phát hiện vi khuẩn K pneumoniae đề kháng carbapenem thông qua gen

mã hóa KPC-2 tại Việt Nam

2 Chứng minh sự lan truyền gen mã hóa enzyme đề kháng carbapenem sang

E coli trong điều kiện phòng thí nghiệm

3 Phân lập và tạo dòng gen mã hóa KPC-2 ở K pneumoniae đề kháng

carbapenem và chứng minh hoạt tính kháng carbapenem của gen này

1.1 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae

K pneumoniae, thuộc họ vi khuẩn đường ruột – Enterobacteriaceae, là

tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và cộng đồng Yếu tố nguy cơ lây nhiễm các chủng này ở bệnh nhân là thời gian nằm viện kéo dài, hệ miễn dịch suy yếu, nằm chung giường với người nhiễm bệnh hay thực hiện những thủ thuật xâm lấn như đặt ống thông tiểu, đặt nội khí quản… Nhiễm khuẩn

bệnh viện do Klebsiella tăng cao chủ yếu do gia tăng việc sử dụng kháng

sinh làm gia tăng những chủng kháng thuốc

1.1.1 Đặc điểm phân loại

Đặc điểm phân loại của K pneumoniae (theo NCBI): Giới: Bacteria;

Ngành: Proteobacteria; Lớp: Gammaproteobacteria; Bộ: Enterobacteriales;

Họ: Enterobacteriaceae; Chi: Klebsiella; Loài: Klebsiella pneumoniae

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân bố

K pneumoniae là trực khuẩn gram âm, kị khí tùy ý, không di động, có

nang polysacharide đặc trưng giúp vi khuẩn tránh được các tác nhân gây hại cho tế bào Vi khuẩn này có mặt khắp nơi trong tự nhiên Ở người, có thể tìm thấy chúng ở da, cổ họng, đường ruột, dạ dày, nước tiểu hay các vết thương

1.1.3 Các yếu tố độc lực của K pneumonia

a) Kháng nguyên vỏ (bề mặt): gồm có 2 nhóm kháng nguyên K có bản

chất polysaccharide và kháng nguyên O có bản chất lipopolysaccharide, đều

là yếu tố gây bệnh ở K pneumoniae

b) Hệ thống nhung mao (pili): là cơ quan giúp Klebsiella bám dính lên

bề mặt tế bào chủ, có khả năng đông tụ hồng cầu của nhiều loài động vật

c) Các yếu tố kháng huyết thanh: lớp vỏ polysaccharide bao bọc và che

chở cho lớp lipopolysaccharide nằm bên dưới và kháng nguyên O xuyên qua

lớp vỏ tạo thành cấu trúc bề mặt không hoạt hóa bổ thể

d) Siderophore (chất mang ion – ion carrier): Klebsiella tiết ra những

chất kìm nối (chelator) phân tử lượng nhỏ, có ái lực rất cao với sắt được gọi

là các siderophore (enterochelin và aerobactin) giúp vi khuẩn có thể tăng

trưởng trong mô tế bào chủ

1.1.4 Cấu trúc di truyền của K pneumoniae

Ngoài một số cấu trúc di truyền của K pneumoniae được giải trình tự toàn bộ hay một phần trước đây như K pneumoniae sub sp pneumoniae MGH (một nhiễm sắc thể dạng vòng 5,1 Mbp có tỷ lệ GC là 57%), chủng K

pneumoniae NTUH-K2044 phân lập tại Đài Loan, chủng K pneumoniae

subsp rhinoscleromatis (ATCC13884), chủng có khả năng cố định nitơ, K

pneumoniae 342, được sử dụng trong nghiên cứu mối quan hệ giữa thực vật

và vi khuẩn Năm 2015, Kathryn E Holt và cộng sự vào đã giải trình tự toàn

bộ hay một phần của 288 K pneumoniae ở nhiều nơi trên thế giới và so sánh

với các trình tự đã được công bố nhằm mục đích xác nhận mối liên hệ giữa các gen và mối liên quan đến khả năng gây bệnh ở người

1.1.5 Sự đề kháng kháng sinh carbapenem ở K pneumoniae

Klebsiella đã đề kháng với hầu hết các kháng sinh họ  -lactam do gen

mã hóa  -lactamase phổ rộng (ESBL) làm bất hoạt các kháng sinh này Carbapenem được khuyến cáo sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn

do các vi khuẩn kháng đa kháng sinh tiết ESBL, nhất là ở nhóm trực khuẩn

đường ruột gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae K pneumoniae đã phát

triển hoặc thu nhận gen mã hóa carbapenemase đề kháng carbapenem một cách nhanh chóng và đã lan truyền cho các vi khuẩn khác trên thế giới

Carbapenemase là enzym β-lactamase, được chia thành ba nhóm lớn: nhóm A, KPC là enzym quan trọng nhất về lâm sàng và dịch tể, các enzyme khác như SME (Serratia marcescens enzym), NMC-A/IMI (not metallo- enzym carbapenemase/imipenem-hydrolysing  -lactamase) và GES (Guiana extended spectrum) không gây ra những vấn đề lâm sàng lớn; Nhóm B gồm metallo-  -lactamase (MBLs), IMP (imipenemase), VIM (Verona integron encoded metallo-  -lactamase) và New Delhi Metallo-  -lactamase (NDM); Nhóm D gồm carbapenemase loại OXA thường được phát hiện ở

Acinetobacter spp và cũng được phát hiện trên các Enterobacteriaceae

1.2 Kháng sinh và kháng sinh họ  -lactam

1.2.1 Kháng sinh

Nhiều loại kháng sinh tự nhiên hay tổng hợp khác nhau có chung một

cơ chế và phổ kháng khuẩn nên được phân loại dựa trên cấu trúc hóa học và trên tác động kìm khuẩn (bacteriostatic) hay diệt khuẩn (bacteriocidal)

1.2.2 Kháng sinh họ  -lactam và các cơ chế đề kháng  -lactam

Kháng sinh  -lactam có cấu trúc chứa vòng  -lactam, khi liên kết với một cấu trúc khác sẽ hình thành nên các phân nhóm khác nhau như penicilin, cephalosporin có phổ kháng khuẩn rộng hơn, có hoạt tính ức chế tổng hợp peptidoglycan trên màng tế bào vi khuẩn, đích đến là phản ứng transpetidase trong liên kết chéo của quá trình tổng hợp peptidoglycan Do vậy, đây là kháng sinh đáp ứng tốt nhất nguyên tắc độc tính chọn lọc và là liệu pháp điều trị hữu hiệu được sử dụng nhiều nhất hiện nay

Sự đề kháng kháng sinh  -lactam ở Enterobacteriaceae chủ yếu do tiết enzym  -lactamase thủy phân vòng  -lactam làm mất hoạt tính của kháng sinh Các  -lactamase được phân loại dựa trên sự tương đồng của các axit amin và được chia thành bốn lớp phân tử là A, C và D gồm các  -lactamases

có serine ở vị trí hoạt hóa và nhóm B còn gọi là metallo-beta-lactamase (MBL), có kẽm ở vị trí hoạt hóa

1.3 Carbapenem và các cơ chế đề kháng carbapenem ở K pneumoniae

Carbapenem có nguồn gốc là một dẫn xuất của thienamycin, một hợp

chất tự nhiên do nấm Streptomyces catlaya tiết ra, có phổ kháng khuẩn rộng

nhất so với các  -lactam khác Carbapenem có cấu trúc gần giống với penicillin nhưng có nhiều ưu điểm hơn so với các kháng sinh  -lactam khác là: (i) phân tử nhỏ nên có khả năng sử dụng những lổ nhỏ trên màng ngoài tế bào vi khuẩn gram âm để tiếp xúc với PBP (penicillin binding protein); (ii) khó bị phân hủy bởi các  -lactamase của nhiều vi khuẩn và (iii) có ái lực với

nhiều PBP khác nhau của nhiều loại vi khuẩn Các cơ chế đề kháng

carbapenem chính ở K pneumoniae gồm:

- Cơ chế qua trung gian enzym ESBL hay carbapenemase và biểu hiện của một hay nhiều ESBL, sản xuất vượt mức AmpC  -lactamase kết hợp với giảm tính thấm màng ngoài do mất hoặc thay thế kênh porin làm chặn cổng vào của kháng sinh

- Cơ chế không enzym: bơm đẩy kháng sinh hay thay đổi ái lực đối với carbapenem làm cho kháng sinh này không tiếp cận được với chuỗi peptidoglycan đang được tổng hợp của vi khuẩn

Cơ chế quan trọng và được quan tâm nhiều nhất hiện nay là cơ chế kháng thông qua enzym carbapenemase được mã hóa bởi gen nằm trên

plamid gọi là Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) và New Dehli

Metalo-  -lactamase (NDM)

1.4 Tình hình nghiên cứu tính đề kháng carbapenem ở K pneumoniae 1.4.1 Tình hình đề kháng carbapenem ở K pneumoniae trên thế giới

Gen mã hóa KPC được phát hiện lần đầu tiên năm 2001 trên plasmid

của K pneumoniae đề kháng carbapenem, các cephalosporin phổ rộng và

aztreonam Sự phát triển tính kháng do KPC được phát hiện khi kháng sinh này được dùng để điều trị trên bệnh nhân đã mang các chủng đề kháng với ceftazidime và aminoglycoside (Muhamad Ahmad và cộng sự) và quá trình kháng carbapenem có thể kết hợp giữa sự mất đi porin và sự hiện diện của  - lactamase qua trung gian plasmid (Martinez) hay giảm điều hòa phosphate transport porin PhoE Gen mã hóa KPC hiện diện trên tranposon mới của

Tn3 là Tn4401 có kích thước 10 kb, mang một transposase và hai trình tự

chèn ISkpn6 và ISkpn7, có vai trò lan truyền gen này thông qua plasmid

Nhiều nghiên cứu môi trường chọn lọc để phát hiện vi khuẩn tiết carbapenemase, các phương pháp sinh học phân tử cũng đã được nghiên cứu

để phát hiện nhanh và phát hiện phân biệt các biến thể của gen mã hóa KPC cũng như chứng minh khả năng lan truyền gen đề kháng cho các vi khuẩn cùng hay khác loài gây nên nhiều vụ dịch bệnh trên thế giới

1.4.2 Tình hình nghiên cứu sự đề kháng kháng sinh carbapenem ở K

pneumoniae tại Việt Nam

Ở Việt Nam, carbapenem là một kháng sinh mới và chưa phổ biến nên

sự đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh này còn ít và hiện nay chưa có

nghiên cứu về sự đề kháng carbapenem ở K pneumoniae thông qua cơ chế

tiết enzym KPC Các dữ liệu công bố tại các bệnh viện về tình hình đề kháng

carbapenem của K pneumoniae chủ yếu dựa trên kết quả xét nghiệm kháng

sinh đồ hay nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) mà chưa nêu rõ được cơ chế của hiện tượng đề kháng Do vậy, việc nghiên cứu các đặc điểm sinh học phân tử

về kiểu hình, kiểu gen và biểu hiện của các gen mã hóa KPC hiện diện trên

plasmid ở một số chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem cũng như cơ chế gây nên sự lan truyền của tính kháng carbapenem của K pneumoniae

mang gen mã hóa KPC là cần thiết trong giai đoạn hiện nay

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

27 chủng K pneumoniae kháng carbapenem phân lập được từ tháng 6 –

2010 đến tháng 6 năm 2014

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Vi khuẩn K pneumoniae được phân lập và định danh vi khuẩn bằng bộ

định danh vi khuẩn IDS 14® GNR (Nam Khoa, Việt Nam, TCCL số 02951/2001/CBTC-TDC) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

- Xác định mức độ đề kháng đa kháng sinh của các chủng K

pneumoniae bằng kỹ thuật kháng sinh đồ với đĩa kháng sinh (Bio-Rad (Mỹ)

- Xác định mức độ đề kháng carbapenem bằng phương pháp khuếch tán kháng sinh và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với kháng sinh carbapenem

(imipenem, meropenem và ertapenem) theo tiêu chuẩn CLSI

- Phát hiện kiểu gen đề kháng carbapenem (gen mã hóa KPC và 1) bằng kỹ thuật Multiplex Real-time PCR theo khuyến nghị của CDC và kiểu gen đề kháng đa kháng sinh (ESBL và AmpC  -lactamase) của các

NDM-chủng bằng kỹ thuật Multiplex PCR

- Các chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem mang gen mã hóa

KPC được xác định kiểu hình sinh carbapenemase bằng kỹ thuật Modified Hodge Test (MHT); Sản phẩm khuếch đại gen mã hóa KPC được giải trình

tự và so sánh trên ngân hàng gen để xác định kiểu gen đề kháng

- Nghiên cứu khả năng lan truyền tính kháng carbapenem từ các chủng K

pneumoniae sang cho vi khuẩn E coli J53 bằng phương pháp tiếp hợp, xác

nhận kiểu hình, kiểu gen bằng kỹ thuật multiplex PCR, multiplex real-time

PCR và kiểm tra xác nhận protein KPC bằng kỹ thuật Western blot

- Phân tích biểu hiện hoạt tính KPC trong dịch đồng nhất sinh khối của hai chủng KP02 vả KP03 và; tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa KPC của hai chủng trên với promoter tự nhiên và promoter T7 Protein KPC được tinh sạch trên cột sắc ký ái lực và kiểm tra bằng kỹ thuật sắc ký kết hợp với khối

phổ (LC-MS), sau đó được dùng để gây đáp ứng miễn dịch trên chuột; kháng

huyết thanh kháng KPC được kiểm tra bằng phương pháp miễn dịch ELISA

và sử dụng để kiểm chứng sự hiện diện của KPC trên các chủng K

pneumoniae đề kháng carbapenem theo cơ chế KPC và các vi khuẩn khác

bằng kỹ thuật Western blot

KẾT QUẢ

3.1 Thu nhận, khảo sát mức độ kháng thuốc của các chủng K

pneumoniae đề kháng carbapenem

3.1.1 Thu nhận, xác nhận các chủng K pneumoniae kháng carbapenem

Từ tháng 06 năm 2010 đến tháng 06 năm 2014, đã thu nhận được 27

chủng K pneumoniae từ Bệnh viện Truyền máu Huyết học Trung ương và

Bệnh Viện Nguyễn Tri Phương TP.HCM đề kháng với kháng sinh carbapenem trong số 1,538 chủng nghi ngờ kháng (1,76%) Các chủng được

định danh là K pneumoniae, đủ điều kiện để thực hiện nghiên cứu

3.1.2 Mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng K pneumoniae

Kết quả kháng sinh đồ cho thấy 100% các chủng đã kháng với ampicillin và các kháng sinh khác thuộc nhóm  -lactam, 93% đến 100% chủng kháng với các kháng sinh khác nhau thuộc nhóm carbapenem, 90% kháng quinolone, gần 50% kháng aminoglycoside và 18,5% kháng colistin

Các chủng kháng với 9 - 14 loại kháng sinh thông dụng 1 chủng kháng

14 kháng sinh (chiếm 4% số chủng), 6 chủng kháng 13 kháng sinh (22%), 6 chủng kháng 12 kháng sinh (22%), 9 chủng kháng 11 kháng sinh (33%), 4 chủng kháng 10 kháng sinh (15%), và 1 chủng kháng 9 kháng sinh (4%)

Hình 3.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh ở các chủng K pneumoniae kháng

carbapenem

3.1.3 Mức độ đề kháng carbapenem của các chủng

Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC cho thấy 26/27 chủng

(96%) K pneumoniae phân lập được đã kháng với imipenem, 25/27 chủng

(92,5%) đã kháng với meropenem và 100% kháng với ertapenem

3.2 Nghiên cứu kiểu gen đề kháng carbapenem của các chủng K

pneumoniae

3.2.1 Kiểm tra sự hiện diện của gen mã hóa KPC và NDM-1 ở các chủng

Kết quả multiplex Real-time PCR cho thấy có 11 chủng dương tính với gen mã hóa KPC, 15 chủng còn lại dương tính với gen mã hóa NDM-1, 1 chủng âm tính với cả hai gen mã hóa trên Các chủng có KPC (+) đều có NDM-1 (-) và ngược lại

3.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của các gen mã hóa ESBL ở các chủng

Các enzym SHV, TEM, CTX-M và OXA là những  -lactamase phổ rộng phổ biến góp phần làm giảm nhạy cảm của kháng sinh carbapenem

trong điều trị ở K pneumoniae và vi khuẩn đường ruột khác Kết quả kiểm

tra sự hiện diện gen mã hóa ESBL ở các chủng được trình bày trên Bảng 3.3

Bảng 3.3 Số gen mã hóa ESBL ở các chủng K pneumoniae kháng

SHV, TEM và CTX-M1 hoặc CTX-M9)

3.2.3 Sự hiện diện gen mã hóa  -lactamase AmpC ở các chủng

Kết quả phân tích cho thấy có bốn loại  -lactamase AmpC ở các chủng

K pneumoniae kháng carbapenem được phát hiện là ACC, DHA, ACT1 và

CMY ở 10 trong số 27 chủng nghiên cứu, chiếm tỷ lệ 37%

3.3 Đặc điểm kháng carbapenem do KPC ở K pneumoniae đề kháng

chuẩn K pneumoniae ATTC® BAA-1705 (chủng có carbapenemase dương tính) và 1706 (chủng có carbapenemase âm tính)

3.3.2 Giải trình tự xác định gen mã hóa KPC

Gen mã hóa KPC của các chủng có kiểu hình KPC (+) và MHT (+) được nhân bản, thu nhận bằng phản ứng PCR trên khuôn là DNA của các