Điều trị thực nghiệm bệnh tim thiếu máu cục bộ bằng liệu pháp tế bào gốc trên chuột

Phương pháp trị liệu cấy ghép tế bào gốc trên các bệnh nhân bệnh tim thiếu máu cục bộ nhằm cải thiện sức khoẻ đang được nhiều quốc gia trên thế giới như Mỹ, Pháp, Áo, Đức, Hàn Quốc, Trun

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Công trình được hoàn thành tại:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

(ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM)

Địa chỉ: 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, TP HCM

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS PHẠM THÀNH HỔ

Phản biện 1: PGS.TS Trương Quang Bình

Phản biện 2: GS.TS Nguyễn Văn Thuận

Phản biện 3: PGS.TS Lê Văn Đông

Phản biện độc lập 1: TS.BS Hoàng Văn Sỹ

Phản biện độc lập 2: TS Nguyễn Lê Xuân Trường

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM

Vào lúc ………giờ…… ngày……tháng…….năm……

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

-   Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM

-   Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

1   Tính cần thiết của đề tài

Từ thuở ban sơ đến nay, loài người đã tiến hành cuộc chiến không ngừng nghỉ chống lại các bệnh tật để kéo dài tuổi thọ của mình Mặc dù sự bùng nổ của hàng loạt công nghệ hiện đại làm cho đời sống văn minh nhân loại thay đổi hằng ngày, nhưng con người vẫn đang phải đối mặt với một thách thức then chốt lớn là suy giảm chất lượng sức khỏe và bệnh tật đe dọa mạng sống Trong các bệnh nguy hiểm gây chết người, bệnh tim mạch hiện được xếp ở

vị trí hàng đầu, cao hơn cả bệnh ung thư và AIDS Theo Tổ chức Y tế Thế giới, mỗi năm có khoảng 17,5 triệu người trên hành tinh chết vì bệnh tim mạch, con số này được dự đoán sẽ tăng lên 25 triệu vào năm 2020 Tại Việt Nam, theo thống kê của Viện Tim mạch Việt Nam, hàng năm có đến hàng triệu người bị bệnh mạch vành và khoảng 10% trong số bệnh nhân này tử vong do nhồi máu cơ tim

Bệnh tim mạch, đặc biệt là bệnh tim thiếu máu cục bộ là một loại bệnh tim thường gặp nhất (chiếm tỉ lệ 42,3%) Nguyên nhân chính do động mạch vành xơ vữa làm giảm lưu lượng máu đến nuôi cơ tim, về lâu dài dẫn đến suy tim Do lượng máu giảm nên tế bào bị thiếu oxy và dinh dưỡng, nếu tình trạng kéo dài một phần tế bào sẽ bị chết Các biện pháp điều trị thường quy

đã được sử dụng như điều chỉnh lối sống, dùng thuốc, can thiệp động mạch vành qua da hay mổ bắc cầu nối động mạch vành Tuy nhiên, cho đến nay, y học vẫn chưa có biện pháp giúp hồi phục phần tế bào chết và đây là vấn đề

mà các nhà y học tái tạo hiện đang rất quan tâm

Phương pháp trị liệu cấy ghép tế bào gốc trên các bệnh nhân bệnh tim thiếu máu cục bộ nhằm cải thiện sức khoẻ đang được nhiều quốc gia trên thế giới như Mỹ, Pháp, Áo, Đức, Hàn Quốc, Trung Quốc… tiến hành nghiên cứu Những kết quả ban đầu cho thấy nhiều triển vọng của phương pháp này trong chữa bệnh tim do thiếu máu cục bộ Lần đầu tiên ở Việt Nam, trường Đại học Y Hà Nội phối hợp cùng Viện Tim mạch Quốc gia Việt Nam đã tiến

hành nghiên cứu và triển khai ứng dụng điều trị cấy ghép tế bào gốc để điều trị cho các bệnh nhân suy tim sau nhồi máu

Để việc điều trị bằng tế bào gốc được tiến hành có hệ thống và căn cơ, các nghiên cứu cần phải tiến hành từ bước cơ bản trên mô hình chuột Do đó,

đề tài “Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh tim thiếu máu cục bộ bằng

liệu pháp tế bào gốc trên chuột” được đặt ra

2   Mục đích nghiên cứu

Thử nghiệm ghép tế bào gốc trên mô hình chuột tổn thương cơ tim do thiếu máu cục bộ nhằm bước đầu đánh giá độ an toàn và hiệu quả của liệu pháp làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 1 Bệnh tim thiếu máu cục bộ

Bệnh tim thiếu máu cục bộ là trạng thái bệnh lý tim không được cung cấp đủ oxy và chất dinh dưỡng so với nhu cầu bình thường dẫn đến tổn thương cơ tim làm giảm hoạt động co bóp của tim, loạn nhịp tim và có thể

dẫn đến tử vong

1 2 Mô hình chuột tổn thương cơ tim do thiếu máu cục bộ

Để hiểu sâu về cơ chế sinh bệnh và phát triển những liệu pháp hiệu quả trong chữa trị, các mô hình động vật thiếu máu tim cục bộ được nghiên cứu Phần lớn mô hình thiếu máu tim cục bộ có thể được tạo dựa trên các nguyên tắc: gây tắc hoàn toàn hoặc gây hẹp một phần động mạch vành bằng các quy trình phẫu thuật hoặc bằng thuốc can thiệp, mô phỏng tiến trình bệnh

ở người bằng cách cảm ứng xơ vữa động mạch Cho đến nay một số các phương pháp tạo mô hình chuột bệnh tim mạch đã được nghiên cứu như sử dụng hóa chất gây suy tim, đóng dòng chảy hoặc co khít mạch máu và thắt mạch vành

1.3 Nguồn tế bào gốc/ tế bào tiền thân được thử nghiệm biệt hoá thành

tế bào cơ tim

Hiện nay đã có một số nguồn tế bào gốc được thử nghiệm biệt hóa thành tế bào cơ tim như tế bào gốc trung mô thu từ tủy xương, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ, tế bào gốc thu từ dịch màng ối, tế bào gốc phôi (ESCs) hay tế bào cảm ứng đa tiềm năng (iPSCs) Tế bào gốc có nguồn gốc từ máu cuống rốn (UCB-MSCs) với các đặc tính như trẻ, khỏe, dễ thu nhận, và có khả năng điều biến miễn dịch được cho là nguồn tế bào tiềm năng để biệt hóa thành tế bào cơ tim hướng đến ứng dụng điều trị các bệnh tim mạch

1.4 Tình hình nghiên cứu liệu pháp tế bào trong chữa trị bệnh tim thiếu máu cục bộ trên thế giới

Đã hơn 20 năm kể từ ngày công trình đầu tiên về cấy ghép tế bào điều trị tổn thương tim được công bố, đến nay liệu pháp tế bào trong điều trị bệnh tim đã có những bước tiến đáng kể Đầu tiên các công trình tập trung vào việc sử dụng tế bào cơ xương và tế bào vệ tinh của nó vì khả năng thu nhận từ nguồn tự thân cao, khả năng tăng sinh mạnh và khả năng chịu được thiếu máu cục bộ tốt Tuy nhiên, nguồn tế bào này sau đó được chứng minh

là không chuyển biệt hóa thành tế bào cơ tim và khả năng kết nối với tế bào

cơ tim trong cơ thể chủ sau khi cấy ghép rất thấp Các nghiên cứu sau đó tiếp tục tìm kiếm nguồn tế bào thích hợp và tế bào gốc trung mô tủy xương là một trong số đó ESCs có thể biệt hóa thành các loại tế bào trưởng thành và đã được chứng minh là có khả năng tái tạo tế bào mô tim trên các mô hình động vật Tuy nhiên, vấn đề đạo đức sinh học, pháp lý và miễn dịch đã cản trở việc

sử dụng chúng trong các thử nghiệm trên người ESCs được thay thế bằng các tế bào gốc đa tiềm năng cảm ứng tái lập trình từ tế bào soma hay các tế bào cơ tim được cảm ứng Hiện nay, các tế bào cơ tim có nguồn gốc từ tế bào gốc trưởng thành, bao gồm cả tế bào đơn nhân từ tủy xương, các tế bào gốc trung mô, tế bào gốc mô mỡ, và các tế bào gốc có nguồn gốc từ tim đang được ưu tiên thử nghiệm và đánh giá lâm sàng

Kết quả thử nghiệm lâm sàng gần đây ủng hộ quan điểm cho rằng liệu pháp tế bào gốc là an toàn và có khả năng sửa chữa các cấu trúc tim cũng

như giúp phục hồi các chức năng tim Các thử nghiệm lâm sàng sử dụng tế bào gốc đồng loại cũng đang rất được quan tâm Emerson C Perin 2015 đã công bố kết quả thử nghiệm ghép tế bào MSCs đồng loại ở 45 bệnh nhân suy tim mãn do thiếu máu hay không do thiếu máu Kết quả cho thấy không có triệu chứng đáp ứng miễn dịch lâm sàng xảy ra, cấu trúc và chức năng tim được cải thiện sau 3 năm cấy ghép Piotr Musialek 2015 ghép tế bào MSCs đồng loại từ màng Wharton’s Jelly cho 10 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp tính Kết quả cho thấy các bệnh nhân này không có dấu hiệu thiếu máu tim khi đo ECG, không có tình trạng tim bị suy, lượng Troponin giảm sau 24 giờ ghép, không có sự kiện bất lợi khác, có xảy ra loạn nhịp tim nhưng không đáng kể

1.5 Tình hình nghiên cứu liệu pháp tế bào trong chữa trị bệnh tim thiếu máu cục bộ ở việt nam

Riêng ở Việt Nam, từ năm 2010 đến nay, Phòng thí nghiệm Tế bào gốc, Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM đã và đang triển khai hướng nghiên cứu về sử dụng liệu pháp tế bào trong điều trị bệnh tim mạch Năm

2008, đề tài cấp nhà nước về Ghép tế bào gốc tự thân điều trị suy tim do GS

TS Nguyễn Lân Việt chủ nhiệm đã sử dụng tế bào gốc tự thân tủy xương để ghép cho 6 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp Cho đến nay, đã có 40 bệnh nhân thử nghiệm phương pháp này với tỉ lệ an toàn, không biến chứng đạt 100%

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chuột nhắt trắng Mus musculus Var Albino sạch bệnh, giống đực, 12 tuần tuổi được mua từ Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu dọc có can thiệp và nhóm chứng

- Phương pháp tạo mô hình chuột thiếu máu tim cục bộ: chuột được gây mê,

đặt nội khí quản trước khi sử dụng chỉ Prolene 7-0 để thắt động mạch vành trước trái ở vị trí 1/3 từ cuống tim nhằm gây tắc nghẽn mạch vành, dẫn đến tình trạng thiếu máu tim cục bộ

- Phương pháp thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người: Tế

bào đơn nhân được huyền phù trong 3 môi trường khảo sát:

(1)-MT1 (M199 + 20% FBS, 1% antibiotic-mycobiotic, 0,4% ECGF/heparin

và 12 µg/ml BBE, 10 ng/ml hEGF, 5 ng/ml bFGF, 5 ng/ml VEGF, 5 ng/ml hIGF); (2)-MT2 (MCDB131 + 20% FBS, 1% antibiotic-mycobiotic, 0,4% ECGF/heparin và 12 µg/ml BBE, 10 ng/ml hEGF, 5 ng/ml bFGF, 5 ng/ml VEGF, 5 ng/ml hIGF); (3)-MT3 (EGM + SingleQuots: 12 µg/ml BBE, 10 ng/ml hEGF, 1 µg/ml hydrocortison và antibiotics, 5% FBS (Sigma) + 50 ng/ml VEGF, 50 ng/ml hIGF, 50 ng/ml hEGF)

với 2 phương pháp:

(1)-PP1 (Thay mới môi trường sau 72 giờ nuôi cấy tế bào)

(2)-PP2 (Chuyển dịch nổi tế bào sau 24 giờ nuôi cấy)

Tế bào tiền thân nội mô ứng viên được đánh giá dựa vào hình thái, sự bám dính và tăng sinh trong thời gian khảo sát 7, 14, 21 và 28 ngày

Bảng 2.1 Tóm tắt cách bố trí các nghiệm thức thí nghiệm STT Tên nghiệm thức Cách bố trí thí nghiệm

- Phương pháp biệt hoá tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người

(hUCB-MSCs) thành tế bào tiền thân cơ tim (CPs): hUBC-MSCs nuôi trong môi

trường DMEM bổ sung 15% FBS và 1% Penicillin/Streptomycin được dùng

làm mẫu đối chứng Xử lí với 5-AZC: Các tế bào được cảm ứng trong môi

trường DMEM bổ sung 10% FBS; 1% Penicillin/Streptomycin; 10 µM azacytidine; 50 ng/ml activin A; 0,1mM acid ascorbic trong 24 giờ Sau đó, các tế bào được rửa qua PBS 2 lần và nuôi trong môi trường DMEM bổ sung 15% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin; bổ sung 50 ng/ml activin A; 0,1mM

acid ascorbic không có AZC để tránh gây chết tế bào do phơi nhiễm với AZC trong một thời gian dài Môi trường được thay mỗi 3 ngày cho đến khi

5-thí nghiệm kết thúc sau 36 ngày Xử lí 5-AZC + HE: các tế bào được cảm

ứng tương tự như phương pháp biệt hóa bằng 5-AZC thông thường nhưng lượng 5-AZC được giảm còn 5µM và môi trường biệt hóa được bổ sung thêm

36 µg/ml dịch chiết tim thai chuột E.18.5

- Phương pháp ghép tế bào: chuột được chia làm 5 nhóm Nhóm chuột bình

thường, nhóm chuột mô hình được tiêm giả dược, nhóm chuột mô hình được ghép EPCs, nhóm chuột mô hình được ghép CPs, và nhóm chuột mô hình được ghép EPCs + CPs Chuột được gây mê, trợ thở, mở lồng ngực, thắt LAD và tiến hành tiêm tế bào hay giả dược Sử dụng thiết bị vi tiêm Ugobasile, số lượng tế bào được tiêm là 106 tế bào/30µl/con Thể tích tiêm

là 30µl/con được chia làm 5 lần tiêm xung quanh vị trí nhồi máu (sau khi thắt mạch vành từ 3-5 phút có thể dễ dàng quan sát vùng tim thiếu máu bị tái đi

so với vùng tim xung quanh) Tốc độ tiêm tế bào là 8,55ml/h Hiệu quả ghép được đánh giá theo các tiêu chí như sự biến động huyết áp chuột, mức độ tổn thương cơ tim qua lượng protein Troponin I trong máu, sự tồn tại, di cư và biến đổi của các tế bào ghép ảnh hưởng đến mô tim được ghép

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả nghiên cứu tạo mô hình chuột tổn thương cơ tim do thiếu máu cục bộ

3.1.1 Tỷ lệ sống

Ở lô đối chứng, chuột không được thực hiện bất cứ thao tác thí nghiệm nào đều sống và hoạt động sinh lý bình thường Tỉ lệ sống được ghi nhận 100% (n=10) Trong tổng số chuột sống sót qua quá trình giải phẫu thắt LAD (n=22), có 2 con chuột chết ngày N3 và N4, 3 con chuột yếu dần và chết ngày N7 Tỷ lệ sống ngay sau thắt mạch vành: 17/22 (77%) Tỷ lệ sống sau khi thắt mạch vành 6 tuần: 17/17 (100%)

3.1.2 Sự thay đổi trọng lượng

Trọng lượng tăng ở nhóm đối chứng và nhóm giả dược trong khi giảm theo thời gian ở nhóm thí nghiệm (hình 3.1)

3.1.3 Sự thay đổi huyết áp

Huyết áp ổn định ở nhóm đối chứng và nhóm giả dược trong khi giảm theo

thời gian ở nhóm thí nghiệm (hình 3.2)

3.1.4 Kết quả nhuộm H&E

3.1.5 Sự hình thành mô sẹo và collagen vùng nhồi máu

Mô sẹo và collagen được hình thành ở mô tim chuột mô hình (Hình 3.6)

Hình 3.3 Hình tim sau khi thắt mạch vành 42 ngày PBS được tiêm

vào tâm thất trái để rửa máu (A) và sau khi rửa máu (B)

Hình 3 2 Biểu đồ sự thay đổi huyết áp chuột (p<0,05)

Hình 3.1 Biểu đồ sự thay đổi

trọng lượng chuột (p<0,05)

Hình 3 4 Mô tim chuột mô hình được cắt lát theo chiều ngang tại vị trí thắt Thành tâm thất trong vùng

nhồi máu (bên phải và phía trên hình ảnh) là mỏng hơn so với thành tâm thất vùng đối diện (bên phải và bên dưới hình ảnh)

3.1.6 Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang

Thành tim chuột mô hình ở vùng thiếu máu do mạch vành bị thắt mỏng hơn rất nhiều so với thành tim chuột đối chứng (82,3%)

Hình 4 10 K ế t qu ả nhu ộ m Trichrome m ẫ u lát c ắ t tim chu ộ t A) Tim chu ( ộ t ĐC ; (B) Tim

chu ộ t mô hình ngày N70; (C) Ph ầ n mô tim kh ỏ e m ạ nh ( 40X ) ; (D) Ph ầ n mô tim đư ợ c xác

đ ị nh nh ồ i máu (40X) ; (E) Thành tim chu ộ t ngày N21 (10X) ; (F) Thành tim chu ộ t ngày N70

T ế bào ch ấ t đư ợ c nhu ộ m đ ỏ , nhân đư ợ c nhu ộ m xanh đen, Collagen đư ợ c nhu ộ m xanh nh ạ t

( B ) ( A )

chuột đối chứng (10x); (B) chuột mô hình 6 tuần sau khi thắt LAD (10x); (C), (D), (E), (F) Chuột mô hình 1 tuần, 3 tuần, 6 tuần và 10 tuần, tương ứng sau khi phẫu thuật (40x); Các đầu mũi tên màu đen cho thấy các tế bào viêm, đầu mũi tên màu xanh cho thấy

các nguyên bào sợi

Hình 3 6 Kết quả nhuộm Trichrome mẫu lát cắt tim chuột

(A) Tim chuột đối chứng; (B) Tim chuột mô hình ngày N70; (C) Phần

mô tim khỏe mạnh (40X); (D) Phần

mô tim được xác định nhồi máu (40X); (E) Thành tim chuột ngày N21(10X); (F) Thành tim chuột

ngày N70 Collagen bắt màu xanh

Hình 3 7 So sánh thành tim chuột đối chứng (A)

và chuột mô hình sau 42 ngày thắt mạch vành (B)

Số tế bào chết khi xét trên tổng diện tích thành tim ở chuột mô hình là rất lớn

so với chuột đối chứng (37,86% so với 0,86%)

BÀN LUẬN

Chuột tắc nghẽn LAD đã được chứng minh là mô hình lý tưởng cho nghiên cứu tình trạng thiếu máu cơ tim cục bộ Theo một số nghiên cứu, việc thắt LAD ở chuột thường hình thành vùng nhồi máu nhỏ (21% tâm thất) dẫn đến sự bất thường trong huyết động học Trong nghiên cứu này, sự thay đổi huyết động ở các con vật mô hình biểu hiện khá rõ Việc giảm huyết áp trung bình MAP ở các con vật thuộc lô chuột bị thắt LAD có thể giải thích do mạch vành bị thắt hẹp gây thiếu máu cấp cho tim dẫn đến thiếu oxy làm xuất hiện các sản phẩm chuyển hóa yếm khí (acid) và các chất khác (histamine, kinins…) ở nồng độ cao đầu độc tế bào tim, gây chết tế bào ở vùng thiếu máu Sự kết hợp đồng thời giữa suy giảm khả năng bơm máu và suy yếu cơ tim sẽ dẫn đến sụt giảm huyết áp ở giai đoạn tim suy Kết quả đánh giá cấu trúc mô cho thấy: dù không có biểu hiện sinh lý rõ rệt nhưng những con chuột sống sót đến ngày 42 đều có thành tim rất mỏng Hình ảnh nhuộm H&E cho thấy tình trạng viêm cơ tim bắt đầu biểu hiện vào ngày N7 và tăng cao ở ngày N21 Sự xơ hoá được ghi nhận từ kết quả nhuộm trichrome mẫu tim chuột

mô hình của nghiên cứu này tương tự như các nghiên cứu của Shigeto Kanno

và cs Hiện tượng cơ tim bị hoại tử cũng được quan sát thấy qua kết quả nhuộm hoá mô miễn dịch huỳnh quang Từ các kết quả ghi nhận được chúng tôi đã tạo được mô hình chuột nhắt trắng tổn thương cơ tim bằng phương pháp thắt LAD phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

Hình 3 8 Mô tim chuột được nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang

3.2 Kết quả nghiên cứu thiết lập quy trình thu nhận tế bào tiền thân nội

mô máu cuống rốn người

3.2.1 Khảo sát nuôi cấy tế bào tiền thân nội mô ứng viên

Nhằm tìm được môi trường và phương pháp thu nhận, nuôi cấy EPCs thích hợp, thí nghiệm được bố trí thành 6 nghiệm thức như Bảng 2.1 Nghiệm thức F cho kết quả tốt nhất so với các nghiệm thức còn lại (hình 3.9, 3.10)

3.2.2 Nuôi cấy tăng sinh tế bào tiền thân nội mô ứng viên

Quần thể tế bào tiền thân nội mô ứng viên trong nghiệm thức F được

sử dụng để nuôi cấy tăng sinh, phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo Tốc độ tăng sinh của tế bào ứng viên trong nuôi cấy thứ cấp là tương đối giống nhau giữa các lần cấy chuyền và nhanh hơn so với quá trình nuôi cấy sơ cấp (sau

6 – 12 giờ cấy chuyền, tế bào đã bám lại), đồng thời, tốc độ tăng trưởng của

tế bào cũng nhanh hơn (có thể cấy chuyền lần tiếp theo sau 5 – 7 ngày)

3.2.3 Xác định đặc tính tế bào tiền thân nội mô

Hình 3 9 Biểu đồ trung bình

số tế bào bám dính qua thời

gian khảo sát ở 6 nghiệm thức

Hình 3 10 Biểu đồ so sánh trung bình tế bào bám dính ở 6 nghiệm thức

Theo kết quả nghiên cứu tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 3 lần cấy chuyền biểu hiện âm tính với 2 marker CD45 (3,09%) và CD73 (6,47%),

âm tính hoàn toàn với 2 marker CD14 (1,06%) và CD90 (0,58%), đồng thời biểu hiện dương tính với 3 marker CD34 (83,13%), CD44 (87,03%) và CD133 (90,01%) Kết quả phân tích tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 5 lần cấy chuyền (bảng 3.4) cho thấy rằng, tế bào vẫn âm tính với 4 marker CD14 (2,20%), CD45 (0,25%), CD73 (2,17%) và CD90 (3,00%) và đồng thời tăng biểu hiện dương tính mạnh với 3 marker CD34 (97,66%), CD44 (97,89%) và CD133 (99,90%)

BÀN LUẬN

Ở nghiệm thức F, mặc dù số tế bào bám dính là không nhiều ở thời điểm 7 ngày nhưng qua 3 thời điểm khảo sát, số lượng tế bào đã tăng lên đáng kể Điều này cho thấy môi trường nuôi cấy ở nghiệm thức F đã giúp tế bào cảm ứng và thích nghi để tăng sinh tốt Đồng thời, phương pháp chuyển dịch nổi tế bào sau 24 giờ nuôi cấy là phù hợp với thời điểm bám dính của tế bào tiền thân nội mô nên số tế bào bám dính ban đầu có thể được xem là các

tế bào nội mô ứng viên Thêm vào đó, kết quả về hình ảnh cũng ủng hộ cho quan điểm này khi các tế bào ở nghiệm thức này có dạng hình viên sỏi nhỏ, khá đồng nhất và có biểu hiện của sự tăng sinh của các tế bào khi quan sát dưới kính hiển vi Kết quả phân tích dòng chảy tế bào cho thấy sau 5 lần cấy chuyền, sự biểu hiện các marker dương tính ở dòng tế bào này rất mạnh (cả

3 marker CD34, CD44 và CD133 đều trên 95%), đồng thời, 4 marker âm tính biểu hiện yếu (dưới 5%) và đặc biệt là CD45 (0,25%) Điều này chứng tỏ tính đồng nhất trong quần thể tế bào tiền thân nội mô là rất cao vì sau các lần cấy chuyền, quần thể các tế bào tạp nhiễm đã bị loại bỏ, đồng thời quần thể

tế bào tiền thân nội mô tăng sinh và biểu hiện mạnh các marker của chúng

3.3 Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành các tế bào tiền thân cơ tim

3.3.1 Đặc tính của các tế bào hUCB-MSCs