Nghiên cứu thu hồi protein và chitin từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng hệ enzyme nội tại

Trong đó, hầu hết các quy trình sản xuất chitin đang sử dụng là các quy trình hóa học, chỉ tập trung thu hồi chitin mà không thu hồi các thành phần khác có giá trị như protein và astaxan

NGUYỄN THỊ THANH HƯNG

NGHIÊN CỨU THU HỒI PROTEIN VÀ CHITIN

TỪ ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG BẰNG HỆ ENZYME NỘI TẠI

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH : CHẾ BIẾN THỦY SẢN

GVHD : ThS NGÔ THỊ HOÀI DƯƠNG

Nha Trang, tháng 07 năm 2013

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

o0o

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, em đã nhận được sự giúp từ nhiều cá nhân, tổ chức và gia đình Qua đây em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Cô giáo Ngô Thị Hoài Dương, người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và

hỗ trợ trong suốt thời gian thực hiện đề tài này

Quý thầy cô giáo và đặc biệt quý thầy cô trong khoa Chế Biến trường Đại Học Nha Trang đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian học tập tại trường

Ban giám đốc và các anh chị quản lí phòng thí nghiệm viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, trường Đại Học Nha Trang đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để chúng em thực hiện đề tài

Cảm ơn quý bạn bè đã giúp đỡ trong suốt thời gian cùng thực hiện đề tài tốt nghiệp

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ba mẹ, gia đình đã động viên tinh thần cũng như vật chất lớn nhất, giúp con vượt qua khó khăn trong suốt bốn năm ngồi trên ghế giảng đường và trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn!

Nha trang, tháng 7 năm 2013 Sinh viên

Nguyễn Thị Thanh Hưng

MỤC LỤC

Trang

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 NGUỒN NGUYÊN LIỆU CÒN LẠI TRONG CHẾ BIẾN TÔM VÀ CÁC HƯỚNG TẬN DỤNG 3

1.1.1 Nguồn nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm 3

1.1.2 Thành phần, tính chất của nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm 4

1.1.3 Các hướng khai thác sử dụng nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm 5

1.1.3.1 Thu hồi chitin 5

1.1.3.2 Thu hồi dịch thủy phân 7

1.1.3.3 Thu hồi protease 9

1.1.3.1 Thu hồi các hợp chất sinh học khác .10

1.2 ENZYME NỘI TẠI VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU CÒN LẠI 12

1.2.1 Protease của tôm 12

1.2.2 Tính chất của hệ enzym nội tại trong nguyên liệu tôm còn lại 13

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng hoạt động của enzyme nội tại 15

1.2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 15

1.2.3.2 Ảnh hưởng của pH: 15

1.2.3.3 Ảnh hưởng của thời gian: 15

1.2.3.4 Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc: 16

1.2.3.5 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: 16

1.2.3.6 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: 16

1.2.3.6 Độ tươi của nguyên liệu 16

1.2.3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào hỗn hợp thủy phân 17

1.2.3.8 Ảnh hưởng của chất kìm hãm 17

1.2.3.9 Ảnh hưởng của chất kích hoạt, chất hoạt hóa 17

1.3 TÍNH CHẤT CỦA DỊCH THỦY PHÂN PROTEIN 18

1.3.1 Quá trình thủy phân Protein 18

1.3.2 Khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm 21

2.1.2 Hóa chất nghiên cứu 22

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 22

2.3.1 Phương pháp thu nhận mẫu 22

2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 22

2.3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 22

2.3.3 Phương pháp phân tích và xác định các chỉ tiêu .27

2.3.3.1 Xác định hàm ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105oC theo TCVN 3700 - 1990 27

2.3.3.2 Xác định hàm lượng protein còn lại trên bã: 27

Hàm lượng protein còn lại trên chitin và hàm lượng protein hòa tan trong dịch được xác định dựa vào phương pháp được giới thiệu bởi Gornall AG và cộng sự 27

2.3.3.3 Xác định hiệu quả khử protein 29

2.3.3.4 Hiệu suất thu hồi protein 30

2.3.3.5 Xác định hàm lượng nitơ bazơ bay hơi tổng số 30

2.3.3.6 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân từ đầu tôm .31

2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu 33

2.3.5 Thiết bị 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ TỚI HIỆU QUẢ KHỬ PROTEIN CỦA ENZYME NỘI TẠI 34

3.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu quả khử protein .34

3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu quả khử protein 36

3.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/nước tới hiệu quả khử protein 38

3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ TỚI CHẤT LƯỢNG DỊCH THỦY PHÂN CỦA ENZYME NỘI TẠI 44

3.2.1 Ảnh hưởng của các yếu tối tới lượng protein hòa tan của dịch 44

3.2.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới lượng protein hòa tan của dịch 44

3.2.1.2 Ảnh hưởng của thời gian tới lượng protein hòa tan của dịch 46

3.2.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/nước tới lượng protein hòa tan của dịch 48

3.2.2 Ảnh hưởng của các yếu tối tới lượng bazo nito bay hơi của dịch 54

3.2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới lượng bazo nito bay hơi của dịch .54

3.2.2.2 Ảnh hưởng của thời gian tới lượng bazơ nitơ bay hơi của dịch 56

3.2.2.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/nước tới lượng bazơ nitơ bay hơi của dịch 58

3.2.3 Khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein 64

3.2.3.1 Khả năng khử gốc tự do DPPH .64

3.2.3.2 Tổng năng lực khử .66

3.2.4 Ảnh hưởng của các yếu tối tới hiệu suất thu hồi protein 69

3.24.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất thu hồi protein 69

3.2.4.2 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới hiệu suất thu hồi protein .71

3.2.4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/nước tới hiệu suất thu hồi protein .73

3.3 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THU HỒI 79

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO 82

PHỤ LỤC 86

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Tỷ lệ nguyên liệu còn lại của các loại tôm 3 Bảng 1.2 Thành phần hóa học cơ bản của vỏ tôm thẻ chân trắng 4 Bảng 3.1 Kết quả đánh giá mức độ ảnh hưởng của các nhân tố khảo sát đến hiệu quả khử protein (thông qua % contribution đóng góp) .40 Bảng 3.2 Kết quả đánh giá mức độ ảnh hưởng của các nhân tố khảo sát đến lượng protein hòa tan qua % contribution đóng góp .49 Bảng 3.3 Kết quả đánh giá mức độ ảnh hưởng của các nhân tố khảo sát đến lượng bazơ nitơ bay hơi dựa vào % contribution đóng góp .59 Bảng 3.4 Kết quả đánh giá mức độ ảnh hưởng của các nhân tố khảo sát đến hiệu suất thu hồi protein thông qua % contribution đóng góp 74

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân protein 18

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tới hiệu quả khử và chất lượng dịch protein thủy phân 26

Hình 2.3 Công thức của phức biure 28

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu quả khử protein trên vỏ đầu 35

Hình 3.2 Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu quả khử protein trên vỏ đầu 37

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/nước tới hiệu quả khử protein .39

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nhiệt độ, thời gian đến hiệu quả khử protein .41

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nhiệt độ, tỷ lệ nguyên liệu/nước đến hiệu quả khử protein 42

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới lượng protein hòa tan của dịch ở các tỷ lệ nguyên liệu/nước khác nhau: 45

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian tới lượng protein hòa tan của dịch ở các tỷ lệ nguyên liệu/nước khác nhau: 47

Hình 3.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/nước tới lượng protein hòa tan của dịch ở nhiệt độ khác nhau: 48

Hình 3.9 Đồ thị đánh giá tương tác hai yếu tố nhiệt độ, thời gian đến lượng protein hòa tan trong dịch .51

Hình 3.10 Đồ thị đánh giá tương tác giữa hai yếu tố nhiệt độ, tỷ lệ nguyên liệu/nước đến lượng protein hòa tan trong dịch 52

Hình 3.11 Đồ thị đánh giá tương tác giữa hai yếu tố thời gian, tỷ lệ nguyên liệu/nước đến lượng protein hòa tan trong dịch 53

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới lượng bazơ nitơ bay hơi của dịch ở các tỷ lệ nguyên liệu/nước khác nhau: 55

Hình 3.13 Ảnh hưởng của thời gian tới lượng bazơ nitơ bay hơi của dịch ở các tỷ lệ nguyên liệu/nước khác nhau: 57

Hình 3.14 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/nước tới lượng bazơ nitơ bay hơi của dịch ở nhiệt độ khác nhau: 58 Hình 3.15 Đồ thị đánh giá ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nhiệt độ, thời gian đến lượng bazơ nitơ trong dịch .61 Hình 3.16 Đồ thị đánh gía ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nhiệt độ, tỷ lệ nguyên liệu/nước đến lượng bazơ nitơ bay hơi trong dịch .62 Hình 3.17 Đồ thị đánh giá ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố thời gian, tỷ lệ nguyên liệu/nước đến lượng bazơ nitơ bay hơi trong dịch .63 Hình 3.18 Đồ thị đánh giá khả năng khử gốc tự do DPPH ở các tỷ lệ nguyên liệu/nước khác nhau: 65 Hình 3.19 Đồ thị đánh giá tổng năng lực khử của dịch thủy phân ở các tỷ lệ nguyên liệu/nước khác nhau 67 Hình 3.20 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất thu hồi protein 70 Hình 3.21 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới hiệu suất thu hồi protein 72 Hình 3.22 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/nước tới hiệu suất thu hồi protein ở nhiệt

độ khác nhau: 74 Hình 3.23 Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa thời gian và nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu hồi protein 76 Hình 3.24 Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa thời gian và nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan .77 Hình 3.25 Sơ đồ quy trình thu hồi protein dịch thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa.79

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ở Việt Nam số lượng đầu, vỏ tôm còn lại sau quá trình chế biến tôm đông lạnh xuất khẩu khá lớn, ước tính trên 100 ngàn tấn/năm [21] Nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm có rất nhiều thành phần có giá trị như chitin, protein, astaxanthin, khoáng hữu cơ Tuy nhiên, hiện nay lượng nguyên liệu còn lại này chủ yếu được sử dụng

để làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất chitin Trong đó, hầu hết các quy trình sản xuất chitin đang sử dụng là các quy trình hóa học, chỉ tập trung thu hồi chitin mà không thu hồi các thành phần khác có giá trị như protein và astaxanthin do chất lượng của protein và astaxanthin thấp vì chịu ảnh hưởng của các hóa chất xử lí, việc này không những gây thất thoát, lãng phí nguồn tài nguyên mà còn dẫn đến ô nhiễm môi trường xung quanh các cơ sở chế biến phế liệu tôm [6]

Để khắc phục các vấn đề tồn tại trên nhiều công trình nghiên cứu sử dụng enzyme trong sản xuất chitin đã được thực hiện tuy nhiên các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc bổ sung protease thương mại mà chưa tập trung vào hướng tận dụng nguồn enzyme nội tại có sẵn trong đầu tôm

Thêm vào đó, protein trên đầu tôm chiếm một tỷ lệ đáng kể và được chứng minh là có giá trị dinh dưỡng cao vì vậy rất cần được khai thác như một sản phẩm chính bên cạnh chitin

Vì vậy vấn đề đặt ra là tận dụng nguồn enzyme nội tại để thu hồi các sản phẩm

lại trong quá trình sản xuất tôm tại Việt Nam

2 Mục đích của đề tài

Xác định điều kiện thuận lợi cho quá trình tự thủy phân bằng hệ protease nội tại

trên đầu tôm để thu chitin và dịch thủy phân protein có hoạt tính chống oxy hóa

3 Nội dung của đề tài

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng khử protein của hệ protease nội tại (nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ nước bổ sung)

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng dịch protein thủy phân bởi

hệ protease nội tại (nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ nước bổ sung)

- Đề xuất chế độ xử lý cho phép sử dụng hiệu quả hệ protease nội tại

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 NGUỒN NGUYÊN LIỆU CÒN LẠI TRONG CHẾ BIẾN TÔM VÀ CÁC

HƯỚNG TẬN DỤNG

1.1.1 Nguồn nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm

Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu Việt Nam, tỷ lệ các mặt hàng giáp xác đông lạnh chiếm từ 50-80% sản lượng chế biến

Nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm xuất khẩu gồm có: đầu, vỏ, thịt vụn… Tỷ lệ của các thành phần này được trình bày cụ thể ở bảng 1.1

Mặt khác có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm từ 30-70%, trung bình khoảng 50% so với khối lượng tôm chưa chế biến (Watkin và cộng sự, 1982; Evers và Carroll)

Trong đó, phần đầu thường chiếm 34-45% và phần vỏ 10-15% so với lượng tôm nguyên liệu đưa vào chế biến [6] Tuy nhiên, tỷ lệ này tùy thuộc vào giống loài và giai đoạn sinh trưởng của chúng [11], [6]

Nguồn nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm này nếu biết tận dụng triệt để sẽ đem lại nguồn lợi nhuận khổng lồ Nó không chỉ đem lại giá trị kinh tế cao

mà còn có ý nghĩa bảo vệ môi trường.[9]

Bảng 1.1 Tỷ lệ nguyên liệu còn lại của các loại tôm [11] Đơn vị (%)

Loại tôm Tôm vỏ bỏ đầu Tôm thịt Đầu tôm Vỏ tôm

Sắt 50,47 39,15 42,38 11,62

1.1.2 Thành phần, tính chất của nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm

Thành phần hóa học chiếm tỷ lệ đáng kể trong đầu tôm là protein, chitin, khoáng, enzyme và sắc tố Trong đó, hàm lượng protein lên chiếm tới trên 50%

Các kết quả nghiên cứu cho thấy các thành phần cơ bản của tôm thẻ chân trắng cũng tương tự như các giống tôm khác, được trình bày cụ thể theo bảng 1.2

Bảng 1.2 Thành phần hóa học cơ bản của vỏ tôm thẻ chân trắng [10] Đơn vị:

- Protein trong đầu tôm tồn tại ở 2 dạng:

+ Dạng tự do: dạng này tồn tại trong nội tạng tôm hay trong cơ thịt

+ Dạng liên kết: đây là protein không hòa tan, thường liên kết với chitin, calci carbonate, với lipid tạo thành lipoprotein, sắc tố tạo proteincarotenoid như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm

- Enzyme:

Trong nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm có chứa một một lượng không nhỏ enzyme nội tại, chủ yếu là enzyme protease tồn tại trong nội tạng nên chủ yếu nằm trong đầu tôm

Hoạt độ enzyme của protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi (Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thủy sản số 05/1993) Trong đầu tôm có chứa

enzyme tiêu hóa chymotrypsin và một vài loại enzyme khác có mặt trong nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm như alkaline phosphatase, -N-acetyl glucosaminse, chitinase cũng được ứng dụng nhiều trong thực tế

- Chitin: tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và những hợp chất hữu

1.1.3 Các hướng khai thác sử dụng nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm

1.1.3.1 Thu hồi chitin

Trong phế liệu tôm hàm lượng chitin chiếm tỷ lệ tương đối cao 11,1% [11], vì nghiên cứu tận dụng phế liệu tôm theo hướng thu hồi chitin rất được quan tâm và triển khai rộng rãi nhất hiện nay

+ Nghiên cứu trong nước

Nguyễn Văn Thiết, Đỗ Ngọc Tú [17] đã nghiên cứu thu hồi chitin bằng phương

pháp sinh học từ phế liệu đầu vỏ tôm thông qua việc sử dụng enzyme papain từ dứa Vật liệu dùng trong quá trình nghiên cứu là phụ phẩm đầu và vỏ tôm khô Phụ phẩm sau khi mua về sấy lại cho khô giòn ở nhiệt độ 40oC rồi nghiền nhỏ thành bột Tiến hành quy trình thu nhận chitin bằng phương pháp enzym sử dụng dịch ép vỏ dứa được thực hiện ở 3 quy mô với 100g, 500g và 2 kg nguyên liệu đầu vỏ tôm Kết quả cho thấy, cứ 100g nguyên liệu ban đầu được xử lý với 300ml dịch ép bã dứa là thích hợp Toàn bộ quy trình thực hiện trong 8h Qua việc tiến hành thu nhận chitin bằng phương pháp hóa học và so sánh kết quả của 2 phương pháp, đề tài cho thấy, sử dụng phương pháp chế biến sinh học có nhiều ưu điểm hơn như: không cần axit để lọai khoáng, tiêu tốn ít xút cho loại bỏ protein, hiệu quả thu hồi chitin cao hơn mà chất lượng chitin thu

được lại tốt hơn, ít gây ô nhiễm môi trường hơn Nhược điểm duy nhất là sử dụng bromelain trong dịch ép vỏ dứa mất nhiều thời gian thực hiện hơn

Theo Trang Sỹ Trung và cộng sự (2008) [23] nghiên cứu ứng dụng ủ xi lô bằng acid focmic kết hợp với enzyme nâng cao chất lượng của chitin và chitosan từ phế liệu tôm và giảm thiểu ô nhiễm môi trường Kết quả là đã loại được 83.1% protein và 66,1% khoáng từ phế liệu tôm trong quá trình sản xuất chitin Tiếp tục khử protein bằng Alcalase và khử khoáng bằng acid lacic cho phép thu được sản phẩm chitin, chitosan có chất lượng tốt, đặc biệt chitosan có độ nhớt cao Bên cạnh đó, quy trình mới cho phép thu được dịch ủ có giá trị dinh dưỡng cao, có thể sử dụng trong chế biến thức ăn gia súc

+ Nghiên cứu ngoài nước

Asbjørn Gildberg và Even Stenberg (2000) [25] đã nghiên cứu thu hồi protein trong quá trình sản xuất chitosan chất lượng cao dùng trong mỹ phẩm Trong quá trình thủy phân, tác giả dùng enzyme thương mại có sẵn (alcalase) và protein thủy phân được thành các acid amin thiết yếu với hàm lượng cao, tuy nhiên chúng không làm ảnh hưởng tới chất lượng chitosan Hàm lượng protein thu được 68,5% cao hơn so với việc thu hồi theo phương pháp thông thường là 12,8% Ngoài ra, sau khi ly tâm để thu hồi protein còn thu được một lượng astaxanthin để bổ sung vào thức ăn cho cá hồi

Y Xu & C Gallert & J Winter (2008) [33] đã nghiên cứu thu chitin tinh chế từ

vỏ tôm Penaeus monodon và Crangon crangon bằng cách sử dụng một quá trình có

hai giai đoạn lên men kỵ khí để thủy phân potein sau đó khử khoáng thông qua quá trình lên men lactic acid Kết quả là tại pH = 3,6 canxi cacbonat của vỏ được hòa tan Sau khi khử protein và khử khoáng, vỏ của Tôm sú và C.crangon, hàm lượng protein

đã khử được 5,8% hoặc 6,7%, và hàm lượng canxi khử được là 0,3% hoặc 0,4%, tương ứng Độ nhớt của chitin từ tôm sú và C crangon là 45 và 135 mPa s tương ứng, trong khi chitn từ vỏ cua (thực tế cấp) có độ nhớt của 21 mPa s Qua đó cho thấy chất lượng chitin tinh khiết hơn [19]

1.1.3.2 Thu hồi dịch thủy phân

Theo nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm từ 30-70%, trung bình khoảng 50% so với khối lượng tôm chưa chế biến (Watkin và cộng sự (1982) Evers và Carroll)

Trong phế liệu tôm, phần đầu thường chiếm 34-45% và phần vỏ 10-15% so với lượng tôm nguyên liệu đưa vào chế biến [6] Tuy nhiên, tỷ lệ này tùy thuộc vào giống loài và giai đoạn sinh trưởng của chúng Trong đầu tôm hàm lượng protein chiếm 53,5

%, vì vậy việc tận dụng nguồn protein này là một vấn đề đang được các nhà khoa học rất quan tâm, đặc biệt là hướng thu hồi dịch thủy phân để bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm cho người và động vật có giá trị dinh dưỡng cao

* Trên Thế giới

Việc thu hồi một phần protein từ phế liệu tôm bằng enzyme thủy phân đã được nghiên cứu rộng rãi (Simpson và Haard, 1985; Cano -Lopezandothers,1987; Synowiecki và Al -Khateeb, 2000; Gildberg vàStenberg, 2001; Mizani và cộng sự, 2005) Các enzyme protease như Alcalase đã được sử dụng để thủy phân protein từ phế liệu tôm (Chabeaud, Guerard, Laroque & Dufosse 2007; Mizani, Aminlari, 2005)

và trypsin , papain, pepsin (Synowiecki & Al-Khateeb,2000; Chakrabarty,2002), neutrase và protease (Rutanapornvareeskul, 2006); Józef Synowiecki và cộng sự (1999) nghiên cứu ứng dụng Alcalase để khử protein của phế liệu vỏ tôm Crangon crangon nhằm thu hồi Chitin và protein

Ban đầu vỏ tôm Crangon được khử khoáng sơ bộ bằng dung dịch HCl 10% ở

20oC trong 30 phút và khử protein bởi enzyme thương mại Alcalase ở 55oC và pH 8,5

Độ thủy phân (DH) cao nhất là 30% và dịch thuỷphân thu được chứa 63% protein so với vật chất khô (N x 6,25), 6,24% lipid, 23,4% NaCl Holanda và Netto, 2006 nghiên cứu thu hồi 3 thành phần chính của phế liệu tôm, protein, chitin, asthaxanthin bằng việc sử dụng enzyme Alcalase và Pancreatin Theo tác giả trong phế liệu tôm Xiphopenaeus kroyeri có chứa 39,42% protein, 31,98 % tro, và 19,92 % chitin Tiến hành thủy phân khử protein bằng enzyme Alcalase tại các điều kiện: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (E/S) 3%, nhiệt độ 60oC, pH=8,5 Kết quả cho thấy khi tăng độ

thủy phân (DH) từ 6% tới 12% thì thu được 26% và 28% protein tương ứng Alcalase

có ảnh hưởng nhiều hơn pancreatin, có thể thu hồi protein từ 57,5% đến 64,6% và asthaxanthin từ 4,7 đến 5,7 mg asthaxanthin/100g phế liệu khô tại DH 12% Gildberg

và Stenberg, 2001 thu được 68,5% protein từ phế liệu tôm Pandalus borealis sau 2 giờ thủy phân với enzyme Alcalase Wenhong Cao và các cộng sự, 2008 đã nghiên cứu thu hồi protein của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng bằng cách cho đầu tôm tự thủy phân và có sự điều chỉnh nhiệt độ bằng cách nâng nhiệt độ dần lên từ 40oC÷70oC, cứ sau 30 phút thì tăng lên 5oC, pH tự nhiên Kết quả cho thấy tại điều kiện nhiệt độ 40oC,

50oC, 60oC thì hàm lượng protein thu hồi được tương ứng là 43,6%, 73,6%, 87,4% Và kết quả cũng chỉ ra là khi nhiệt độ tăng từ 45oC ÷ 60oC là nhiệt độ mà enzyme nội tạng hoạt động mạnh nhất thì độ thủy phân (DH) tăng từ 0 ÷ 48% sau 180 phút khi nâng nhiệt dần lên, lượng protein thu hồi cao nhất là 87,4% tại 60oC

số protease hoạt động Sau 24h phần trăm protein còn lại trong phế liệu tôm so với mẫu chưa xử lý là 12,99%

Đặng Thị Hiền (2008) đã sử dụng enzyme Alcalase để tiến hành thuỷ phân phế liệu tôm và tận thu protein và astaxanthin trong công nghệ sản xuất chitin - chitosan Tại nhiệt độ 54oC, 8h, tỷ lệ enzyme bổ sung là 0,22%; pH 8, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1 thì thu hồi được 52,7% protein so với ban đầu [5]

Trang Sỹ Trung đã sử dụng enzyme Flavouzyme để tiến hành thuỷ phân phế liệu tôm Tại nhiệt độ 50oC, 6h, tỷ lệ enzyme bổ sung là 0,1; pH 6,5, thì hiệu suất thu hồi protein khoảng 92 ÷ 95%

1.1.3.3 Thu hồi protease

Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ 20 đến nay Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại lợi nhuận lớn cho nhiều nước, sản lượng và kim ngạch mua bán các chế phẩm enzyme trên thị trường thế gới tăng 20-30% mỗi năm Việt Nam là nước có nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzyme Trong đó protease là enzyme thủy phân có giá trị thương mại rất lớn Nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, mỹ phẩm đặc biệt trong y học hiện đại Chính vì thế đã có nhiều nghiên cứu tách chiết thu nhận protease từ nhiều nguồn gốc khác nhau: động vật, thực vật, vi sinh vât Gần đây, do những nhu cầu về vệ sinh, an toàn thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt, chi phí cho kiểm tra chất lượng và do

đó, chế phẩm protease từ vi sinh vật ngày càng cao Trong khi đó, chế phẩm protease thu nhận từ thực vật và mô động vật luôn được coi là tuyệt đối an toàn nên ngày càng thu hút được sự quan tâm của các phòng thí nghiệm cũng như các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thương mại

+ Nghiên cứu trong nước

Ở nước ta hiện nay, công bố nhiều công trình nghiên cứu protease Chủ yếu là nghiên cứu tách chiết tinh sạch và ứng dụng của enzyme các lĩnh vực công nghê thực phẩm và mỹ phẩm, dược phẩm

Đỗ Văn Ninh (2004), công bố các nghiên cứu về protease thu nhận từ nội tạng

cá và mực, cho thấy chế phẩm protease thu được từ nội tạng cá và mực là một hỗn hợp gồm nhiều protease có nhiệt độ thích hợp từ 50-55oC và hoàn toàn có thể sử dụng protease này trong thủy phân cơ thịt cá để sản xuất dịch đạm thủy phân ứng dụng trong sản xuất pasta cá cũng như bột dinh dưỡng [14]

Vũ Ngọc Bội (2004), nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá mối bằng protease từ Bacillus subtilis S5 Qua nghiên cứu cho thấy protease từ Bacillus subtilis S5 có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn toàn có thể sử sụng enzyme này

trong sản xuất bột đạm thủy phân Khi bổ sung protease từ Bacillus subtilis S5 với nồng độ 0,3% vào hỗn hợp thịt cá mối và thủy phân ở 55oC [1]

+ Nghiên cứu ngoài nước

Corvisat (1857) chiết tách trypsin từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên được thu nhận nhưng chưa tinh sạch Danivevski (1862) chiết tách trypsin, amylase tụy tạng bằng phương pháp hấp phụ Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong chiết tách và nghiên cứu các tính chất của enzyme cũng như protein Tiếp theo đó là Hommarsten (1872) chiết tách được Chymosin Wurtz (1879) chiết tách được papain, Crassman và Ambros (1926) chiết tách được bromelain…

Theo Salem và các cộng sự (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0.3% enzyme so với cá gồm papain, trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark) Kết quả cho thấy với 0.3% papain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30% Liang và các cộng sự (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trà trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain được tăng lên Nielsen (2001) nghiên cứu cải tiến phương pháp xác định mức độ thủy phân protein cho kết quả nhanh chóng và chính xác Stein (2004) sử dụng protease nội sinh thủy phân nội tạng cá tuyết Đại Tây Dương cho hiệu suất thủy phân khá cao [34]

1.1.3.1 Thu hồi các hợp chất sinh học khác

Thành phần của protein thủy phân gồm các peptid và các axit amin khi sự phân giải protein được gây ra bởi protease nội tại và enzyme bổ sung Nó dường như là thành phần ứng dụng khoa học dinh dưỡng của protein thủy phân không tinh chế, nó

có thể giúp ích chút ít hơn peptid tinh chế từ sự hút của oligopeptid được tăng lên sự

do có mặt của nó đường và axit amin

Peptid từ thực phẩm được coi là hợp chất an toàn và có lợi cho sức khỏe, chúng có cấu trúc đơn giản, có nhiều tính chất ổn định Chúng có giá trị dinh dưỡng cao và nhiều chức năng sinh học như chống tăng huyết áp, điều hòa miễn dịch…[20] trong đó có

chức năng chống oxi hóa Có sự ức chế quá trình peroxid lipid, lọc sạch các gốc tự do

và kiềm hãm sự chuyển đổi ion kim loại của các peptid chống oxi hóa Khả năng chống oxi hóa của các peptid có liên quan tới kết cấu của chúng, cấu trúc và tính không ưa nước Sự hiện diện ở vị trí thích hợp của các axit amin cấu thành các peptid trong chuỗi peptid giữ một vai trò quan trọng trong chức năng chống oxi hóa của peptid Liên kết peptid phản ánh cấu trúc rõ ràng, cụ thể của peptid, đồng thời cũng được khẳng định là có ảnh hưởng đến phạm vi chất chống oxi hóa của peptid Khối lượng phân tử của peptid cũng ảnh hưởng đến hoạt động chống oxi hóa của nó, peptid

có khối lượng phân tử trong khoảng 500 – 1500 Da là có hoạt động chống oxi hóa tốt nhất [3]

Nguồn protein trong dịch thủy phân thường được tận thu bằng ba phương pháp chủ yếu là dùng nhiệt, pH và các chất trợ lắng Sản phẩm protein thu được thường được tận dụng bổ sung vào thức ăn gia súc Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần đây cho thấy dịch thủy phân thu được khi thủy phân nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm bằng các enzyme khác nhau có hoạt tính sinh học Điều này mở ra hướng tận dụng cao hơn cho sản phẩm thủy phân, có thể ứng dụng sản phẩm thủy phân này trong thực phẩm chức năng và y dược Ví dụ như sử dụng enzyme protease trong chiết rút carotenoprotein từ phế liệu của quá trình chế biến các loài giáp xác là một hướng nghiên cứu đang rất được chú ý hiện nay vì giúp nâng cao lợi nhuận sản xuất nhờ tạo

ra sản phẩm giá trị gia tăng và giảm thiểu ô nhiễm môi trường Các carotenoprotein, thường được sử dụng như chất bổ sung cho sản xuất thức ăn chăn nuôi hoặc chất tạo màu trong công nghệ thực phẩm, có tính chất bền vững và dễ bảo quản hơn nhiều so với carotenoid riêng lẻ Carotenoprotein từ đầu, vỏ tôm hiện đang rất được quan tâm

để sử dụng làm thực phẩm chức năng cho người vì thành phần carotenoid chủ yếu là astaxanthin, một hợp chất chống oxy hóa thiên nhiên với các lợi ích kỳ diệu

cho sức khỏe đang được phát hiện và khẳng định [4]

1.2 ENZYME NỘI TẠI VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU CÒN LẠI

1.2.1 Protease của tôm

Sự tiêu hoá và trao đổi chất protein và các hợp chất nitơ khác giữa các loài giáp xác khác nhau rất nhiều Hầu hết, các cơ chế tiêu hoá và hấp thụ khác với động vật có xương sống Các enzyme tiêu hoá, đặc biệt các enzyme tiêu hoá protein ở giáp xác nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serin dạng trypsin và có khả năng hoạt động rất cao Ngoài ra, còn có enzyme chymotrypsin, astacine, collagenase…

Protease của tôm cũng như của các loài động vật thuỷ sinh khác là các protease nội bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó đến nội tạng và cơ thịt Đặc biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác Có nhiều cách phân loại protease, tuỳ vào khả năng thuỷ phân khác nhau mà các protease có đặc tính khác nhau Nhóm enzyme này có tác dụng thuỷ phân protien, có tính đặc hiệu rộng rãi, chúng không chỉ thuỷ phân liên kết peptid mà còn có thể thuỷ phân các liên kết ester

và cũng có thể xúc tác cho chuyển về gốc acid amin Tuy nhiên, mức độ tác dụng khác nhau Phần lớn các nhóm enzyme thuộc protease của tôm thường có tính chất chung của một enzyme: Hòa tan được trong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trung tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào những đặc tính này để tách chiết chúng

Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium), ethanol, acetone…để thu nhận chế phẩm enzyme Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạt hóa hay ức chế Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: nhiệt độ, pH môi trường Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu cùng cộng tác viên về protease đầu tôm biển và Th.s Nguyễn Thị

Mỹ Trang về protease đầu tôm bạc nghệ cho thấy các enzyme tiêu hoá protein là các

enzyme hoạt động mạnh trong môi trường kiềm Theo Nguyễn Việt Dũng thì protease của tôm sú lại thể hiện hoạt tính cao ở môi trường gần trung tính

Khả năng hoạt động của các enzyme tiêu hoá protein khác nhau tuỳ theo loài Chuang (1985) nhận thấy khả năng hoạt động của protease thô được xác định như khả năng hoạt động phân giải casein ở tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) và tôm đất (Metapenaecus ensis) thấp hơn ở Penaeus pencillatus, Penaeus monodon và Penaeus japonnicus [34]

1.2.2 Tính chất của hệ enzym nội tại trong nguyên liệu tôm còn lại

Các enzyme tiêu hóa, đặc biệt các enzyme tiêu hóa ở protein ở giáp xác nói chung và ở tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá Protease của tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serin dạng trypsin

và có khả năng hoạt động rất cao Ngoài ra còn có enzyme chymotrypsin, astacine, collagenase…

Protease của tôm cũng như các loài động vật thủy sinh khác là các protease nội bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hóa, sau đó đến nội tạng và cơ thịt Đặc biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hóa nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác Các enzyme có tác dụng thủy phân protein, tính đặc hiệu rộng rãi, không chỉ thủy phân các liên kết peptide mà còn thủy phân cả liên kết este, liên kết amin… Phần lớn các enzyme thuộc protease của tôm thường có tính chất chung của một protease:

- Hòa tan được trong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trung tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ khác, nên dựa vào những đặc tính này

Trypsin: Có nhiều trong dịch vị tụy tạng, có tác dụng mạnh với các loại protid

có phân tử lượng thấp ở các mối liên kết peptide, amit, este Trypsin từ ruột tôm có pH thích hợp là 7,8 ở 38oC Peptidase, ereptase, và các loại khác: Tham gia xúc tác thủy phân liên kết peptide trong phân tử protein và các polypeptide Khả năng tác dụng cũng như tính đặc hiệu của các loại enzyme này tùy thuộc vào bản chất của các nhóm nằm liền kề mối liên kết peptide Cacbonhydrase: Enzyme này xúc tác thủy phân các glucid và glucozit

Hiện nay, có nhiều công trình trong và ngoài nước nghiên cứu về hệ enzyme protease của tôm Phan Thị Trân Châu và cộng sự nghiên cứu protease trên tôm biển miền Bắc

Việt Nam cho thấy phạm vi hoạt động của chúng khá rộng từ pH 6 đến 9 và pH hoạt động tối ưu là 7,5 và 8,5 [2]

Nguyễn Văn Lệ (1996) nghiên cứu về protease đầu tôm bộp cho thấy khi tách protease đầu tôm qua cột lọc gel sephadex H – 75 thu được hai protease có nhiệt độ thích hợp là 60oC và 50oC với pH tương ứng là 7,5 và 8,5 Tác giả còn cho thấy có thể

sử dụng protease đầu tôm bộp để thủy phân thu bột đạm từ phế liệu đầu tôm và ứng dụng trong thủy phân cá [8] Nguyễn Văn Truyền (2006) đã nghiên cứu chiết xuất protease từ đầu tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii và thu được enzyme protease có nhiệt độ tối thích là 55oC, pH tối thích là 8 [24] Nguyễn Lệ Hà (2011) đã nghiên cứu tách chiết và ứng dụng enzyme protease từ tôm sú Penaeus monodon vào chế biến thủy sản Kết quả nghiên cứu đã phát hiện hệ protease ở đầu và gan tụy tôm

sú có ít nhất 5 loại khác nhau với phân tử lượng từ 20.200 đến 40.200 Da, riêng đầu tôm còn có thêm hai protease với phân từ lượng là 49.200 và 76.000 Da Ba protease chiếm vai trò hoạt động chủ đạo có phân tử lượng 20.200 đến 25.000 Da Protease tôm

sú bền nhiệt, có nhiệt độ tối thích là 62oC, pH hoạt động tối ưu là 7,5 với nồng độ muối NaCl thích hợp cho hoạt động là 1% Hoạt động của protease gan tụy và đầu tôm giảm khi có mặt của một số ion kim loại, đặc biệt là Hg2+, Ion Mn2+ làm tăng hoạt tính của protease tôm sú [4]

Trên thế giới, các nhà nghiên cứu cũng dành sự quan tâm đến khía cạnh này Doek S.N và các cộng sự cho biết protease của thịt tôm he Ấn Ðộ (P.inducus) là một protease kiềm, hoạt động cực đại ở pH 8,0 bền với nhiệt, hoạt động phụ thuộc vào ion kim loại [26].

Shann Tzong Jiang và cộng sự đã tách chiết được Cathepsin D từ một loài tôm nuôi ở Ðài loan, đồng thời cũng xác định được nhiệt độ, pH tối thích cho enzyme này hoạt động, cũng như các yếu tố hoạt hóa và ức chế [29]

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng hoạt động của enzyme nội tại [32]

1.2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Bản chất của enzyme là protein nên khi tăng hay giảm nhiệt độ thường ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme và enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định Thông thường đối với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40 ÷ 50oCvà nhiệt độ lớn hơn 70oC đa số enzyme bị mất hoạt tính Do vậy nhiệt độ 70oC gọi là nhiệt độ tới hạn của enzyme

Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của enzyme, nếu nhiệt độ tăng

10oC thì tốc độ thủy phân của enzyme tăng từ 1,5 – 2 lần Nhiệt độ thích hợp đối với một enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH và cơ chất

1.2.3.2 Ảnh hưởng của pH:

Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi của pH Mỗi enzyme chỉ hoạt động ở một vùng pH nhất định gọi là pH tối thích pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng trung tính, axit yếu hoặc kiềm yếu, chỉ rất ít enzyme hoạt động mạnh trong vùng axit hay kiềm Nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm có thể bị thủy phân bởi enzyme protease có sẵn trong đầu tôm vì thế chúng ta phải chọn enzyme nào đóng vai trò là enzyme chính xúc tác cho quá trình thủy phân để tạo môi trường có pH thích hợp cho

nó hoạt động và hạn chế ảnh hưởng của các enzyme khác

1.2.3.3 Ảnh hưởng của thời gian:

Thời gian thủy phân kéo dài hay rút ngắn đều ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân và chất lượng của sản phẩm Thời gian tác dụng kéo dài thì enzyme có

điều kiện để cắt mạch triệt để, dẫn đến sự biến đổi sâu sắc của cơ chất Nhưng nếu kéo dài thời gian thủy phân quá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra nhiều sản phẩm cấp thấp như: NH3, H2S, indol, scaptol…đồng thời khi kéo dài hiệu quả kinh tế kém Khi rút ngắn thời gian thủy phân, sự thủy phân protein chưa triệt

để dẫn tới hiệu suất thủy phân kém, gây lãng phí nguyên liệu và gây khó khăn cho khâu lọc rửa để thu dịch protein

1.2.3.4 Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc:

Khi thủy phân diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease và nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm cũng ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ thủy phân Để tạo điều kiện cho enzyme protease hoạt động tốt người ta thường xay nhỏ phế liệu tôm Khi diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease với protein càng lớn thì quá trình thủy phân càng dễ dàng và ngược lại

1.2.3.5 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme:

Trong điều kiện thừa cơ chất, nếu càng tăng nồng độ enzyme protease thì quá trình thủy phân xảy ra càng mãnh liệt Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất, dù tăng nồng độ enzyme bao nhiêu đi nữa vận tốc của quá trình thủy phân rất ít thay đổi

1.2.3.6 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:

Khi enzyme protease kết hợp với cơ chất là nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm, sẽ tạo thành phức trung gian enzyme và cơ chất Phức chất này sẽ kéo căng liên kết peptid, chuyển hóa thành sản phẩm dịch đạm và giải phóng enzyme Quá trình này

cứ tiếp tục xảy ra đến khi cơ chất hết, nếu nồng độ cơ chất thích hợp với lượng enzyme

sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn ra đều đặn, nhanh chóng

1.2.3.6 Độ tươi của nguyên liệu

Thành phần hóa học của đầu tôm ngoài chitin, protein, astaxanthin, còn có một lượng lớn enzyme nội tạng tại thuộc họ protease Theo các nghiên cứu của các nhà khoa học trường Đại Học Nha Trang đã chứng minh rằng hoạt độ enzyme protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g Các enzyme này chủ yếu tồn tại trong nội tạng

của đầu tôm nguyên liệu tươi Chính vì vậy mà độ tươi nguyên liệu có ảnh hưởng lớn tới hoạt động của protease nguyên liệu càng tươi thì lượng enzyme càng nhiều hoạt động càng mạnh và mgược lại)

Do vậy chất lượng của nguyên liệu là mối quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu

về thủy phân protein để đảm bảo chất lượng sản phẩm mà còn ảnh hưởng nhiêu tới hiệu quả thủy phân của protease [15]

1.2.3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào hỗn hợp thủy phân

Nước là yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến phản ứng thủy phân Nó có khả năng điều chỉnh phản ứng thủy phân, bởi lẽ nước là môi trường tăng cường quá trình phân cắt các liên kết nhị dương, là môi trường khuyếch tán enzyme và cơ chất tạo điều kiện cho tốc độ phản ứng xảy ra Do vậy quá trình thủy phân nguyên liệu đầu tôm nếu ta bổ sung nước với tỷ lệ thấp sẽ hạn chế được hoạt động của vi sinh vật nhưng đồng thời ức chế hoạt động của enzyme làm giảm hiệu suất thủy phân Nhưng nếu bổ sung nước với

tỷ lệ quá cao, vi sinh vật hoạt động và phát triển phân hủy sản phẩm thành các sản phẩm thứ cấp Vì vậy, ta phải xác định tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân

1.2.3.8 Ảnh hưởng của chất kìm hãm

Là chất làm giảm khả năng xúc tác hoặc vô hoạt enzyme, chất kìm hãm kết hợp thuận nghịch với enzyme Chúng là chất hữu cơ phân tử thấp, ion kim loại, phi kim

Nó có thể là chất kìm hãm thuận nghịch hay bất thuận nghịch Kìm hãm thuận nghịch

có thể là cạnh tranh, không cạnh tranh hay hỗn tạp

1.2.3.9 Ảnh hưởng của chất kích hoạt, chất hoạt hóa

Là chất làm tăng hoạt động của enzyme, enzyme từ không hoạt động sang hoạt động hoặc ít hoạt động chuyển sang hoạt động nhiều Chất hoạt hóa có tác dụng cắt một vài đoạn peptid đang ức chế hoạt động củ enzyme để hình thành lại trung tâm hoạt động của enzyme và enzyme trở nên hoạt động Mỗi enzyme đòi hỏi một số chất hoạt hóa mang bản chất khác nhau Chất hoạt hóa có thể làm cho các ion kim loại, phi kim làm cầu nối giũa enzyme và cơ chất hoặc làm tăng diện tích tiếp xúc giữa enzyme và

1.3 TÍNH CHẤT CỦA DỊCH THỦY PHÂN PROTEIN

1.3.1 Quá trình thủy phân Protein [5], [25]

Protein là một chuỗi polymer dài, mà bao gồm các nhóm amino gắn với nhau bởi các liên peptid Phản ứng liên quan tới việc phá vỡ chuỗi các nhóm amino này thành các mạch, nhánh nhỏ hơn sử dụng nước được gọi là sự thủy phân protein

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân protein

Trong suốt quá trình phản ứng, liên kết peptid sẽ được tách ra do sự tấn công nuclephilic bởi phân tử nước, tạo thành axit cacboxylic và amin Nhóm cacboxyl và

nhóm amino tự do hình thành sau quá trình thủy phân sẽ nhiều hơn hay ít ion hóa hơn, phụ thuộc vào pH của phản ứng thủy phân Từ đây sẽ hình thành anion RCOOH- và cation R-NH3+

Theo Alder – Nissen, thêm nước vào trong quá trình thủy phân protein có liên quan đến sự tấn công nucleophilic, các nhóm amino tự do (-NH2) có thể cũng hoạt động như nucleophilic phản ứng trực tiếp với protein để tách các liên kết peptid Phản ứng này cũng được xem như sự vận chuyển các peptid sinh ra anion RCOOH- và cation R-

NH3+ Vì vậy trong quá trình thủy phân protein, các nhóm amino tự do hình thành hỗ trợ cho sự phá vỡ, cắt mạch protein Sự thủy phân protein xảy ra rất chậm ở điều kiện bình thường như pH trung tính và nhiệt độ phòng Sử dụng enzyme chắc chắn sẽ thúc đẩy phản ứng thủy phân, dẫn tới việc cắt mạch chuỗi peptid triệt để hơn, hình thành nhiều phân tử nhỏ hơn như axit amin Enzyme mà xúc tác cho phản ứng thủy phân protein là protease hay proteinase

Quá trình thủy phân diễn ra như sau:

Enzyme enzyme enzyme

Tỷ lệ giữa enzyme và cơ chất xác định tốc độ thủy phân, ban đầu tốc độ thủy phân là cao nhất sau đó giảm dần theo thời gian Phản ứng thủy phân tạm dừng khi

không còn nhiều liên kết peptid sẵn có cho enzyme Độ thủy phân tối đa có thể đạt được phụ thuộc vào tính chất tự nhiên của protein và đặc trưng cả enzyme

1.3.2 Khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân

a Tình hình nghiên cứu trên thế giới về khả năng chống oxi hóa từ phế liệu thủy sản [3]

Ngoài hướng tận dụng phế liệu tôm để sản xuất chitin – chitosan, trên thế giới

đã có nhiều công trình nghiên cứu thu hồi dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt là khả năng chống oxi hóa Nghiên cứu của Gildberg & Stenberg, 2001 chỉ ra rằng sự thủy phân làm giảm chiều dài của các chuỗi peptide, tạo ra nguồn di, tri peptide là một nguồn protein có hoạt tính sinh học Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiêncứu về việc tận dụng nguyên liệu còn lại trong quá trình chế biến tôm Các chất chống oxi hóa trong phế liệu vỏ tôm đã được nghiên cứu bởi Seymour và Li (1996) Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất chống oxi hóa trong vỏ tôm là các protein mà đơn phân là các acid amin chứa gốc phenol trong đó các acid amin sắp xếp theo một qui tắc nhất định

Năm 2007, bằng các test thử về khả năng chống oxi hóa, một nhóm các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra chất chống oxi hóa có trong Mungoong, một món ăn truyền thống của người Thái được làm từ dịch chiết phế liệu tôm Qua nghiên cứu người ta nhận thấy rằng Mungoong chứa chất chống oxi hóa Dịch hòa tan từ sản phẩm này có hoạt tính chống oxi hóa cao nhờ các test thử DDPH, khả năng bắt giữ các gốc tự do ABTS và FRAP Hoạt tính chống oxi hóa phụ thuộc vào nồng độ dịch hòa tan từ sản phẩm này

Năm 2008, S.J.Li, T.A Seymour đã nghiên cứu ứng dụng chất chống oxi hóa được chiết từ vỏ tôm vào việc bảo quản một loại cá mú (thường sống ở các rặng san hô) nhằm chống sự mất màu và oxi hóa lipid của loài cá này Kết quả cho thấy rằng dịch chiết bằng dung môi ethanol từ phế liệu tôm khi được bổ sung vào mẫu bảo quản lạnh sẽ có khả năng ngăn chặn sự biến màu của cá và phản ứng oxi hóa lipid cũng xảy

ra ít hơn so với các mẫu đối chứng Tuy nhiên, các dịch chiết này thể hiện khả năng chống oxi hóa thấp hơn so với các chất chống oxi hóa tổng hợp

Năm 2009, nhóm các nhà khoa học người Thái Lan đã nghiên cứu sản phẩm lên men truyền thống tôm và giáp xác (Kapi, Koong – Som and Jaloo) Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng sản phẩm lên men này có hàm lượng protein cao và hầu hết các sản phẩm có hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng chống oxi hóa tự nhiên và rất tốt cho sức khỏe

b Tình hình nghiên cứu trong nước về khả năng chống oxi hóa từ phế liệu thủy sản

Từ trước đến nay, ở Việt Nam đã có nhiều đề tài nghiên cứu thu hồi các sản phẩm trên phế liệu tôm Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu mới chỉ tập trung thu hồi chitin –chitosan, chưa chú trọng đến việc tận thu các sản phẩm khác của phế liệu tôm như protein, asthaxanthin Đặc biệt là hoạt tính sinh học, hoạt tính chống oxi hóa của dịch thủy phân protein đầu tôm chưa được quan tâm nhiều và hầu như đang trong giai đoạn nghiên cứu bước đầu Việc nghiên cứu về hoạt tính sinh học của protein của phế liệu tôm trong quá trình thủy phân sẽ mở ra hướng kết hợp thu protein có hoạt tính sinh học với sản xuất chitin – chitosan và ứng dụng vào lĩnh vực y học, thực phẩm, làm tăng hiệu quả kinh tế trong sản xuất

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm

Nguyên liệu đầu tôm được mua tại cơ sở chế biến nhỏ chuyên cung cấp tôm tươi cho các trường học nên chất lượng đầu tôm luôn ổn định và đảm bảo số lượng Yêu cầu nguyên liệu phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, biến đen, không lẫn tạp chất

Nguyên liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa nước đá

và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm Nguyên liệu được rửa nhặt sạch tạp chất, cân cho vào túi PE, bảo quản đông ở điều kiện nhiệt độ -20oC Khi tiến hành thí nghiệm thì lấy ra rã đông bằng không khí kết hợp với nước sau đó cân 100g nguyên liệu cho mỗi mẫu rồi tiến hành thí nghiệm xác định khả năng tách thịt đầu ra khỏi vỏ

2.1.2 Hóa chất nghiên cứu

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết được dùng cho phân tích

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng khử protein của hệ protease nội tại (nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ nước bổ sung)

2.2.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng dịch protein thủy phân bởi hệ protease nội tại (nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ nước bổ sung)

2.2.3 Đề xuất chế độ xử lý cho phép sử dụng hiệu quả hệ protease nội tại

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

2.3.1 Phương pháp thu nhận mẫu

Nguyên liệu vỏ tôm được thu từ cơ sở chế biến nhỏ ở chợ xóm mới, nguồn nguyên liệu

ổn định và có nguồn gốc rõ ràng ở khu vực Nha Trang

Yêu cầu nguyên liệu phải còn tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất Nguyên liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm Nguyên liệu được rửa, loại bỏ tạp chất và tiến hành làm thí nghiệm Trong trường hợp chưa làm ngay thì nguyên liệu được cho vào túi polymer (mỗi túi 1kg), bảo quản đông ở nhiệt độ -20oC, bảo quản không quá 1 ngày

2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm

2.3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Để đánh giá khả năng thủy phân của protease có trong đầu tôm trước hết phải tạo điều kiện thuận lợi nhất cho enzyme này hoạt động để quá trình thủy phân là triệt

để nhất Hệ enzyme protease có trong đầu tôm gồm nhiều enzyme và để tránh mất enzyme do các quá trình xử lý sơ bộ cần tiến hành thủy phân ngay sau khi rửa sơ bộ đầu tôm, sử dụng cơ chất thủy phân là protein có trong chính đầu tôm để đánh gía khả năng thủy phân của hệ protease nội tại Khả năng thủy phân được đánh giá thông qua

hiệu quả khử protein ở phần bã và chất lượng của dịch thủy phân thu được Các bước thực hiện được trình bày trong sơ đồ tổng quát ở hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Đầu tôm tươi

Rửa sơ bộ

Thủy phân bằng enzyme nội tại

Thu dịch thủy phân

Bã vỏ đầu tôm

Xác định hiệu quả khử protein

Đánh giá chất lượng của dịch thủy phân

Xử lý kết quả đạt được bằng DX6.01, MINITAB 16 và Excel

2.3.2.2 Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tới hiệu quả khử protein

và chất lượng dịch thủy phân thu được

Trong quá trình thủy phân, các enzyme protease có sẵn trong đầu tôm sẽ thủy phân cắt mạch các protein thịt đầu còn lại trong đầu tôm sau quá trình chế biến tạo thành hỗn hợp hai phần là dịch thủy phân và bã chitin

Quá trình thủy phân protein của enzyme nội tại được thực hiện với hai mục tiêu là đạt được đồng thời hiệu quả khử protein cao và dịch sau thủy phân có chất lượng tốt vì nếu hiệu quả cao mà chất lượng thấp thì khả năng ứng dụng thấp sẽ làm giảm giá trị của sản phẩm dịch thủy phân Chính vì vậy mà 2 chỉ tiêu này luôn đi kèm với nhau trong đánh giá hiệu quả của 1 quá trình thủy phân Các bước tiến hành được trình bày ở sơ đồ hình 2.2

Thuyết minh :

Rửa sơ bộ : nguyên liệu chứa trong rổ rửa dưới vòi nước chảy để loại bỏ bụi bẩn và tạp chất (râu, đuôi, vỏ, ), rửa nhanh trong 5 phút rồi để ráo trước khi thủy phân

Thủy phân : Cân mỗi mẫu 100g cho vào bình tam giác bằng thủy tinh, bổ sung nước vào với tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1 :0, 1 :1, 1 :2 rồi dùng giấy bạc đậy kín nắp bình, bố trí thí nghiệm ở 2 khoảng nhiêt độ là nhiệt độ phòng và 60oC (đặt vào bể ổn nhiệt cài sẵn nhiệt độ 60oC) Bố trí thủy phân ở 4 mốc thời gian lần lượt là 0h, 1h, 2h, 3h Thủy phân xong đem đi xay nhồi để tác động cơ học nhằm tách nâng cao hiệu quả tách protein, sản phẩm thủy phân có 2 phần :

+ Phần dịch thủy phân: ly tâm, thu phần dịch nổi, đánh giá chất lượng protein của dịch, cụ thể là hàm lượng nitơ hòa tan, hàm lượng bazơ nitơ bay hơi, và khả năng chống oxy hóa

+ Phần bã chitin: phơi khô sơ bộ, xác định hiệu quả khử protein của enzyme protease :

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tới hiệu

quả khử và chất lượng dịch protein thủy phân

Đầu tôm tươi

Rửa sơ bộ

Thủy phân bằng enzyme nội tại

Dịch thủy phân

Xác định hiệu quả khử protein

Ly tâm

Xác định lượng protein hòa tan có trong dịch thủy phân

Xác định lượng bazo nito bay hơi có trong dịch thủy phân

Xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân

2.3.3 Phương pháp phân tích và xác định các chỉ tiêu

2.3.3.1 Xác định hàm ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105 o C theo TCVN 3700

- Xác định hàm ẩm: Cho vào mỗi cốc khoảng 2 g mẫu đã chuẩn bị sẵn Cân tất

cả trên cân phân tích có độ chính xác như trên Sau đó cho tất cả các mẫu vào tủ sấy có nhiệt độ 100-105oC, sấy đến khối lượng không đổi tối thiểu là 6h Sấy xong đem làm nguội ở bình hút ẩm 20-30 phút và cân Cho lại vào tủ sấy trong 30 phút nữa, rồi cân xác định khối lượng Cứ tiếp tục như vậy cho đếm khi kết quả giữa hai lần cân liên tiếp không được cách nhau quá 0,5mg cho mỗi gam mẫu

c.Tính kết quả: Độ ẩm theo % (X) được tính theo công thức sau:

Trong đó:

G: Trọng lượng của cốc sứ (gam)

G1: Trọng lượng của mẫu và cốc trước khi sấy (gam)

G2: Trọng lượng của mẫu và cốc sau khi sấy (gam)

2.3.3.2 Xác định hàm lượng protein còn lại trên bã:

Hàm lượng protein còn lại trên chitin và hàm lượng protein hòa tan trong dịch được xác định dựa vào phương pháp được giới thiệu bởi Gornall AG và cộng sự

a Nguyên lý: Trong môi trườn kiềm, protein kết hợp với Cu++ thanh một phức chất màu tím (phản ứng biuret) Màu sắc của phức chất tỷ lệ với lượng peptid ( CO-NH) của protein và gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin

và globulin

Công thức của cấu tạo của biure

= X

G1 – G2

G1 – G

*100 (%)

Hình 2.3 Công thức của phức biure

C4H4NaKO6.4H2O ( Kali Natri Tartrat)

BSA( Bovine serum albumin)

d Tiến hành:

 Pha thuốc thử Biuret: Hòa tan 2,35375g CuSO4.5H2O và 8,0571g

C4H4NaKO6.4H2O trong 500ml nước cất, khuấy đều và cho thêm 300 ml NaOH 10% Dung dịch trên được khuấy trộn đều và định mức lên 1000ml bằng nước cất

 Xây dựng đường chuẩn: Được bố trí như trong phần phụ lục 1

 Xử lí mẫu:

Đối với chitin:

Cách 1: Cân khoảng 3 nguyên liệu khô trong NaOH 4% với tỷ lệ 1:10 tới 1:15 w/v Sau đó đem ủ ở 90oC/6h

Cách 2: Cân khoảng 3 nguyên liệu khô trong NaOH 4% với tỷ lệ 1:10 tới 1:15 w/v Sau đó đem ủ ở 80oC/8h

Sau khi ủ: Đối với dịch thủy phân thu được, nếu không đủ 100ml thì dung nước cách rửa bã và định mức lên cho đủ 100ml

Lấy 1ml mẫu + 4ml thuốc thử Biuret đem đi đo ở bước sóng 570nm tại thiết bị

đo UV-Vis mini 1240

 Đối với phần dịch

Phần dịch được ly tâm (ở nhiệt độ 4oC, thời gian 15 phút, 5000 vòng/phút) và lọc tách riêng các phần không hòa tan, lấy phần nước nổi tiến hành xác định chỉ tiệu

lượng protein hòa tan theo phương pháp được giới thiệu bởi Gornall AG và cộng sự

Lấy mỗi mẫu 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống nghiệm 1ml mẫu + 4ml dung dịch thuốc thử biure (pha sẵn)

Mẫu trắng: thay 1ml mẫu bằng 1ml nước cất

Sau đó đem tất cả các ống nghiệm đi vortex, để trong 15 phút rồi đo ở bước song 570nm tại thiết bị đo UV-Vis mini 1240

e Kết quả

Kết quả đo được tương ứng với giá trị Y (OD=570nm), dựa vào phương trình đường chuẩn tính ra được hàm lượng protein có trong 1ml dịch Từ đó tính ra phần trăm protein có trong mẫu theo công thức sau:

Trong đó:

V: Thể tích mẫu sau khi pha loãng (ml)

C: Hàm lượng protein trong 1ml (mg/ml)

m: Khối lượng mẫu đem đi ủ (g)

M: Độ ẩm của mẫu đem đi phân tích (%)

2.3.3.3 Xác định hiệu quả khử protein

Hiệu quả khử protein (%) được xác định dựa trên công thức của Rao và cộng sự (2000)

Hiệu quả khử protein (%) =[ (Po*O) - (PR *R) * 100]/ (Po * O)

Trong đó:

Po, PR: là hàm lượng protein (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau khi thủy phân

O, R: là khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau khi thủy phân

2.3.3.4 Hiệu suất thu hồi protein

Hiệu suất thu hồi protein (%) được xác định bằng công thức:

Trong đó:

H: Lượng protein ban đầu có trên đầu tôm (g)

H1: Lượng protein còn lại trên đầu tôm sau thủy phân (g)

2.3.3.5 Xác định hàm lượng nitơ bazơ bay hơi tổng số

a Nguyên tắc

Các nitơ bazơ bay hơi có trong mẫu được chiết bằng dung dịch axit percloric Sau khi được kiềm hóa, dịch chiết được chưng cất bằng hơi nước và các thành phần nitơ bazơ bay hơi được hấp thụ trong bình chứa axit Chuẩn độ các nitơ bazơ đã hấp thụ bằng dung dịch axit clohydric chuẩn

b Cách tiến hành

- Chuẩn bị mẫu

Nghiền và trộn kỹ mẫu, sử dụng máy xay thịt

Cân 10 g  0.1 g phần mẫu đã được chuẩn bị cho vào bình chứa thích hợp Thêm 90.0 ml dung dịch axit percloric, đồng hóa mẫu trong 2 phút bằng máy trộn rồi lọc Dịch chiết có thể được bảo quản ở nhiệt độ từ 2oC đến 6oC trong 7 ngày

- Chưng cất bằng hơi nước

Cho 50.0 ml dịch chiết thu được vào thiết bị chưng cất hơi nước Để kiểm tra độ kiềm hóa của dịch chiết, thêm vài giọt phenolphtalein Sau đó bổ sung vài giọt chất chống tạo bọt silicon, 6.5ml dung dịch natri hydroxit vào dịch chiết và tiến hành chưng cất ngay

Điều chỉnh hơi nước sao cho thu được 100 ml dịch chưng cất trong 10 min Đầu

ra của thiết bị chưng cất ngập trong 100 ml dung dịch axit boric đã được bổ sung năm

giọt dung dịch chất chỉ thị Sau đúng 10 phút kết thúc việc chưng cất Tháo ống ra của thiết bị chưng cất ra khỏi bình thu nhận và rửa sạch bằng nước

c Phép thử trắng

Tiến hành phép thử trắng đồng thời với phép xác định nhưng sử dụng 50 ml dung dịch axit percloric thay cho dịch chiết mẫu

d Tính toán

Hàm lượng nitơ bazơ bay hơi tổng số, X, được tính bằng miligam trên 100 g

mẫu thử (mg/100 g), theo công thức sau:

m

a V V

X ( 1  0) 2100



Trong đó:

V1 là thể tích dung dịch axit clohydric đã dùng cho mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

V0 là thể tích dung dịch axit clohydric đã dùng cho mẫu trắng, tính bằng mililit (ml);

a là số miligam nitơ tương ứng với một mililit dung dịch chuẩn axit clohydric:

 đối với dung dịch axit clohydric 0.01 mol/l, a = 0.14 mg/ml

 đối với dung dịch axit clohydric 0.05 mol/l, a = 0.70 mg/ml

m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g)

2.3.3.6 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân từ đầu tôm

a Xác định khả năng chống oxy hóa của dịch thu được bằng test DPPH

Xác định khả năng chống oxy hóa thông qua khả năng kiểm soát gốc tự do DPPH (2,2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl) Khả năng kiểm soát gốc tự do DHHP được xác định dựa vào phương pháp đã được Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Yoshihiro Ochiai, Toshiaki Ohshima giới thiệu (2010) [27]

- Nguyên lí: dựa vào độ mất màu của gốc tự do DPPH khi có mặt dịch thủy phân DPPH là gốc khử, có bản chất dễ bị oxy hóa, có màu tím đậm, khi có mặt chất chống oxy hóa, gốc tự do DPPH sẽ nhận điện tử chuyển thành phân tử DPPH và mất màu tím Như vậy, chất có hoạt tính chống oxy hóa càng mạnh sẽ làm mất màu dung dịch gốc tự do DPPH càng mạnh

- Cách tiến hành: 1ml DPPH 0,2mM (dung môi là cồn 96%) và 3ml mẫu vào mỗi ống nghiệm, lắc đều và ủ trong tối ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút Sau đó, đo mật độ quang của mẫu ở bước sóng 517nm So sánh mật độ quang với ống đựng mẫu trắng (chỉ có 1ml thuốc thử và 3ml H2O)

- Kết quả được tính theo: Phương trình đường chuẩn DPPH:

Y=0,2448x - 0,0058 Trong đó: x: Nồng độ DPPH (mM)

Mô tả: Cho vào ống nghiệm 0.2 ml mẫu cần đo, tiếp đó cho 0.5 ml K3Fe(CN)6

1% bổ sung tiếp 0.8 ml dung dịch đệm (pH = 6.6) cho đủ 1.5 ml Hỗn hợp được đem ủ

ở 500C trong 20 phút

Tiếp tục cho vào mỗi ống nghiệm 0,5ml CCl3COOH 10% +2ml nước cất + 0.4

ml FeCl3 0.1%

Mẫu trắng: thay 0,2ml mẫu bằng dung dịch đệm

Sau đó vortex, để trong 15 phút rồi đo ở bước sóng 700 nm tại thiết bị đo Vis mini 1240

UV Kết quả được tính theo công thức:

Trong đó:

 TNLK (%): Tổng năng lực khử của dịch thủy phân

 Acontrol: mật độ quang của ống đựng mẫu trắng

 Amẫu: mật độ quang của ống có mẫu

Acontrol