Tuyển chọn chủng vi khuẩn bacillus spp sinh enzyme phytase, cellulase để ủ bã sắn dùng trong chăn nuôi

25 Hình 2.3: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase và phytase của Bacillus spp .... 27 Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm xác định ả

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

- -

MẠCH TRẦN PHƯƠNG THẢO

TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP SINH ENZYME

CELLULASE, PHYTASE ĐỂ Ủ BÃ SẮN DÙNG TRONG CHĂN NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Khánh Hòa - Năm 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

- -

MẠCH TRẦN PHƯƠNG THẢO

TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP SINH ENZYME

CELLULASE, PHYTASE ĐỂ Ủ BÃ SẮN DÙNG TRONG CHĂN NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch

Mã số : 60.54.01.04

Hướng dẫn khoa học:

TS Nguyễn Minh Trí

Khánh Hòa - Năm 2014

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn tới Trường Đại học Nha Trang, khoa Công nghệ Thực phẩm, khoa Sau đại học, Trung tâm thí nghiệm – Thực hành với lòng biết

ơn, sự kính trọng, tự hào được học tập, thực hành trong những năm qua

Tôi xin gửi lời cám ơn tới thầy Nguyễn Minh Trí, cô Phạm Hồng Ngọc Thùy

đã giúp đỡ, động viên, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Cuối cùng tôi muốn tỏ lòng biết ơn tới Mẹ, gia đình và bạn bè đã cùng tôi trong những năm tháng qua

Học viên

Mạch Trần Phương Thảo

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực, là một phần trong đề tài ”Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng vào việc nâng cao giá trị sử dụng của bã sắn” Học viên tham gia làm nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Minh Trí

Học viên

Mạch Trần Phương Thảo

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

PHẦN MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

3 Nội dung nghiên cứu 3

Chương 1 – TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về nguyên liệu sắn và bã sắn 4

1.1.1 Tổng quan về cây sắn 4

1.1.1.1 Phân loại thực vật và nguồn gốc 4

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật học 4

1.1.1.3 Thành phần hóa học của củ sắn 6

1.1.1.4 Phân loại 8

1.1.1.5 Diện tích, sản lượng sắn trong và ngoài nước 8

1.1.2 Bã sắn 10

1.1.3 Các sản phẩm từ sắn và bã sắn 11

1.2 Tổng quan về Bacillus subtilis 12

1.2.1 Đặc điểm của Bacillus subtilis 12

1.2.2 Các nghiên cứu sinh tổng hợp cellulase từ Bacillus spp 14

1.2.3 Các nghiên cứu sinh tổng hợp phytase từ Bacillus spp 14

1.3 Tổng quan về cellulase, phytase 15

1.3.1 Giới thiệu về cellulase 15

1.3.1.1 Giới thiệu về cellulose 15

1.3.1.2 Cơ chế cắt cellulose 16

1.3.2 Giới thiệu về phytase 17

1.3.2.1 Giới thiệu về phytate 17

1.3.2.2 Cơ chế cắt phytate 18

1.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng bã sắn làm thức ăn chăn nuôi 18

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.1.1 Mẫu phân lập 22

2.1.2 Bã sắn 22

2.1.3 Đậu nành 22

2.1.4 Cám gạo 22

2.1.5 Rỉ đường 22

2.1.6 Hóa chất, môi trường, thiết bị 22

2.2 Phương pháp phân tích, nghiên cứu – Bố trí thí nghiệm 23

2.2.1 Các phương pháp phân tích sử dụng trong đề tài 23

2.2.1.1 Xác định tỷ lệ sống vi khuẩn 23

2.2.1.2 Xác định tỷ lệ bào tử 23

2.2.1.3 Kiểm tra khả năng sinh enzyme 23

2.2.1.4 Phân tích các chất 24

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 24

2.2.3 Bố trí thí nghiệm 26

2.2.3.2 Tuyển lựa chủng có khả năng sinh enzyme cellulase, phytase 26

2.2.3.3 Bố trí xác định ảnh hưởng của pH và thời gian đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của Bacillus spp 27

2.2.3.4 Bố trí thí nghiệm xác định một số đặc tính của enzyme cellulase và phytase thô sinh tổng hợp từ chủng Bacillus spp 29

2.2.3.5 Xác định điều kiện nhân giống của củng Bacillus spp trên môi trường cơ bản là bã sắn 30

2.2.3.6 Bố trí thí nghiệm xác định các yếu tố nâng cao hiệu quả thủy phân cellulose và phytate của bã sắn từ chủng Bacillus subtilis 32

Chương 3 – KẾT QUẢ THẢO LUẬN 39

3.1 Tuyển lựa chủng Bacillus spp sinh cellulase và phytase 39

3.2 Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase, phytase 41

3.2.1 Ảnh hưởng yếu tố thời gian đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 41 3.2.2 Ảnh hưởng yếu tố thời gian đến khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase 42

3.2.3 Ảnh hưởng yếu tố pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 43

3.2.4 Ảnh hưởng yếu tố pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase 44

3.3 Ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt độ enzyme cellulase, phytase 45

3.3.1 Ảnh hưởng của yếu tố pH đến hoạt độ enzyme cellulase 45

3.3.2 Ảnh hưởng của yếu tố pH đối với hoạt độ enzyme phytase 46

3.3.3 Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đối với hoạt độ enzyme cellulase 46

3.3.4 Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đối với hoạt độ enzyme phytase 47

3.3.5 Ảnh hưởng của yếu tố độ bền nhiệt đối với hoạt độ enzyme cellulase 48

3.3.6 Ảnh hưởng của yếu tố độ bền nhiệt đối với hoạt độ enzyme phytase 48

3.4 Ảnh hưởng của các yếu tố đến điều kiện nhân giống tối ưu của củng Bacillus

subtilis trên môi trường cơ bản là bã sắn 49

3.5 Ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình ủ Bacillus subtilis C7 với bã sắn nhằm thủy phân cellulose và phytate 50

3.5.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến khả năng thủy phân cellulose 50

3.5.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến khả năng thủy phân phytate 51

3.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến khả năng thủy phân cellulose 52

3.5.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến khả năng thủy phân phytate 53

3.5.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung đến khả năng thủy phân cellulose 54

3.5.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung đến khả năng thủy phân phytate 55

3.5.7 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình thủy phân cellulose 56

3.5.8 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình thủy phân phytate 57

3.5.9 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng thủy phân cellulose 58

3.5.10 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến quá trình thủy phân phytate 59

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: A Cấu trúc cơ bản của cellulose B Mặt cắt của nhánh cellulose 15

Hình 1.2: Cấu trúc của lignocellulose 16

Hình 1.3: Vi khuẩn Bacillus spp 12

Hình 1.4: Cơ chế cắt phytate 18

Hình 2.1: Phương pháp nghiên cứu 25

Hình 2.2: Quy trình chung khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng thủy phân 25

Hình 2.3: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase và phytase của Bacillus spp 27

Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian lắc môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase và phytase của Bacillus spp 28

Hình 2.5: Bố trí thí nghiệm xác định pH thích hợp của enzyme cellulase và phytase 29

Hình 2.6: Bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt của enzyme cellulase và phytase 29

Hình 2.7: Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp của enzyme cellulase và phytase 30

Hình 2.8: Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nhân giống của chủng Bacillus spp trên môi trường cơ bản là bã sắn 31

Hình 2.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đối với khả năng thủy phân cellulose và phytate 33

Hình 2.10: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đối với khả năng thủy phân cellulose và phytate 34

Hình 2.11: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nước đối với khả năng thủy phân cellulose và phytate 35

Hình 2.12: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian ủ đối với khả năng thủy phân cellulose và phytate 36

Hình 2.13: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thành phần bổ sung đối với khả năng thủy phân cellulose và phytate 37

Hình 3.1: Đường kính vòng thủy phân của chủng Bacillus spp 39

Hình 3.2: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 41

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase 42

Hình 3.4: Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 43

Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase 44

Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ enzyme cellulase 45

Hình 3.7: Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ enzyme phytase 46

Hình 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ enzyme cellulase 47

Hình 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ enzyme phytase 47

Hình 3.10: Ảnh hưởng của độ bền nhiệt tới hoạt độ enzyme cellulase 48

Hình 3.11: Ảnh hưởng của độ bền nhiệt tới hoạt độ enzyme phytase 48

Hình 3.12: Ảnh hưởng các yếu tố tới nhân giống vi khuẩn trên bã sắn 49

Hình 3.13: Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến khả năng thủy phân cellulose 51

Hình 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến khả năng thủy phân phytate 51

Hình 3.15: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân cellulose 52

Hình 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân phytate 53

Hình 3.17: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến khả năng thủy phân cellulose 54

Hình 3.18: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến khả năng thủy phân phytate 55

Hình 3.19: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình thủy phân cellulose 56

Hình 3.20: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình thủy phân phytate 57

Hình 3.21: Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng thủy phân cellulose 58 Hình 3.22: Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng thủy phân phytate 59

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết

Sắn là cây nông nghiệp được trồng nhiều ở các nước châu Á, châu Phi đặc biệt

là những nước có điều kiện khí hậu nhiệt đới như Việt Nam, Thái Lan…Hiện nay sắn được xem là nguồn cung cấp lương thực quan trọng chỉ đứng sau lúa gạo, lúa mì Không những là nguồn sản xuất thực phẩm, sản phẩm gia tăng từ sắn cũng là nguồn chính để làm thức ăn chăn nuôi phát triển nông nghiệp

Việc sử dụng bã sắn sau khi thu hồi tinh bột để làm thức ăn gia súc đã được nông dân thực hiện từ lâu Tuy nhiên có những bất cập khi trong bã sắn có chứa hàm lượng glycoside cao, gây ngộ độc và hàm lượng cellulose, phytate đáng kể khiến vật nuôi không hấp thu được dẫn đến hiệu quả kém khi sử dụng sản phẩm dạng này

Bên cạnh đó vấn đề ô nhiễm môi trường từ bã sắn được phản ánh từ nhiều địa phương nhưng vẫn chưa có biện pháp khắc phục nào triệt để Bã sắn sau khi được người dân thu mua từ những công ty, lò chế biến tinh bột thì vận chuyển về khu đất vắng, phơi khô Vào mùa mưa thì nước rỉ từ bã sắn tươi sẽ ôi chua, chảy lênh láng, ô nhiễm sông ngòi, kênh rạch, mùa nắng thì phát sinh thêm mùi hôi, ruồi, giòi phát triển

Đã có những nghiên cứu, ứng dụng quy mô nhỏ, mô hình phòng thí nghiệm hay phương pháp thủ công như lên men, bổ sung vi khuẩn lactic vào bã sắn giúp cho vật nuôi hấp thụ tốt hơn Nguyễn Hữu Văn, Nguyễn Xuân Bả và Bùi Văn Lợi (2009)[16]

đã tiến hành khảo sát, đánh giá giá trị dinh dưỡng của bã sắn công nghiệp ủ chua với các phụ gia để làm thức ăn cho gia súc nhai lại Kết quả cho thấy ủ chua là biện pháp phù hợp để bảo quản bã sắn làm thức ăn cho gia súc nhai lại trong điều kiện nông hộ

Nhóm tác giả Lương Hữu Thành (Viện Môi trường Nông nghiệp) và Nguyễn Kiều Bằng Tâm (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội)[14] đã sử dụng chế phẩm vi sinh vật do Bộ môn Vi sinh Môi trường, Viện Môi trường Nông nghiệp cung cấp (thành phần chính gồm xạ khuẩn, nấm men, vi khuẩn với hoạt tính phân giải cellulose, tinh bột và phân giải phosphatase khó tan), sau đó cho ủ cùng bã sắn theo phương pháp ủ kết hợp có bổ sung thêm các nguyên liệu phụ như rỉ mật, ure, kali, super

lân, vôi bột để làm thức ăn cho gia súc

Đề tài “Bã sắn lên men-nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng cho bò sữa và lợn ở Việt Nam” nghiên cứu bởi Nguyễn Thị Xuân Sâm, Đặng Thị Thu [9] được công bố trên tạp chí Khoa học và Công nghệ - Viện KHTN&CN Quốc gia có thử nghiệm các

qui trình xử lý bã sắn bằng phương pháp lên men vi sinh vật để ủ làm thức ăn gia súc với qui mô nhỏ ở phòng thí nghiệm nhưng chưa áp dụng trong thực tế sản xuất

Công ty CP thực phẩm và đầu tư công nghệ miền Trung (Fococev) đã sản xuất phân bón vi sinh từ chất thải tinh bột sắn Công ty đã sản xuất với công suất 120 tấn sắn tươi/ngày, khắc phục được tình trạng ôi nhiễm do quá trình chế biến mang lại

Các nhà khoa học phòng Vi sinh ứng dụng-Viện sinh học nhiệt đới đã thử sản xuất acid citric bằng cách nuôi một số chủng nấm mốc có lợi trên bã khoai mì Acid citric được cho vào nước giải khát và thực phẩm chế biến, tuy nhiên giá thành chưa thể cạnh tranh với các sản phẩm từ Trung Quốc Sau đó, các kỹ sư đã nghiên cứu sử dụng

bã sắn làm thức ăn cho vật nuôi khi ủ với chế phẩm Probio-S và Bio-E Bio-E là chế

phẩm dạng bột khô, được cấy chủng nấm mốc A.Niger lên bã khoai mì với tỉ lệ 2g

mốc/kg bã Kết quả thử nghiệm trên heo thì sau 3 tháng dùng chế phẩm trên, heo tăng trọng nhanh hơn 1,3-1,4kg so với heo bình thường

Kế thừa và tiếp tục góp kết quả vào các nghiên cứu trên, mong muốn của đề tài

là đưa ra sản phẩm có tính ứng dụng cao đồng thời góp phần giảm chi phí thức ăn chăn nuôi, sử dụng nguồn bã sắn sẵn có hạn chế ô nhiễm môi trường, thúc đẩy ngành chăn nuôi phát triển

Với định hướng trên, đề tài sẽ nghiên cứu tuyển lựa chủng Bacillus spp thủy

phân cơ chất là bã sắn tạo ra sản phẩm thủy phân có tính dinh dưỡng và giúp vật nuôi hấp thụ tốt hơn một cách an toàn

2 Mục tiêu của đề tài

Xây dựng phương pháp tuyển lựa chủng Bacillus spp có khả năng sinh enzyme

cellulase, phytase để ủ bã sắn ứng dụng trong chăn nuôi

3 Ý nghĩa đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp cho ngành khoa học thức ăn chăn nuôi những thông tin cơ bản và hệ thống về phương pháp nghiên cứu chế phẩm vi sinh bao gồm tuyển chọn chủng giống, nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme và thủy phân cơ chất

Những thông tin này có thể được dùng để tham khảo cho các đề tài ứng dụng và các đề tài cùng lĩnh vực

3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus spp sinh enzyme (phytase, cellulase) từ các

nguồn trong tự nhiên

Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp và tính chất của enzyme cellulase, phytase

Khảo sát điều kiện nhân giống vi khuẩn Bacillus spp sinh enzyme (phytase,

cellulase) thích hợp với môi trường cơ bản là bã sắn

Khảo sát điều kiện thích hợp ủ bã sắn bằng vi khuẩn Bacillus subtilis

Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nguyên liệu sắn và bã sắn

1.1.1 Tổng quan về cây sắn

1.1.1.1 Phân loại thực vật và nguồn gốc

Tên khoa học : Maniho esculenta Crantz

Tên tiếng Anh : Cassava, Manioc root, Manihot, Mogo

Tên gọi khác : Khoai mì

Loài tương cận : Sắn lá hẹp Manihot angustiloba (Torr.) Müll.Arg

Phân loại khoa học:

Giới (regnum ) : Plantae

Bộ (ordo ) : Malpighiles

Họ (familia ) : Euphorbiaceae

Phân họ (subfamilia): Crotonoideae

Tông (tribus ) : Manihoteae

Chi (genus ) : Manihot

Loài (species ) : Manihot esculenta

Cây sắn có tên khoa học là Manihot Esculenta Crantz hay một số tên gọi khác như cassava, manioc, tapioca, maniva cassava Ở Việt Nam cây sắn được gọi là cây khoai mì, cây củ mì, sắn tầu…

củ sắn Một số rễ sẽ bị mỏng đi và chỉ có chức năng hút nước và chất dinh dưỡng, còn

rễ phát triển thành củ thì chức năng này không đáng kể

Thân sắn: Là loại cây thân gỗ, hình trụ, có chia đốt và có lóng, sinh trưởng lâu năm cây cao từ 1-5m Thân và cành già đã hóa gỗ có màu trắng bạc, xám, nâu hoặc hơi vàng Thân được cấu tạo gồm 4 lớp (trong cùng là lớp lõi xốp, tế bào rất to, tiếp đến là tầng gỗ, mô mềm của vỏ và cuối cùng là tầng bần)

Lá sắn: Là loại lá đơn mọc xen kẽ, thẳng hàng trên thân cây Lá gồm 2 phần: cuống và phiến lá Lá có thùy sâu, dạng chân vịt, thùy thường có cấu tạo số lẻ từ 5-7 thùy Lá gần cụm hoa có số thùy giảm dần và thậm chí không chia thùy, lá phía trên thường có biểu bì bóng như sáp Cuống lá dài từ 5-30cm và có các màu sắc khác nhau phụ thuộc vào giống sắn chủ yếu là màu hồng, vàng, xanh, đỏ tươi

Hoa sắn: Hoa thuộc loại hoa chùm, đơn tính có cuống dài mọc ra từ chổ phân cành, ngọn thân Những cụm hoa gồm một trục dài 2-10cm và nhiều trục bên hợp thành nên gọi là chùy Hoa cái thường nở trước hoa đực từ 5-7 ngày

Quả sắn: Có kích thước từ 1-1,5cm, 1 quả thường có 3 hạt Màu quả đa dạng phụ thuộc vào giống Hạt sắn hình trứng tiết diện hơi giống hình tam giác Quả sắn thành thục sau khi thụ phấn 75-90 ngày Hạt sắn nặng từ 95-136mg, màu nâu đen, trơn nhẵn, có đường gân màu nâu Hạt sắn nảy mầm ngay sau khi được thu hoạch, quá trình nảy mầm mất khoảng 16 ngày

Sắn là nguồn thực phẩm carbohydrate thứ 3 sau lúa và ngô Ở những quốc gia đang phát triển, sắn là nguồn lương thực chính, cung cấp khẩu phần ăn hơn nửa tỷ người Nó là một trong những cây trồng chịu hạn lớn nhất, nước Nigeria là nước sản xuất lớn nhất thế giới về sắn Rễ sắn là nguồn cung cấp carbohydrate nhưng nó lại khá nghèo protein Một chế độ ăn chủ yếu là sắn thì có thể gây nên suy dinh dưỡng

Sắn được phân thành sắn ngọt hoặc sắn đắng Như các hệ rễ của thực vật khác, sắn chứa các chất kháng dinh dưỡng và độc tố vì thế cần sơ chế cẩn thận trước khi chế biến Nếu sơ chế không đúng, dư lượng cyanide có thể gây ngộ độc cấp tính Tuy nhiên, nông dân hay lựa chọn trồng sắn đắng vì có khả năng chống chịu côn trùng gây hại cao

Cây sắn được trồng ở nhiều nước trên thế giới từ 30o vĩ Bắc đến 30o vĩ Nam với

độ cao giới hạn trong khoảng 2000m Sản phẩm từ sắn (củ, thân, lá) được dùng để chế biến ra nhiều loại sản phẩm phục vụ cho nhiều ngành công nghiệp như: dược, dệt, hóa dầu thực phẩm, chăn nuôi…Giá trị của cây sắn ngày càng được nâng cao nhờ những ứng dụng rộng rãi của nó Trong ngành dược, tinh bột sắn được dùng làm tá dược trong sản xuất thuốc, biến tính tinh bột sắn cho nhiều sản phẩm có giá trị như đường glucose, fructose…để làm dịch truyền hoặc các phụ gia cho các sản phẩm khác Tinh bột sắn còn được dùng để làm hồ vải, làm lương thực, thực phẩm cho người, đặc biệt tinh bột sắn là thành phần không thể thiếu trong ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi

10 củ ít tinh bột hàm lượng nước cao, lượng chất hòa tan nhiều, như vậy nếu chế biến sắn non không những tỷ lệ thành phần tinh bột thấp mà còn khó bảo quản Sau tháng 2

và 3 lượng tinh bột trong củ lại giảm vì một phần phân hủy thành đường để nuôi mầm non trong khi cây chưa có khả năng quang hợp

Đường trong sắn chủ yếu là glucoza và một lượng mantoza, saccaroza Sắn càng già thì hàm lượng đường càng giảm Trong chế biến, đường hòa tan trong nước thải ra theo nước dịch

Protein của sắn tới nay chưa được nghiên cứu kỹ, tuy nhiên vì hàm lượng thấp cho nên cũng ít ảnh hưởng tới quy trình công nghệ

Ngoài những chất dinh dưỡng trên sắn còn có độc tố, tanin, sắc tố và hệ enzym phức tạp Những chất này gây khó khăn cho chế biến và nếu quy trình không thích hợp thì chất lượng sản phẩm kém

Độc tố trong sắn là HCN Nhưng khi chưa đào nó ở dạng glucozit gọi là phazeolutatin, dưới tác dụng của enzym hay môi trường axit thì phân hủy tạo thành glucoza, axeton và axit xyanhydric Như vậy, khi đào sắn rồi mới xuất hiện HCN tự do

vì chỉ sau khi đào các enzym trong sắn mới bắt đầu hoạt động mạnh đặc biệt xuất hiện nhiều khi chế biến hoặc sau khi ăn sắn

Phazeolunatin có công thức hóa học C10H17O6N hòa tan tốt trong nước, kém tan trong rượu metylic, rất ít hòa tan trong clorofoc và hầu như không tan trong ete Vì tan tốt trong nước nên khi chế biến tinh bột độc tố theo nước dịch ra ngoài Vì vậy, mặc dù sắn đắng có hàm lượng độc tố cao nhưng tinh bột và sắn lát từ sắn đắng vẫn sử dụng làm thức ăn cho con người và gia súc tốt Song nếu chế biến không tách dịch bào nhanh thì có thể ảnh hưởng tới màu sắc tinh bột do axit xyanhydric tác dụng với sắt tạo thành sắt xyanat có màu xám

Tùy thuộc giống và đất nơi trồng mà hàm lượng độc tố trong sắn khoảng 0,001-0,04% Sắn ngọt có hàm lượng độc tố thấp còn sắn đắng thì cao Tuy nhiên nếu trồng sắn ngọt với đất nhiều đạm thì lượng độc tố trong củ nhiều hơn

Phazeolunatin chủ yếu tập trung ở vỏ cùi nên dễ giảm bớt khi sử dụng sắn bằng cách bóc vỏ và ngâm vào nước

Enzym trong sắn tới nay chưa được nghiên cứu kỹ Người ta cho rằng trong số các enzym thì polyphenol-oxydase có ảnh hưởng nhiều tới chất lượng sắn trong bảo quản và chế biến Khi chưa đào, hoạt độ của các enzym trong sắn yếu và ổn định, nhưng sau khi đào thì mọi enzym đều hoạt động mạnh Polyphenoloxydase xúc tác quá trình oxy hóa polyphenol tạo thành octoquinon sau đó trùng hợp với các chất không có bản chất phenol như axit amin để hình thành các sản phẩm có màu Trong nhóm polyphenoloxydase có những enzym oxy hóa monophenol mà điển hình là tirozinaza xúc tác sự oxy hóa axit amin tirozin tạo ra khi kinon tương ứng Sau một loạt chuyển hóa các kinon này sinh ra sắc tố màu xám đen gọi là melanin Đây là một trong những nguyên nhân làm cho thịt sắn có màu đen mà thường gọi là sắn chảy nhựa Vì enzyme chủ yếu tập trung trong mủ ở vỏ cùi cho nên các vết đen cũng xuất hiện trong thịt củ bắt đầu từ lớp ngoại vi

Khi sắn chảy nhựa thì khi chế biến như luộc, hấp sẽ bị sượng và khi mài xát khó phá vỡ tế bào để giải phóng tinh bột do đó hiệu suất lấy tinh bột thấp và tinh bột không trắng

Ngoài tirozinase, các enzym oxy hóa khử khác cũng hoạt động mạnh làm tổn thất chất khô của củ

Tanin trong sắn ít nhưng sản phẩm oxy hóa tanin là chất flobafen có màu sẫm đen khó tẩy

Khi chế biến, tanin còn tác dụng với sắt tạo thành sắt tanat cũng có màu sẫm đen Cả hai chất này đều ảnh hưởng tới màu sắc tinh bột nếu như khi chế biến không tách dịch bào nhanh và triệt để

Sắc tố trong sắn tới nay cũng chưa được nghiên cứu đầy đủ, tuy nhiên trong bảo quản và chế biến đều xảy ra quá trình hình thành của sắc tố mới do tác dụng của polyphenoloxydaza oxy hóa polyphenol tạo thành các octoquinon và sau đó tạo thành flobafen có màu đen

Cũng giống khoai tây trong bảo quản tươi sắn thường nhiễm bệnh thối khô và thối ướt do nấm và vi khuẩn gây nên đặc biệt đối với những củ bị tróc vỏ và dập nát Ngoài ra khác với khoai tây là có bệnh chảy nhựa và nếu chảy nhựa nghiêm trọng thì dẫn tới hiện tượng thối khô

1.1.1.5 Diện tích, sản lượng sắn trong và ngoài nước

Việt Nam: Diện tích trồng sắn và sản lượng sắn ngày càng tăng trong cả nước

Các khu vực canh tác sắn chủ yếu tập trung ở các vùng trung du và vùng núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam, chiếm khoảng

80 % tổng sản phẩm trên cả nước (Bảng 1.2)

Bảng 1.2: Sản lượng sắn ở các khu vực Việt Nam giai đoạn 2000 – 2010

Khu vực

tấn

2000 2005 2006 2007 2008 2009 Sb 2010 Đồng bằng sông

Trung du và miền

núi phía Bắc 678,5 986,8 1070,8 1132,3 13099 1220,1 1260,1 Bắc Trung Bộ và

Duyên hải miền

Trung

645,9 1855,9 2167,6 2359,9 2736,3 2561,0 2607,6

Tây Nguyên 351,5 1446,6 2058,8 2090,4 2371,7 2148,8 2179,5 Đông Nam Bộ 154,3 2270,5 2327,4 2434,4 2684,8 2401,4 2283,3 Đồng bằng sông Cửu

CẢ NƯỚC 1986,3 6716,2 7782,5 8192,8 9309,9 8530,5 8521,6

Theo GSO (2011)

Trên thế giới:

Sản lượng sắn thế giới năm 2012 ước tính đạt 252,125 triệu tấn củ tươi so với

2011 là 245,71 triệu tấn và 1961 là 71,26 triệu tấn Nước có sản lượng sắn nhiều nhất thế giới là Nigeria (54 triệu tấn), kế đến là Thái Lan (26,6 triệu tấn) và Indonesia (23,9 triệu tấn) Việt Nam đứng thứ tám trên thế giới về sản lượng sắn (9,75 triệu tấn) (FAO 2013)

Mức tiêu thụ sắn bình quân toàn thế giới năm 2012 khoảng 18,1 kg/người/năm Sản lượng sắn của thế giới được tiêu dùng trong nước khoảng 93% (sử dụng làm lương thực, thức ăn gia súc, chế biến công nghiệp …), còn lại 7% (17,5 triệu tấn) được xuất khẩu dưới dạng sắn lát khô, sắn viên (60%) và tinh bột (40%) (FAO, 2013)

1.1.2 Bã sắn [6]

Bã sắn được thải ra trong quá trình sản xuất tinh bột và tập trung nhiều tại Đồng Nai, Gia Lai, Tây Ninh và Bình Phước Theo ước tính, một nhà máy chế biến có công suất 30÷100 tấn/ngày thì sẽ sản xuất được 7,5÷25 tấn tinh bột, kèm theo đó là 12÷48 tấn bã Thứ phế thải này thường được phơi khô thành từng luống trắng xoá trên đồng ruộng và dùng để

bổ sung cellulose cho gia súc, gia cầm Tuy nhiên, do khó tiêu và không mùi nên bã sắn không hấp dẫn đối với vật nuôi Nếu trời mưa vài ngày thì bã sắn thối rữa, bốc mùi hôi thối Đến khi trời nắng lên thì nấm mốc độc hại phát triển và theo gió phân tán khắp nơi, ảnh hưởng tới môi trường và sức khoẻ con người

Hình 1.1: Hình ảnh bã sắn khô Bảng 1.3: Thành phần hóa học của bã sắn

20- 25 0,1- 1,0 0,1 5-7

16

Từ bảng 1.3 trên cho thấy bã sắn với hàm lượng tinh bột chiếm 5- 7% trọng lượng bã, ước tính mỗi năm ngành sản xuất tinh bột củ bị thất thoát khoảng 50,8- 69,8 nghìn tấn tinh bột sắn Nếu không được xử lí kịp thời, các chất hữu cơ trong bã sắn bị phân hủy

có mùi khó chịu, làm ô nhiễm môi trường không khí, ảnh hưởng tới sức khỏe con người Ngoài ra, hàm lượng nước trong bã cao gây khó khăn trong bảo quản và sử dụng bã

1.1.3 Các sản phẩm từ sắn và bã sắn [6]

Phương án xử lý bã sắn có hiệu quả nhất là tận dụng bã sắn để sản xuất ra những sản phẩm có giá trị, vì như vậy có thể tiết kiệm được toàn bộ hoặc đáng kể chi phí xử lý bã sắn, mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn cho cơ sở sản xuất Ghildal và Losane (1990) đã xem xét, phân tích lợi ích, tính khả thi của các phương án xử lý bã sắn như sau:

- Làm thức ăn cho động vật: Bã sắn sau khi phơi nắng hoặc sấy khô thường

được làm thức ăn cho gia súc, có thể cho ăn trực tiếp hoặc trộn lẫn với các chất dinh dưỡng khác Phương án này ít có hiệu quả kinh tế vì giá bã sắn phơi khô trên thị trường rất thấp Ngoài ra, phơi bã sắn còn phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, gây mùi hôi và ở chừng mực nào đó có thể bị hư hỏng Hơn nữa, phơi bã sắn không thể áp dụng cho các cơ sở sản xuất lớn vì lượng bã sắn thải ra hàng ngày quá lớn

- Làm phân bón: Ngoài tinh bột và cellulose, bã sắn còn có một ít nitơ,

photpho, kali và các chất khoáng khác nên làm phân bón rất tốt Nhưng do chi phí vận chuyển cao nên việc dùng bã sắn làm phân bón chỉ giới hạn ở khu vực gần nhà máy chế biến Hơn nữa, lượng axit trong bã sắn ảnh hưởng đến chất lượng phân bón, những chất dễ bay hơi trong bã sắn ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái, nên ít được quan tâm

- Sản xuất syrup glucose: Đã có các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật kết hợp axit –

enzym và enzym – enzym ở mức độ phù hợp để chuyển được 98-99% tinh bột có trong bã sắn thành siro chứa lượng glucose cao (70% lượng đường khử) Căn cứ vào ước tính chi phí thì quy trình trên không kinh tế vì chi phí cô đặc sản phẩm thuỷ phân cao, phải dùng nhiều than hoạt tính để khử màu, khó khuấy trộn khối bã sắn dày trong nồi, nên truyền nhiệt không hiệu quả

- Sản xuất rƣợu etylic: Sau khi thuỷ phân tinh bột có trong bã sắn theo quy

trình axit – enzym, cô đặc để đạt lượng đường 15%, lên men rượu bằng cách sử dụng

nấm men Saccharomyces cerevisiae FT-18 Quá trình thuỷ phân tinh bột ở bã sắn chỉ

đạt khoảng 7% đường khử Nếu muốn có dịch đường đạt đến 15%, có thể sử dụng hai phương án: hoặc cho thêm mật mía vào hoặc cô đặc sản phẩm thuỷ phân Tuy nhiên,

cả hai phương án đều kém khả thi Thêm vào đó lượng nước thải ra từ các nhà máy sẽ nhiều hơn và làm phát sinh chi phí xử lý nước thải cao hơn

- Làm cơ chất cho quá trình lên men ở trạng thái rắn: Đã có một số công

trình nghiên cứu sử dụng bã sắn thay thế cho cám lúa mì trong quá trình lên men VSV

ở trạng thái rắn

1.2 Tổng quan về Bacillus subtilis

1.2.1 Đặc điểm của Bacillus subtilis

Bacillus spp là loài vi khuẩn gram dương, hình que, hiếu khi và hình thành bào

tử, đặc điểm hình thái này cho phép phân biệt với các chủng khác Bacillus có chút tương đồng hình dạng với Clostridium spp ngoại trừ Clostridium là chủng vi khuẩn kỵ khí bắt buộc trong khi Bacillus thì hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc Tính chất hiếu khí của loài Bacillus giúp thuận lợi hơn khi nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

hoặc trong ứng dụng công nghiệp

Hình 1.2: Vi khuẩn Bacillus spp

Bacillus spp được tìm thấy chủ yếu trong đất, phân vật nuôi, bùn, rác Hầu hết

các chủng vi khuẩn Bacillus spp không gây hại cao ngoại trừ Bacillus anthracis gây bệnh than Có 4 loài chính trong họ Bacillacaea mà hiếu khí, hình thành bào tử là

Thermoactinomycetes, Sporoarcina, Sporolactobacillus và Bacillus Chủng Bacillus

gồm trên 60 loài phân bố rộng rãi khắp nơi Theo Sonenshein, gene Bacillus có thể phân thành 6 nhóm dựa trên hình thái và đặc điểm gene tương đồng Những loài

Bacillus được phân loại dựa trên tương đồng DNA sử dụng phương pháp định danh

theo chuỗi lai giống DNA-DNA và chuỗi 16S rDNA [22]

Bacillus hình thành bào tử dưới điều kiện môi trường sống hạn chế như nhiệt độ

cao, dinh dưỡng kém (đặc biệt hạn chế về hàm lượng carbon, nitrogen hoặc phosphore) Bào tử được hình thành trong tế bào chất của vi khuẩn ban đầu và chuyển thành dạng bất hoạt Nó có thể tồn tại trong điều kiện vật lý và hóa học có thể giết chết

tế bào sinh dưỡng Bào tử tồn tại trong thời gian dài và khi điều kiện môi trường thích hợp, nó sẽ chuyển thành tế bào sinh dưỡng Bào tử tạo thuận lợi cho việc phân tán vi khuẩn trên diện rộng khi nó có thể bay theo gió, bụi lan vào trong tự nhiên [22]

Nhiều ứng dụng Bacillus liên quan tới tính chất hình thành bào tử Khả năng

tồn tại ở điều kiện khắc nghiệt giúp nó có tính ổn định trong các quá trình sản xuất

Một vài chủng Bacillus được ứng dụng cho các sản phẩm giặt tẩy, kháng vi sinh vật,

sinh tổng hợp enzyme

Bacillus subtilis là loài vi khuẩn hiếu khí có khả năng tồn tại trong môi trường

kỵ khí, đặc biệt là khi có glucose và nguồn nito tương ứng Bào tử của Bacillus subtilis

có hình oval nằm vị trí trung tâm hoặc phía cuối

Bacillus subtilis có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như thực phẩm, nước

uống, chất tẩy rửa Ví dụ như nó được sử dụng để sản xuất natto, một sản phẩm lên

men đậu nành của Nhật Bản Trong nông nghiệp, Bacillus subtilis có thể được dùng để kháng nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum và Botryodiplodia theobromae và để

cung cấp dinh dưỡng như phosphore hay sulphur kích thích giúp cây trồng phát triển

Vi khuẩn này cũng được dùng trong công nghiệp để sản xuất enzyme quy mô lớn Nó

có khả năng sản xuất α-amylase, β-glucanase , chitinase, β-galactosidase , cellulase, phytase [21]

Bacillus subtilis dễ dàng được phân lập từ môi trường xung quanh Từ đất, vi

khuẩn được lan truyền tới thực vật, động vật, thực phẩm, môi trường nước

1.2.2 Các nghiên cứu sinh tổng hợp cellulase từ Bacillus spp

Nghiên cứu của Rasstogi G [30] “Characterization of thermostable cellulose

produced by Bacillus and Geobacillus strains” động lực học của phản ứng đạt

3,11-1,08mg/ml và có khả năng chịu được nhiệt độ 70oC trong 1 ngày

L M Robson (1984) [31] đã nghiên cứu các chủng Bacillus và có nhiều tính chất tương đồng với Bacillus subtilis qua bài “Characterization of cellulolytic activity

of a Bacillus isolate” Khi sinh trưởng trên nhiều loại đường, dịch nổi thu được có hoạt

tính cellulolytic khi kiểm chứng bằng cách phân giải với trinitrophenyl0carboxymethyl cellulose, còn sinh trưởng trên cellobiose và glucose thì khả năng sinh hoạt độ rất tốt Enzyme chỉ sinh tổng hợp ở pha cân bằng và thông số tối ưu ở pH=4,8 tại 58oC

Nghiên cứu “Purification and characterization of cellulases produced by two

Bacillus strains” của Mawadza C, Hatti-Kaul R, Zvauya R [28] đã phân lập được 2

chủng Bacillus CH43 và HR68 từ suối nước nóng của Zimbawe Các enzyme này có

hoạt độ tối ưu khi pH 5-6,5, nhiệt độ 65-70oC, bền ở nhiệt độ 50oC trong 1 ngày

Nghiên cứu “Studies on cellulase production by a Bacillus subtilis” của

Kwong-Yu Chan [27] đã phân lập được chủng Bacillus subtilis AU-1 sinh tổng hợp

carboxymethylcellulase (CMCase) với môi trường chứa D(+) raffinose 0,2% là chất cảm ứng, 0,5% cao nấm men, 0,5% acid casamino và 0,5% proteose pepton ở nhiệt độ

50oC với pH=6 Hoạt độ đạt mức cao nhất sau 10 giờ lắc

1.2.3 Các nghiên cứu sinh tổng hợp phytase từ Bacillus spp

Nghiên cứu “Phytase production by Bacillus subtilis US417 in submerged and

solid state fermentations” của Radhouane Kammoun [25] đã khảo sát ảnh hưởng của

các biến cách ủ, methanol, cao nấm men ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp Bacillus

subtilis US417 theo mô hình tối ưu hóa đáp ứng bề mặt Plackett-Burman có hoạt độ

enzyme đạt 112U/g

Nghiên cứu “Characterization of a Thermostable alkaline phytase from Bacillus

licheniformis” của Shijun Fu [18] đã phân lập được chủng Bacillus licheniformis Hoạt

độ cao nhất đạt 0,267U/ml khi ở nhiệt độ tối ưu 55oC, pH=7 Sau khi xử lý ở nhiệt độ

80oC trong 10 phút, hoạt độ còn lại 57,36%

1.3 Tổng quan về cellulase, phytase

1.3.1 Giới thiệu về cellulase

1.3.1.1 Giới thiệu về cellulose

Xơ trong thực vật thành phần chủ yếu là cellulose và hemicellulose, lignin Nó

là nguồn chất hữu cơ có nhiều trong tự nhiên và chiếm khoảng 50% nguồn carbon trên thế giới Cellulose tồn tại nhiều dưới dạng cấu trúc polymer và được thấy nhiều trong thực vật, tảo, nấm và một vài vi khuẩn Trong thực vật, hàm lượng cellulose chiếm trung bình khoảng 20% trong cỏ, 45% trong gỗ (trọng lượng khô) và 90% trong sợi cotton [11]

Nhiều nghiên cứu đã mô tả cấu trúc cellulose gồm nhiều đơn vị cellobiose, là 2 tiểu đơn vị glucose gắn với nhau bởi cầu nối β-D-1,4 glucosidic ở góc 180o Chiều dài của nhánh β-D-glucan tùy vào nguồn gốc của nó, ví dụ 10000 đơn vị mỗi nhánh đối với gỗ và 15000 đơn vị trong cotton [11]

Các nhánh cellulose nằm song song với nhau tạo thành các vi sợi Cellulose khá cứng và không tan trong nước nhờ các cầu nối hydrogen bên trong giữa các phân tử và liên kết kỵ nước giữa các nhánh với nhau.Vi sợi được cấu tạo từ các vùng tinh thể định hình xen giữa một số ít vùng vô định hình ít trật tự Số lượng tinh thể giữa vùng định hình và vô định hình phụ thuộc vào nguồn gốc sinh học của cellulose Vi sợi có thể bé

hơn 30nm trong thành tế bào thực vật và rộng khoảng 20nm trong tảo Valonia

Macrophyase [14]

Hình 1.3: A Cấu trúc cơ bản của cellulose B Mặt cắt của nhánh cellulose

Trong tự nhiên, các vi sợi cellulose quấn với hemicelluloses và lignin tạo thành hợp chất khá phức tạp gọi là lignocelluloses Cấu trúc kết hợp với lignocelluloses giúp cho thành tế bào thực vật tăng sức căng để chịu được áp suất thẩm thấu và các tác động cơ học [14]

Hình 1.4: Cấu trúc của lignocellulose

Trong tự nhiên cơ chất lignocelluloses bao phủ bên ngoài cellulose/hemicelluloses cản trở sự tương tác với enzyme Lignin là thành phần khá phức tạp trong hợp chất lignocelluloses Nhiều phương pháp tiền xử lý được nghiên cứu nhằm loại bỏ lignin để tăng sự tương tác của cellulose với sự tác dụng của enzyme Những cách hay được sử dụng như nghiền, rửa với alcohol hoặc dung môi hữu cơ; xử lý với kiềm như sodium hydroxide và ammonia; xử lý với acid như acid acetic và acid hydrochloric; hoặc là xử lý hơi nước cho sợi lignin bung ra Trong ngành sản xuất giấy thường sử dụng Lignozyme để làm mềm gỗ dễ xử lý enzyme Trong tự nhiên có loại nấm rễ trắng có khả năng tách lignin làm cho nấm và vi khuẩn

có thể tấn công cellulose [14]

1.3.1.2 Cơ chế cắt cellulose

Enzyme cellulase chịu trách nhiệm cắt mạch cellulose thành đường glucose Quá trình gồm 2 bước: chuyển cellulose thành cellobiose bằng enzyme β-1,4-glucanase và từ đường cellobiose thành glucose bằng β-glucosidase [12]

Glucanase được chia thành 2 nhóm endoglucanase và exoglucanses Endoglucanases đề polymer nhóm cellulose vô định hình (cơ chất thương mại thường gặp là carboymethyl cellulose CMC) bởi vì nó có thể tấn công liên kết β-glucosidic ngẫu nhiên trong nhánh cellulose Cellulose định hình (cơ chất như Avicel) liên kết bởi cầu hydrogen nên enzyme không thể tấn công β-glucosidic Vì thế, exoglucanase (hay cellobiohydrolases) tấn công vào liên kết glycosidic từ phía ngoài cùng của cellulose định hình Exoglucanase giải phóng nhóm cellobiose từ cuối mạch cellulose, sau đó sẽ bị tách thành glucose bằng bellobiase (hoặc β-glucosidases) [12]

1.3.2 Giới thiệu về phytase

1.3.2.1 Giới thiệu về phytate

Phytate là một dạng phosphor hữu cơ chiếm từ 1 đến 5% (w/w) của đậu hạt, ngũ cốc, hột chứa dầu, phấn hoa và hạnh nhân; hầu hết thực phẩm có nguồn gốc thực vật từ 50% đến 80% phosphor tổng là phytate và dĩ nhiên phytate chứa khoáng liên kết với acid amine và protein Trong tự nhiên, acid phytic tồn tại chủ yếu trong các dạng muối phytate dưới dạng phức với các cation quan trọng cho dinh dưỡng như Ca2+, Zn2+

và Fe2+ và phytate chứa 14-25% phosphor, 1,2-2% canxi, 1-2% kẽm và sắt Lượng phytate cao nhất trong các loại ngũ cốc, bắp (0,83-2,22%) và trong các loại hạt đậu (5,92-9,15%) [20]

Phytate làm giảm khả năng tiêu hóa protein, tinh bột và lipid vì phytate tạo phức làm protein kém tan và kháng lại được sự phân giải protein Acid phytic có thể ảnh hưởng đến tiêu hóa tinh bột thông qua sự tương tác với enzyme amylase Ở pH thấp, acid phytic có điện tích âm mạnh vì các nhóm phosphate phân ly không hoàn toàn Dưới điều kiện này acid phytic có ảnh hưởng xấu đến khả năng hòa an protein vì liên kết ion của các nhóm phosphate của acid phytic và các gốc acid amine bị ion hóa (lysine, histidine, arginine) Trong pH acid, acid phytic có thể gắn chặt với các protein thực vật, vì điểm đẳng điện của proein này nằm trong pH 4,0-5,0 Ở pH 6,0-8,0 acid phytic và protein thực vật đều có điện tích âm, phức hợp acid phytic và protein vẫn được hình thành Việc gắn kết này làm giảm giá trị dinh dưỡng protein thực vật [33]

Thành phần thức ăn chăn nuôi của chứa nhiều phytate và hàm lượng này khiến động vật khó hấp thụ các chất khác Đối với thú nhai lại thì phần phosphor này được các enzyme trong cơ thể giúp tiêu hóa dễ dàng nhưng với các loài còn lại thì rất khó

khăn Vì thế enzyme phytase thường được bổ sung vào trong thức ăn chăn nuôi hoặc các sản phẩm thực phẩm chứa nhiều phytate dành cho con người và vật nuôi

1.3.2.2 Cơ chế cắt phytate

Enzyme phytase tấn công vào nhóm phosphate đầu tiên và phân giải liên kết monophosphoester, giải phóng phosphor vô cơ và myo-inositol pentakisphosphate Sau đó, năm nhóm phosphate còn lại được tiếp tục tách ra khỏi phytate nhờ phytase hoặc những enzyme phosphatase không đặc hiệu khác vốn hiện diện với số lượng lớn trong đường tiêu hóa của vật chủ

Hình 1.5: Cơ chế cắt phytateCơ chế cắt phytate 1.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng bã sắn làm thức ăn chăn nuôi

Các nghiên cứu về ứng dụng bã sắn thường được tiến hành ở những nước đang phát triển và kém phát triển nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng của nguồn lương thực tại chổ

Những đề tài chuyên đi sâu về nghiên cứu những thành phần dinh dưỡng từ sản phẩm thừa của sắn nhằm tạo tiền đề nghiên cứu cho nhứng đề tài ứng dụng lựa chọn phương án có thể tận dụng được bã sắn Chẳng hạn như đề tài về thành phần dinh dưỡng của bã sắn của S O Aro , V A Aletor, O O Tewe và J O Agbede[13] ở Nigeria:

“Nitritional potentials of cassava tuber wastes: A case study of a cassava starch processing factory in souhth-western Nigeria” đăng trên tạp chí Livestock Research for Rual Development (Nghiên cứu chăn nuôi dành cho khu vực miền núi) số 22 năm

2010 Nghiên cứu so sánh thành phần giữa phần thải từ sắn củ (CTW), vỏ sắn (CAP), nước thải (CAE), phần còn lại của sắn (CAS), dịch whey của sắn (CAW) Kết quả cho thấy hàm lượng xơ cao nhất ở CAP 29,6%, protein cao nhất 4,2% ở CAP Hàm lượng phytate cao nhất là 15926mg/kg trong CAS

Bên cạnh đó, các đề tài cũng cố gắng khai thác những phương án để xử lý bã sắn nhằm giảm gánh nặng cho môi trường đồng thời cũng tăng tính kinh tế cho sản phẩm

có nhiều xu hướng tận dụng bã sắn như thủy phân thu hồi đường glucose nuôi vi sinh/nấm, nhiên liệu sinh học, thức ăn chăn nuôi…Đề tài của S.Gaewchingduang và P Pengthemkeerati (2010) [20] đã chỉ ra các biện pháp xử lý bã sắn nhằm nâng cao hiệu suất chuyển hóa thành đường khi thủy phân bã sắn bằng enzyme và bằng acid Kết quả cho thấy khi thủy phân bã sắn bằng enzyme thì xử lý nhiệt ở 1300C trong 30 phút sẽ làm tăng hiệu suất thu hồi đường, trong khi đối với thủy phân bằng acid là 1200C trong

60 phút

Obol (2006) [19] nghiên cứu việc tổng hợp dinh dưỡng bằng cách lên men từ

vỏ sắn sử dụng hỗn hợp vi khuẩn Saccharomyces cerevisae và Lactobacillus spp

Phương pháp được áp dụng gồm (trộn 150ml dịch nước thải từ chế biến sắn với 200g

vỏ đã phơi, rửa, nghiên nhỏ/ trộn 150ml dịch nước thải từ chế biến sắn đã ủ lên men với 200g vỏ phơi khô nghiền nhỏ) để xem xét khả năng lên men Mẫu không ủ được dùng làm mẫu chứng Kết quả cho thấy hàm lượng protein tăng 8,2% so với mẫu không ủ Hàm lượng carbohydrate trong vỏ sắn giảm 51,1% khi ủ với dịch đã lên men trước Hàm lượng đường đã thủy phân có thể tận dụng để trồng nấm hoặc tạo nguồn thu glucose Nghiên cứu cũng quan sát rằng không có sự thay đổi về hàm lượng xơ thô, tro và khoáng trong vỏ sắn

Sriroth (1999) [26] với đề tài “Processing of cassava waste for improved biomass ultilization” (Chế biến nước thải sau xử lý sắn nhằm tận dụng tăng sinh khối sinh học) đã tận dụng ủ bã sắn với hỗn hợp enzyme cellulase và pectinase nhằm thu hồi lượng đường được thủy phân để cải thiện sinh khối lên men

Nhiều đề tài của nước ngoài tập trung theo xu hướng xử lý sạch, chăn nuôi giảm giá thành kinh tế, tạo nhiên liệu sạch nhằm phát triển một ngành nông nghiệp bền vững Nhiều đề tài trong nước được nghiên cứu nhằm đưa ra những đánh giá, quy trình ủ

bã sắn để nâng cao giá trị bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên các nghiên cứu

chỉ mới tập trung làm thức ăn chăn nuôi cho bò, gia súc nhai lại, chưa có tận dụng làm thức ăn cho lợn – vật nuôi phổ biến của nông dân nhiều vùng miền Việt Nam

Nguyễn Hữu Văn, Nguyễn Xuân Bả và Bùi Văn Lợi (2009)[16] đã tiến hành khảo sát, đánh giá giá trị dinh dưỡng của bã sắn công nghiệp ủ chua với các phụ gia để làm thức ăn cho gia súc nhai lại Kết quả cho thấy ủ chua là biện pháp phù hợp để bảo quản

bã sắn làm thức ăn cho gia súc nhai lại trong điều kiện nông hộ Hàm lượng HCN giảm đáng kể sau 21 ngày ủ nên có thể sử dụng một lượng lớn bã sắn ủ trong khẩu phần cho gia súc nhai lại mà không gây ngộ độc

Nhóm tác giả Lương Hữu Thành (Viện Môi trường Nông nghiệp) và Nguyễn Kiều Bằng Tâm (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội)[14] đã sử dụng chế phẩm vi sinh vật do Bộ môn Vi sinh Môi trường, Viện Môi trường Nông nghiệp cung cấp (thành phần chính gồm xạ khuẩn, nấm men, vi khuẩn với hoạt tính phân giải cellulose, tinh bột và phân giải phosphatase khó tan), sau đó cho ủ cùng bã sắn theo phương pháp ủ kết hợp có bổ sung thêm các nguyên liệu phụ như rỉ mật, ure, kali, super lân, vôi bột để làm thức ăn cho gia súc

Đề tài “Đánh giá giá trị dinh dưỡng của bã sắn công nghiệp ủ chua với các phụ gia để làm thức ăn cho gia súc nhai lại” của Nguyễn Hữu Văn [10] với thành phần cám gạo 3%+ muối ăn 0.5% (tính theo khối lượng tươi) (BSC); rỉ mật 3% + muối ăn 0,5% (BSMa); và muối ăn 0.5% (BSMu) để ủ chua làm thức ăn gia súc trong quy mô gia đình.Kết quả là giá trị pH và hàm lượng HCN ở các công thức giảm nhanh chóng sau khi ủ Giá trị pH thấp dưới 3,8 sau 21 ngày ủ và hàm lượng HCN sau 14 và 21

ngày ủ lần lượt giảm dưới mức 100 và 80mg/kg DM

Nghiên cứu “Khả năng lên men bề mặt của Aspergillus niger XP trên bã sắn để

thu phytase dùng cho chăn nuôi động vật dạ dày đơn” của Ngô Thanh Xuân, Mai Thị Hằng [7] đã thu được enzyme phytase có hoạt độ 4,84 IU/g với thành phần môi trường

bổ sung 3% KNO3, pH 4, ủ trong 40 giờ ở 30oC

Đề tài “Bã sắn lên men-nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng cho bò sữa và lợn ở Việt Nam” nghiên cứu bởi Nguyễn Thị Xuân Sâm, Đặng Thị Thu [9] được công bố trên tạp chí Khoa học và Công nghệ - Viện KHTN&CN Quốc gia có thử nghiệm các qui trình xử lý bã sắn bằng phương pháp lên men vi sinh vật để ủ làm thức ăn gia súc với qui mô nhỏ ở phòng thí nghiệm nhưng khó áp dụng trong thực tế sản xuất

Nghiên cứu của Nguyễn Xuân Bả, Nguyễn Hữu Văn, Lê Đức Ngoan (2008) [3]

“Kết quả bước đầu sử dụng bã sắn ủ chua để vỗ béo bò thịt”, tạp chí Khoa Học, Đại học huế; số 49-2008; trang 5-11 Thí nghiệm được tiến hành trên 20 bò đực Laisind và được phân thành 5 lô theo nguyên tắc ngẫu nhiên và đồng đều về tuổi, khối lượng, thể trạng Khẩu phần của bò gồm 33% thức ăn xanh và 66% thức ăn tinh (theo vật chất khô) và rơm lúa cho ăn tự do ban đêm Khi tăng tỷ lệ bã sắn ủ trong khẩu phần vỗ béo

bò thịt lên 85% trong thức ăn tinh đã có ảnh hưởng giảm tỷ lệ tiêu hóa biểu kiến chất hữu có và năng lượng khẩu phần (p<0,05) và không ảnh hưởng một cách đáng kể đến lượng chất hữu cơ thu nhận hoặc năng lượng thu nhận hoặc tăng trọng của bò ở các lô thí nghiệm Bã sắn ủ chua là nguồn thức ăn tiềm năng để vỗ béo bò thịt

Công ty CP thực phẩm và đầu tư công nghệ miền Trung (Fococev) đã sản xuất phân bón vi sinh từ chất thải tinh bột sắn Công ty đã sản xuất với công suất 120 tấn sắn tươi/ngày, khắc phục được tình trạng ôi nhiễm do quá trình chế biến mang lại

Các nhà khoa học phòng Vi sinh ứng dụng-Viện sinh học nhiệt đới đã thử sản xuất acid citric bằng cách nuôi một số chủng nấm mốc có lợi trên bã khoai mì Acid citric được cho vào nước giải khát và thực phẩm chế biến, tuy nhiên giá thành chưa thể cạnh tranh với các sản phẩm từ Trung Quốc Sau đó, các kỹ sư đã nghiên cứu sử dụng

bã sắn làm thức ăn cho vật nuôi khi ủ với chế phẩm Probio-S và Bio-E Bio-E là chế

phẩm dạng bột khô, được cấy chủng nấm mốc A.Niger lên bã khoai mì với tỉ lệ 2g

mốc/kg bã Kết quả thử nghiệm trên heo thì sau 3 tháng dùng chế phẩm trên, heo tăng trọng nhanh hơn 1,3-1,4kg so với heo bình thường

Tuy nhiên, các nghiên cứu này chỉ mới tập trung nhiều trên các đề tài, chưa thực sự phố biến ra thị trường nên chưa được nhiều nông dân biết tới và ứng dụng Đây cũng là một yếu điểm chung của nghiên cứu khoa học nông nghiệp ở Việt Nam, chưa thể nghiên cứu tận cùng tới vấn đề trực tiếp tới nông dân, các nhà kinh doanh cũng chưa tiếp cận với những nhà khoa học để hợp tác đưa kết quả trong phòng thí nghiệm áp dụng ra ngoài thực tế

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Mẫu phân lập

Chủng Bacilus subtilis có khả năng sinh enzyme cellulase, phytase phân lập từ các

nguồn khác nhau: môi trường đất, các thực phẩm lên men kiềm (natto), dạ cỏ trâu bò

2.1.2 Bã sắn

Sau quá trình chế biến tinh bột sắn, bã sắn được thu nhận và sấy khô đến hàm lượng ẩm từ 5 – 6% để tiến hành nghiên cứu Bã sắn mua từ Công ty TNHH Ánh Tuyết, Cam Hải Tây, Cam Lâm, Khánh Hòa

2.1.3 Đậu nành

Đậu nành được được tiến hành phân loại để loại bỏ các hạt bị hư hỏng, sâu mọt, sau đó tiến hành sấy khô đến hàm lượng ẩm khoảng 5 - 6%, xay nhỏ để sử dụng cho nghiên cứu

2.1.6 Hóa chất, môi trường, thiết bị

Hóa chất: Các hóa chất được mua từ nhà phân phối Phương Trang, có nguồn

gốc, xuất xứ rõ ràng, nồng độ đúng như công bố trên nhãn mác

Thuốc thử Wade, Axit phytic, NaOH 1N, HCl 1N, Etanol 95%, Iod (Iodine), Crystal violet, Ammon oxalate, KI (Kali iodide), Safranin, sodium phytate, sodium, acetate, acid acetic đậm đặc, K2HPO4, ammonium molybdat, [(NH4)6Mo7O24.4H2O], FeSO4, TCA (acid tricloacetic), sodium potassium tartrate, Glucose, Congo Red, axit sulfosalisylic, CaCl2, H2SO4 98%, HNO3 đậm đặc, HCl 37%, DNS, FeCl3, NaOH,

K2SO4, KHSO4, cao nấm men

Môi trường: Nutritional agar, BHB

Thiết bị: Máy so màu UV- vis, Kính hiển vi, Buồng cấy, Nồi hấp thanh trùng, Máy lắc Máy ủ nhiệt, Tủ sấy, Tủ host

2.2 Phương pháp phân tích, nghiên cứu – Bố trí thí nghiệm

2.2.1 Các phương pháp phân tích sử dụng trong đề tài

2.2.1.1 Xác định tỷ lệ sống vi khuẩn[2]

Phương pháp xác định tỷ lệ sống chủng vi sinh vật bằng phương pháp đếm

khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng Chia ô trên lam kính, đếm lượng vi khuẩn nhuộm gram bắt màu trên tổng số tế bào sinh dưỡng và bào tử

2.2.1.2 Xác định tỷ lệ bào tử [5]

Trên tiêu bản nhuộm gram, tiến hành đếm số bào tử và số tế bào sinh dưỡng cho đến khi đạt tổng số bào tử và tế bào sinh dưỡng là 100 Số phần trăm được xác định bằng số bào tử đếm được

2.2.1.3 Kiểm tra khả năng sinh enzyme

Phương pháp xác định hoạt tính cellulase theo phương pháp đo đường kính vòng phân giải [24]

Nguyên tắc:Khi cho cellulase tác dụng lên cơ chất CMC trong môi trường thạch, cơ chất bị phân giải, độ đục của môi trường giảm và môi trường trở lên trong suốt Độ lớn của vòng phân giải phản ánh mức độ hoạt động của cellulase

Phương pháp xác định hoạt tính phytase bằng cách đo đường kính vòng thủy phân[23]

Nguyên tắc: Cho phytase tác dụng lên cơ chất phytat trong môi trường thạch, cơ chất bị phân giải, độ đục của môi trường bị giảm, môi trường trở nên trong suốt Độ

lớn của vòng phân giải phản ánh mức độ hoạt động của phytase

Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme cellulase [29]

Nguyên tắc: Hoạt tính của enzyme cellulase được xác định dựa vào lượng đường khử tạo thành Đường khử sẽ phản ứng với thuốc thử DNS [29] Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với đường khử Đơn vị hoạt độ của enzyme là lượng

ml enzyme ở điều kiện xác định (pH: 5, nhiệt độ 40°C, thời gian 1 phút) thủy phân cơ chất để tạo thành 1 µg glucose, đơn vị UI/ml

Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme phytase [15]

Nguyên tắc: Dựa vào cường độ màu tại bước sóng 700 nm của phức chất tạo ra

giữa phosphor tự do (được giải phóng từ quá trình thủy phân phytate) và ammonium molipdate [15] Đơn vị hoạt động của enzyme là lượng enzyme làm giải phóng 1 nmol

phosphate trong thời gian 1 phút dưới điều kiện thí nghiệm (pH: 5, nhiệt độ 37°C, nồng độ cơ chất: sodium phytate 5 µmol/lít), đơn vị UI/ml

2.2.1.4 Phân tích các chất

Xác định hàm lượng cellulose [1]

Nguyên tắc: Dùng dung dịch axit và kiềm với nồng độ nhất định thủy phân và tách khỏi mẫu thử các chất bột đường, protit, dầu mỡ, một phần hemicelulose và lignin còn gọi là xơ thô

Xác định hàm lượng phytat theo phương pháp Wade [17]

Nguyên tắc: Sử dụng dung dịch HCl 2,4% để chiết axit phytic ra khỏi mẫu, sau

đó bổ sung dung dịch Wade (0,03% FeCl3 và 0,3% axit sulfosalisylic) để phản ứng với axit phytic, lượng dung dịch Wade không tác dụng với axit phytic được xác định bằng cách so màu ở bước sóng 500nm, từ đó tính được hàm lượng axit phytic đã tác dụng với dung dịch Wade

Cách tính hiệu suất thủy phân

Chuẩn bị mẫu chứng ban đầu so với từng thí nghiệm bố trí, kiểm tra hàm lượng cellulose, phytate trong mẫu (a) Tiến hành ủ các mẫu theo bố trí, kiểm tra hàm lượng cellullose, phytae của mẫu sau ủ (b)

Hiệu suất thủy phân = a*100/b

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Tuyển lựa chủng Bacillus spp có khả năng

sinh enzyme cellulase, phytase

Xác định yếu tố nâng cao sinh tổng hợp

cellulase, phytaseXác định tính chất của enzyme cellulase,

phytase

Xác định điều kiện nhân giống tối ưu của

củng Bacillus spp trên môi trường cơ bản là

bã sắnXác định yếu tố ảnh hưởng khả năng thủy phân cellulose, phytate trong bã sắn

Hình 2.1: Phương pháp nghiên cứu

Bã sắn Xay nhỏ

Rỉ đường

Xác định nhiệt độ ủ

Xác định thời gian ủ

Xác định thành phần bổ sung

phytate Chủng vi sinh vật

Hình 2.2: Quy trình chung khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng thủy phân

vi khuẩn lên mật độ 106CFU/ml sau 24h ủ trong môi trường BHB

Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus spp từ natto

Đậu nành được ngâm 1 ngày sau đó được luộc chín trong nồi áp suất trong 30 phút Rơm được chần sơ qua nước sôi để tiêu diệt một số vi khuẩn gây bệnh sau đó lấy

ra làm ráo nước Đậu nành đã nấu chín đem ủ trong rơm trong 24 giờ ở 37oC thì được sản phẩm natto (đậu nành lên men)

Quan sát đậu nành đã ủ phải có độ nhớt cao, mùi nồng Đậu có độ nhớt càng cao thì chất lượng của natto càng tốt

Phân lập vi khuẩn từ natto theo phương pháp cấy ria trên môi trường thạch dinh

dưỡng sau đó chọn các khuẩn lạc riêng biệt đặc trưng của loài Bacillus spp (trực khuẩn

gram dương, sinh bào tử) nhằm tìm chủng có khả năng thủy phân phytate hiệu quả

Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus spp từ dạ cỏ bò

Dịch dạ dày bò được lấy mẫu ngay lập tức sau khi giết mổ ở lò mổ bò chợ Đầm

(Nha Trang- Khánh Hòa) Phân lập các chủng Bacillus có trong dịch dạ dày nhằm tìm

kiếm chủng có khả năng thủy phân cellulose hiệu quả

Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus spp từ đất

Lấy mẫu đất ở những vùng ẩm trộn chung với bã sắn để lâu ngày (5-10 ngày)

để phân lập chủng có khả năng thủy phân cellulose và phytate

2.2.3.2 Tuyển lựa chủng có khả năng sinh enzyme cellulase, phytase

Nguyên tắc sàng lọc: Sử dụng phương pháp đo vòng kính thủy phân trên môi trường thạch có chứa cơ chất đặc hiệu cho từng enzyme (CMC đối với cellulase,

phytate đối với phytase) nhằm tìm kiếm và sàng lọc các chủng có khả năng sinh

enzyme cellulase và phytase tốt

2.2.3.3 Bố trí xác định ảnh hưởng của pH và thời gian đến khả năng sinh tổng

hợp enzyme của Bacillus spp

Để tham khảo được các đặc tính của enzyme ứng dụng cần khảo sát các yếu tố nhằm sinh tổng hợp enzyme có hoạt độ cao nhất Đơn vị hoạt độ cellulase tính theo lượng µg glucose giải phóng trong 1 phút , đơn vị hoạt độ phytase tính theo số nmol

phosphor giải phóng trong 1 phút

Môi trường sinh tổng hợp: CMC 1%, phytate 1%, cao nấm men 1%, KH2SO40,2%, chiết xuất thịt 0,5%, glucose 0,5%, CaCl2 0,5%

Bố trí xác định ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của

Bacillus spp

Điều chỉnh pH Môi trường sinh tổng hợp

Hấp vô trùng

Để nguội

Lắc 48 giờ ở nhiệt độ phòng

Ly tâm, thu dịch nổi

Bảo quản ở nhiệt độ 0-4 độ C

Xác định hoạt độ cellulase, phytase

Chọn pH thích hợp

Bacillus spp

6

Hình 2.3: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng

sinh tổng hợp enzyme cellulase và phytase của Bacillus spp

Thuyết minh quy trình: Chuẩn bị môi trường sinh tổng hợp như trên, dùng NaoH 1N và HCl 1N điều chỉnh về các pH 5-6-7-8-9, sau đó đem hỗn hợp đi hấp ở

121oC trong 15 phút rồi lấy ra làm nguội Mật độ vi khuẩn cho vào 100ml dung dịch môi trường là 106 CFU/g, lắc trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng (30oC) Thu dịch enzyme thô bằng cách ly tâm dịch, thu dịch nổi và bảo quản ở nhiệt độ 0-4oC để kiểm tra hoạt tính enzyme cellulase, phytase

Bố trí xác định ảnh hưởng của thời gian lắc đến khả năng sinh tổng hợp

enzyme của Bacillus spp

Điều chỉnh pH Môi trường sinh tổng hợp

Hấp vô trùng

Để nguội

Lắc thời gian khác nhau ở nhiệt độ

phòng

Ly tâm, thu dịch nổi

Bảo quản ở nhiệt độ 0-4 độ C

Xác định hoạt độ cellulase, phytase

Chọn thời gian lắc thích hợp

Bacillus spp

24

Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian lắc môi trường đến

khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase và phytase của Bacillus spp

Thuyết minh quy trình: Chuẩn bị môi trường sinh tổng hợp như trên, dùng

NaoH 1N và HCl 1N điều chỉnh về các pH 7, sau đó đem hỗn hợp đi hấp ở 121oC

trong 15 phút rồi lấy ra làm nguội Mật độ vi khuẩn cho vào 100ml dung dịch môi trường là 106

CFU/ml, lắc trong thời gian 0-96 giờ với bước nhảy 12 giờ ở nhiệt độ phòng (30oC) Thu dịch enzyme thô bằng cách ly tâm dịch, thu dịch nổi và bảo quản ở nhiệt độ 0-4oC để kiểm tra hoạt tính enzyme cellulase, phytase

2.2.3.4 Bố trí thí nghiệm xác định một số đặc tính của enzyme cellulase và

phytase thô sinh tổng hợp từ chủng Bacillus spp

1 Xác định pH thích hợp của cellulase và phytase

Đi ủ ở cơ chất có pH khác nhau

Kiểm tra yếu tố pH: dịch enzyme thô thu được sẽ kiểm tra hoạt độ ở môi trường

cơ chất có pH khác nhau: 5-6-7-8-9 Dùng NaOH 1N và HCl 1N để điều chỉnh pH

2 Xác định độ bền nhiệt của cellulase và phytase

Gia nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau

trong 30 phút Dịch enzyme thô

Đi ủ ở nhiệt độ khác nhau

40

Xác định hoạt độ cellulase, phytase

Hình 2.6: Bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt của enzyme cellulase và phytase

Kiểm tra yếu tố độ bền nhiệt: dich enzyme thô được gia nhiệt ở các nhiệt độ 40-50-60 trong 30 phút sau đó đem đi kiểm tra hoạt độ enzyme

30-3 Xác định nhiệt độ hoạt động thích hợp của cellulase và phytase

Đi ủ ở nhiệt độ khác nhauDịch enzyme thô

Xác định hoạt độ cellulase, phytase

2.2.3.5 Xác định điều kiện nhân giống của củng Bacillus spp trên môi

· Thời gian ủ: 24, 48, 72 giờ

Kiểm tra tỷ lệ sống và tỷ lệ bào tử của mẫu sau khi ủ

Chọn điều kiện nhân giống tối ưu

Hình 2.8: Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nhân giống của chủng Bacillus spp

trên môi trường cơ bản là bã sắn