Nghiên cứu cơ chế viêm của cá giò (rachycentron canadum) sau khi tiêm vắc xin phòng bệnh vi khuẩn bằng phương pháp mô bệnh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ PHƯƠNG HUYỀN NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ VIÊM CỦA CÁ GIÒ RACHYCENTRON CANADUM SAU KHI TIÊM VẮC XIN PHÒNG BỆNH VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG HUYỀN

NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ VIÊM CỦA CÁ GIÒ (RACHYCENTRON CANADUM) SAU

KHI TIÊM VẮC XIN PHÒNG BỆNH VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÔ

BỆNH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Khánh Hòa - 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG HUYỀN

NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ VIÊM CỦA CÁ GIÒ (RACHYCENTRON CANADUM)

SAU KHI TIÊM VẮC XIN PHÒNG BỆNH VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

MÔ BỆNH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Nuôi trồng Thủy sản

Mã số: 60 62 03 01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS PHAN THỊ VÂN

Khánh Hòa - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin thích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc

Quảng Ninh, 25 tháng 11 năm 2014

Tác giả

Nguyễn Thị Phương Huyền

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của

thầy cô, gia đình và bạn bè Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến thầy cô trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1, Trung tâm Nghiên cứu Quan trắc và Cảnh báo môi trường dịch bệnh Thủy sản khu vực miền Bắc - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 đã hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phan Thị Vân, Ths Võ Anh Tú, Ths.Cung Thị Lý đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và giúp đỡ tôi bố trí thí nghiệm, thu mẫu và xử lý mẫu trong suốt quá trình tôi thực tập tốt nghiệp và hoàn thành bài khóa luận

Cuối cùng, lời cảm ơn chân thành nhất xin được gửi tới gia đình và tập thể lớp

và các anh chị đồng nghiệp đã luôn bên cạnh động viên, đóng góp cho sự thành công của luận văn

Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp, mặc dù đã có nhiều cố gắng, tuy nhiên thời gian và kiến thức còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những sai sót nhất định Tôi rất mong được sự quan tâm, góp ý của của Hội đồng khoa học, quí thầy cô và các bạn Tôi xin chân thành cảm ơn!

Quảng Ninh, 25 tháng 11 năm 2014

Học viên thực hiện

Nguyễn Thị Phương Huyền

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC HÌNH v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược tình hình nuôi cá giò trên thế giới 3

1.2 Tình hình nuôi cá giò ở Việt Nam 4

1.3 Tình hình bệnh Vibriosis trên cá giò 5

1.3.1 Tình hình bệnh Vibriosis ở cá giò trên thế giới 5

1.3.2 Tình hình bệnh Vibriosis ở cá giò tại Việt Nam 6

1.4 Sử dụng vắc xin trong nuôi trồng thủy sản 7

1.4.1 Tình hình sử dụng vắc xin trong NTTS trên thế giới 7

1.4.2 Tình hình và triển vọng sử dụng vắc xin trong NTTS ở Việt Nam 9

1.5 Biến đổi mô tế bào tại vùng tiêm vắc xin 11

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 14

2.2 Đối tượng nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Các nội dung thực hiện 14

2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 15

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu mô học 16

2.3.4 Phương pháp xác định các loại tế bào 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Kết quả nghiên cứu 20

3.1.1 Đặc điểm mô học cơ cá giò khỏe 20

3.1.2 Mô cơ cá giò 7 ngày sau khi tiêm các loại vắc xin và nhũ dầu 21

3.1.3 Mô cơ cá giò 14 ngày sau khi tiêm các loại vắc xin và nhũ dầu 30

3.1.4 Mô cơ cá giò 21 ngày sau khi tiêm các loại vắc xin và nhũ dầu 40

3.2 Thảo luận 46

3.2.1 Quá trình viêm 46

3.2.2 Bước đầu đánh giá hiệu quả của các loại vắc xin nhũ dầu 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

1 Kết luận 50

2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cá giò (Rachycentron canadum) 14

Hình 2.2 Sơ đồ khối nội dung thực hiện đề tài 15

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 15

Hình 2.4 Các bước thực hiện của phương pháp mô bệnh học 16

Hình 2.5 Tế bào hồng cầu 18

Hình 2.6 Tế bào bạch cầu 19

Hình 2.7 Tế bào đại thực bào 19

Hình 2.8 Tế bào Lympho 19

Hình 3.1 Mô cơ cá giò bình thường 20

Hình 3.2 Mô cơ cá giò 7 ngày sau khi tiêm nhũ dầu, x100 21

Hình 3.3 Mô cơ cá giò 7 ngày sau khi tiêm vắc xin V1, V6, V4-1, V4-2, x100 22

Hình 3.4 Mô cơ cá giò sau 7 ngày tiêm nhũ dầu, x400 23

Hình 3.5 Biến đổi mô cơ sau 7 ngày tiêm vắc xin V1, x400 23

Hình 3.6 Biến đổi mô cơ sau 7 ngày tiêm vắc xin V6, x400 24

Hình 3.7 Biến đổi mô cơ sau 7 ngày tiêm vắc xin V4-1, x400 24

Hình 3.8 Biến đổi mô cơ sau 7 ngày tiêm vắc xin V4-2, x400 25

Hình 3.9 Lớp tế bào sau 7 ngày tiêm nhũ dầu, x1000 25

Hình 3.10 Lớp tế bào sau 7 ngày tiêm vắc xin V1, x1000 26

Hình 3.11 Lớp tế bào sau 7 ngày tiêm vắc xin V6, x1000 27

Hình 3.12 Lớp tế bào sau 7 ngày tiêm vắc xin V4-1, x1000 28

Hình 3.13 Lớp tế bào tại ổ viêm sau 7 ngày tiêm vắc xin V4-2, x1000 30

Hình 3.14 Mô cơ cá giò sau 14 ngày tiêm nhũ dầu, x100 30

Hình 3.15 Mô cơ cá giò 14 ngày sau khi tiêm vắc xin V1, V6, V4-1, V4-2 31

Hình 3.16 Mô cơ cá giò 14 ngày sau khi tiêm nhũ dầu (đối chứng) 32

Hình 3.17 Biến đổi mô cơ 14 ngày sau khi tiêm vắc xin V1, x400 32

Hình 3.18 Biến đổi mô cơ 14 ngày sau khi tiêm vắc xin V6, x400 33

Hình 3.19 Biến đổi mô cơ 14 ngày sau khi tiêm vắc xin V4-1, x400 33

Hình 3.20 Biến đổi mô cơ 14 ngày sau khi tiêm vắc xin V4-2, x400 33

Hình 3.21 Lớp tế bào trong mô cơ sau 14 ngày tiêm nhũ dầu, x1000 34

Hình 3.22 Lớp tế bào trong ổ viêm sau 14 ngày tiêm vắc xin V1, x1000 35

Hình 3.23 Các lớp tế bào trong ổ viêm sau 14 ngày tiêm vắc xin V6, x1000 36

Hình 3.24 Ba lớp tế bào trong ổ viêm sau 14 ngày tiêm vắc xin V4-1, x1000 37

Hình 3.25 Lớp tế bào trong ổ viêm sau 14 ngày tiêm vắc xin V4-1, x1000 38

Hình 3.26 Các lớp tế bào trong ổ viêm sau 14 ngày tiêm vắc xin V4-2, x1000 39

Hình 3.27 Mô cơ cá giò 21 ngày sau khi tiêm nhũ dầu, x100 40

Hình 3.28 Mô cơ cá giò 21 ngày sau khi tiêm vắc xin V1, V6, V4-1, V4-2, x100 40

Hình 3.29 Mô cơ cá giò 21 ngày sau khi tiêm nhũ dầu, x400 41

Hình 3.30 Mô cơ cá giò 21 ngày sau khi tiêm vắc xin V1, x400 41

Hình 3.31 Mô cơ cá giò 21 ngày sau khi tiêm vắc xin V6, x400 42

Hình 3.32 Mô cơ cá giò 21 ngày sau khi tiêm vắc xin V4-1, x400 42

Hình 3.33 Mô cơ cá giò 21 ngày sau khi tiêm vắc xin V4-2, x400 42

Hình 3.34 Mô cơ cá giò 21 ngày sau khi tiêm nhũ dầu, x1000 43

Hình 3.35 Lớp tế bào sau 21 ngày tiêm vắc xin V1, x1000 43

Hình 3.36 Lớp tế bào sau 21 ngày tiêm vắc xin V6, x1000 44

Hình 3.37 Lớp tế bào sau 21 ngày tiêm vắc xin V4-1, x1000 45

Hình 3.38 Lớp tế bào sau 21 ngày tiêm vắc xin V4-2, x1000 46

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BKD Bệnh vi khuẩn ở thận (Bacteria Kiney Disease)

BSA Anbumin huyết thanh bò (Bovine Serum Anbumin)

CFA Chất bổ trợ hoàn chỉnh (Complete Freund’s Adjuvant)

E Tế bào hồng cầu (Erythrocyte)

ERM Bệnh xuất huyết đường tiêu hóa (Enteric Redmouth)

FAO Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (Food and Agriculture

Organization) H&E Hematocylin và Eosin

M Đại thực bào (Macrophage)

NTTS Nuôi trồng thủy sản

O Giọt dầu (Drop oil)

SRBC Hồng cầu cừu (Sheep Red Blood Cells)

WBC Tế bào bạch cầu (White blood cell)

MỞ ĐẦU

Cá giò (Rachycentron canadum) là loài cá dữ, ăn thịt động vật và có tốc độ

sinh trưởng rất nhanh Trong tự nhiên, cá giò sống ở vùng nước mặn, nước lợ ven biển, rặng san hô cho đến vùng biển khơi thuộc các vùng biển nhiệt đới, cận nhiệt đới và vùng nước ấm của biển ôn đới (Shaffer, 1989) Do có tốc độ sinh trưởng nhanh (có thể đạt 6-8 kg sau 1 năm nuôi), chất lượng thịt cá ngon và có tiềm năng

về sản lượng lớn, giá trị cao trên thị trường nên cá giò hiện đang được nuôi phổ biến

ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam (Su và ctv, 2000) Tại Việt Nam,

cá giò được nuôi lồng trên biển ở các tỉnh thành như Hải Phòng, Quảng Ninh, Nghệ

An, Khánh Hòa và Vũng Tàu (Svennevig và Nguyễn Quang Huy, 2005) Dịch bệnh

là một trong những yếu tố có ảnh hưởng lớn tới sự sụt giảm năng suất của các loài nuôi thủy sản, trong đó có cá giò Đối với cá giò, nếu như vi rút là tác nhân gây tỷ lệ

chết cao ở giai đoạn cá giống thì vi khuẩn Vibrio (gây bệnh Vibriosis) lại là tác

nhân gây bệnh chủ yếu ở giai đoạn cá thương phẩm (Lopez và ctv, 2002) Cá giò bị bệnh Vibriosis thường có tỷ lệ chết trên 80% (Liu và ctv, 2004) trong đó cá dưới 4 tháng tuổi, <500 gam được cho là nhạy cảm nhất với bệnh này với tỷ lệ chết cao lên đến 100% (Lin và ctv, 2005)

Khi cá bị bệnh do vi khuẩn, trong đó có bệnh Vibriosis trên cá giò, người nuôi dùng kháng sinh để trị bệnh Tuy nhiên điều này dẫn đến ô nhiễm môi trường

và không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Chính vì vậy, liệu pháp phòng bệnh bằng vắc xin trong nuôi trồng thủy sản đang là hướng đi mới của các nhà khoa học trong và ngoài nước Hiện nay, các loại vắc xin thương mại cho cá trên thế giới thường ở dạng tiêm, mặc dầu các loại vắc xin khác như ngâm, phun và trộn vào thức ăn cũng đang được nghiên cứu Sau khi tiêm vắc xin ở cơ lưng xảy ra biến đổi

mô học tại vùng tiêm, sự biến đổi này được gọi là phản ứng viêm Vùng xảy ra phản ứng viêm được gọi là vùng viêm và trong vùng này có sự hiện diện của các ổ viêm khác nhau Đối với loại vắc xin tiêm thì việc nghiên cứu sự biến đổi mô cũng như

sự có mặt của các tế bào miễn dịch tại vùng tiêm vắc xin trên cá là hết sức cần thiết

để có thể đánh giá được hiệu quả của vắc xin Chính vì vậy luận văn tốt nghiệp với

tiêu đề: “Nghiên cứu cơ chế viêm của cá giò (Rachycentron canadum) sau khi

tiêm vắc xin phòng bệnh vi khuẩn bằng phương pháp mô bệnh học” được thực

hiện và là một phần của đề tài nghiên cứu cấp nhà nước nói trên

Mục tiêu nghiên cứu

 Nghiên cứu sự biến đổi mô học tại vùng tiêm vắc xin

 Bước đầu nghiên cứu khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các loại vắc xin khác nhau

Nội dung nghiên cứu

 So sánh sự biến đổi mô cơ cá giò tại vị trí tiêm ở 7, 14, 21 ngày sau khi tiêm các loại vắc xin

 Xác định sự xuất hiện các loại tế bào miễn dịch theo thời gian sau khi tiêm các loại vắc xin

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược tình hình nuôi cá giò trên thế giới

Cá giò (Rachycentron canadum) là loài sống ven biển, các loài cá di cư phân

bố rộng trong vùng biển nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới (Shaffer và Nakamura 1989) Cá giò là một đối tượng nuôi mới đầy tiềm năng, đã được nhiều nước trên thế giới từ Bắc Mỹ tới Châu Á tiến hành nghiên cứu và đưa vào sản xuất Ở khu vực Bắc Mỹ đã cho sinh sản nhân tạo thành công bằng cách tiêm hoocmon sinh dục cho

cá bố mẹ thu ngoài tự nhiên và tiến hành nuôi thương phẩm cá giò (Arnold, 2002;

Lê Xân và Nguyễn Quang Huy, 2005)

Do tốc độ tăng trưởng nhanh, giá trị thị trường cao và thành công lớn trong việc sản xuất cá giò giống nên cá giò ngày càng được nuôi phổ biến ở khu vực Đông Nam Á Cá giò nuôi lồng có thể đạt được 6kg trong vòng một năm (Chou và ctv, 2001; Nguyễn Quang Huy, 2002; Chou và ctv, 2004; Wang và ctv, 2005) Cá giò là thực phẩm rất được ưa chuộng của người dân châu Á, đặc biệt là Đài Loan và Nhật Bản Cá giò được đánh giá là có giá trị dinh dưỡng rất cao (giàu vitamin E, protein, axit béo và DHA) và thường được dùng làm nguyên liệu cho các nhà hàng

(Miao và ctv, 2009)

Sản lượng cá giò nuôi gia tăng nhanh chóng từ năm 2002, đạt khoảng 30.000 tấn trong năm 2007 Ba nước sản xuất chính cá giò trong năm 2007 là Trung Quốc (26.000 tấn), Đài Loan (4000 tấn) và Việt Nam (1.500 tấn) (Như Văn Cẩn và ctv, 2010)

Ngoài ra cá giò cũng được báo cáo đang sản xuất giống và nuôi tại các nước: Hoa Kỳ, Puerto Rico, Bahamas, Martinique, Belize, Brazil và Panama (Bennetti và ctv, 2008) Vào tháng 3 năm 2010 Ấn Độ đã tiến hành sinh sản nhân tạo 2,1 triệu trứng cá giò với tỷ lệ thụ tinh 90% (1,9 triệu trứng được thụ tinh) và tỷ lệ nở 80% thu được 1.5 triệu ấu trùng cá giò (Gopakumar, G; Rao, G.S; Nazar, A.K.A; Kalidas, C; Tamilmani, G; Sakthivel, M; Maharshi, V.A and Rao, K.S, 2011)

Năm 2011 công ty sản xuất cá giò Antillana của Colombia đã sản xuất được

140 tấn cá giò nuôi lồng, Mỹ là thị trường chính của loại cá này Cá giò được coi là hướng đi chủ chốt cho sự phát triển của các doanh nghiệp thủy sản tại Châu Mỹ La

Tinh, nhằm cạnh tranh với các nước Châu Á và áp đảo trên thị trường thế giới trong những năm qua Theo thống kê của FAO, Đài Loan là nước sản xuất cá giò lớn nhất thế giới với sản lượng hàng năm khoảng 4000 tấn

1.2 Tình hình nuôi cá giò ở Việt Nam

Nuôi cá biển đang là hướng phát triển mới của nghề nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam với mục tiêu đến năm 2015 đạt sản lượng là 1 triệu tấn cá biển (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2006) Cá giò là một trong những loài cá biển nuôi phổ biến ở nước ta và đã được xác định là đối tượng nuôi chủ lực của nghề nuôi biển do nhu cầu của thị trường cao và đặc biệt là đã chủ động được việc sản xuất giống nhân tạo Việt Nam sản xuất giống cá giò thành công vào năm 1999 (Nguyễn Quang Huy, 2002, 2003) Cá giò được nuôi tại Việt Nam bằng quy mô trang trại hộ gia đình (khoảng 1.000 tấn, chủ yếu là cho tiêu thụ trong nước) cũng như trang trại hợp tác xã (khoảng 1.600 tấn / năm, chủ yếu là để xuất khẩu) (Nguyễn Quang Huy, 2008; Như Văn Cẩn và ctv, 2010)

Hiện nay cá giò đang được nuôi ở nhiều tỉnh ven biển như Quảng Ninh, Hải Phòng, Nghệ An, Hà Tĩnh, Thừa Thiên Huế, Phú Yên, Khánh Hoà, Vũng Tàu, Kiên Giang Ở miền Nam và miền Trung Việt Nam, sản lượng cá giò thu được chủ yếu được xuất khẩu sang Đài Loan và Nhật Bản, là nơi đầu mối đầu tư kinh doanh của các nhà sản xuất chính (Svennevig và Nguyễn Quang Huy, 2005) Đặc biệt, hiện nay đã có 3 công ty 100% vốn nước ngoài đầu tư vào Việt Nam chỉ để nuôi cá giò phục vụ xuất khẩu

Việt Nam được xem là nước đứng “hàng thứ 3” trên thế giới về sản xuất giống và nuôi cá giò (Niels Svennevig, 2001) Công nghệ nuôi chủ yếu là nuôi theo lồng, bè với hai kiểu lồng cơ bản là lồng kiểu Nauy và lồng chi phí thấp, chịu được sóng gió Hình thức nuôi bè chủ yếu tập trung ở Quảng Ninh, Hải Phòng (Niels Sevenning, 2005).Việt Nam đã được ước tính về sản lượng cá giò trong năm 2009

là 2.600 tấn (Như Văn Cẩn và ctv 2010)

Các yếu tố chính hạn chế phát triển cá giò tại Việt Nam là: thiếu chất lượng giống, mặc dù sản xuất giống sản xuất tại Việt Nam đang gia tăng với một tốc độ nhah, ví dụ như Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 sản xuất 400.000 giống trong năm 2007 và 900.000 vào năm 2008 (Như Văn Cẩn và ctv, 2010); Ngành

công nghiệp nuôi cá giò vẫn dựa trên nhập khẩu giống từ Đài Loan và Trung Quốc (Hải Nam) (Nguyễn Quang Huy, 2008); Hạn chế khác bao gồm dịch bệnh và thiếu thức ăn Cá giò thường được cho ăn thức ăn giá trị thấp (cá tạp), mặc dù một lượng nhỏ khẩu phần ăn được bổ sung thức ăn viên Các quy mô nuôi cá giò lớn hơn sử dụng ăn viên (Như Văn Cẩn và ctv, 2010)

1.3 Tình hình bệnh Vibriosis trên cá giò

1.3.1 Tình hình bệnh Vibriosis ở cá giò trên thế giới

Một trong những mối đe dọa lớn nhất đối với ngành nuôi trồng thủy sản là dịch bệnh Tác nhân gây bệnh có thể được phân chia thành ba nhóm chính: vi rút, vi khuẩn

và ký sinh trùng Cá giò nhạy cảm với cả ba nhóm tác nhân gây bệnh trên Có nhiều báo cáo về bệnh do vi khuẩn trên cá giò như: bệnh Mycobacteriosis (do tác nhân gây

bệnh thuộc giống Mycobacterium gây ra), bệnh Vibriosis (do tác nhân gây bệnh thuộc giống Vibrio gây ra) và bệnh Streptococcosis (do tác nhân gây bệnh thuộc giống Streptococcus gây ra) (Liao và ctv, 2004; Lowery và Smith, 2006) Các bệnh vi rút Lymphocystis và bệnh ký sinh Myxosporidosis cũng có thể ảnh hưởng đến cá giò

(Kaiser và Holt, 2005)

Vibriosis là một trong những bệnh do vi khuẩn nghiêm trọng nhất đối với cá biển nuôi trên toàn thế giới trong đó có cá giò (Egidius, 1987; Hjeltnes và Roberts, 1993; Lee, 1995; Ishimaru & ctv, 1996; Austin, 1999; Lee & ctv, 2002; Alcaide, 2003) Cá giò bị bệnh Vibriosis thường có dấu hiệu bệnh lý như chướng bụng, hỏng mắt, da bị loét và có màu tối sẫm Cá giò nuôi nhiễm bệnh thường có tỷ lệ chết cao

trên 80% (Reed và Francis-Floyd, 2002; Liu và ctv, 2004) Cá dưới 4 tháng tuổi,

<500 gam dường như nhạy cảm nhất với tỷ lệ chết cao nhất do các tác nhân gây

bệnh thuộc giống Vibrio gây ra (Lin và ctv, 2006)

Vibrio anguillarum là một tác nhân chính gây bệnh Vibriosis trên cá giò Bệnh

thường bùng phát thành dịch vào cuối mùa hè ở vùng biển gần bờ khi nhiệt độ tăng Vibriosis ảnh hưởng đến gần 50 loài cá biển và cá nước ngọt (Woo và Bruno, 1999)

Cá giò bị nhiễm V.anguillarum thường có những biểu hiện như: xuất huyết ở mắt, vây, ở bề mặt bụng và nội tạng (Toranzo và ctv, 2003)

Năm 2001, lần đầu tiên cá giò nuôi tại Đài Loan bị bệnh Vibriosis Bệnh này

có thể xảy ra trên cá giò ở các kích cỡ khác nhau V.alginolyticus đã thấy xuất hiện

trên cá giò ở kích thước 100-120gam và 8-12gam nuôi tại Đài Loan V alginolyticus được báo cáo là một tác nhân gây bệnh chủ yếu cho cá giò nuôi ở Đài Loan (Liu và ctv, 2004) Cá giò nhiễm V alginolyticus thường có biểu hiện: bơi lờ

đờ, da tối và một số cá mắt bị hỏng

Tác nhân gây bệnh Vibriosis là V.alginolyticus và V.parahaemolyticus xuất

hiện trên cá giò nuôi tại Đài Loan gây chết nghiêm trọng với tỷ lệ sống dưới 20% (Lin, Chen, Yang và ctv, 2005) Vào tháng 8 nẳm 2001 tại Đài Loan xác định được

V.harveyi (V.carchariae) là tác nhân gây ra viêm dạ dày và ruột ở cá giò nuôi V.harveyi được phân lập từ đợt bùng phát dịch bệnh nghiêm trọng trên cá giò (Lee,

1.3.2 Tình hình bệnh Vibriosis ở cá giò tại Việt Nam

Cá giò là đối tượng đang được nuôi phổ biến ở vùng ven biển, đặc biệt ở Hải Phòng, Quảng Ninh và Khánh Hòa Do môi trường nuôi ngày càng ô nhiễm nên dịch bệnh thường xuyên xảy ra, làm giảm năng suất cá nuôi

Ở nước ta mùa vụ dịch bệnh của cá giò khá rõ ràng, xuất hiện vào các tháng

11 và 12 trong năm Tỷ lệ chết cao 50% - 60%, nhất là vào thời điểm cuối năm gắn với thời tiết lạnh và thường chết vào gần sáng Cá chết ở kích cỡ nhỏ hơn 0.6kg chiếm tới 65% (30.90% với cá kích cỡ nhỏ hơn 0,4kg và 35,95% với cá kích cỡ từ 0,4 đến 0,6kg) Tỷ lệ chết giảm dần theo kích cỡ cá từ nhỏ đến lớn, điều này có thể cho thấy cá nhỏ nhạy cảm với tác nhân gây bệnh hơn Đối với bệnh Vibriosis đã

phân lập được một số loài thuộc giống Vibrio sau: Vibrio alginolyticus, V.vulnificus, V.cholene, V.parahaemolyticus, V.anguillarum Nhóm vi khuẩn Vibrio spp luôn tồn

tại trong nước biển, khi điều kiện môi trường thay đổi xấu làm cá yếu, vi khuẩn sẽ xâm nhập và gây thành bệnh (Phan Thị Vân và ctv, 2006)

Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2008), bệnh Vibriosis đã được phát hiện trên cá giò nuôi tại trang trại ở Khánh Hòa Cá bệnh xuất hiện các vết thương tổn trên bề mặt

cở thể, tróc vẩy và xuất huyết dưới da, nặng hơn có các vết loét sâu trên bề mặt cơ thể Cá bệnh bơi lờ đờ trên mặt nước, kém ăn hoặc bỏ ăn, chết lác đác và mọi kích thước cá đều có thể nhiễm bệnh Bệnh Vibriosis có tỷ lệ gặp cao ở cá nuôi lồng

(100%), cá nuôi ao gặp thấp hơn (58,3%) Một số loài vi khuẩn Vibrio đã phân lập được từ nội tạng cá bệnh, trong đó Vibrio anguillarum đã gây bệnh trong điều kiện

nhân tạo (60-80%) với liều tiêm 0,3ml huyền dịch có mật độ vi khuẩn 4.106 - 4.107

tb/ml sau 3 ngày tiêm

1.4 Sử dụng vắc xin trong nuôi trồng thủy sản

1.4.1 Tình hình sử dụng vắc xin trong NTTS trên thế giới

Vắc xin là một chế phẩm có tính kháng nguyên từ toàn bộ hoặc một phần chiết xuất từ sinh vật gây bệnh, được sử dụng để tăng cường phản ứng miễn dịch đặc trưng của vật chủ mẫn cảm Vắc xin phòng bệnh trong NTTS được bắt đầu nghiên cứu và phát triển từ năm 1973, đến cuối những năm 1987 thì được đưa vào

sử dụng (Newman và ctv, 1993) Tính đến tháng 7 năm 2005, đã có 35 loại vắc xin phòng bệnh vi khuẩn và 2 loại vắc xin phòng bệnh vi rút được đăng ký bản quyền

và sử dụng cho 6 đối tượng nuôi phổ biến trên 41 quốc gia trên thế giới bao gồm cá hồi, cá chẽm châu Âu, cá chẽm châu Á, cá rô phi và cá Bơn đuôi vàng Tại Na Uy, việc sử dụng vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn rất có hiệu quả Những nghiên cứu trước đây cho thấy phòng bệnh cho cá bằng vắc xin ở quy mô thương mại đã được thực hiện rất hiệu quả trong nghề nuôi cá hồi nhằm phòng ngừa các bệnh do vi

khuẩn: bệnh do Vibrio (Vibriosis), bệnh do Vibrio mùa lạnh (cold water Vibriosis),

bệnh xuất huyết đường tiêu hóa (enteric redmouth-ERM), bệnh lở loét (furunculosis) (Ellis, 1997; Gudding và ctv, 1997)

Hiện nay, có nhiều phương pháp sử dụng vắc xin trong NTTS khác nhau như: tiêm, cho ăn, ngâm, tắm, phun…Tuy nhiên, phương pháp tiêm được áp dụng khá phổ biến nhất là trong nghề nuôi cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar) Tiêm vắc xin có thể tiêm xoang bụng hoặc tiêm cơ Nhiều tác giả thông báo rằng việc tiêm kháng nguyên vào cơ tạo nên lượng kháng thể lớn hơn so với tiêm vào xoang bụng (Rijkers và ctv, 1980) Cá giống được tiêm vắc xin vào xoang bụng nhiều tháng trước khi đưa cá ra nuôi lồng ở biển Đây là phương pháp có hiệu quả nhất để kích thích sản xuất kháng thể toàn thân cũng như tạo được hiệu quả bảo vệ tốt nhất

Phương pháp này cũng cho phép việc sử dụng chất bổ trợ nhằm gia tăng đáp ứng miễn dịch Ví dụ như: Tiêm SRBC (sheep red blood cell) vào cơ cá chép tạo nên lượng kháng thể cao hơn so với tiêm vào tĩnh mạch (Rijkers & ctv, 1980) Ngoài ra còn phải kể đến các nhân tố khác tác động tới hiệu quả sử dụng vắc xin ở cá như tuổi cá, mùa vụ, nhiệt độ (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004)

Chất bổ trợ là chất làm tăng đáp ứng miễn dịch, bao gồm nhiều chất khác nhau, cơ chế tác dụng của chúng rất đa dạng và nhiều trường hợp vẫn chưa được làm rõ Trong đáp ứng miễn dịch dịch thể, đặc biệt với kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức, có thể được tăng cường khi kết hợp kháng nguyên với chất bổ trợ như

trường hợp vắc xin phòng bệnh Aeromonas (Paterson và ctv, 1981) hoặc BKD

(Klonz và ctv, 1983) Trong các trường hợp này có lẽ có vai trò tăng cường đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên hoặc có tác dụng kích hoạt đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu hoặc cả hai vai trò này Do hiệu quả bảo vệ khi sử dụng chất bổ trợ mang lại trong các loại vắc xin hiện hành mà mọi thử nghiệm đánh giá hiệu quả vắc xin hiện hành đều sử dụng kết hợp với chất bổ trợ Tuy nhiên, một số chất bổ trợ mang lại hiệu quả bảo vệ cao trong thử nghiệm vẫn chưa được sử dụng trong các sản phẩm thương mại do các chất này gây nên phản ứng viêm cục bộ tại vị trí dẫn truyền kháng nguyên và gây ra các tác dụng phụ khác Nhìn chung kháng nguyên hòa tan cần phải được sử dụng phối hợp với chất bổ trợ mới có thể tạo nên đáp ứng miễn dịch dịch thể (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004)

Theo FAO, 2006 nghề nuôi cá hồi mới phát triển từ đầu năm 1980 nhưng đến năm 2003 sản lượng cá hồi trên thế giới đạt khoảng 700.000 tấn Tuy nhiên bệnh do vi khuẩn là một trở ngại chính cho ngành công nghiệp này Lượng sử dụng thuốc kháng sinh trong nghề nuôi cá hồi tăng dần từ 0,3kg/1tấn cá đến 0,9kg/1tấn cá năm 1987, sau đó lượng kháng sinh sử dụng giảm dần từ khi xuất hiện các loại vắc xin có hiệu quả trong phòng bệnh vi khuẩn gây ra trên đối tượng này Từ những năm 90 của thế kỷ trước và cho đến nay thì hầu như không còn sử dụng kháng sinh trong nuôi cá hồi thương phẩm (Phạm Văn Thư, 2006)

Việc sử dụng vắc xin không chỉ thay thế thuốc kháng sinh trong nghề nuôi cá hồi mà chúng còn giảm chi phí sản xuất cá hồi trên thế giới Theo số liệu thống kê của FAO, 2006 chi phí sản xuất ra 1 kg cá hồi từ năm 1987 là gần 7 euro thì đến

năm 2003 đã giảm xuống dưới 2 euro/kg Có nhiều nguyên nhân giúp cho chi phí sản xuất cá hồi giảm trên 30% từ năm 1987 đến 2003 như cải thiện công nghệ nuôi, hoàn thiện thức ăn công nghiệp và đặc biệt là tăng tỷ lệ sống của cá nhờ vào việc sử dụng các loại vắc xin phòng bệnh vi khuẩn trên đối tượng này Theo kết quả thống

kê của FAO, 2006 thì cho đến năm 2005 có đến 95% tổng số cá được tiêm vắc xin trước khi đưa vào nuôi thương phẩm và tỷ lệ sống của cá nuôi thương phẩm đạt trên 90% Chính vì vậy, sử dụng vắc xin đóng vai trò quan trọng cho sự phát triển NTTS bởi vì:

- Trong nuôi trồng thủy sản, phương châm “phòng bệnh hơn chữa bệnh” cần được

áp dụng triệt để vì việc trị bệnh cho đối tượng thủy sản khó khăn hơn rất nhiều so với động vật trên cạn

- Tăng lợi nhuận nhờ tăng tỷ lệ sống và giảm hệ số thức ăn nhờ nâng cao được sức khỏe cá

- Giảm thiểu lượng thuốc, hóa chất, đặc biệt là kháng sinh sử dụng trong quá trình nuôi do đó giảm giá thành sản phẩm

- Thân thiện với môi trường

- Nâng cao chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm cho cá thu hoạch, đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng trong và ngoài nước

- Cải thiện được thương hiệu của sản phẩm thủy sản trên thị trường thế giới và góp phần tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản do các doanh nghiệp xuất và nhập khẩu yên tâm vì chất lượng sản phẩm từ nuôi trồng thủy sản ở các nước trên thế giới được đảm bảo

- Góp phần quan trọng trong sự phát triển nuôi lồng bè một cách bền vững (Phạm Văn Thư, 2006)

1.4.2 Tình hình và triển vọng sử dụng vắc xin trong NTTS ở Việt Nam

Ngày 03/3/2011, Thủ tướng Chính phủ đã ra Quyết định số 332/QĐ-TTg phê duyệt đề án phát triển nuôi trồng thủy sản đến năm 2020 với mục tiêu đến năm 2020 sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt trên 4,5 triệu tấn, giá trị kim ngạch xuất khẩu từ nuôi trồng thủy sản đạt 5 - 5,5 tỷ USD, giải quyết việc làm cho khoảng 3,5 triệu người Để đạt được mục tiêu như trên thì việc phát triển cần có quy họach cụ thể, trong đó quản lý dịch bệnh cho các đối tượng nuôi thủy sản được đặt lên hàng đầu

Nhiều giải pháp để quản lý dịch bệnh đã và đang được áp dụng như cải tạo ao kỹ, chọn giống tốt sạch bệnh, quản lý tốt môi trường, quan tâm đến dinh dưỡng, quản lý việc sử dụng thuốc và hóa chất nhưng hiệu quả vẫn chưa cao (Bùi Thị Bích Hằng, 2010) Trong số các bệnh của thuỷ sản thì nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn gây

ra với những ổ dịch có qui mô lớn Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh Do việc sử dụng không đúng cách và quá nhiều các loại thuốc kháng sinh nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc (antibiotic resistence) và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh trong cơ thể động vật thuỷ sản Một nguyên nhân khác gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc là việc sử dụng các loại kháng sinh với hàm lượng nhỏ trong thức ăn của thuỷ sản như một chất kích thích sinh trưởng Vì vậy, việc sản xuất và sử dụng vắc xin trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam để quản lý dịch bệnh có ý nghĩa rất lớn (Trần Đăng Ninh, 2006)

Hiện tại đã có một số công trình nghiên cứu, phát triển và ứng dụng vắc xin vào nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam Đề tài sản xuất vắc xin Bộ Thủy Sản năm 2006: ”Nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, basa, cá giò, cá Hồng Mỹ nuôi công nghiệp” Từ đầu năm 2006, PHARMAQ- công ty dược phẩm thủy sản hàng đầu thế giới của Na Uy đã chọn cá tra Việt Nam là đối tượng đầu tiên để nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh gan thận mủ (do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri gây ra) cho cá tra Từ cuối năm 2009, bước đầu thử nghiệm

tiêm vắc xin phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi do Đại học Cần Thơ tiến hành

ở 3 điểm thí nghiệm thuộc các tỉnh Đồng Tháp, An Giang và Bến Tre đã đạt kết quả rất hứa hẹn, cho phép hy vọng ứng dụng thực tiễn rộng rãi trong thời gian không xa, giúp ngăn ngừa dịch bệnh, giảm tổn thất cho người nuôi, loại trừ việc sử dụng các loại kháng sinh trong nuôi cá và ngăn chặn nguy cơ ảnh hưởng xấu đến môi trường, bảo đảm sự phát triển bền vững ngành sản xuất loài thủy sản chiến lược này của Việt Nam (Thương mại thủy sản – Số 127/ tháng 7/ 2010)

Với những kết quả đạt được như trên, hy vọng trong tương lai việc ứng dụng vắc xin phòng bệnh cho cá nuôi sẽ được triển khai rộng rãi và đây là một công cụ quản lý sức khỏe hữu hiệu cho các đối tượng nuôi thủy sản

Vắc xin bất hoạt có sử dụng chất bổ trợ

Là vắc xin được sản xuất trực tiếp từ chủng vi khuẩn gây bệnh, sau khi nuôi cấy tăng sinh và diệt vi khuẩn bằng nhiệt hoặc hóa chất (formalin, glutaraldehyde) Loại vắc xin này rẻ, công nghệ sản xuất đơn giản và có thể sản xuất với quy mô lớn, phù hợp với điều kiện Việt Nam (Phạm Văn Thư, 2006)

Chất bỗ trợ là những hợp chất hóa học được them vào trong vắc xin nhằm làm tăng khả năng kích thích miễn dịch và tăng hiệu lực của vắc xin Bao gồm: chất

bổ trợ vô cơ, hữu cơ (nhũ dầu) và sinh vật (xác vi khuẩn, nội độc tố của vi khuẩn) Tác dụng của chất bỗ trợ:

- Kích thích miễn dịch do bản thân chất bổ trợ gây phản ứng viêm nhẹ, kéo theo hay tăng sinh các đại thực bào và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch khác

- Hấp thụ kháng nguyên, khoanh vùng kháng nguyên, làm chậm quá trình giải phóng kháng nguyên tại vị trí tiêm, do đó kháng nguyên tồn tại lâu trong cơ thể, kéo dài sự trình diện kháng nguyên

- Kích thích sự hoạt động của tế bào tình diện kháng nguyên cho cơ quan Lympho để quá trình phân tích trình diện kháng nguyên đạt hiệu quả

- Chất bổ trợ sinh vật có tác dụng kích thích tế bào miễn dịch (Phạm Văn Tý, 2001)

1.5 Biến đổi mô tế bào tại vùng tiêm vắc xin

Khi tiêm vắc xin, tại vùng tiêm sẽ xảy ra biến đổi mô tế bào rõ rệt Đặc trưng của biến đổi mô này chính là phản ứng viêm Viêm là hiện tượng xảy ra ở tổ chức tế bào, là phản ứng phòng vệ của sinh vật trước sự tấn công hay kích thích từ bên ngoài lên cơ thể thông qua phản xạ của hệ thống thần kinh Đây là một quá trình bệnh lý cơ bản, bao gồm một số quá trình nhỏ sau:

 Biến đổi về chất của tổ chức tế bào tại vùng tiêm vắc xin

Khi tác nhân lạ xâm nhập vào cơ thể sẽ xảy ra đáp ứng miễn dịch, biến đổi mô

tế bào và phản ứng viêm bắt đầu Biến đổi về chất của tế bào ưu tiên chính giữa ổ viêm, còn xung quanh biến đổi về chất không rõ ràng Nguyên nhân làm biến đổi chất của mô tế bào do trao đổi chất bị rối loạn, thiếu dinh dưỡng cung cấp đến do kích thích cơ học và hóa học của tác nhân lạ xâm nhập khi tiêm vắc xin Mặt khác hệ

thống tuần hoàn bị rối loạn, làm tế bào bị hoại tử Kết quả của quá trình này là tạo ra các chất phân giải như protein và các axit hữu cơ (Trịnh Bỉnh Dy và ctv, 2006)

 Tăng cường sự thẩm thấu của các tế bào máu và dịch thể

Khi cơ thể sinh vật có phản ứng viêm, dịch thể và các tế bào máu thẩm thấu qua thành mạch máu, đi vào tổ chức tế bào đang bị viêm Tại ổ viêm, đầu tiên mạch máu có sự thay đổi, do kích thích, động mạch nhỏ co lại, thời gian co rất ngắn sau

đó giãn ra, các mao quản trong vùng viêm cũng giãn ra, lúc này một lượng máu lớn hơn bình thường được đưa đến mạch máu gần ổ viêm Tính thẩm thấu qua vách mạch máu cũng tăng lên, đặc biệt khi ổ viêm nặng Nhiều thành phần máu được thẩm thấu gồm: globulin miễn dịch, hồng cầu thẩm thấu qua thành mạch máu một cách bị động, các loại bạch cầu thẩm thấu một cách chủ động Tại tổ chức tế bào bị viêm, bạch cầu tiêu diệt tác nhân và các loại tế bào chết bằng cách bao vây và tiết men để tiêu hóa, đây là hiện tượng thực bào Các thể Globulin miễn dịch có nhiệm

vụ kết hợp với các kháng nguyên trung hòa độc tố Như vậy, kết quả của quá trình thẩm thấu qua thành mạch máu là tiêu diệt tác nhân, trung hòa độc tố và làm sạch vết thương (Trịnh Bỉnh Dy và ctv, 2006)

 Tăng sinh tế bào

Cùng với hiện tượng tăng quá trình thẩm thấu của các thành phần máu qua vách mạch máu, tới ổ viêm, các tế bào xung quanh ổ viêm có hiện tượng tăng sinh tế bào, với mục đích phục hồi lại các tế bào đã chết của tổ chức, bao vây cô lập tác nhân

Bất kỳ một chứng viêm nào của cơ thể sinh vật cũng xảy ra 3 quá trình nêu trên và có quan hệ mật thiết với nhau Đây cũng là một trong nhiều bản năng tự vệ của cơ thể trước sự xâm nhập của tác nhân lạ

Đến nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về biến đổi mô học của cá sau khi tiêm vắc xin nhằm nâng cao hiệu quả của vắc xin trong phòng bệnh Đặc trưng của biến đổi mô học sau khi tiêm vắc xin chính là phản ứng viêm của cơ thể khi có tác nhân lạ xâm nhập vào Cơ chế hình thành phản ứng viêm ở cá, nhìn chung tương tự như ở động vật có vú Ngoại trừ điểm khác biệt là cá không có histamine, chức năng xúc tác của histamine được thay thế bởi 5-hydroxytryptamin (serotonin) (Nilsson và Holmgren, 1992) Đáp ứng tế bào trong phản ứng viêm trải qua 2 giai đoạn, thoạt đầu là sự gia tăng số lượng bạch cầu trung tính từ máu chuyển

đến, tiếp sau là sự xuất hiện của đại thực bào và Lympho bào tại ổ viêm Bạch cầu trung tính tập trung khoảng 1 giờ sau khi tiêm tác nhân gây viêm và số lượng sẽ đạt cực đại sau 48 giờ (Afonso và ctv, 1998) Phản ứng viêm được kích ứng và kiểm soát bởi một số yếu tố, bao gồm các amin gây giãn mạch, các bổ thể, eicosanoid và cytokine được giải phóng trong đáp ứng đối với tổn thương mô hoặc sản phẩm của các tác nhân gây bệnh Các amin gây giãn mạch (5-hydroxytryptamin) là các nhân

tố tiền phát, phản ứng nhanh Sau đó các yếu tố mới được tổng hợp như eicosanoid

và cytokine sẽ thu hút và hoạt hóa các bạch cầu Sau khi tới ổ viêm, bạch cầu sẽ giải phóng các yếu tố nhằm điều hòa phản ứng viêm (Secombes, 1996; Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004)

Theo Phạm Văn Tý (2001), tế bào Đại thực bào có tác dụng bắt giữ, tiêu kháng nguyên lạ thành mảnh peptid để tiến hành trình diện kháng nguyên Việc xuất hiện của Đại thực bào nhiều sẽ làm cho việc trình diện kháng nguyên có hiệu quả Vài trò của tế bào Lympho là thực hiện đáp ứng miễn dịch Việc tăng tế bào Lympho sẽ tăng khả năng sinh kháng thể

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Thời gian thực hiện từ tháng 2 năm 2014 tới tháng 8 năm 2014

- Địa điểm:

+ Tiến hành bố trí thí nghiệm và thu mẫu tại Cam Ranh - Khánh Hòa

+ Tiến hành phân tích và xử lý mẫu tại: Phòng Bệnh cá - Trung tâm Nghiên cứu

Quan trắc cảnh báo môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền Bắc - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 (Đình Bảng - Từ Sơn - Bắc Ninh)

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Ngành: Chordata

Lớp: Actinopterygii

Bộ: Perciformes

Họ: Rachycentridae

Giống: Rachycentron (Kaup, 1826)

Loài: Rachycentron canadum (Linnaeus, 1766)

Hình 2.1 Cá Giò (Rachycentron canadum) (dpi.qld.gov.au)

Tên tiếng Việt: Cá Giò, cá Bớp, cá Bóp

Tên tiếng Anh: Cobia, Black Kingfish, lemonfish

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Các nội dung thực hiện

Hình 2.2 Sơ đồ các nội dung thực hiện của đề tài

V1

Thu mẫu mô ở ngày thứ 7, 14, 21 sau khi tiêm

Vắc xin thử nghiệm phòng bệnh Vibriosis

Tiêm 0,1ml vắc xin vào cơ lưng cá giò

(15-25gam)

Xử lý mẫu mô Thu mẫu mô ở 7, 14, 21 ngày sau khi tiêm

Đọc kết quả

Kết luận và đề xuất ý kiến

+ V1, V6: Phối trộn tỷ lệ kháng nguyên khác nhau (V1:V6: 5:1) nhưng cùng tỷ

lệ nhũ dầu (1:1)

+ V4-1, V4-2: Phối trộn cùng một tỷ lệ kháng nguyên (1:1) nhưng tỷ lệ nhũ dầu khác nhau (1:2)

- Đối chứng (ĐC): Tiêm nhũ dầu

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu mô học

Áp dụng theo phương pháp mô bệnh học của D.V Lightner (1996)

Hình 2.4 Các bước thực hiện của phương pháp mô bệnh học

 Cố định và bảo quản mẫu

Dùng dụng cụ giải phẫu cắt lấy một miếng nhỏ mô (khoảng 0,5cm3) từ cơ để cố định trong dung dịch: 100ml fomalin 10%, 900ml nước cất, 0,4g Acidsodiumphosphate monohydrate (NaH2PO4.H2O; 6,5g Anhydrous disodiumphosphate (Na2HPO4), tỷ lệ về thể tích giữa mẫu và dung dịch cố định là 1/10 Mẫu này được giữ trong dung dịch cố định từ 24 đến 48 giờ tùy thuộc vào khối mẫu lớn hay nhỏ mà thời gian cố định khác nhau Sau thời gian cố định, mẫu được bảo quản trong cồn etanol 70% Thời gian để bảo quản trong cồn etanol không giới

Đọc tiêu bản trên kính hiển vi quang học ở các độ phóng đại x100, x400 và x1000

Cố định và bảo quản mẫu

hạn Tuy vậy, mẫu càng nhanh xử lý các bước tiếp theo càng tốt Khi cố định và bảo quản cần ghi nhãn để tránh nhầm lẫn

 Xử lý mẫu

Mẫu được lấy ra khỏi cồn 70% và được làm mất nước bằng cách ngâm trong dung dịch cồn etanol với liều lượng tăng dần (70%, 95% và 100%) trong 4 giờ cho mỗi nồng

độ cồn Sau đó tiếp tục ngâm mẫu trong dung dịch Methyl salicylate từ 12 đến 24 giờ

để làm mềm mẫu, rồi thấm parafin vào mẫu bằng cách ngâm các mẫu này trong parafin nóng chảy (60oC) với thời gian ít nhất là 6 giờ

 Đúc mẫu trong Parafin

Lấy mẫu đã ngâm trong parafin, phân bố vào các khuôn, ghi nhãn để không bị nhầm lẫn, sau đó đổ parafin nóng chảy vào khuôn, dùng panh để sắp xếp mẫu vào chính giữa khuôn, chuyển vào dàn lạnh để khối mẫu nhanh chóng đông cứng thành khối parafin chứa mẫu ở trong

 Cắt và sấy mẫu

Mẫu sau khi đúc parafin xong, được gọt thành khối hình thang cân hoặc hình chữ nhật Sau đó, gắn lên máy Microtom và tiến hành cắt mẫu với độ dày lát cắt 3 đến 4 micromet Lát cắt được đưa vào nước ấm 40 – 50oC trong khoảng 1 - 2 phút

có thể lâu hơn để mẫu giãn hết cỡ không bị nhăn, trong nước ấm có bổ sung lòng trắng trứng gà Tiếp theo, dùng lam sạch lấy lát cắt ra khỏi nước và đặt lên máy sấy

ở nhiệt độ 45 – 60oC trong 1 – 4 giờ

 Phương pháp nhuộm Hematoxyline và Eosin (H&E)

Nhằm để phát hiện những biến đổi trong tổ chức mô và tế bào khi nhiễm bệnh Quy trình thực hiện nhuộm H&E như sau:

 Etanol 75% 2 – 3 phút

 Etanol 70% 2 – 3 phút

 Rửa nước: nhúng trong nước từ 1 – 3 phút

 Nhuộm Hematoxyline – Mayer từ 4 – 6 phút

 Rửa qua nước chảy nhẹ từ 4 – 6 phút

 Đậy lamel bằng Bomcanada

Đọc các tiêu bản nhuộm H&E dưới kính hiển vi quang học ở các độ phóng

đại: x100, x400 và x1000 để phát hiện các biến đổi trong tế bào và trong mô cá ở

7, 14, 21 sau khi tiêm nhũ dầu và vắc xin có nhũ dầu

2.3.4 Phương pháp xác định các loại tế bào

 Tế bào hồng cầu (Erythrocyte)

- - Tế bào hồng cầu cá có dạng

hình bầu dục

- Nhân nằm giữa tế bào

- Nhân bắt màu đậm của thuôc

nhuộm H

Hình 2.5.Tế bào hồng cầu (Erythrocyte)

(Chapter 4 – Blood and Blood Cell Development Fish Histology and Histopathology, 4-1)

 Tế bào bạch cầu (White blood cell)

Hình 2.6.Tế bào bạch cầu (White blood cell) (library.thinkquest.org)

 Tế bào đại thực bào (Macrophage)

- Tế bào có dạng hình cầu

- Nhân lớn lệch về một bên tế bào

- Có các không bào dạng bọt khí

bên trong nếu bị kích hoạt

- Tế bào bắt màu nhạt của thuốc

nhuộm H

Hình 2.7 Tế bào đại thực bào (macrophage) (scielo.br)

 Tế bào Lympho (Lymphocyte)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu

Sau khi tiêm 4 loại vắc xin và tiến hành thu mẫu mô ở 7, 14, 21 ngày (tổng thu

60 mẫu) thì tất cả các mẫu mô đều có biến đổi tế bào tại vị trí tiêm, có xuất hiện vùng viêm và phản ứng viêm xảy ra, xuất hiện ổ viêm bên trong vùng viêm

Sau khi tiêm đối chứng nhũ dầu và tiến hành thu mẫu mô sau 7, 14, 21 ngày (tổng thu 15 mẫu) thi trong tất cả các mẫu mô đều thể hiện biến đổi mô học giống nhau ở cùng thời gian tiêm

3.1.1 Đặc điểm mô học cơ cá giò khỏe

Tiến hành phân tích mẫu mô cơ cá giò tại vị trí cơ lưng, cấu tạo chủ yếu là

mô cơ vân

Hình 3.1 Mô cơ cá giò bình thường

(Sợi vân dọc (A); sợi vân ngang (B), A(x40), B(x100), C(x400), D(x1000))

Do vắc xin được tiêm ở vị trí cơ lưng, chính vì vậy để nghiên cứu sự biến đổi

mô tại vị trí tiêm, cần phải có hình ảnh cơ cá khỏe để so sánh Hình 3.1 là tiêu bản

mô cơ cá giò khỏe ở các độ phóng đại khác nhau x40, x100, x400, x1000 Mô cơ cá giò là cơ vân gồm nhiều các sợi cơ liên kết với nhau, xếp song song thành từng bó, cấu trúc liên kết chặt chẽ, rất ít bắt gặp các tế bào máu trong cơ và bắt màu hồng

của thuốc nhuộm Eosin Quan sát được cơ vân cắt ngang và cơ vân cắt dọc vì chúng

sắp xếp theo nhiều hướng khác nhau (Hình 3.1A, B)

Mỗi sợi cơ vân là một khối lăng trụ do các tơ cơ, tương cơ và màng cơ tạo thành Toàn bộ sợi cơ là những vân ngang sáng, tối xen kẽ nhau Mỗi sợi cơ vân là một hợp bào chứa nhiều nhân và được bọc ngoài bằng màng sợi cơ Nhân thường có hình trứng hoặc hơi dài, ít chất nhiễm sắc chứa 1-2 hạt nhân Nhân nằm ở ngoại vi

khối cơ tương, sát dưới màng sợi cơ, mỗi sợi có nhiều nhân (Hình 3.1C) Bên trong

sợi cơ, dọc theo chiều dài là các tơ cơ giống như sợi chỉ xếp song song với nhau và

ít bắt gặp các tế bào máu (Hình 3.1D)

3.1.2 Mô cơ cá giò 7 ngày sau khi tiêm các loại vắc xin và nhũ dầu

3.1.2.1 Mô cơ cá giò 7 ngày sau khi tiêm các loại vắc xin và nhũ dầu, x100

Hình 3.2 Mô cơ cá giò 7 ngày sau khi tiêm nhũ dầu, x100

Quan sát trên tiêu bản mô cơ 7 ngày sau khi tiêm nhũ dầu (Hình 3.2), nhận

thấy mô cơ có sự biến đổi Mô cơ bắt màu hồng của Eosin, các sợi cơ xếp song song, một số bị đứt gãy, mất liên kết và không có hiện tượng hoại tử nghiêm trọng Trong cơ xuất hiện khá nhiều giọt dầu

Hình 3.3 Mô cơ cá giò 7 ngày sau khi tiêm vắc xin V 1 ,V 6 ,V 4-1 ,V 4-2 , x100

Quan sát tiêu bản 7 ngày sau khi tiêm vắc xin V1 thấy xuất hiện một vùng mô

cơ bị biến đổi rộng lớn ngay dưới da, lan rộng và gây hoại tử một vùng cơ lớn bắt màu tím của thuốc nhuộm Hematocylin Vùng bị biến đổi này được gọi là vùng

viêm Các giọt dầu (O) với nhiều kích thước khác nhau Ngoại vi vùng viêm không

bị hoại tử, cấu trúc tế bào cơ bình thường bắt màu hồng của Eosin Quanh giọt dầu

có những sợi cơ chun lại và rách nát

Quan sát tiêu bản mô cơ cá giò cắt ngang sau 7 ngày tiêm vắc xin V6 ở độ phóng đại x100 thấy vùng viêm xuất hiện Các sợi cơ hoại tử không còn hình dạng bình thường Vùng viêm bắt màu tím đậm của thuốc nhuộm Hematoxylin Vùng viêm này lớn hơn so với đối chứng nhưng so với 3 loại vắc xin trên thì bé hơn

Quan sát tiêu bản mô cơ cá giò cắt ngang sau 7 ngày tiêm vắc xin V4-1 ở độ phóng đại x100 thấy vùng viêm gây hoại tử nghiêm trọng một vùng cơ lớn Vùng viêm bắt màu tím của thuốc nhuộm Hematocylin khác với vùng mô bình thường bên cạnh chưa bị biến đổi Vùng viêm xuất hiện rất nhiều giọt dầu có kích thước bé, rải rác có giọt dầu kích thước lớn hơn Vùng viêm khi tiêm vắc xin V4-1 lớn hơn rất nhiều so với khi tiêm đối chứng nhũ dầu

Sau 7 ngày tiêm vắc xin V4-2 vùng viêm xuất hiện dưới da bắt màu tím đậm thuốc nhuộm Hematoxylin Bên cạnh là vùng mô bình thường chưa bị biến đổi bắt màu hồng thuốc nhuộm Eosin