Enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tự nhiên và tái tổ hợp quyền đình thi, đỗ thị tuyên

Đặc tính chung của enzyme Với trình độ khoa học phát triển, trang thiết bị máy móc hiện đại, hầu hết các enzyme biết đến đã được kết tinh và xác định cấu trúc phân tử như ribonucléase, l

V IỆ N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG N G H Ệ V IỆ T NAM

BỘ SÁCH CHUYÊIN KHẢO

ÚNG DỤNG VÀ PHÁT TRIÊN CÓNG NGHỆ CAO

QUYỂN ĐÌNH THI, Đ ỗ THỊ TUYÊN

QUYỂN ĐÌNH THI, Đ ỗ THỊ TUYÊN

Biên mục trên xuất bản phẩm của Thư viện Quốc gia Việt Nam

VIỆN HÀN LÂ M KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ V IỆT NAM

BỘ SÁCH CHUYÊN KHẢO ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ CAO

Lời giới thiệu

Viện Hàn lảm Khoa học và Công nghệ Việt Nam là cơ quan nghiên cứu khoa học tự nhiên và công nghệ đa ngành lớn nhất cả nước, có thế mạnh trong nghiên cứu cơ bản, nghiên cứu và phát triển công nghệ, điều tra tài nguyên thiên nhiên và môi trường Việt Nam Viện tập trung một đội ngũ cán bộ nghiên cứu có trình độ cao,

cơ sở vật chất kỹ thuật hiện đại đáp ứng các yêu cầu về nghiên cứu

và thực nghiệm của nhiều ngành khoa học tự nhiên và công nghệ Trong gần 40 năm xây dựng và phát triển, nhiều công trình và kết quả nghiên cứu có giá trị của Viện đã ra đời phục vụ đắc lực cho

sự nghiệp xây dựng và bảo vệ Tổ quốc Để tổng hợp và giới thiệu có

hệ thống ở trình độ cao, các công trình và kết quả nghiên cứu tới bạn đọc trong nước và quốc tế, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam quyết định xuất bản bộ sách chuyên khảo Bộ sách tập trung vào bốn lĩnh vực sau:

• ứng dụng và phát triển công nghệ cao;

■ Tài nguyên thiên nhiên và môi trường Việt Nam,

■ Biển và Công nghệ biển,

« Giáo trình đại học và sau đại học.

Tác giả của các chuyên khảo là những nhà khoa học đầu ngành của Viện hoặc các cộng tác viên đã từng họp tác nghiên cứu.

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam xin trân trọng giới thiệu tới các quý độc giả bộ sách này và hy vọng bộ sách chuyên khảo sẽ là tài liệu tham khảo bổ ích, có giá trị phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học, ứng dụng công nghệ, đào tạo đại học

và sau đại học.

HÔI ĐỒNG BIÊN TÂP

Chương 2 ENZYME BỐ SUNG VÀO THỨC ĂN CHĂN NUÔI 41

6 Quyền Đinh Thi, Đỗ Thị Tuyên

2.1.4 Chuyên gene mã hóa enzyme vào thực vật 532.2 Sản xuất enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi trên thế giới 572.3 Hiệu quả của đa enzyme so với đơn enzyme 582.4 Nghiên cứu và sản xuất enzyme ờ Việt Nam 60

2.4.4 Hiệu quả kinh tế và mức độ an toàn 67

3.3.1 Biếu hiện xylanase tái to hợp trong Pichia pastoris 106

Mục lục 7

4.1.1 Đặc tínlĩ và cấu trúc của cellulose 133

4.1.2 Khái niệm về cellulase và endo- Í3-ỉ,4-glucanase 136

4.1.6 Các yếu tổ ảnh hưởng đến hoạt tính 147

4.1.7 Tình hình nghiên cứu của (3-glucanase 149

178

4.3.1 Nhân dòng gene mã hóa endoglucanase

4.3.2 Biêu hiện glucanase tái tô hợp

4.3.3 Một số tính chất lý hóa của EglA tái tổ hợp * ^

4.3.4 Nhăn dòng gene mã hóa endo endo-ỊỈ-1,4 từ

4.3.5 Thiêt kê plasmid biêu hiện EglA

4.3.6 Thiết ke plasmid pANEglA biểu hiện trong nấm mốc 194 4.3.7 Biếu hiện rEglA trong p.pastoris GS115 196

8 Quyền Đinh Thi, Đỗ Thị Tuyỏn

4.3.8 Biểu hiện rEglA trong A niger DSM1957 201

4.3.9 Xây íhmg quy trình sản xuất chế phẩm EgỉA 209

5.1.7 Endo- ịd -1,4-mannanase tái to hợp 232

5.1.8 Một số nghiên cứu liên quan ở Việt Nam 238

5.2.1 Chọn chủng Aspergillus sinh tông hợp

5.2.2 Môi trường thay thế của A niger VTCC-F128 247

5.2.3 Môi trường thay thế cùa A oryzae MNO 2 249

5.2.4 Môi trường thay thế của A awamori VTCC-E296 250 5.2.5 Sinh trường của các chùng nghiên cứu trong môi

5.3.1 Xây dimg hệ thống biếu hiện p pastoris

5.3.3 Tính chất lý hóa của mannanase tái to hợp 258

Chương 6 PROTEASE 263

6.1.3 Cơ chề xúc tác của subtilisin

6.1.5 Tình hình nhân dòng gene mã hóa subtilisin từ

6.2.7 Xác định thời gian sinh tong hợp subtiỉisin tối ưu 272

6.2.3 Anh hường của nnguôn carbon và nitrogen 273

6.2.5 Anh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 275

6.3.1 Biếu hiện subtilisin trong E coli BL21 với pET22b+ 275 6.3.2 Biêu hiện subtilisin tái tỏ hợp trong E coli BL21 276

6.3.3 Biếu hiện subtilisin trong p pastorỉs với pPICZaA 278

6.3.4 Biêu hiện subtilisin trong Bacillus subtilis vớipAC7 281

6.3.5 Biếu hiện pAsubGÌ trong Bacillus subtilis WB800 282Chương 7 SẢN XUÁT VÀ ĐÁNH GIÁ CHÉ PHÁM ĐA

10 Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyên

7.1.2 Quy trình công nghệ sản xuất subtilisỉn tái tô hợp 287 7.1.3 Quy trình công nghệ sản xuất glucanase tái to hợp 291 7.1.4 Quy trình công nghệ sàn xuât mannanase tái tô hợp 296 7.1.5 Quy trình công nghệ sản xuất xylanase tái to hợp 301 7.1.6 Quy trình sản xuât chê phàm đa enzyme

8.8.2 Sinh tong hợp mannanase và xylanase 337

8.9.2 Thao tác cẳt, gẳn dính DNA và biến nạp hóa học 339

8.9.6 Biểu hiện plasmid tái tổ hợp trong E coli BL21 340

8.9.7 Biểu hiện plasmid tái to hợp trong Aspergillus 340

8.9.10 Tách chiết DNA tổng so từ Pichia pastorỉs 341

8.9.13 Biến nạp vào Bacillus subtilis WB800 344

12 Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyên

8.12 Các phương pháp thử nghiệm ché phẩm 347

8.12.1 Xác định độ an toàn, độ độc cấp tính và bán

8.12.2 Đánh giá hiệu quả chế phẩm đon enzyme 350

8.12.3 Đánh giá hiệu quà chế phẩm Vietzyme M 352

Deoxyribonucleic acidDinitro salysilicDeoxyadenineDeoxyadenosine triphosphate Deoxycytidine triphosphate Dideoxyadenosine triphosphate Dideoxycytidine triphosphate Dideoxyguanosine triphosphate Nước cất hai lần

Dideoxynucleotide Dimethyl sulfoxide Desoxyribonucleic acid Deoxynucleotide triphosphate

Escherichia coli

Ethylenediaminetetraacetic acid Ethidium bromide, thuốc nhuộm DNA trên gel agarose

EthanolHigh-performance liquid chromatography Kilobase, 1.000 base

Kilo Dalton

14 Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyên

IPTG Isopropyl p-D-l-thiogalactopyranoside

p pastoris Pichia pastorỉs

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis

PCR Polymeration chain reaction, phản ứng chuỗi

kéo dài, phản ứng chuỗi polymer, phản ứng khuếch đại DNA

LỜI MỞ ĐẦU

Enzyme (chất xúc tác sinh học) đóng một vai trò quan trọng trong đời sông con người, chúng được sử dụng rộng rãi trong các ngành nông nghiệp, công nghiệp và y dược Ngày nay với sự phát triển của sinh học phân tử, các enzyme quan trọng đã và đang được cài biến trong các chủng vi sinh vật để nâng cao năng suất, chất lượng, đơn giản hóa quá trình tách chiết và hạ giá thành sản xuất nhằm phục vụ ngày càng tốt hơn cho nhu cầu của con người Xuất phát từ thực tế đó, phòng Công nghệ sinh học enzyme đã tạo ra một loạt các chủng sinh vật biến đổi gene sinh tổng hợp các enzyme tái

tổ hợp như lipase, mannanase, xylanase, glucanase, protease (subtilisin) để có thê ứng dụng vào nông nghiệp, công nghiệp và y dược Bên cạnh đó phòng chúng tôi cũng đã sàng lọc được rất nhiều

các chủng vi sinh vật tự nhiên như Bacillus, Aspergillus có khả

nàng sinh tổng hợp các enzyme xylanase, mannanase, glucanase và protease để ứng dụng bổ sung thức ăn cho chăn nuôi làm tăng trọng

và giảm tiêu tốn thức ăn cho vật nuôi

Để khai thác, sử dụng enzyme có hiệu quả, cần có những hiểu biết nhất định về enzyme, đặc biệt là các enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi.Cuốn sách chuyên khảo này là tài liệu có giá trị tham khảo cho các nhà nghiên cứu về các enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

và những cán bộ nghiên cứu cơ bản về công nghệ tạo chủng tái tổ hợp cũng như biểu hiện chủng tái tổ hợp để sản xuất enzyme nói chung Mặt khác cũng có tác dụng tham khảo cho các nhà sản xuất, chế biến và tiêu thụ thức ăn chăn nuôi

Cuốn sách chuyên khảo này được chia làm 8 chương: Chương 1 giới thiệu chung về enzyme: cấu trúc chức năng, ứng dụng của enzyme; Chương 2 giới thiệu về enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, 4 chương tiếp theo cho 4 loại enzyme xylanase, manananase, glucanase và protease; Chương 7 là nhận xét và đánh giá về thức ăn chăn nuôi bổ sung đơn enzyme và đa enzyme; Chương 8 là vật liệu

và phương pháp cho những nghiên cứu cụ thể

16 Quyền Đình Thi, Đỗ Thị TuyênCác tác già cũng xin chân thành cám ơn những ý loến đóng góp của bạn đọc để chúng tôi có thể bổ sung, sửa chữa và hoàn thiện hơn trong các lần in tiếp theo.

Các tác giả

Chương 1

GIỚI THIỆU CHUNG VÈ ENZYME

Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học, là các chất xúc tác sinh học Chất xúc tác này có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống Nhờ có các chất xúc tác sinh học mà các quá trình hóa học trong cơ thể có thể xảy ra rất nhạy với tốc độ rất nhanh trong những điều kiện sinh lý bình thường cùa môi trường cơ thể sống: nhiệt độ và áp xuất không cao, pH gần như trung tính Như vậy theo định nghĩa chất xúc tác là chất làm tăng cường phản ứng hóa học, sau khi kết thúc quá trình phản ứng, không bị biến đổi hoặc mất đi và không tham gia vào thành phần sần phẩm cùa phản ứng

Một điều quan trọng cần phải kể đến là trong quá trình phàn ứng, chi cần một lượng vô cùng nhỏ enzyme xúc tác cũng đủ để biến đồi ưiột lượng chất tham gia phàn ứng lớn hơn gấp nhiều lần trong một phút Tuy nhiên enzyme không những có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong hệ thống sống, mà sau khi tách khỏi hệ thống sống

chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng in vitro (ở ngoài tế bào)

Do đó có thể tận dụng các nguồn nguyên liệu giàu enzyme như từ thực vật, động vật và đặc biệt là vi sinh vật để tách enzyme Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu tốt của ngành công nghệ sản xuất enzyme, v:i sinh vật có tốc độ sinh trường phát triển nhanh trên các môi trường không đắt tiền như bột đầu cá, bột đậu tương, cao nấm men thậm trí là lõi ngô được sử dụng khi sinh tổng hợp một số các emzyme xylanase, glucanase, mannanase bổ sung vào thức ăn đhăn nuôi, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn cho vật nuôi

Mặt khác sử dụng nguồn vi sinh vật đề sản xuất enzyme có thể clhủ động điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme, nâng cao hàm lượng enzyme trong tế bào của chúng dễ dàng hơn so với thực vật

và động vật bàng các biện pháp công nghệ sinh học như tối ưu các

18 Quyền Đinh Thi, Đỗ Thị Tuyênđiều kiện nuôi cấy, tối ưu môi trường nuôi cấy, hay sử dụng các phương pháp đột biến tia u v , đột biến NTG để tăng khả năng sinh tổng hợp các enzyme.

1.1 Đặc tính chung của enzyme

Với trình độ khoa học phát triển, trang thiết bị máy móc hiện đại, hầu hết các enzyme biết đến đã được kết tinh và xác định cấu trúc phân tử như ribonucléase, lysozyme, trypsin, pepsin, catalase, peroxidase, cytochrome P450 reductase Mặt khác người ta cũng

đã tổng hợp được rất nhiều các enzyme trong phòng thí nghiệm như tag- polymerase, ligase, protease

Bản chất hóa học của enzyme đều là những protein đặc hiệu có cấu tạo phân tử rất phức tạp do đó cũng như các protein, enzyme có một số các đặc tính chung sau:

(1) Enzyme có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa

của protein Đa so enzyme có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn

(2) Các enzyme có thể hòa tan trong nước hoặc trong dung dịch muối loãng và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trong ete và các dung môi không phân cực

(3) Các enzyme không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzyme bị biến tính Môi trường acid hay bazơ cũng làm enzyme mất khả năng hoạt động Enzyme cũng thường bị tủa và biến tính trong các dung môi hữu cơ như rượu, axetone các chất gây kết tủa thuận nghịch đối với protein

như ammonium sulfate, natri clorua và các dung môi hữu cơ ở

nhiệt độ thấp cũng có tác dụng tương tự đối với các enzyme Người ta có thể dùng các chất này để kết tủa và tinh sạch enzyme ví dụ như sử dụng nồng độ muối ammonium sulfate 65% đã tinh sạch được enzyme chitinase từ chủng nấm

Lecanicillium lecaniỉ (Nạuyễn Hữu Quân et al 2013), enzyme

xylanase ở nồng độ muối ammonium sulfate 50- 80% (Lu et

al 2008), glucanase ở nồng độ muối 65% (Huu Quan Nguyen

and Dinh Thi Quyen 2010)’

(4) Enzyme có tính lưỡng tính: tùy pH của môi trường mà tồn tại

ờ các dạng cation, anion hay trung hòa điện có thể sử dụng kỹ thuật điện di biến tính SDS-PAGE để phân tách các loại enzyme và các phân tử của enzyme Ngày nay người ta đã sử

Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG VÈ ENZYME 19dụng kỹ thuật điện di hai chiều (Two-dimensional electrophoresis, 2 DE) một trong những công cụ phân tách protein/enzyme Đây là phưcmg pháp có độ phân giải cao hcm hẳn các phưong pháp phân tách protein/enzyme khác như sắc

ký, điện di 1 chiều, phưcmg pháp này giúp phân tách các protein khác nhau chi đến 0,1 đon vị pi, 1 kDa về khối lượng phân tử và có thể phát hiện vệt protein/enzyme có hàm lượng

< lrịg (Gôrg et al 2000).

(5) Enzyme chia làm hai nhóm: enzyme một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin, amylase và cấc enzyme hai cấu tử (trong

phân tử còn có nhóm không phải protein) Trong phân tử enzyme

hai cấu tử có hai phần: apoenzyme: phần protein (nâng cao lực xúc tác của enzyme, quyết định tính đặc hiệu); coenzyme-, phần

không phải protein (trực tiếp tham gia vào phản ứng enzyme), bản chất là những họp chất hữu cơ phức tạp

(6) Một đặc điểm nữa là enzyme do tế bào sống tổng hợp lên và hoạt động trong môi trường của cơ thể sống cho nên bản thân enzyme cũng như sự hoạt động của nó đều chịu sự kiểm tra điều khiển của tế bào về nhiều mặt Và cũng cần chú ý rằng,

sự tổng hợp của chính enzyme và những chất có hoạt tính sinh học quan trọng khác cũng đều do enzyme xúc tác

1.2 Phân loại enzyme

Người ta thường gọi tên và phân loại enzyme bằng cách lấy tên

cư chất đặc hiệu của enzyme cộng thêm đuôi “ase” Ví dụ: urease là

enzyme tác dụng vào ure, proteinase là enzyme tác dụng vào protein, lipase là enzyme tác dụng vào lipide, amylase là enzyme tác dụng vào tinh bột

Đối với các nhóm enzyme cùng xúc tác một loại phản ứng

thường lấy tên của phản ứng enzyme thêm đuôi “ase”.

Ví dụ:

- Enzyme xúc tác sự oxy hóa được gọi là oxidase

- Những enzyme khử hydro được gọi là dehydrogenase

- Những enzyme thúy phân liên kết este được gọi là esterase

- Những enzyme thủy phân liên kết glucozit được gọi là glucosidase

- Những enzyme đồng phân được gọi là isomerase

2 0 Quyền Đinh Thi, Đỗ Thị Tuyên

Đe gọi tên đầy đủ hơn và chính xác hơn, người ta lấy tên cơ chất cùng với tên của loại phản ứng enzyme cộng thêm đuôi “ase”

Ví dụ:

- Tyrosin decarboxylase: khử cacboxyl của tyrosin

- Lactat dehydrogenase: khử hydro của lactat

- Glucose 6- phosphate dehydrogenase: khứ hydro của glucose 6- phosphate

Bên cạnh đó còn có những tên enzyme đã quen dùng không có đuôi “ase” như trypsin, pepsin, Chymotrypsin, lysozyme Hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã đưa ra cách phân loại thống nhất dựa trên các loại phản ứng và cơ chế phản ứng Enzyme được chia làm 6 lóp, dựa theo phản ứng mà enzyme xúc tác và được đánh số từ 1 đến 6, mồi lớp được chia ra làm nhiều tổ

1 Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng oxi hoá-khử Ví dụ: dehydrogenase, reductase, peroxidase, oxygenase

2 Transferase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyến

vị Ví dụ: acyltransferase, glucozyl transferase,aminotranferase, photphotransferase

3 Hydrolase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy phân

Ví dụ: amylase (a-ß amylase), lipase, petide hydrolase

4 Lyase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử nước vào nối đôi Ví dụ: pyruvat decarboxylase

5 Isomerase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng đồng phân hoá Ví dụ: UDP glucose 4- epimerase

6 Ligase (synthetase): các enzyme xúc tác cho các phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lượng của ATP Ví dụ: pyruvat cacboxylase: xúc tác cho phản úng carbonyl hỏa acid pyruvic tạo thành acid oxalo acetic

Tên enzyme có 2 phần, phần thứ nhất là tên của cơ chất đặc hiệu, nếu là phản ứng hai phân tứ thì lấy tên của cả hai chất Phần thứ hai chỉ loại phản ứng mà enzyme xúc tác cộng thêm với đuôi

“ase” Mồi enzyme được ký hiệu bằng bốn con số, con số thứ nhất chỉ lớp, con số thứ hai chỉ tổ, con số thứ ba chỉ nhóm và con số thứ

4 là số của bản thân từng enzyme

Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG VÈ ENZYME 21

Ví dụ: (2.6.1.2) L- alanine: a- xetoglutarate aminotransferase (alanine aminotransferase) xúc tác cho phàn ứng chuyển vị (lớp 2) nhóm chứa nitơ (tổ 6), nhóm chứa nitơ ấy là nhóm amin (nhóm 1): phàn ứng do enzyme này xúc tác:

Alanine + a- xetoglutarate = pyruvate + glutamate

Tên được gọi như trên là tên hệ thống, cách gọi này chính xác có tính mô tả và có nhiều thông tin, nhưng phức tạp do đó người ta vẫn hay dùng những tên thông thường như amylase, pepsin, Chymotrypsin, glucokinase, peroxidase, catalase

1.3 Cấu trúc phân tử của enzyme

Việc nghiên cứu cấu trúc phân tử của enzyme có vai trò rất quan trọng, nó giúp chúng ta hiểu được cơ chế hoạt động và động học của enzyme Từ đó sẽ giúp chúng ta hiểu được mối liên quan giữa cấu trúc và chức năng của enzyme Enzyme có khả năng và hiệu lực xúc tác rất lớn, có tính đặc hiệu rất cao Để đảm bảo chức năng của enzyme là chất xúc tác sinh học, cấu trúc của enzyme phải rất tinh

tử có thê làm thay đôi hoạt tính xúc tác của enzyme Câu trúc bậc I của enzyme có thể bị biến đổi trong quá trình tiến hóa, tuy nhiên các gốc acid amin có vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động của enzyme không bị biến đổi

Cấu trúc bậc II

Phổ biến là cấu trúc xoắn a (a- helix), phiến nếp gấp ß, ngoài ra còn một số kiểu khác như quay ß, thòng lọng omega £2, cấu trúc lộn xộn (coil) cấu trúc này được giữ vừng nhờ liên kết hydrogéné

Cấu trúc bậc III

Là dạng cuộn lại trong không gian của toàn bộ chuỗi polypeptide, tạo thành hình dạng chung của một chuỗi polypeptide

2 2 Quyền Đinh Thì, Đỗ Thị TuyênKhi tạo thành cấu trúc bậc m , các gốc ở xa nhau trong chuỗi polypeptide có thể được xích lại gần nhau hon trong không gian, tưcrng tác với nhau Đặc tính cấu trúc cũng như độ bền của cấu trúc bậc m chủ yếu nhờ các tưong tác yếu:

Liên kết hydrogen

Tương tác ion giữa các nhóm tĩnh điện trái dấu

Tương tác Vander Waals

Tương tác kỵ nước giữa các nhóm không phân cực

Cấu trúc bậc IV

Các protein/enzyme bao gồm hai hay nhiều chuồi polypeptide (đã có cấu trúc bậc III) kết hợp với nhau nhờ các tương tác phi cộng hóa trị Mỗi chuỗi polypeptide thành viên gọi là phần dưới đơn vị Các enzyme có cấu trúc bậc IV gọi là các enzyme oligomer, tùy theo số lượng các phần dưới đơn vị trong phân tử mà có các tên tương ứng là dimer (gồm hai phần dưới đơn vị), tetramer (4 phần dưới đơn vị), hexamer (6 phần dưới đơn vị) hoặc polymer (nhiều phần dưới đơn vị) Các phần dưới đơn vị của enzyme có cấu trúc bậc IV có thể hoàn toàn giống nhau hoặc khác nhau về cấu trúc và chức năng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Trong một số enzyme có sự phân hóa chức năng rõ rệt, một số phần dưới đơn vị có chức năng xúc tác, một sổ khác có chức năng điều hòa

Thành phần cấu tạo

Có những enzyme chỉ là những phân tử protein đơn giản là sản phẩm của sự thủy phân hoàn toàn của chúng chỉ gồm toàn acid amin Ví dụ các enzyme thuộc loại hydroxylase nhưng cũng có nhiều loại enzyme bản chất thuộc loại protein phức tạp, thành phần câu tạo của chúng gồm hai thành phần, 1 phần là protein đơn giản được gọi là apoprotein hay apoenzyme và một phấn không phái là protein

Phần không phải là protein thường là những chất hữu cơ đặc hiệu

có nhiệm vụ cộng tác với enzyme trong quá trình xúc tác Những tính chất cơ bản của enzyme là do phần apoprotein quyết định nhưng đối với enzyme loại 2 thành phần này, nếu thiếu chất hữu cơ đặc hiệu để làm chất cộng tác (cofactor) thì enzyme cũng không hoạt động được

Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG VÊ ENZYME 2 3Trung tâm hoạt động của enzyme

Dinh nghĩa:

Một phần nhỏ của phân tử enzyme chứa các nhóm chức trực tiếp kết hợp với cơ chất (chất phản ứng bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzyme) tham gia trực tiêp trong việc hình thành, cắt đứt các liên kêt để tạo thành sàn phẩm phản ứng Gọi là trung tâm hoạt động của enzyme

Hay nói một cách khác:

Tat cả các enzyme đều hoạt động xúc tác thông qua những bộ phận đặc hiệu của phản ứng enzyme, gọi là trung tâm hoạt động.Một phần hoặc toàn bộ phần còn lại của phân tử enzyme được coi như các khung câu trúc thích hợp để duy trì hình dạng không gian cân thiêt đôi với tính chât đặc hiệu và hiệu lực xúc tác Khi có

sự biến đôi hình dạng không gian của phân tử enzyme do tác dụng của các chất ậây biến tính như nhiệt, ure, dung môi, hữu cơ làm ảnh hưởng đến khung cấu trúc, gây ra những biến đổi sâu sắc về hoạt tính của enzyme

Trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm: những acid amin có nhóm hóa học có hoạt tính cao như serin, histidin, cysteine, lysine, acginin, glutamic, aspastic tryptophan Ví dụ: trypsin xúc tác thủy phân liên kết peptide của nhóm carboxyl cùa lysine và arginine

/>

N i l - CH ,—c

o-Oỉy

Trợ giúp bẻ gay protein trong ruột

Trypsin là enzyme thủy phân protein tạo ra các peptid có lysine (K) hoặc arginine (R) tại đầu c

Một số đặc điểm chung của trung tâm hoạt động của enzyme

1 Trung tâm hoạt động cùa enzyme chỉ chiếm một tỷ lệ thể tích tương đối nhỏ của phân tử enzyme;

2 Trung tâm hoạt động bao gồm nhiều nhóm chức khác nhau cùa acid amin Phân tử nước liên kết và trong nhiêu trường họp có cả ion kim loại, các nhóm chức của coenzyme (coenzyme hai thành phân);

H , N - C — N H ,

o

rỉ—C H —C — CH,

¿ 0 0

-Aap

2 4 Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyốn

3 Trung tâm hoạt động có cấu trúc không gian xác định;

4 Sự tương ứng về cấu hình không gian giữa trung tâm hoạt động và cơ chất được hình thành trong quá trình enzyme tiếp xúc với cơ chất

Chú ý: Có những enzyme có một trung tâm hoạt động, nhimg cũng có enzyme có hai hay nhiều trung tâm hoạt động,

Ví dụ: Ancol dehydrogenase gan có hai trung tâm hoạt động còn ancol dehydrogenase nấm men có tới 4 trung tâm hoạt động Các trung tâm hoạt động có thể giống nhau nhưng cũng có thể khác nhau về cấu tạo và chức năng

Theo quan điểm của Fisher thì trung tâm hoạt động của enzyme

đã được hình thành sẵn với một cấu tạo nhất định và chi cho phép

cơ chất có cấu tạo tương ứng kết hợp vào, do đó có thể ví sự tương

ứng đó là “ổ khóa và chìa khóa”.

Như vậy mô hình khóa và chìa có thể tóm tắt một số ý chính sau:

Một enzyme liên kết với một cơ chất ở vùng được gpi là trung tâm hoạt động;

Chỉ có những cơ chất nhất định có thể vừa với trung t:âĩn hoạt động;

Nhóm R của amino acid trong trung tâm hoạt động có (thể giúp cơ chất liên kết;

Phức enzyme- cơ chất được tạo thành;

Cơ chất phản ứng tạo ra sản phẩm;

Sàn phẩm được giải phóng

Hình 1.1 Mô hình khóa và chìa khóa của Fisher

Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG VÈ ENZYME 25

Theo Koshland đã đưa ra một giả thiêt:

Dặc điểm của vùng trung tâm hoạt động là rất mềm dẻo và linh hoạt, các nhóm chức năng của trung tâm hoạt động của enzyme tự

dơ chưa ở tư thế sẵn sàng hoạt động khi tiếp xúc với cơ chất (hoặc một chất kết hợp khác nào đó) thì chính cơ chất, do tác dụng cảm ứng không gian đã làm biến đồi hình dạng của phân tử của enzyme

và làm cho các gốc acid amin và các nhóm chức năng của trung tâm hoạt động của enzyme di chuyển và định hướng một cách thích hợp

và chính xác để gắn cơ chất và để thực hiện quá trình xúc tác Trong qúa trình này, một số gốc acid amin khác, do sự thay đổi cấu hình không gian của phân tử enzyme có thê bị vùi kín vào trong phân tử Như vậy có thể nói rằng trung tâm hoạt động của enzyme chỉ thực

sự dược hình thành trong quá trình tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất

Mô hình này được gọi là mô hình “tiếp xúc cảm ímg” hay “mô hình

điêu chình cảm sinh”.

Tóm tắt một so đặc điểm chính của mô hình “điêu chinh cảm sinh ”

- Cấu trúc enzyme linh động, không cứng nhẳc;

- Enzyme và trung tâm hoạt động điều chình cấu dạng để liên kết với cơ chất

- Tăng phổ đặc hiệu cơ chất;

- Các thay đổi cấu dạng cũng cải thiện xúc tác trong lúc phảnứng

E + s ES complex E + P

Hình 1.2 Mô hình điều chỉnh cảm sinh theo Koshland

2 6 Quyền Đinh Thi, Đỗ Thị Tuyên

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tói hoạt động enzyme

Các enzyme tham gia xúc tác vào các phản ứng hóa học đều phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như: nhiệt độ, pH phản ứng, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, các ion kim loại, dung môi, các chất tẩy rửa thậm trí là các chất ức chế Đối với mỗi loại enzyme khác nhau thì sự ảnh hưởng của các yếu tố này là khác nhau có thể dẫn đến thay đổi cấu trúc không gian, độ bền cấu trúc không gian do

đó làm thay đổi hoạt độ xúc tác của enzyme

1.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Do bản chất hóa học của enzyme là protein nên vận tốc phàn ứng do enzyme xúc tác chi tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ánh hưởng đến cấu trúc của enzyme (Hình 1.3)

Nhiệt độ tõl ưu

I

Hình 1.3 Ảnh hường của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng

Có nhiều nghiên cứu đã chứng minh ảnh hường cùa nhiệt độ đén vận tốc phản ứng enzyme cho thấy nhiệt độ hoạt động thích hợp cùa nhiều enzyme vào khoảng 40- 50°c, trên 50°c hoạt động thường bị giảm mạnh do làm hòng cấu trúc phân tử Ở nhiệt độ thấp dưới 0°c, hoạt động enzyme bị giảm nhiều, nhưng lại có thế được hôi phục khi đưa về nhiệt độ bình thường

Tóm tắt một sổ ý chính do ảnh hường của nhiệt độ như sau:

- Hoạt tính thấp ờ nhiệt độ thấp;

- Tôc độ tăng lên với nhiệt độ;

- Hoạt tính cao nhất ờ nhiệt độ tối ưu (thường là 37°c ờ người);

- Mất hoạt tính khi biến tính ờ nhiệt độ cao

Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG VÈ ENZYME 2 7

Ví dụ khi nghiên cứu độ bền hoạt tính của enzyme xylanase từ

chủng A awamori VTCC 312 ở các nhiệt độ khác nhau từ 25-

80°c, hoạt tính enzyme xylanase vẫn duy trì trên 80% ở 37-40°C

(Đo Thi Tuyen et al, 2012) Hoạt tính enzyme xylanase B trong

chủng tái tồ hợp trong P pastoris G S115, nhóm nghiên cứu đã đánh giá một số tính chất lý hóa của xylanase B tái tổ hợp Nhiệt độ và

pH tối ưu là 4 0 °c và pH 4,0 Hoạt tính xylanase vẫn còn duy trì được hon 70% sau khi ủ 1 giờ ở pH 4,0-5,0 và 40°c Như vậy là nhiệt độ càng cao thì hoạt tính của enzyme càng giảm Hầu hết các enzyme đều duy trì hoạt tính ở nhiệt độ dưới 40°c, bền ớ nhiệt độ

37°c (Hình 1.4).

Thời gian (giờ)

40 45 50 Nhiệt dộ (0C)

Hình 1.4 (A) Độ bền của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme xylanase

tách ra từ chủng A awamoriVTCC 312 (Đo Thi Tuyen et al., 2012);

(B) Ảnh hường của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính của enzyme

xylanase tái tổ hợp trong p pastoris từ chủng A.niger DSM1957

(Đo Thi Tuyên et al., 2009)

1.4.2 Anh hưởng nồng độ cơ chất

Tăng nồng độ cơ chất sẽ làm tăng tốc độ phản ứng (nồng độ enzyme không đôi) Hoạt tính tối ưu đạt được khi tất cả các enzyme liên kết với cơ chất

2 8 Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyên

Hình 1.5 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Chúng ta có thể thấy một mối tươníi quan không đổi giừa nồng

độ và tôc độ phản ứng Thực ra, môi tương quan là một đường hyperbola chữ nhật (Hình 1.6) Brown cho rằng tại nồng độ cơ chất cao thì mọi phân tử enzyme được chuyển sang dạng phức hợp ES Nồng độ sucrose tiếp tục tăng thì cũne không có thêm hiệu quả gì Như vậy, tại nồng độ cực thấp, tốc độ phản ứng tuân theo phản ứng bậc nhất

Tại nồng độ cực cao, tốc độ phản ứng tuân theo phản ứng bậc không (zero):

C hlíong 1 GIỚI THIỆU CHUNG VÈ ENZYME 2 9

Năm 1914, Leonar Michaelis và Maud Menten tiếp tục theo đuổi

ý tưcrng này Họ đã đưa ra các hằng số tốc độ: ki, k_i, nhanh hơn so với k2 do vậy một trạng thái gần cân bằng xảy ra giữa E và ES Họ

đã sử dụng mối tương quan để phát triển một phương trình quan trọng, đó là phương trình Michaelis Menten

v = ỵ ss£ Ẽ i

K m+[S]

Phương trình này có các hằng số, v max và K m

Vmax có thể được định nghĩa là tốc độ phản ứng nhận được khi tất cả các phân tứ enzyme (E) chuyển sang dạng ES

Điều này xảy ra tại nồng độ cao (bão hòa) [S]

3 0 Quyền Đinh Thi, Đỗ Tht Tuyên

- Phản ứng xuôi như sau :

1.4.3 Anh hưởng độ p H

Enzyme rất nhạy cảm với pH cùa môi trường, do đó pH có tác dụng rất lớn với tốc độ của phản ứng enzyme Mồi một enzyme có

Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG VÊ ENZYME

một trị so pH thích hợp cho sự hoạt động của nó Ảnh hường cùa

pH đối với phản ứng enzyme có thể do nhiều tác dụng rất khác nhau: pH có thể ảnh hường đến tốc độ phản ứng enzyme do tác dụng vào trạng thái ion hóa cùa phân tử enzyme nhất là các nhóm hoạt động của enzyme

Có thê tóm tăt một sô điêm sau:

- Hoạt tính tối đa ở pH tối ưu

- Các nhóm R của các amino acid có độ tích điện đúng

- Cấu trúc bậc 3 của enzyme là đúng

3 2 Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyên

Ví dụ: Đánh giá ảnh hường đến pH tối ưu và độ bền của pH

của enzyme xylanase tinh sạch khi tách từ chủng A niger

DSM1957, xylanase đã được tách chiết và tinh sạch từ dịch

enzyme thô của chủng A niger DSM1957 sau 72 giờ nuôi cấy

trong môi trường khoáng MTK (Đỗ Thị Tuyên et al., 2009) Bằng phương pháp sắc ký lọc gel (sephadex G-100) thu dược xylanase tinh sạch

Đe xác định pH phàn ứng tối ưu, thực hiện phản ứng ở các pH khác nhau với đệm potassium photphate từ pH 3,0 - 8,0 Khi ủ mẫu với đệm photphate ở dải pH từ 3,0 - 8,0, hoạt tính xylanase đạt 18 -

97 u/m l ở pH 3 hoạt tính là 18 u/m l, hoạt tính tăng dần từ pH 3 - 5

và đạt giá trị cao nhất ở pH 5 (97 u/m l) Sau đó hoạt tính xylanase giảm dần đến pH 8 là 18 u/m l.

Do pH môi trường ảnh hưởng đến độ bền của protein enzyme nên việc lựa chọn môi trường đệm pH thích hợp để bảo quản enzyme là rất quan trọng Có những loại enzyme bền trong môi trường axit; có loại bền trong môi trường trung tính và có loại lại bền trong môi trường kiềm, ờ đây chúng tôi khảo sát độ bền hoạt tính của xylanase trong các đệm 0,02 M potassium photphat với pH

3,0 - 8,0 Sau một thời gian nhất định ủ cùng với đệm ở 30°c, hoạt tính còn lại của dịch enzyme được xác định Kết quả ờ hình 1.10

cho thấy ở pH 6,0 hoạt tính xylanase của chủng A niger DSM1957

tương đối bền, sau 5 giờ ủ hoạt tính còn lại là 69%, sau 6 giờ ủ hoạt tính xylanase còn 66% Trong khi đó ở pH 3 hoạt tính còn lại là 44% sau 5 giờ ủ và giảm mạnh còn 42% sau 6 giờ ủ (Hình 1.10B)

ớ pH 8 sau 6 giờ ủ hoạt tính còn lại là 61% Như vậy là hoạt tính

xylanase ớ chủng A niger DSM1957 bền trong độ pH 6 - 8

1.5 ứ n g dụng của enzyme

Đặc tính của enzyme có một số các đặc tính đặc trưng như có hiệu quả xúc tác cao, tăng vận tốc phản ứng, hoạt động ớ điều kiện và nhiệt độ, pH, áp suất bình thường, cọ tính đặc hiệu cao, không bị mất hoạt tính khi ủ trong các dung môi Ví dụ: các enzyme xylanase, manannase, glucanase và protease Tuy nhiên khi tách enzyme ở các chủng khác nhau thì hoạt tính xúc tác của

enzyme khác nhau Ví dụ: khi tách xylanase ở chủng B subtilis

GI hoạt tính đạt 0,54 u/ml (Đỗ Thị Tuyên et al., 2009) Ó

chủng A oryzae VTCC-F0187 hoạt tính đạt 50 u /m l (Lê Thanh

Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG VÈ ENZYME 3 3Hoànạ et al., 2013) Dựa vào những đặc tính này mà người ta cho rằng việc sử dụng enzyme sẽ đem lại hiệu quà kinh tế to lớn, lợi nhuận lớn cho các nhà doanh nghiệp Đặc biệt củng VỚI

sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, enzyme/protein được sản xuất và thương mại hóa ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các ngành như chế biến thực phẩm và thức ân gia súc, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất bột giặt, làm thuốc chữa bệnh trong dược phẩm, làm các công cụ chẩn đoán bệnh trong y học, công nghiệp sản xuất hóa chất tinh khiết, làm các công cụ cho các phòng thí nghiệm công nghê sinh học và khoa học sự sống

Năm 1995, ước tính ngành công nghiệp enzyme trên thế giới thu được 1 tỷ USD, năm 2005 khoảng 1,7-2 tỷ USD Châu Ấu sản xuất 60% tong so enzyme trên thế giới, số còn lại do Mv và Nhật Bản sản xuất Trong các loại enzyme công nghiệp thì enzyme thủy phân hydrolase chiếm lượng lớn nhất (75%), tiếp đến là carbohydrolase

ứng dụng công nghệ enzyme trong chế biến thực phẩm và thức

ăn gia súc, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất bột giặt, làm thuốc chữa bệnh trong dược phẩm, làm các công cụ chẩn đoán bệnh trong y học, công nghiệp sản xuất hóa chất tinh khiết, làm các công

cụ cho các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và khoa học sự sống ngày nay giúp thay đổi công nghệ truyền thống, tạo ra các sản phẩm thực phẩm có chất lượng cao, thân thiện với môi trường Trên thế giới, việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme trong sản xuất đã được triển khai từ lâu Ờ Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng công nghệ enzyme tuy đã được triển khai ớ nhiều cơ sớ Viện Nghiên cứu và Trường Đại học, nhưng nói chung, những nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm, số ít ở quy

mô thử nghiệm

Khoa học tự nhiên đã có bước phát triển trong nghiên cứu cơ bàn, tạo cơ sở cho việc hình thành một số lĩnh vực khoa học và công nghệ đa ngành mới, góp phần nâng cao trình độ và năng lực cùa khoa học cơ bản Đặc biệt Khoa học kỹ thuật và công nghệ đã đóng góp tích cực vào việc nâng cao năng suất, chất lượng hàng hóa và dịch vụ; cải thiện năng lực cạnh tranh của doanh nghiệp và nền kinh tế; một số lĩnh vực đã tiếp cận trình

độ tiên tiến khu vực và thế giới

3 4 Quyền Đinh Thi, Đỗ Thị Tuyên

Như vậy người ta có thế sử dụng enzyme theo hai cách:

(1) Không tách enzyme ra khởi nguyên liệu, sử dụng các biện pháp công nghệ sinh học đc nâng cao hoạt tính của enzyme

Ví dụ như tối ưu các điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ, độ pH, các thành phần môi trường, nguồn nitơ, nguồn cacbon Ví dụ sau khi tối ưu các điều kiện nuôi cấy, hoạt tính của enzyme

xylanase ở chủng Aspergillus tăng so với chủng tự nhiên (Đàm Thị Hồng et al., 2010).

(2) Tách enzyme ra khỏi nguồn nguyên liệu ban đầu Sau đó

sử dụng các phương pháp tách chiết tinh sạch như sử dụng các dung môi, muối ammonium sulfate, qua các cột sắc ký lọc gel như sephadex, sepharose, biogel hay sác

ký trao đổi ion DEAE từ đó ứng dụng sản xuất các enzyme tinh sạch để sử dụng trên nhiều đối tượng khác nhau và trong các lĩnh vực khác nhau: như nghiên cứu khoa học, nghiên cứu cấu trúc phân tử, phân tích định lượng các chất, xác định chính xác hàm lượng các chất, công nghiệp thực phẩm, chế biến, y dược Tuy nhiên đế giúp tận dụng các nguồn enzyme rộng rãi hơn, chúng ta cần phải phát triển ngành công nghệ sán xuất enzyme, và tìm ra các biện pháp để giảm giá thành chế phẩm enzyme: như tìm các nguồn nguyên liệu thích hợp, ré tiền hoặc có thế sử dụng enzyme lặp lại nhiều lần, sử dụng các biện pháp công nghệ sinh học phù hợp đặc hiệu với từng loại enzyme

1.5.1 Sử dụng enzyme để nghiên cún, phân tích các chất

- Sử dụng các enzyme protease có tính đặc hiệu cao như trypsin

đê nghiên cứu câu trúc phân tử protein

Ví dụ:

Đe nghiên cứu khối phổ của lumbrokinase (protein tinh sạch được tách ra từ chủng tái tố hợp), một điều quan trọng là ngay sau khi protein này được kiểm tra trên điện di SDS- PAGE, thì ngay lập tức băng protein quan tâm cần được xử lý bang trypsin Đây là enzyme thủy phân protein tạo ra các peptid có lysine (K) hoặc arginine (R) tại đầu c Theo tính toán lý thuyết, lumbrokinase bị thủy phân hoàn toàn sẽ tạo thành 10 peptide và 3 amino acid đơn (R, K và K) (Bảng 1.1)

Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG VÈ ENZYME 35

Bảng 1.1 Các đoạn petide thu được theo lý thuyết khi xử lý bằng trypsin

3 6 Quyền Đình Thi, Đỗ Thị TuyênKêt quả báng 1.2 cho thấy petide lớn nhất có kích thước 2336,9194 Da ở vị trí 168- 188 và nhỏ nhất là peptide có kích thước 1405,6144 ở các vị trí khác nhau 190-203; 195-208; 207-220; 216-

229.

Kêt quá thực nghiệm bảng 1.2 cho thấy các peptide sau khi thúy phân đều được ghi lại rõ nét Trên phổ Maldi- Tof xuất hiện các đoạn peptide có khối lượng phân tử trùng với khối lượng phân tử của các đoạn petide được tạo ra theo lý thuyết (1779,4432 Da; 1779,5334 Da; 1651,7674 Da; 1406,3234Da)

Hình 1.11 (A) Nhận dạng protein bằng phương pháp khối phổ nano

LC-MS/MS; (B)Kết quả tìm kiếm trên cơ sờ dữ liệu của NCBI

- Có thê xác định các chất đặc biệt với hàm lượng rất thấp:

Ví dụ việc xác định hàm lượng enzyme SOD trong các mẫu gan động vật sau khi được nghiên cứu thử nghiệm một hoạt chất chống oxy hóa Ịiào đó Hoạt độ enzyme SOD được xác định theo McCord và Fridovich (1969), sử dụng enzyme xanthine oxidase (XO) đề oxy hóa xanthine và sinh ra Superoxide (02-)- Superoxide sẽ khử cyt (Fe3+) thành cyt (Fe2+), có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 550 nm Hoặc hoạt độ peroxidase được xác định sử dụng 3,3'-5,5' tetramethyl benzidine (TMB) làm cơ chất theo phương pháp của Josephy và cộng sự (1982) Trong môi trường đệm phàn ứng thích hợp có hydrogen peroxide (H2O2) và cơ chất TMB, H2O2 sẽ được khử thành H2O và oxy hóa cơ chất TMB tạo thành họp chất có màu xanh hấp thụ cực đại ở

Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG VÈ ENZYME 3 7

bước sóng 492 nm Phương trình phản ứng: H2O2 + 2 TMB

—> oxidized-TMB + H20 Hoạt độ peroxidase được xác định khi so sánh giá trị mật độ quang ở bước sóng 492 nm trên đồ thị đường chuẩn của HPO Hay xác định hàm lượng các nhóm SH dựa trên phản ứng:

5.5’-dithio-bis (2nitrobenzoicacid) -(► R-SHThiophenolatanion

(màu vàng)

Đo độ hấp thụ màu ở 420 nm Sử dụng hệ số £420nm = 13.000 mỉvr! cm'1 tính nồng độ mmol -SH/mg protein

- Có thể phân tích các chất không bền, sử dụng enzyme để phân

tích, tiến hành ờ các điều kiện nhẹ nhàng như nhiệt độ phòng,

pH trung tính

- Xác định cơ chất của enzyme thông qua việc xác định sản

phẩm được tạo thành dưới tác dụng của enzyme, cần phải có

một số điều kiện như nồng độ enzyme phải cao, nồng độ cơ chất đủ để đàm bào phản ứng tiến hành là phản ứng bậc 1, chi phụ thuộc vào nồng độ cơ chất cần xác định

Ví dụ như phản ứng thủy phân tinh bột tạo thành các dextrin

Trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng hiện đại, phát triển với tốc

độ nhanh, việc sử dụng enzyme trong phân tích thực phẩm sẽ đem lại một số lợi ích sau:

Xác định chính hàm lượng các chất trong nguyên liệu ban đầu và sản phẩm cuối trong quá trình sản xuất Ví dụ việc

sàn xuất chế phẩm đa enzyme Sonlazyme từ chủng A

oryzae VTCC-F-0187, trước khi phối trộn tạo sản phẩm cần

phải xác định hoạt tính đặc hiệu của một so enzyme xylanase, glucanase, mannanase và protease từ nguồn nguyên liệu đầu vào sau đó thêm các chất phụ gia để cho đạt được sản phẩm đa enzyme với hoạt tính các enzyme tương ứng 1000 u/g, 200 u/g, 100 u/g và 40 u/g (Lê Thanh

Hoàng et al., 2013)

- Đánh giá tính trung thực trong sản xuất thực phẩm

- Sự biến đổi chất lượng thực phẩm trong quá trình chế biến, bảo quản để lựa chọn tối ưu