Trong nghiên cứu này, chín gene mã hóa cho chín enzyme chịu nhiệt cấu tạo nên quy trình chuyển hóa glucose không sinh ATP được tập hợp trong một operon nhân tạo và cùng thể hiện trong mộ
Trang 1TẬP HỢP VÀ CÙNG BIỂU HIỆN NHIỀU GENE MÃ HÓA
CHO NHIỀU ENZYME CHỊU NHIỆT TRONG E COLI,
ỨNG DỤNG TRONG SINH CHUYỂN HÓA IN VITRO
Phạm Huỳnh Ninh 1 , Kohsuke Hond 2 , Takaaki Sakai 2 , Kenji Okano 2 và Hisao Ohtake 2
1
Bộ môn Dinh dưỡng và thức ăn chăn nuôi, Phân Việ n chăn nuôi Nam bộ, Viện Chăn nuôi 2
Biotechnology department, Graduate school of engineering, Osaka university, Japan
TÓM TẮT
Xây dựng một quy trình chuyển hóa nhân tạo là một trong những phương pháp nổi bật trong sinh chuyển hóa các hóa chất công nghiệp Tuy nhiên, nhiều enzyme phải được chuẩn bị (tinh chế) một cách riêng lẻ cho việc xây dựng quy trình chuyển hóa in vitro vì thế hạn chế việc ứng dụng phương pháp này trong thực tế Trong nghiên cứu này, chín gene mã hóa cho chín enzyme chịu nhiệt cấu tạo nên quy trình chuyển hóa glucose không sinh ATP được tập hợp trong một operon nhân tạo và cùng thể hiện trong một tế
bào tái tổ hợp E coli Mức độ biểu hiện của các gene mã hóa cho các enzyme chịu nhiệt được kiểm soát bởi trình tự của chúng trong operon nhân tạo Hoạt tính của các enzyme tái tổ hợp trong tế bào E coli chứa
chín gene tái tổ hợp cao gấp 5.0-1.370 lần so với hoạt tính của chúng trong chủng tái tổ chứa từng gene mã hóa cho từng loại enzyme chịu nhiệt Chỉ cần xử lý nhiệt dung dịch tế bào tái tổ hợp chứa nhiều enzyme
chịu nhiệt đã làm bất hoạt các protein nội sinh trong E coli và một bước chuẩn bị quy trình chuyển hóa in
vitro gồm một lượng giới hạn các enzyme chịu nhiệt Phối hợp quy trình này với enzyme chịu nhiệt khác
như NADH oxidase hay malate/lactate dehydrogenase chúng ta có thể sản xuất pyruvate và lactate tương ứng chỉ trong 1 mẽ phản ứng.
GIỚI THIỆU
Ngành sản xuất các hóa chất công nghiệp dựa trên xúc tác sinh học đã cho thấy có nhiều lợi thế so với tổng hợp hóa học, ví dụ như sản xu ất có chọn lọc các đồng phân quang học hay
là sử dụng sinh khối, hỗn hợp phức tạp các phân tử hữu cơ, làm nguyên liệu Thêm vào đó, phản ứng chuổi với nhiều enzyme có thể được thực hiện chỉ trong một mẻ phản ứng và do đó chúng ta không cần phải tiến hành t inh lọc các chất trung gian sau mỗi phản ứng (Burda và ctv, 2008) Các lợi thế của quá trình sản xuất dựa vào lên men vi sinh chủ yếu đến từ tính chất chọn lọc độc đáo của enzyme Sự nổi lên của phương pháp sinh chuyển hóa (metabolic
engineering) đã mang lại ứng dụng rộng rải các quy trình lên men cho sản xuất hàng loạt chất
hóa học công nghiệp bao gồm hóa chất thương mại (Nakamura và Whited, 2003; Whited và
ctv, 2010), dược phẩm (Ajikumar và ctv, 2010; Paddon và ctv, 2013) và cả năng lượng
(Atsumi và ctv, 2008; Choi và Lee, 2013) Tuy nhiên, việc đưa một hệ thống trao đổi chất nhân tạo vào vi sinh vật thường dẫn đến việc cạnh tranh các chất trung gian và cofactor với hệ thống trao đổi chất của vi sinh vật, làm giảm hiệu quả sản xuất các hoạt chất mong muốn Một trong những chiến lược để vượt qua hạn chế này là tránh dùng vi sinh vật sống, chỉ dùng những enzyme cấu tạo nên hệ thống trao đổi chất mà chúng ta muốn Gần đây, một loạt các
con đường trao đổi chất nhân tạo đã được thiết kế cho việc sản xuất các loạ i alcohol (Guterl
và ctv, 2012; Krutsakorn và ctv, 2013), axít hữu cơ (Ye và ctv, 2012, 2013), carbohydrate
Trang 2(You và ctv, 2013), hydrogen (Woodward và ctv, 2000; Zhang và ctv, 2007), và điện sinh học
(Zhu và ctv, 2014) Việc áp dụng các phản ứng sinh chuyển hóa phức tạp bằng cách tập hợp hàng loạt các enzyme của cùng 1 quy trình trao đổi chất thể hiện khá nhiều lợi thế như hạn chế hình thành phụ phẩm, có thể dự đoán được lượng sản phẩm sinh ra và có thể đơn giản quá trình tinh lọc, thu hồi sản phẩm (Ye và ct v, 2012) Mặc dù cho thấy khá nhiều điểm nổi bật
như trên, nhưng phương pháp sinh chuyển hóa in vitro vẫn còn nhiều hạn chế cần phải cải
thiện Rollin và cộng sự (2013) đã đưa ra 4 điểm hạn chế chính cần phải khắc phục trước khi
có thể được áp dụng vào sản xuất, bao gồm sản xuất enzyme chi phí thấp, kéo dài thời gian phản ứng của enzyme, công nghiệp hóa sản xuất cofactor và tối ưu hóa, mô hình hóa quy trình phản ứng Bên cạnh đó, việc các enzyme trong quy trình phản ứng nhân tạo phải được chuẩn bị riêng lẻ ở các mẻ nuôi cấy khác nhau đã hạn chế việc khai thác một trong những đặc tính nổi bật của các phản ứng sinh học, đó là việc thực hiện nhiều phản ứng trong cùng 1 mẻ (multistep reactions in a single reactor)
Giải pháp tiềm năng cho các vấn đề ở trên có thể đến từ việc sử dụng enzyme chịu nhiệt
như là chất xúc tác khi thiết kế quy trình chuyển hóa Xử lý nhiệt tế bào vi khuẩn (vd: E coli),
chứa toàn bộ hệ thống enzyme chịu nhiệt cấu tạo nên chuổi phản ứng mà chúng ta muốn, sẽ làm biến tính các enzyme nội sinh của tế bào và vì thế chúng ta chỉ cần một bước chuẩn bị để
có thể có một hỗn hợp các enzyme chịu nhiệt Thêm vào đó, do đặc tính bền của enzyme chịu nhiệt nên chúng ta có thể hạn chế bất lợi cơ bản của của sinh chuyển hóa in vitro, là không có khả năng tổng hợp protein và tái tạo Trong nghiên cứu này, các gene mã hóa cho 9 enzyme chịu nhiệt, các enzyme này tạo nên quy tình chuyển hóa glucose không sinh ATP (non
-ATP-forming chimeric glycolytic pathway) (Ye và ctv, 2012), được tập hợp trong một operon nhân
tạo và cùng được biểu hiện trong một tế bào E coli Bằng cách kết hợp dịch chiết đã xử lý nhiệt của E coli chứa các enzyme chịu nhiệt với enzyme chịu nhiệt khác như H2O-forming NADH oxidase hay malate/lactate dehydrogenase, ta có thể chuyển hóa glucose thành các sản phẩm tương ứng là pyruvate hay lactate
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Chủng vi khuẩn và plasmid
E coli DH5a được sử dụng để nhân dòng plasmid và biểu hiện các gene Bacillus subtilis
BUSY9797 (Hiroe và ctv, 2012), có khả năng ức chế hoạt động biểu hiện gene của Pr
promoter, được sử dụng cho việc tập hợp nhiều gene vào operon nhân tạo Cả E coli và B subtilis đều được nuôi cấy trong môi trường Luria -Bertani (LB) ở 37oC Ampicillin (100
mg/mL) và tetracycline (10 mg/mL) được sử dụng để chọn lọc các chủng tái tổ hợp Hệ thống
(promoter cảm ứng nhiệt/chất ức chế biểu hiện) Pr/CI857 (Jechlinger và ctv, 1999) được sử
dụng cho việc biểu hiện của các gene tái tổ hợp ở E coli do việc sử dụng loại promoter khác
sẽ tạo nên việc biểu hiện gene ngoại lai k hông thể kiểm soát ở B subtilis và có xu hướng cản
trở việc tập hợp các gene vào operon nhân tạo (Nishizaki và ctv, 2007) Biểu hiện gene ngoại
lai ở E coli được thực hiện bằng cách tăng nhiệt độ nuôi cấy vi khuẩn lên 42oC vào cuối giai
đoạn pha log Tiế p đến, vi khuẩn được nuôi cấy ở 42oC trong 4 giờ và sau đó ly tâm thu tế
bào E coli-B subtilis shuttle vector, pGETS118 (Kaneko và ctv, 2005), và một loạt các
Trang 3vector pUC19 với các trình trự cắt giới hạn duy nhất (DraIII) được thiết kế để nhân dòng từng gene mã hóa cho từng enzyme chịu nhiệt (Hiroe và ctv, 2012), là quà tặng từ Tiến sỹ K
Tsuge (Đại học Keio, Nhật) Vector pRCI, sở hữu Pr promoter và một cassette biểu hiện cho
hệ thống ức chế (cI857 của 1 phage) Pr promoter
Tập hợp gene vào operon nhân tạo
Các gene, được tối ưu các codon phiên mã, mã hóa cho glucokinase (GK), glucose
-6-phosphate isomerase (PGI), 6-phosphofructokinase (PFK), fructose-bis-6-phosphate aldolase (FBA), triosephosphate isomerase (TIM), enolase (ENO), and pyruvate kinase (PK) của vi
khuẩn chịu nhiệt Thermus thermophilus HB8, non-phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPN) của vi khuẩn cổ (archaea) Thermococcus kodakarensis
KOD1, và phosphoglycerate mutase không phụ thuộc cofactor (PGM) của vi khuẩn cổ
Pyrococcus horikoshii OT3, được tập hợp vào một operon nhân tạo theo thứ tự nhất định trong B subtilis bằng phương pháp OGAB (Ordered Gene Assembly in B.subtilis) (Tsuge và
ctv, 2003) Trình tự 5’ không mã hóa (UTR) chứa vị trí bám ribosome (RBS) của vector
pET21a được tạo ra sau (upstream) trình tự codon khởi động của mỗi gene nhân tạo (gen sử
dụng được tổng hợp nhân tạo) Cả 2 đầu 5’ và 3’ của gen tổng hợp nhân tạo đều được thiết kế
vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn BspQI Các gene tổng hợp sau đó được cắt với enzyme cắt giới hạn BspQI và được đưa vào vị trí tương ứng trong các vector nhân dòng pUC Các vector nhân dòng chứa gene nhân tạo (pUC19V-1st-GAPN, pUC19V-2nd-FBA, pUC19V-3rd-GK, pUC19V-4th-ENO, pUC19V-5th-PGM, pUC19V-6th-PFK, pUC19V-7th-PK, pUC19V-8th-TIM, và pUC19V-9th-PGI) sau đó được cắt với enzyme cắt giới hạn DraIII để tạo ra các đoạn
gene có 2 đầu với các đầu so le chứa 3 base (được thiết kế đặc biệt cho để kết nối các gen vào
vị trí đã xác định trong operon nhân tạo) Các đoạn DNA với 2 đầu so le sau đó được tinh sạch, trộn với nhau (2 fmol/mL mỗi loại gene) và được kết nối vào vị trí được cắt bởi S fiI của vector pGETS118 bằng T4 DNA ligase (Toyobo, Osaka, Nhật) Quá trình biến nạp plasmid
tái tổ hợp vào B subtilis được thực hiện như mô tả của Tsuge và ctv (2003) Plasmid tái tổ hợp chứa các gene mong muốn được tách chiết từ B subtilis (pGETS-CGP) sau đó biến nạp vào E coli DH5a Vi khuẩn E coli DH5a này cũng được biến nạp plasmid pRCI.
Real-Time PCR
Mức độ phiên mã mRNA của các gene tái tổ hợp được xác định bằng Real-time PCR (RT-PCR) RNA tổng số được tách chiết bằng RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA), và
sau đó sử dụng cho phản ứng phiên mã ngược với ReverTra Ace qPCR RT kit (Toyobo) RT-PCR được tiến hành với máy RT -RT-PCR StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA)
sử dụng SYBR green real-time PCR Master Mix-plus (Toyobo) Đường chuẩn được dựng để
tính toán hàm lượng mRNA với phương pháp hồi quy tuyến tính Mức độ biểu hiện của các
gene tái tổ hợp ở E coli được chuẩn hóa bằng cách so sánh với mức biểu hiện của gene tham
khảo rrsA (16s rRNA)
Trang 4Xác định hoạt lực enzyme
Vi khuẩn E coli tái tổ hợp sản xuất enzyme chịu nhiệt được trộn đều với dung dịch đệm
50 mM HEPESNaOH (pH 7,0) và tiến hành phá vở tế vào bằng song siêu âm với máy UD
-201 ultrasonicator (Kubota, Osaka, Nhật) Dịch tế bào sau đó được xử lý nhiệt ở 70oC trong
30 phút và ly tâm để loại bỏ các mảnh vở tế bào Phần dịch trong được thu và được sử dụng như là dung dịch enzyme Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme được thực hiện như theo
mô tả trước đây của Ye và ctv (2012) Tóm tắt quy trình như sau, một lượng enzyme GK vừa đủ trong dung dịch đệm 50 mM HEPES-NaOH (pH 7,0) với 0,2 mM ATP, 5 mM MgCl2, 0,5 mM MnCl2, 1 mM NADP, 0,1 mM glucose-1-phosphate, và một lượng thừa enzyme PGI, PFK, FBA, TIM, và GAPN Hỗn hợp các enzyme này được ủ ở 70oC trong 2
phút, sau đó phản ứng được bắt đầu bằng cách bổ sung 0,1 mM glucose Mức giảm của NADP được đo đạc bằng máy quang phổ hồng ngoại ở bước sóng (Model UV-2450,
Shimadzu, Kyoto, Nhật) Tương tự , hoạt tính của PGI, PFK, FBA, TIM, và GAPN cũng
được đo đạc bằng máy quang phổ với việc thay thế glucose bằng cơ chất của mỗi enzyme (tương ứng 0,1 mM glucose -6-phosphate, fructose-6-phosphate, fructose-1,6-bisphos-phate,
dihydroxyacetone phosphate hay 0,2 mM glyceralde-hyde-3-phosphate) Hoạt tính của
PGM được xác định bằng cách kết hợp với ENO, PK và lactate dehydrogenase của T thermophilus (TtLDH) Dung dịch phản ứng chứa 0,2 mM ADP, 5 mM MgCl2, 0,5 mM MnCl2, 0,2 mM NADH và một lượng dư ENO, PK, TtLDH Sau khi ủ ở 70oC trong 2 phút, phản ứng được bắt đầu bằng cách thêm vào dung dịch 0,2 mM 3 -phosphoglycerate và việc tiêu thụ NADH được đo đạt bằng máy quang phổ ở 340 nm Hoạt tính của ENO và PK được
xác định tương tự như trên nhưng thay đổi cơ chất tương ứng bằng 0,2 mM
2-phosphoglycerate và phosphoenolpyruvate Một đơn vị hoạt tính được định nghĩa là tổng
lượng mmol cơ chất được tiêu thụ trên một đơn vị thời gian
Xác định tốc độ phản ứng sản xuất Pyruvate
Tế bào vi khuẩn E coli chứa vector pGETS-CGP và pRCI được huyền phù trong dung
dịch đệm 50 mM HEPES-NaOH (pH 7,0) với mật độ tế bào là 50 mg/mL và sau đó bị phá hủy bởi sóng siêu âm Dịch tế bào sau đó được ủ ở 70oC trong 30 phút và sau đó sử dụng trực
tiếp như chất xúc tác sinh học mà không cần phải loại bỏ các mảnh vở tế bào hay protein bị biến tính Việc chuẩn bị chất xúc tác sinh học từ hỗn hợp chín loại tế bào vi khuẩn chứa chín loại enzyme khác nhau cũng được thực hiện tương tự như trên Các chủng vi khuẩn chứa enzyme chịu nhiệt GK, PGI, PFK, FBA, TIM, GAPN, PGM, ENO và PK được trộn với nhau theo tỷ lệ tương ứng là 5, 1, 2, 5, 1, 32, 2, 1 và 1 mg tế bào/mL, phá vở tế bào bằng sóng siêu
âm và sau đó ủ ở 70oC for trong 30 phút Dung dịch phản ứng (1 mL) chứa dung dịch đệm 50
mM HEPES-NaOH (pH 7,0), 0,1 mM glucose, 5 mM MgCl2, 0,5 mM MnCl2, 0,2 mM ATP, 0,2 mM ADP, 1 mM NADP, 1 mM glucose-1-phosphate và dịch tế bào chuẩn bị từ 50 mg tế
bào NADH oxidase của Thermococcus profundus được thêm vào phản ứng với nồng độ 0,1
U/mL để tái tổng hợp NADP cần cho phản ứng Phản ứng được thực hiện ở 70oC, khuấy trộn với tốc độ 1.400 vòng/phút sử dụng máy thermomixer (Eppendorf, Hamburg, Đức) Sau khi ủ
10 phút, phản ứng được dùng lại bằng cách thêm vào dung dịch phản ứng 0,8 ml 1 M HCl
Trang 5trong dung dịch methanol lạnh Tiếp theo đó, protein biến tính được loại bỏ bằng ly tâm và
sau đó tiến hành vi lọc bằng Amicon 3 K (Millipore, Billerica, MA) Dịch lọc được cho phản ứng với một lượng tương đượng với dung dịch o -phenylene diamine (1 mg/mL) hòa tan trong
3 M HCl (Mühling và ctv, 2003) để tạo hỗn hợp chất phản quang từ pyruvate Dịch phản ứng
sau đó được ủ ở 80oC trong 60 phút và sau đó xác định nồng độ chất phát huỳnh quang bằng
máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Sản xuất lactate
Dung dịch phản ứng (4 mL) chứa dịch đệm 50 mM HEPES-NaOH (pH 7,0), 0,1 mM glucose, 5 mM MgCl2, 0,5 mM MnCl2, 0,2 mM ATP, 0,2 mM ADP, 1 mM NADP, 0,2 mM NADH và 1 mM glucose-1-phosphate Dung dịch tế bào, được chuẩn bị từ 200 mg tế bào vi
khuẩn tái tổ hợp chứa 9 enzyme chịu nhiệt, và 0,2 U malate/lactat e dehydrogenase của T thermophilus HB8 (MLDH) (Ye và ctv, 2012), được sử dụng như chất xúc tác sinh học Phản
ứng được tiến hành ở 70oC với hệ thống khuấy trộn Dung dịch gồm glucose (24 mM) và
NADP (10 mM) được cung cấp vào phản ứng với tốc độ 1 mL/phút (tương ứng 6 nmol
glucose/mL/phút và 2,5 nmol NADP mL/phút) sử dụng bơm dung môi Shimadzu LC -20 AD Dung dịch phản ứng (60 m L) được thu sau mội giờ, ly tâm loại bỏ mảnh vở tế bào (15.000 vòng/phút trong 10 phút) Dịch trong được thu nhận và tiến hành vi l ọc với Amicon 3K và phân tích bằng HPLC
Phương pháp phân tích
Pyruvate dưới dạng chất phát huỳnh quang được xác định bằng HPLC với cột Cosmosil
l5C18-ARII (4,6 x 150 mm, Nacalai Tesque, Kyoto, Nhật) Cột được rửa ở 35oC sử dụng hỗn hợp dung môi gồm 45% methanol và 1% axít acetic với tốc độ dòng 0,4 mL/phút Chất phát huỳnh quang được xác định bằng đầu dò huỳnh quang RF10A (Shimadzu) với bước sóng
kích thích và phát quang tương ứng là 360 và 415 nm Lactate được phân tích bằng HPLC với
việc kết nối 2 cột nối với nhau như mô tả bởi Ye và ctv (2012)
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tập hợp gene
Tối ưu hóa quy trình chuyển hóa là vấn đề quan trọng cốt lõi để có thể đạt được tốc độ phản ứng cao trong các quy trình nhân tạo (Nowroozi và ctv, 2014; Oliver và ctv, 2014; Pfleger và ctv, 2006) Trước đây, chúng tôi đã chứng minh rằng dòng vật chất đi qua hệ thống chuyển hóa vật chất nhân tạo có thể được kiểm soát bằng cách kiểm soát sự tiêu thụ hay sản xuất NAD(P)H bằng máy quang phổ (Ye và ctv, 2012) Kỹ thuật kiểm soát này ch o phép
chúng ta xác định được bước giới hạn trong chuổi phản ứng, bằng cách tăng lượng của từng
loại enzyme Tỷ lệ enzyme tối ưu để có thể đạt được tốc độ phản ứng thông qua quy trình chuyển hóa đã được thiết kế có thể được xác định bằng thực nghiệm thông qua việc thay đổi nồng độ của enzyme ở bước giới hạn trong chuổi phản ứng (Krutsakorn và ctv, 2013; Ye và ctv, 2012) Thách thử chủ yếu cho quá trình tạo ra chủng vi khuẩn tái tổ hợp Có khả năng biểu
Trang 6hiện tất cả các enzyme trong chuổi phản ứng là việc sản xuất lại tỷ lệ thích hợp của các enzyme trong vi khuẩn bằng cách thay đổi mức độ biểu biệu của các gene Mặc dù mức độ biểu hiện của gene bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố bao gồm sức mạnh của promoter và hiệu quả của quá trình giải mã, chúng tôi chỉ tập t rung vào vị trí của các gene để giảm bớt các yếu
tố cần khảo sát Việc sử dụng 1 operon đơn lẻ giúp hạn chế sự thay đổi trong quá trình kiểm soát phiên mã (Pfleger và ctv, 2006) và mức độ phiên mã của các cistron trong polycistron có
xu hướng giảm dần về phía xa của promoter (Nishizaki và ctv, 2007) Dựa trên giả thuyết
rằng, gene mã hóa cho 9 enzyme chịu nhiệt trong quy trình chuyển hóa glucose được sắp xếp trên một operon nhân tạo ở vị trí thích hợp Để xác định vị trí của các gene, chín gene được
lần lượt được đưa vào sau Pr promoter của vector pRCI và được biểu hiện ở E coli DH5a.
Mức độ phiên mã tạo mRNA và hoạt tính của các enzyme chịu nhiệt mã hóa từ những gene
trên trong từng vi khuẩn E coli được xác định và số lượng bản sao mRNA cần thiết để tạo
nên 1 đơn vị hoạt tính của enzyme được trình bày trong bảng 1, dòng 4 Lượng enzyme để đạt
được tốc độ phản ứng tạo pyruvate 0,005 µmol/phút thông qua toàn chuổi phản ứng được xác định bằng thực nghiệm sử dụng dịch chiết tế bào chứa mỗi enzyme như mô tả bởi Ye và ctv (2012), và lượng mRNA cần thiết để mã hóa được lượng enzyme tối ưu được tính toán như
bảng 1, dòng 6 Kết quả chỉ ra rằng gene mã hóa cho GAPN cần phải được phiên mã nhiều nhất trong tất cả 9 gene Theo đó, gene mã hóa cho GAPN cần được đặt ở vị trí gần promoter nhất, tiếp theo là gene mã hóa cho FBA, GK, ENO, PGM, PFK, PK, TIM và PGI (bảng 1, dòng 7) Các gene được tập hợp trong operon nhân tạo và sau đó được đưa vào vector
pGETS118 dưới sự kiểm soát của Pr promoter bằng phương pháp OGAB (Tsuge v à ctv, 2003) Điện di các đoạn DNA sau khi cắt vector tái tổ hợp (pGETS -CGP) bằng EcoRI cho kết
quả đúng như tính toán, điều này chứng tỏ rằng các gene đã được đưa vào operon nhân tạo ở chính xác vị trí mong muốn (Hình 1)
Bảng 1 Sự biểu hiện gene và hoạt tính enzyme trong tế bào tái tổ hợp chứa mỗi một enzyme.
Số lượng mRNA
Hoạt tính enzyme
mRNA/đơn vị enzymea
Lượng enzyme tối ưub
Lượng mRNA cần thiếtc
a
Số lượng bản sao mRNA cần để sản xuất 1 U mỗi enzyme được tính toán bằng cách chia mức độ biểu hiện mRNA (dòng 2) cho hoạt tính enzyme (dòng 3).
b
Hàm lượng enzyme được xác định bằng thí nghiệm để đạt được tốc độ tiêu t hụ glucose 2,5 nmol/phút/ml.
c
Lượng mRNA cần thiết để sản suất lượng enzyme tối ưu được tính toán bằng cách nhân mRNA/đơn vị enzyme
(dòng 4) và nồng độ enzyme tối ưu (dòng 5).
Trang 7Hình 1 (A) Sơ đồ các vị trí các genen trong pGETS-CGP và kích thước các đoạn DNA ước tính
nếu cắt vector tái tổ hợp bằng EcoRI (B) Điện di các đoạn DNA sau khi cắt bằng EcoRI.
Khoảng 0,1g pGETS-CGP được cắt với EcoRI và tách rời nhau bằng điện di
trên gel agarose (cột phải).DNA bị cắt bởi HindIII được sử dụng làm marker (cột trái).
Sự biểu hiện của các gene tái tổ hợp
Sự phiên mã mRNA của các gene mã hóa cho 9 enzyme chịu nhiệt trong tế bào tái tổ hợp
được xác định bằng RT-PCR (Hình 2) Mức độ biểu hiện của các gene tương ứng với vị trí
của chúng trong operon nhân tạo, ngoạ i trừ gene mã hóa cho ENO và PGM Mức độ biểu hiện của 2 gene này cao hơn mong muốn Kết quả này có thể do sự hình thành một promoter khác,
do quá trình tối ưu hóa gene cho việc biểu hiện ở E coli, nằm trong gene mã hóa cho GK.
Mức độ biểu hiện cao của gene mã hóa cho enzyme ENO và PGM cũng có thể đế từ sự khác nhau về tính bền của các cistron Mặc dù nguyên nhân dẫn đến sự biểu hiên vượt trội của 2
gene trên chưa được làm rõ, tuy nhiên sự khác nhau về tính bền của các cistron trong
polycistron mRNA đã đượ c quan sát trong tự nhiên trên tế bào vi khuẩn E coli (Esquerré và
ctv, 2014) Sự khác nhau về mức ảnh hưởng của các yếu tố cis-acting RNA và hoạt động của các endoribonuclease nội sinh cũng có thể đóng góp vào tính bền vững của mRNA SDS
-PAGE cho thấy hầu hết protein nội sinh của dịch chiết tế bào E coli không có vector
pGETS-CGP đã bị biến tính ở 70oC trong 30 phút (Hình 3, cột 2) Trong khi đó, dịch chiết đã xử lý
nhiệt của tế bào E coli có vector pGETS-CGP cho thấy có những vạch mà không tìm thấy ở
tế bào E coli không chứa vector tái tổ hợp (Hình 3A, cột 4) Việc sản xuất các enzyme chịu nhiệt ngoại lai trong tế bào tái tổ hợp E coli còn được khẳng định bằng cách so sánh sự di
chuyển của các vạch protein trong tế bào tái tổ hợp có vector chứa 9 gene mã hóa cho 9
enzyme và các vạch của tế bào E coli tái tổ hợp có vector chứa 1 gene mã hóa cho 1 enzyme
(Hình 3 B) Thêm vào đó, việc xác định hoạt lực của tất cả 9 enzyme chịu nhiệt trong tế bào
vi khuẩn E coli chứa vector pGETS-CGP tái khẳng định sự biểu hiện của các gene tái tổ hợp (bảng 2) Hoạt tính của 9 enzyme chịu nhiệt trong dịch chiết tế bào E coli tái tổ hợp được so
sánh với chúng trong hỗn hợp gồm 9 tế bào (mỗi tế bào chứa 1 loại enzyme) Tỷ lệ của các tế bào chứa mỗi enzyme trong hỗn hợp đượ c tính toán nhằm đảm bảo tốc độ phản ứng sản xuất pyruvate thông qua toàn chuổi phản ứng là 0,005 µmol/phút/mL (cụ thể chúng tương đương
Trang 8với số liệu trong bảng 1, dòng 5) Hoạt tính của enzyme trong chủng tái tổ hợp chứa 9 enzyme
cao hơn từ 5,0 (FBA) đến 1.370 (PGM) lần so với hoạt tính của chúng trong hỗn hợp 9 chủng
khác nhau (bảng 2)
Hình 2 Mức độ biểu hiện của các gene mã hóa cho các enzyme chịu nhiệt chuyển hóa glucose trong
tế bào E coli tái tổ hợp Dữ liệu của RT-PCR được phân tích lặp lại ít nhất 3 lần và được thể hiện
trong hình là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn
Hình 3 (A) Sử biểu hiện protein của vi khuẩn E coli chứa pGETS118 (không chứa gene ngoại lai, cột
1 và 2) và pGETS-CGP (chứa 9 gene ngoại lai, cột 3 và 4) Dịch chiết tế bào được chuẩn bị từ 1 mg tế bào, xử lý nhiệt (cột 1 và 3) và sau khi xử lý nhiệt (cột 2 và 4) ở 70°C trong 30 phút và sau đó chạy gel 12% acrylamide (B) SDS-PAGE của dịch chiết tế bào tái tổ hợp chứa từng enzyme chịu nhiệt và tế bào chứa 9 enzyme chịu nhiệt Khối lượng phân tử của các enzyme tái tổ hợp (kDa) như sau: GAPN, 55,5; PK, 51,1; PGI, 46,1; ENO, 45,5; PGM, 45,1; PFK, 33,5; FBA, 32,3; GK, 31,5 và TIM, 27,0
Trang 9Bảng 2 Hoạt tính riêng enzyme trong tế bào tái tổ hợp cứa chí enzyme và hỗn hợp chín loại tế
bào chứa mỗi một enzyme a
Tế bào chứa chín enzyme
a
Hoạt tính enzyme được xác định trong dịch chiết tế bào của vi khuẩn tái tổ hợp đã xử lý nhiệt Hoạt tính
enzyme được tính toán quy về khối lượng ướt của tế bào sử dụng để chuẩn bị dịch chiết enzyme (50 mg tế bào
chứa 9 enzyme và 50 mg hỗn hợp chín tế bào chứa mỗi một enzyme).
b
Hỗn hợp chín tế bào E coli chứa một trong các enzyme GAPN, FBA, GK, ENO, PGM, PFK, PK, TIM và GI
được trộn với nhau theo tỷ lệ 32:5:5:1:2:2:1:1:1 (khối lượng ướt).
Việc sản xuất một protein ngoại lai trong vi sinh vật tái tổ hợp thường hình thành các cấu trúc lỗi và dẫn đến việc tích lũy các potein không tan trong nước (inclusion body) Trong thực nghiệm, SDS-PAGE của dịch chiết các chủng vi khuẩn chỉ chứa 1 enzyme chịu nhiệt cho thấy một số enzyme chịu nhiệt hình thành dưới dạng protein không tan (ví du như PFK và FBA)
Trong khi đó, các enzyme khác như ENO và GK thì hầu hết được biểu hiện dưới dạng protein
hoạt động (hòa tan trong nước) (hình 4) Các quan sát này chỉ ra rằng sự khác nhau về hiệu quả của quá trình cuộn gập của protein cũng có đóng góp vào sự kiểm soát chặt chẻ quá trình biểu hiện đa gene Nói chung, việc tích lũy protein dạng inclusion body không đáng kể trong
vi khuẩn tái tổ hợp chứa nhiều enzyme, vì vậy nó tạo nên hoạt tính cao của enyzm trong chủng tái tổ hợp đa enzyme chịu nhiệt
Hình 4 SDS-PAGE của protein tan (soluble -S) và không tan (insoluble-I) của tế bào tái tổ hợp chứa
mỗi enzym và chứa 9 enzyme chịu nhiệt Dịch chiết tế bào được chuẩn bị từ 1 mg tế bào ướt Phần protein tan và không tan được tách ra bằng cách ly tâm ở 15.000 × g trong 15 phút Phần protein tan trong nước được xử lý nhiệt ở 70oC trong 30 phút, sau đó lý tâm, phần dịch trong sẽ được thu và dùng cho SDS-page Phần không tan trong nước được rửa 1 lần với dung dịch đệm và dùng c ho SDS-page
mà không cần xử lý nhiệt
Trang 10Xác định tốc độ phản ứng thông qua toàn bộ quy trình chuyển hóa in vitro
Tốc độ chuyển hóa glucose thành pyruvate thông qua toàn bộ chuổi phản ứng với chín enzyme chịu nhiệt được xác định bằng cách sử dụng chủng tái tổ hợp chứa chín enzyme
NADH oxidase chịu nhiệt từ T profundus, xúc tác chuyển 4 electron từ O2sang H2O sử dụng
NADH như là chất cho electron (Jia và ctv, 2008), được thêm vào phản ứng nhằm tổng hợp
cofactor cần cho phản ứng Khi 50 mg tế bào chứa 9 enzym e và hỗn hợp 9 loại tế bào vi khuẩn chứa một trong chín loại enzyme được sử dung Tế bào chứa 9 enzyme cho tốc độ phản ứng sản xuất pyruvate cao hơn 4,2 lần so với hỗn hợp 9 loại tế bào (hình 4) Hoạt tính cao của enzyme trong tế bào chứa 9 enzyme (bảng 2) dường như góp phần làm nên tốc độ phản ứng cao này Việc sử dụng dịch tế bào (dịch thô, bao gồm cả mảnh vỡ tế bào) chứa 9 enzyme và hỗn hợp chín tế bào chứa mỗi loại enzyme cho kết quả cao hơn 1,4 và 2,1 lần tốc độ sản xuất pyruvate
so với việc sử dụng tế bào nguyên vẹn (xử lý nhiệt nhưng không phá vở tế bào bằng sóng siêu âm) Kết quả này chỉ ra rằng việc gom, đóng gói nhiều enzyme vào trong tế bào có ảnh hưởng
đến tốc độ phản ứng Cấu trúc màng tế bào E coli bị phá vở 1 phần hay toàn bộ ở nhiệt độ cao
và 1 phần enzyme chịu nhiệt (dạng hòa tan trong nước) thoát ra ngoài môi trường phản ứng
(Ninh và ctv, 2013) Chúng tôi đã tiến hành đánh giá mức độ thất thoát lượng enzyme chịu nhiệt
từ tế bào ra ngoài môi trường của tế bào tái tổ hợp chứa 9 enzyme (hình 5 ) Mặc dù mức độ thất
thoát khác nhau ở từng enzyme, tuy nhiên hơn 80% lượng enzyme vẫn còn giữ trong tế bào E coli Điều này có nghĩa là cấu trúc màng tế bào vi khuẩn E coli không bị phá hủy hoàn toàn
(chỉ 1 phần) dưới điều kiện thí nghiệm Màng tế bào còn tồn tại có thể phần nào ảnh hưởng đến
sự khuếch tán của cơ chất vào bên trong tế bào và do đó làm giảm tốc độ phản ứng Tốc độ phản ứng chậm hơn trong phản ứng sử dụng tế bào (đã xử lý nhiệt) cũng có thể đến từ tình trạng
đông đúc của các đại phân tử sinh học bên tong tế bào Tổng lượng protein và RNA trong một
tế bào E coli nằm trong khoảng 300-400 mg/mL và chúng chiếm từ 20-30% thể tích tế bào chất
(Ellis, 2001) Do đó, sự khuếch tán của các phân tử có kích thước nhỏ trong tế bào chậm hơn từ
3 đến 4 lần so với khuếch tán trong nước (Kao và ctv, 1993) Tốc độ khuếch tán chậm có thể
làm giảm tốc độ phản ứng chuổi nhân tạo bên trong tế bào
Hình 5 Tốc độ sản xuất pyruvate với tế bào chứa 9 enzyme (cột màu xám) và hỗn hợp chín tế bào
chứa một trong chín enzyme (cột màu trắng) Tốc độ sản xuất được xác định sử dụng 50 mg (khối lượng ướt) của tế bào và dịch tế bào (tế bào bị phá vở bằng sóng siêu âm) Hỗn hợp các tế bào chứa một trong chín en zyme có tỷ lệ GK, PGI, PFK, FBA, TIM, GAPN, PGM, ENO và PK như sau: 5: 1: 2: 5: 1: 32: 2: 1: 1 (khối lượng ướt)
