Tìm hiểu và thực tập quy trình định danh vi khuẩn staphylococcus aureus, heamophilus influnenae và klebsiall peneumoniae trên bệnh phẩm đàm tại bệnh viện nhân dân Gia Định

Bên cạnh sự nổ lực của bản thân đã vận dụng những kiến thức thu thập ở trường, tìm tòi học hỏi cũng như thu thập những thông tin số liệu liên quan đến đề tài, nhóm chúng em đã nhận được

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

2 NGUYỄN THỊ THÙY

3 PHẠM TRỌNG

4 PHAN HÙNG VƯƠNG

5 NGUYỄN NGỌC YẾN – 10271641 Lớp: CDSH12

Niên khóa: 2010 – 2013

Tp Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2013

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa thực tập tốt nghiệp và bài báo cáo thực tập này Bên cạnh sự nổ lực của bản thân đã vận dụng những kiến thức thu thập ở trường, tìm tòi học hỏi cũng như thu thập những thông tin số liệu liên quan đến đề tài, nhóm chúng em đã nhận được sự quan tâm cũng như hướng dẩn tận tâm của Quý Thầy Cô , Cán Bộ và các Anh ( Chị ) tại bệnh viện, cùng với những lời động viên và khích lệ từ phí gia đình và bạn bè trong lúc em gặp khó khăn

Chúng em xin được gởi lời cảm ơn đến Quý Thầy Cô Ban Giám Hiệu trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh, Quý Thầy Cô Viện Công Nghệ Sinh Học và Thực Phẩm đã tận tình dạy dỗ, trang bị cho chúng em những kiến thức, những kinh nghiệm quí báo, để chúng em có được kiến thức thực hành trong thực tiển và vận dụng trong cuộc sống

Chúng em xin cảm ơn chân thành đến Ths.BS Nguyễn Sử Ánh Tuyết và KS Nguyễn Thùy Trang

đã tạo điều kiện tốt nhất cho chúng em thực tập và tận tình giúp đỡ, hướng dẩn trong suốt quá trình thực tập khoa vi sinh của bệnh viện

Chúng em xin gởi lời cảm ơn Th.S Lưu Huyền Trang , Cô đã tận tình hướng dẩn, cung cấp kiến thức và giúp đỡ nhóm chúng em để hoàn thành bài báo cáo thực tập này

Chúng em cũng xin cảm ơn các Anh (chị) tại Bệnh Viện Nhân Dân Gia Định đã chỉ dạy, quan tâm và giúp đỡ chúng em trong quá trình thực tập tại Bệnh Viện

Đồng thời chúng em xin cảm ơn đến gia đình và tập thể lớp CDSH12 trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh đã động viên, giúp đỡ trong những năm học vừa qua và trong quá trình thực tập

Nhóm chúng em xin chân thành cảm!

T.p Hồ Chí Minh tháng 5 năm 2013

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Báo cáo thực tập tại Bệnh Viện Nhân Dân Gia Định

CBHD: Ths.BS Nguyễn Sử Ánh Tuyết

KS Nguyễn Thùy Trang

Nhận xét:

T.p Hồ Chí Minh, ngày… tháng… năm 2013 Cán bộ hướng dẫn:

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN Báo cáo thực tập tại Bệnh Viện Nhân Dân Gia Định

GVHD: Th.S Lưu Huyền Trang

Nhận xét:

T.p Hồ Chí Minh, ngày….tháng….năm 2013 Giảng viên hướng dẫn:

MỤC LỤC

1 GIỚI THIỆU 7

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 7

1.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 8

1.3 MỤC ĐÍCH, NHIỆM VỤ 8

1.4 PHẠM VI ĐỀ TÀI 9

2 TỔNG QUAN 9

2.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH 9

2.1.1 Lịch sử hình thành và phát triển 9

2.1.2 Cơ cấu tổ chức 11

2.2 KHOA VI SINH 13

2.2.1 Giới thiệu khoa 13

2.2.2 Chức năng và nhiệm vụ 13

2.2.3 Thành tích đạt được 14

2.2.4 Hướng phát triển trong tương lai 15

2.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH 15 2.3.1 Phương pháp cấy mẫu bệnh phẩm 15

2.3.2 Phương pháp nhuộm Gram 15

2.3.3 Phương pháp định danh sinh hóa 16

2.3.5 Chuẩn bị môi trường 25

2.4 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27

2.4.1 Haemophilus influenzae 27

2.4.2 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae 37

a Đặc điểm phân loại 37

2.4.3 STAPHYLOCOCCUS AUREUS 40

3 NỘI DUNG THỰC TẬP 49

3.1 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 49

3.1.1 Dụng cụ 49

3.2 PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU BỆNH PHẨM 50

3.2.1 Chỉ định 50

3.2.2 Thời điểm lấy mẫu 51

3.2.3 Cách lấy mẫu đàm 51

3.3 ĐÁNH GIÁ MẪU BỆNH PHẨM ĐÀM 52

3.3.1 Khảo sát đại thể mẫu đàm 52

3.3.2 Khảo sát vi thể 53

3.4 TIẾN HÀNH ĐỊNH DANH CÁC VI KHUẨN 53

3.4.1 Quy trình định danh H influenzae 53

3.4.2 giải thích quy trình 54

3.4.3 Phương pháp định danh Klebsiella pneumoniae 56

MỤC LỤC BẢNG+HÌNH

Các bệnh lý nhiễm khuẩn hô hấp cấp bao gồm viêm xoang , viêm tai giữa , viêm amydale là các bệnh lý viêm nhiễm khuẩn cấp đường hô hấp trên, và viêm phổi, viêm phế quản – phổi là các bệnh lý viêm nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới Tác nhân vi khuẩn thường gặp gây các bệnh lý

nhiễm khuẩn hô hấp cấp là Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae và Moraxella catarrhalis Riêng đối với bệnh lý viêm amydale thì mặc dù tác nhân siêu vi được xem là

nguyên nhân của gần 50% các trường hợp, nhưng Streptococcus pyogenes là tác nhân vi khuẩn

hàng đầu phải được các nhà lâm sàng nghĩ đến Ngoài các tác nhân vi khuẩn trên thì các tác nhân

vi khuẩn không điển hình như Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae và Legionella pneumophila cũng là những tác nhân vi khẩn cần phải được quan tâm

Đó là vấn đề chung trong tình hình bệnh hô hấp hiện nay.Vì vậy quy trình tìm khuẩn gây bệnh đường hô hấp là rất quan trọng trước hết là lấy bệnh phẩm rồi đánh giá có tồn tại sự có mặt của khuẩn hay không Theo xét nghiệm thường quy thì bệnh phẩm có liên quan đến bệnh đường hô hấp nhiều nhất được lấy từ mẫu đàm Vì trong bệnh phẩm đàm có chứa rất nhiều vi khuẩn liên quan đến bệnh lý theo khảo sát tại nhiều bệnh viện trong nước

Đàm tươi thường chứa nhiều lao khuẩn ẩn trú dịch phế quản và vùng họng vì vậy đánh giá mẫu đàm là đánh giá khá chính xác nguyên căn bệnh về đường hô hấp.các vi khuẩn thường chứa

trong mẫu đàm gồm Staphylococci,Streptococci,Haemophilus influenza ,Klebsiella pneumoniae,

M catarrhalis và bacillus Koch…Sự có mặt của các vi khuẩn này theo khảo sát có ảnh hưởng

quan trọng đến bệnh lý đường hô hấp

Vi khuẩn là tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp phổ biến nhất Vi khuẩn hiếu khí chiếm ít nhất 73% và nấm chiếm 4% các vi sinh vật phân lập được từ đàm và dịch hút phế quản ở bệnh nhân

Vi khuẩn thường là nhiễm khuẩn đa tác nhân và trực khuẩn Gram âm là các thường gặp Tuy nhiên, MRSA và các cầu khuẩn Gram dương khác kể cả phế cầu (Streptococcus pneumoniae) ngày càng xuất hiện phổ biến Tại các bệnh viện thì các chủng Pseudomonas aeruginosa,

Enterobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Serratia marcescens và Proteus sp

chiếm 50% các tác nhân phân lập được từ bệnh phẩm đường hô hấp.Trong đó Escherichia coli (29,7%), Klebsiella spp (26%), Pseudomonas aeruginosa (13,7%), Staphylococcus aureus (6%), Acinetobacter spp (5%), Haemophilus influenza,(tháng 8/2008, khoa vi sinh bệnh viện nhân dân

1.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Là những mẫu bệnh phẩm đàm của các bệnh nhân từ khoa lâm sàng gửi tới khoa vi sinh tại bệnh viên nhân dân Gia định có chỉ định cấy vi khuẩn, định danh và làm kháng sinh đồ

1.3 MỤC ĐÍCH, NHIỆM VỤ

 Mục đích

Tìm hiểu, theo dõi và thực hành thao tác phân lập và định danh,kháng sinh đồ với các chủng

Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae phân lập từ mẫu bệnh

phẩm đàm

 Nhiệm vụ

Hiểu được nguyên lý, nắm vững các thao tác về lấy mẫu bệnh phẫm, các thao tác trong quy trình

định danh, làm kháng sinh đồ với chủng Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza,

Klebsiella pneumoniae trong mẫu bệnh phẩm đàm

1.4 PHẠM VI ĐỀ TÀI

Đề tài được thực hiện trên tất cả các bệnh phẩm đàm thu nhận được tại khoa vi sinh bệnh viện nhân dân Gia định Các thao tác, quy trình định danh vi khuẩn dùng để báo cáo là những thao tác, quy trình đang được áp dụng tại bệnh viện Nhân Dân Gia Định

2.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH

Vị trí địa lý: Số 01 Nơ Trang Long, Phường 7, Quận Bình Thạnh, Thành Phố Hồ Chí Minh 2.1.1 Lịch sử hình thành và phát triển

Bệnh viện Nhân Dân Gia Định sơ khai do người Pháp xây dựng với bảng hiệu là Hospital de Gia Định, trong những thập niên đầu của thế kỷ XX

-Năm 1945, Hôpital de Gia Định được đổi tên thành bệnh viện Nguyễn Văn Học

- Đến năm 1968 bệnh viện được phá đi và xây dựng mới với mô hình 4 tầng để tiếp nhận điều trị khoảng 450 đến 500 bệnh nhân nội trú và đổi tên thành Trung tâm thực tập y khoa Gia Định

- Từ sau năm 1975, bệnh viện Nguyễn Văn Học được đổi tên thành bệnh viện Nhân Dân Gia Định

- Đến năm 1996, bệnh viện được phân hạng là bệnh viện loại I (quyết định số 4630/QĐ-UB-NC) với nhiệm vụ khám chữa bệnh và là cơ sở thực hành của trường Đại học Y – Dược TP Hồ Chí Minh

- Từ bệnh viện ban đầu được xây dựng với quy mô cho 450 đến 500 bệnh nhân nội trú và khoảng 1.000 lượt người đến khám chữa bệnh ngoại trú, hiện nay số lượng người đến khám chữa bệnh ngoại trú trung bình khoảng 3.000 lượt/ngày và bệnh nhân điều trị nội trú trên 1.000 bệnh

nhân/ngày Trước tình hình qúa tải trầm trọng cả khu vực nội trú và ngoại trú, bệnh viện đã được xây dựng mới khu khám bệnh – cấp cứu 4 tầng với tổng diện tích 10.100 m2, đã đưa vào sử dụng vào tháng 7/2007

- Hiện tại, Bệnh viện Nhân Dân Gia Định là bệnh viện đa khoa loại 1 trực thuộc Sở Y tế TP Hồ Chí Minh với quy mô 1.200 giường, khám chữa bệnh cho nhân dân sinh sống trên địa bàn TP

Hồ Chí Minh (các quận trong tuyến: Bình Thạnh, Gò Vấp, Phú Nhuận, một phần Quận I và các quận ngoài tuyến: Thủ Đức, Quận 2, 12, 9 ), ngoài ra bệnh viện còn tiếp nhận bệnh nhân đến

từ các tỉnh thành lân cận như Đồng Nai, Bình Dương, Vũng Tàu và một số tỉnh miền Trung Bệnh viện có đủ các chuyên khoa lớn, với nhiều phân khoa sâu, bệnh viện được trang bị khá đầy

đủ trang thiết bị y tế nhằm nâng cao chất lượng chẩn đoán, điều trị và chăm sóc bệnh nhân, đáp ứng được nhu cầu khám chữa bệnh ngày càng cao của nhân dân

- Bệnh viện còn là cơ sở thực hành của 2 trường Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh và Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch Trung bình mỗi năm bệnh viện tiếp nhận khoảng 1500 học viên đến thực tập thuộc hệ trung học, hệ đại học và sau đại học

2.1.2 Cơ cấu tổ chức

Ban giám đốc:

 Khoa nội hô hấp – cơ xương khớp

 Khoa nội tiết – thận – niệu

 Khoa nội thần kinh – huyết học – y

 Khoa ngoại thần kinh

 Khoa ngoại tiêu hóa

 Khoa ngoại thận – tiết niệu

 Khoa ngoại lồng ngực – mạch máu

 Khoa dinh dưỡng

 Khoa sinh hóa huyết học

 Khoa vi sinh

 Khoa chuẩn đoán hình ảnh

 Khoa nội soi - thăm dò chức năng

 Khoa giải phẩu bệnh lý

 Khoa chống nhiễm khuẩn



Trong nhiều năm qua bệnh viện đã có nhiều thành tích đáng ghi nhận trong việc cứu chữa bệnh

và nghiên cứu khoa học chẳng hạn như có thể mổ ghép thận, phẩu thuật vi mạch điều trị co giật nửa mặt,…và nhiều nghiên cứu khoa học khác

Với nhiều trang thiết bị ngày càng tiên tiến cùng với đội ngũ y bác sĩ giàu kinh nghiệm,bệnh viện

sẽ có nhiều hướng phát triển hơn nữa trong tương lai

2.2 KHOA VI SINH

2.2.1 Giới thiệu khoa

Năm 1978, từ khoa xét nghiệm bao gồm sinh hoá - huyết học – vi trùng, bộ phận vi trùng học tách ra để lập khoa riêng với tên gọi KHOA VI TRÙNG hoạt động độc lập với khoa Sinh hoá - Huyết học

Năm 1998, khoa được đổi tên thành KHOA VI SINH cho đến nay

Khoa gồm có 17 công nhân viên chức

Phó trưởng khoa: Ths.Bs Nguyễn Sử Minh Tuyết

Cán bộ trên đại học: 01 (thạc sỹ vi sinh y học)

• Thực hiện các xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn cho bệnh nhân nội trú và ngoại trú tại bệnh viện Bên cạnh đó, chúng tôi còn thực hiện nuôi cấy vi khuẩn cho các đơn vị bạn: bệnh viện Ung Bướu, Bình Thạnh, Quận 1, bệnh viện quốc tế Vũ Anh

• Thực hiện các xét nghiệm miễn dịch học bao gồm: HIV, viêm gan siêu vi A, B, C, sốt xuất huyết Dengue, Helicobacter pylori; xét nghiệm sàng lọc một số bệnh bẩm sinh (Toxoplasmosis, Rubella, Cytomegalovirus) Các phản ứng huyết thanh học như: Widal, ASO, RF; thử phản ứng lao tố (IDR), test thử thai

• Thực hiện nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm; thẩm định kết quả xét nghiệm trước khi trả cho các khoa lâm sàng

• Thực hiện công tác kiểm tra vô khuẩn chung trong toàn bệnh viện và một số bệnh viện tuyến dưới (bệnh viện Bình Thạnh, bệnh viện Quận 1)

• Theo dõi sự đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được

• Nghiên cứu khoa học các đề tài thuộc lãnh vực vi sinh y học

• Phối hợp với các khoa lâm sàng giải quyết các vấn đề liên quan về chuyên môn, hội chẩn các trường hợp nhiễm trùng đa kháng thuốc

2.2.3 Thành tích đạt được

Nuôi cấy các loại bệnh phẩm như máu, mủ, đàm, nước tiểu, phân, các loại dịch (mật, não tuỷ, màng phổi ); phân lập và định danh các loại vi khuẩn thông thường; tiến hành làm kháng sinh đồ; theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn mỗi 6 tháng – 1 năm

• Kiểm tra vô khuẩn định kỳ các khoa trong bệnh viện, lưu ý các khoa trọng điểm như Hồi sức tích cực - chống độc, Hồi sức ngoại, Phòng mổ, Bệnh lý sơ sinh Thực hiện cấy không khí, nước, tay phẫu thuật viên, y dụng cụ

• Các xét nghiệm miễn dịch học: HIV (Determine, Vironostika, Murex), viêm gan siêu vi

(HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb, antiHBc-IgM/IgG, antiHCV, antiHAV-IgM/IgG),

Toxoplasma gondii (IgM, IgG), Rubella (IgM, IgG), Cytomegalovirus (IgM, IgG)

• Tham gia công tác ngoại kiểm tra chất lượng của Trung tâm Kiểm chuẩn TP.HCM với đánh giá

“Kết quả hoàn toàn phù hợp”

• Hướng dẫn sinh viên các trường Đại học đến thực tập và làm Luận văn tốt nghiệp

• Tham dự và báo cáo trong các hội nghị Khoa học kỹ thuật, lao động sáng tạo – sáng kiến cải tiến trong và ngoài bệnh viện

2.2.4 Hướng phát triển trong tương lai

Triển khai nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí, huyết thanh chẩn đoán bệnh do ký sinh trùng, các xét

nghiệm sinh học phân tử đáp ứng nhu cầu cung cấp các dịch vụ xét nghiệm chẩn đoán toàn diện 2.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH

2.3.1 Phương pháp cấy mẫu bệnh phẩm

2.3.2 Phương pháp nhuộm Gram

Mục đích: xác định vi khuẩn là Gram âm hay dương để tiến hành các bước định danh tiếp theo

Nguyên tắc: khi nhuộm vi khuẩn với thuốc màu tím gentian và một chất gắn màu Iodine như Lugol nếu ta tẩy màu bằng aceton, vi khuẩn Gram dương có lớp peptidolycan dày ăn màu tím của gentian, ngược lại vi khuẩn Gram âm bị tẩy mất màu tím Khi nhuộm lại với safranin 0,5%, nhóm Gram dương vẫn giữ màu tím còn nhóm Gram âm sẽ bắt màu đỏ

Tiến hành

- Phết nhuộm được cố định trên lame

- Phủ tím Genatin lên phết nhuộm trong 1 phút Rửa nước và nghiêng kính đểcho ráo

- Phủ Lugol lên phết nhuộm trong 2 phút.Rửa nước và nghiêng kính cho ráo

- Rửa acetol lên phết nhuộm, tẩy giọt cuối cùng còn phết tím Rửa bằng nước và nghiêng kính cho ráo

- phủ lại với dung dịch Safranin trong 30 giây Rửa nước và thấm khô vết nhuộm

- Quan sát ở vật kính dầu

Đọc kết quả: vi khuẩn Gram dương giữ màu tím của tím gentian, vi khuẩn

Gram âm giữ màu hồng đỏ của Safranin

2.3.3 Phương pháp định danh sinh hóa

Các chủng vi khuẩn thí nghiệm được phân lập trên các loại môi trường khác nhau như MC, BA,… Các vi khuẩn mọc được được định danh bằng bộ hóa chất định danh

Nguyên tắc một số phản ứng sinh hóa định danh

• Thử nghiệm khả năng lên men

Khi sử dụng các nguồn cacbon để lên men, tùy phương thức lên men các sản phẩm tạo ra sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2,…Trong tất cả các trường hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường

• Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)

Nhằm xác định vi sinh vật có có hệ enzyme citratase có khả năng khử nitrat thành nitrite hay nitơ

tự do trong điều kiện kị khí Nitrite được tạo ra sẽ phản ứng với sulphanilamide và

N-napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất có màu hồng

• Thử nghiệm ONPG

Các vi khuẩn có khả năng len men đường lactose nhanh có khả năng sản xuất cả2 loại men lactose permease và β-galactosidase Một số vi khuẩn được xem là nhóm vi khuẩn lên men lactose chậm chỉ sản xuất được β-galactosidase Hoạt tính của enzyme này có thể xác định dựa một cơ chất tổng hợp là o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPG).Sự thủy phân của cơ chất đường này bởi β-galactosidase sẽ phóng thích o- nitrophenol có màu vàng

• Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate

Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường Mặt khác mọi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon duy nhất đều có khả năng dùng muối

ammonium làm nguồn đạm duy nhất.Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường

• Thử nghiệm Urease

Vi khuẩn tiết men urease có khả năng thủy phân urê trong môi trường thành CO2 và NH3 làm môi trường bị kiềm hóa Chất chỉ thỉ Phenol Red trong môi trường thửnghiệm làm môi trường chuyển sang màu đỏ

• Phenylalanine deaminase (PAD)

Một số vi khuẩn thuộc bộ lạc Proteeae như Proteus, Morganella, Providencia có khả năng sản xuất men deaminase khử amin của amino acid phenylalanine thành một keto acid, chất này kết hợp với ion sắt trong thuốc thử Ferric chloride 10% để cho ra màu xanh lá cây

• Thử nghiệm bile esculine

Thử nghiệm này giúp phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên kết glucoside trong esculine thành esculetin và glucose tự do khi có sự hiện diện của muối mật Esculetin tạo ra sẽ phản ứng với muối sắt trong môi trường thử nghiệm tạo thành hợp chất màu đen hay nâu đen

• Thử nghiệm khả năng sinh indol

Thử nghiệm này phát hiên vi sinh vật sản xuất men tryptophanase khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường canh trypton Phản ứng thủy phân trytophan tạo thành Indole, chất này kết hợp với Para-dimethylamino benzaldehyde trong thuốc thử Kovác cho ra một hợp chất muối dimethyl ammonium màu đỏ

• Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)

Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật Chất này bị oxid hóa trong môi trường kiềm biến đổi thành diacetyl, dưới sự xúc tác của alpha-naphthol để cho một phức chất màu hồng đỏ

• Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate

Thử nghiệm nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng malonate như là nguồn carbon duy nhất trong môi trường Các vi sinh vật biến dưỡng malonate sẽ sửdụng chu trình glyoxylic acid

để biến dưỡng năng lượng Nếu không sử dụng được malonate, chất này có tác dụng như một chất diệt khuẩn Các vi sinh vật có khả năng biến dưỡng malonate đồng thời có khả năng sử dụng ammonium là nguồn đạm duy nhất Do vậy khả năng biến dưỡng malonate được ghi nhận nhờ sự phóng thích NH3 làm kiềm hóa môi trường và chuyển màu của chỉ thị pH

• Thử nghiệm KIA

Thử nghiệm này nhằm phát hiện khả năng sử dụng các nguồn carbonhydrate, khả năng sinh H2S

và sinh khí trong môi trường KIA chứa hai loại đường lactose 1% và glucose 0.1% Sau khi nuôi cấy chủng này 18-24 giờ, có ba trường hợp có thể xảy ra:

+ Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, phần trên bề mặt của ống thạch nghiêng trở nên có pH kiềm và phần sâu trong ống có pH acid Điều này có thể giải thích do visinh vật sau khi sử dụng hoàn toàn lượng glucose ít ỏi trên bề mặt mội trường, chúng tiếp tục dị hóa pepton trong môi trường giải phóng NH3 làm phần bề mặt của môi trường có pH kiềm Ở phần sâu trong môi trường với điều kiện thiếu ôxi, glucose được lên men kỵ khí sinh ra các acid hữu cơ làm giảm pH của môi trường.Nếu trong môi trường có chất chỉ thị phenol red thì trên mặt thạch nghiêng sẽ có màu đỏ và phần sâu sẽ có màu vàng

+ Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả glucose và lactose, toàn bộ môi trường trở nên có pH acid, vi sinh vật không cần phải sử dụng đến pepton để tạo năng lượng

+ Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này, thì pepton được sử dụng để biến dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự tăng trưởng của vi sinh vật Tuy nhiên, do pepton chỉ được biến dưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa chỉ diễn ra trên phần của

bề mặt môi trường và chỉ phần này mới trở nên có màu đỏ.Trong khi đó, phần môi trường sâu trong ống nghiệm sẽ không có hiện tượng đổi màu

Trong các trường hợp nêu trên, sự lên men đường tạo ra các sản phẩm khí được nhận biết nhờ các khí này đẩy ống thạch lên trên hay làm vỡ thạch Thử nghiệm này cũng có thể phát hiện khả năng sinh H2S do thành phần môi trường có chứa sodium thiosulphate Vi sinh vật khử sulfate

có thể khử hợp chất này để giải phóng H2S Khí H2S tạo ra sẽ được phát hiện dựa vào phản ứng tạo kết tủa màu đen FeS giữa H2S và ion Fe2+ của chỉ thịammonium citrate hiện diện trong môi trường

•Thử nghiệm tính di động

Vi sinh vật di động thường là các vi sinh vật có tiêm mao phân bố tại các vi trí khác nhau trên tế bào vi sinh vật Trong môi trường thử nghiệm tính di động thường bổ sung triphenyltetrazolium chloride để phát hiện dễ dàng vị trí hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất này khi vào bên trong tế bào sẽ bị khử thành formazan có màu đỏ

• Thử nghiệm decarboxylase

Thử nghiệm này giúp xác định khả năng một vi sinh vật tạo enzyme carboxylase thủy phân được các axít amin đặc hiệu để xúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl Các enzyme carboxylase chỉ được cảm ứng tổng hợp khi môi trường có tính acid và chứa chất cảm ứng đặc hiệu.Phản ứng tạo CO2 trong điều kiện kỵ khí, CO2 sinh ra làm giảm pH của môi trường và được ghi nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH

Thử nghiệm MR

Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào sự khác biệt trong qusa trình taaoj và duy trì các sản phẩm có tính acid từ sự lên men glucose Vi sinh vật lên men glucose tạp và duy trì sản phẩm acid, làm đổi màu thuốc thử Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến thành các sản phẩm trung tính, không làm đổi màu thuốc thử

-chất chỉ thị màu Ph môi trường là methyl red đỏ

-môi trường thử nghiệm: môi trương VP-MR

-Sau thử nghiệm: môi trường chuyển sang đỏ :+

Môi trường không đổi màu: -

Thử nghiệm catalase

Dùng để phân biệt vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí Vi sinh vật hiếu khí có enzyme catalase, có khả năng phân giải H2O2 thành H2O và O2

Hóa chất : H2O2 30% được giữ lạnh

Nhỏ một giọt sinh khối lên H2O2: Nếu sủi bọt : +

Nếu không sủi bọt :-

(BỔ SUNG THỬ NGHIỆM VÀ HÌNH ẢNH)

Cách tiến hành

Bộ hóa chất bao gồm:

• Đĩa giấy oxidase (OXI): thực hiện thử nghiệm oxidase

- Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame

- Dùng kẹp giấy lấy một đĩa giấy oxidase nhúng vào giọt nước muối sinh lý cho vừa đủ ướt và đặt lên lame

- Dùng vòng cấy vô trùng lấy khúm khuẩn quệt lên đĩa giấy oxidase

- Đọc kết quả sau 10 giây: phản ứng dương tính khi đĩa giấy oxidase xuất hiệnmàu tím đen; âm tính khi đĩa giấy oxidase không có màu tím đen

• Thử nghiệm trên ống nghiệm đã có chứa các môi tường thử nghiệm tương ứng

- Dùng tăm bông vô trùng lấy khúm khuẩn cho vào nước muối sinh lý vô trùng đểlàm thành huyền dịch có độ đục McFarland 2,0

- Dung que cấy vòng lấy dịch từ ống pha nước muối sinh lý có chứa vi sinh vật cấy vào các ống chưa các thử nghiệm tượng ứng

- Ủ 35-37oC/12-24 giờ

-Đọc kết quả theo bảng 2.1

Tương tự cho thử nghiệm sinh hóa đối với bộ API trên 10 giếng thử nghiệm

-cách dùng: dùng Micropipetcho vào mỗi giếng 200 µl huyền dịch, đậy nắp

- Ủ 35-37oC/12-24 giờ

-Đọc kết quả theo bảng 2.1

Bộ thử nghiệm API

Bảng 2.1 Hướng dẫn đọc kết quả phản ứng sinh hóa

Thuốc thử thêm vào

biển)

Xanh lá/ vàng

Esculine

Đen( có màu từ đen nhạt qua đen đậm)

Không đen

giếng, mất màu khi nhỏ kovac)

hệ thống định danh phân chia các thử nghiệm sinh hóa theo nhóm như trong hình 2.1

3.Phương pháp cấy mẫu đàm (PHẦN NÀY CHƯA NẮM RÕ CẦN TÌM HIỂU KỸ)

Trước hết làm tan đàm trong dung dịch nước muối sinh lý vô trùng vừa pha thêm NALC

(SPUTAPREP-QT kit của Nam Khoa) và sau đó pha loãng đàm Tiến hành như sau:

- Trong một tube 15 ml vô trùng (loại Falcon) đã chứa 10 ml nước muối sinh lý vô trùng (NS), cho thêm vào 50 mg NALC (N-Acetyl-L-Cystein), tức là toàn bộ bột NACL chứa trong một tube Eppendorf Lắc nhẹ cho tan hoàn toàn Dung dịch NS có NALC này chỉ dùng trong ngày và

đủ cho 2 – 3 mẫu Luôn luôn bảo quản tube dung dịch NALC đã pha trong tủ lạnh 4 o C

- Lấy một thể tích đàm cần nuôi cấy cho vào một tube vô trùng nắp vặn chặt Thêm vào một thể tích như vậy dung dịch NS có NALC vừa mới pha Lắc nhẹ cho đến khi đàm tan trong dung dịch này Như vậy chúng ta đã có đàm pha loãng 1/2 Sau khi đàm tan hoàn toàn, pha loãng tiếp mẫu đàm này thành 1/10 trong nước muối sinh lý vô trùng Như vậy chúng ta đã có mẫu đàm pha loãng 1/20

- Tiến hành cấy định lượng mẫu đàm đã pha loãng 1/2 trên các hộp thạch máu cừu ( BA ), thạch

và 1 µl (0,001 ml) hay dùng micropipett để hút 10 µl và 1 µl cấy lên mặt thạch Với mẫu đàm pha loãng 1/20, dùng khuên cấy 1 µl hay dùng micropipet để hút 1 µl cấy lên mặt thạch và cũng như trên 3 loại hộp thạch như trên Phương pháp cấy định lượng trên mặt thạch được thực hiện như cấy định lượng nước tiểu Sau khi cấy, các hộp thạch BA và CAHI được ủ trong khí trường CO2 còn các hộp thạch MC được ủ trong khí trường bình thường, nhiệt độ ủ là 35 – 37 o C, thời gian ủ qua đêm hay tối đa 24 giờ Đọc kết quả và định lượng các vi khuẩn mọc trên các hộp thạch như trong bảng trình bày sau:

Bảng 1 : Cách đọc kết quả định lượng các loại vi khuẩn trong mẫu đàm dựa trên số lượng các loại khóm vi khuẩn mọc trên các hộp thạch

Hộp thạch Mẫu đàm pha

loãng

Vòng cấy định lượng

Thể tích đàm được cấy

Số vi khuẩn được định lượng

Sơ đồ cấy định lượng mẫu đàm trên các hộp thạch

N là số khóm của một loại vi khuẩn đếm được trên các hộp thạch Để có con số định lượng của một loại vi khuẩn thì chúng ta nên lấy số trung bình của các kết quả Ví dụ: ứng với

các khóm nghi ngờ K pneumoniae, kết quả trên hộp thạch MC1 là 200 khóm, lượng vi khuẩn K pneumoniae trong 1 ml đàm là 40000 CFU/ml (2 x200 x 102); trên hộp thạch MC2 là 15, lượng

vi khuẩn / ml đàm là 30000 CFU/ml (2 x 15 x 103); và trên hộp thạch MC3 là 3, lượng vi khuẩn

là 60000 CFU/ml (2 x 3 x104) Như vậy kết quả cuối cùng lượng vi khuẩn K pneumoniae trong

mẫu đàm sẽ được tính là (40000 + 30000 + 60000)/3 = 43333 CFU/ml Nếu các hộp thạch 1 và 2

có vi khuẩn quá nhiều (> 200 khóm 2), chúng ta chỉ nên đếm số khóm trên hộp thạch 3

-Tuy vậy, tùy từng Labo xét nghiệm chọn các vi khuẩn có lượng từ 103 – 107 CFU/ml để tiến hành làm kháng sinh đồ

2.3.4 Phương pháp làm kháng sinh đồ với kỹ thuật KIRBY

2.3.5 Chuẩn bị môi trường

Môi trường được chuẩn bị theo hướng dẫn của từng hãng sản xuất: bằng cách cân chính xác lượng thạch Muller-Hinton khô và hòa tan vào trong nuớc cất trung tính, kiểm tra pH trước khi hấp tiệt khuẩn Trong khi hấp, tránh để môi trường ở nhiệt độ cao và thời gian dài hơn sự cần

trường tới 50 – 600C (có pH khoảng 7,2 – 7,4) có thể thêm máu hoặc các sản phẩm của máu, lắc cho đều và đỗ vào đĩa petri đã vô khuẩn với độ dày 3,5 – 4,5 mm (có nghĩa 25 ml thạch cho một đĩa Petri đường kính 90 mm hoặc 40 ml thạch cho đĩa có đường kính 110mm v.v…) Các đĩa này phải đặt trên mặt phẳng nằm ngang để đảm bảo cho độ sâu của thạch ở mọi vị trí trong đĩa bằng nhau Để đĩa môi trường nguội ở nhiệt độ phòng rồi bảo quản trong túi nilon ở tủ lạnh 4 – 80C Các đĩa thạch này được dùng trong vòng 7 ngày kể từ ngày chuẩn bị

Các đĩa thạch có máu hoặc chế phẩm của máu phải được kiểm tra vô khuẩn trong tủ ấm qua đêm mới được sử dụng

Ria cấy vi khuẩn:

Sau khi vi khuẩn thuần khiết được nuôi cấy qua đêm trên các môi trường không có chất ức chế, dùng que cấy lấy 5 – 10 khuẩn lạc (hoặc 3 vị trí khác nhau, nếu vi khuẩn ở trong ống) để tránh phải các vi khuẩn đột biến, nghiền vào một ống PBS (hoặc nước muối sinh lý) vô trùng, lắc đều bằng máy lắc Votex, so sánh với ống độ đục chuẩn Mc Farland 0,5 (nếu đục quá thì cho thêm PBS hoặc nước muối sinh lý; ngược lại nếu không đủ đục thì cho thêm vi khuẩn), ta được hỗn dịch vi khuẩn ≈ 108 CFU/ml Dùng que tăm bông vô trùng nhún vào hỗn dịch vi khuẩn trên ép vào thành ống cho bớt nước, rồi ria đều khắp với những đường bắt chéo nhau 1200 lên mặt thạch

đã được để trong tủ ấm cho khô (nhưng không quá 30 phút)

Chuẩn bị khoanh giấy kháng sinh:

Lấy ống khoanh giấy kháng sinh từ tủ lạnh để ở nhiệt độ phòng 30 phút cho thăng bằng nhiệt độ giữa trong và ngoài ống

Đặt các khoanh giấy đã chọn lựa với từng vi khuẩn được thử sao cho mặt của khoanh giấy áp sát vào mặt môi trường, mép ngoài của khoanh giấy cách thành trong của đĩa 15 mm và khoanh nọ cách khoanh kia 20mm Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút cho kháng sinh khuếch tán, rồi để môi trường trong tủ ấm 350C qua đêm Các đĩa thử với các chủng H.influenzae, S pneumoniae và phải để trong tủ ấm có 5 -10% CO2

Đọc kết quả:

Dùng thước đo đường kính vùng ức chế, dựa vào tiêu chuẩn của từng hãng sản xuất khoanh giấy kháng sinh, ta có mức độ nhạy cảm, trung gian và kháng của từng loại vi khuẩn

( BIỆN LUẬN TÍNH KHÁNG *ĐƯỜNG KÍNH VÔ KHUẨN*)

2.4 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Mẫu bệnh phẩm đàm

Đàm tươi thu nhận được từ các bệnh nhân có bệnh lý liên quan đến đường hô hấp như suy hô hấp, viêm phổi do vi trùng, thoe dõi tràn khí màn phổi, cường giáp,…

Trong mẫu đàm có chứa nhiều tác nhân đích gây bệnh như chủng Staphylococcus aureus,

Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae …

2.4.1 Haemophilus influenzae

a lịch sử và tên gọi

H influenzae được phân lập lần đầu bởi Richard Pfeiffer từ đờm của một bệnh nhân bị

viêm phổi - cúm trong đại dịch cúm năm 1890 Lúc đó, vi khuẩn này được hiểu lầm là nguyên nhân gây ra bệnh cúm nên được gọi là trực khuẩn cúm (Influenzae bacteria) Mãi cho đến khi đại

dịch cúm xảy ra trong những năm 1918-1919, người ta mới biết H influenzae chỉ là thành viên

của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên và không phải lúc nào cũng gây bệnh Đến năm

1933, khi phát hiện ra virus cúm là căn nguyên của bệnh cúm, vai trò của H influenzae mới được làm sáng tỏ: virus cúm gây ra bệnh cúm, còn Haemophilus influenzae chỉ là vi khuẩn “ăn theo”

(second invader) sau khi các tế bào đường hô hấp đã bị tổn thương nặng nề bởi virus cúm Vì

vậy, vi khuẩn này có tên là H influenzae được xuất phát từ nhu cầu đòi hỏi môi trường giàu chất dinh dưỡng, đó là các yếu tố phát triển có ở máu (Haemophilus: ưa máu), đặc biệt là yếu tố X

(hemin) và yếu tố V (NAD hoặc NADP) Thêm vào đó, vi khuẩn này lại có mối liên quan lịch sử

với bệnh cúm (Influenzae: bệnh cúm) Cho nên, vi khuẩn được gọi tên là như vậy

Đặc điểm sinh học đặc trưng của Haemophilus influenzae typ b

b Hình thái và cấu trúc

H influenzae là một trong những loài vi khuẩn nhỏ nhất, còn được gọi là cầu trực khuẩn

vì vi khuẩn này có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5m) nhưng uốn cong ở hai đầu trông như hình cầu Tuy nhiên, khi vi khuẩn này ở dịch não tuỷ hình thể có thể kéo dài ra gấp vài lần so với

chiều dài thông thường (Hình 1.1) H influenzae có đặc tính bắt màu Gram âm, không di động

và không hình thành nha bào Thành tế bào vi khuẩn này có cấu trúc bề mặt lipopolysaccharide–

protein tương tự như thành của các vi khuẩn Gram âm khác Ngoài ra, H influenzae được phân

loại thành 2 nhóm: loại không vỏ polysaccharide (non-typeable không xác định được typ huyết

thanh) và loại có vỏ (typeable xác định được typ huyết thanh) Loài H influenzae (Hi) có vỏ bọc được phân loại tiếp tục theo các typ huyết thanh từ a đến f tuỳ thuộc vào đặc tính kháng nguyên

của vỏ polysaccharide do gen qui định Vỏ bọc typ b là một dạng trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate, được gọi là polyribosyl - ribitol - phosphate (PRP) Polysaccharide bề mặt này liên

quan mạnh mẽ đến tính gây độc của vi khuẩn, đặc biệt là H influenzae typ b (Hib), là nguyên

nhân của nhiều trường hợp nhiễm trùng hệ thống nghiêm trọng bao gồm cả viêm màng não mủ

(trên 90% các ca nhiễm khuẩn lan tràn do Hib)

Hình Hình thể của H influenzae typ b trên tiêu bản nhuộm gram dịch não tuỷ dưới

kính hiển vi quang học