Công nghệ sản xuất ENZYME AMYLASE và ứng dụng AMYLASE trong công nghệ sản xuất MALTOSEDEXTRIN

Công nghệ sản xuất ENZYME AMYLASE và ứng dụng AMYLASE trong công nghệ sản xuất MALTOSEDEXTRIN

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÔN: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CÔNG NGHỆ

THỰC PHẨM - -

LỜI MỞ ĐẦU

Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinhtrưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trongcông nghiệp chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trongcông nghệ gen và trong bảo vệ môi trường

Ngày nay, ngành công nghệ enzyme đã phát triển rất mạnh mẽ và đượcứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm Một số enzyme được sửdụng phổ biến như: amylase, pectinase, protease, lipase,…

Sự có góp mặt của enzyme amylase trong thực phẩm đã được biết từlâu.Với đề tài “Công nghệ sản xuất enzyme amylase và ứng ụng của enzymeamylase trong sản xuất maltose dextrin”, sẽ cung cấp thêm cho các bạn kiến thức

về qui trình sản xuất ra enzyme cũng như một trong những ứng dụng củaamylase

Trong quá trình tìm kiếm tài liệu, viết bài do kiến thức còn hạn chế, khôngtránh khỏi những sai sót Rất mong sự đóng góp ý kiến từ cô và các bạn để đề tàiđược hoàn thiện hơn Chân thành cảm ơn!

Nhóm thực hiện:

Nhóm 9

RR’ + H-OH → RH + R’OH

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE

1 Tổng quan về enzyme amylase và maltosedextrin

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Cácenzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân

tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose

- Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này,thu được kết tủa có khả năng phân giải tinh bột thành đường, đặt tên là Diastase

- Năm 1851, Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phângiải tinh bột thành đường

- Sau đó, amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người vàđộng vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu được quantâm nghiên cứu

1.2 Phân loại amylase

Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào)

và exoamylase (enzyme ngoại bào)

 Endoamylase gồm có:

- α-amylase (hay α – 1-4 – glucanohydrolase)

- Nhóm enzyme khử nhánh gồm có 2 loại:

 Khử trực tiếp là Pullulanase (hay α-dextrin 6 – glucosidase)

 Khử gián tiếp là Transglucosylase và Amylose-1,6 glucosidase.Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗipolysaccharide

glucosidase

Maylo-1,6-S đ 1 ơ đồ 1 ồ 1 1- Phân loại Enzyme amylas

Sự khác biệt giữa các loại enzyme amylase

- Các loại Enzyme Amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà cònkhác nhau ở pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt

- Tốc độ phản ứng của Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độpolyme hóa của cơ chất: các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ cótính chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khácnhau

- Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt

độ hoạt động, pH tối ưu và các đặc điểm thủy phân khác nhau

1.3 Cơ chất của enzyme amylase

Cơ chất tác dụng của Amylase là tinh bột và glucose

1.3.1 Tinh bột

- Là nhóm Cacbonhydrat ở thực vật, có chủ yếu trong các loại củ nhưkhoai lang, khoai tây, khoai mì…, trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và có côngthức tổng quát là (C6H10O5)n Hạt tinh bột có hình dáng rất khác nhau với kíchthước từ 2 đến 15µm Tinh bột không nước có khối lượng riêng khoảng 1,633 –1,648

- Tinh bột là chất keo háo nước điển hình cấu tạo từ amylose – mạchthẳng và amylopectin Tỷ số amylose và amylopectin trong tinh bột thường vàokhoảng 1 : 4 Cả hai đều tạo những gốc α-D-glucose Amylo có cấu tạo mạchthẳng Chúng được liên kết bởi các nối α-1,4 glucozit và α-1,6 glucozit nên tạothành nhiều nhánh Ngoài amylose và amylopectin trong tinh bột còn có chứamột lượng nhỏ các chất khác như muối khoáng, chất béo, protit… Hàm lượngchung của chúng khoảng 0,2 – 0,7%

- Tinh bột không hòa tan trong nước lạnh, trong rượu và ete Amylose dễtan trong nước nóng và tạo nên độ nhớt của dung dịch Amylopectin khi hòa tantrong nước nóng tạo dung dịch rất nhớt

- Trong nước nóng tinh bột sẽ hút nước trương nở và tạo dạng gel Mức

độ trương của tinh bột phụ thuộc nhiệt độ Khi tăng dần nhiệt độ, dịch tinh bột sẽbiến thành dạng keo và gọi là hồ tinh bột Nhiệt độ làm cho hồ tinh bột có độnhớt cực đại gọi là nhiệt độ hồ hóa của tinh bột Trong thực tế luôn luôn tồn tạimột giới hạn nhiệt độ hồ hóa, vì tinh bột của nguyên liệu bất kì đều gồm nhiềuhạt có kích thước khác nhau

Tinh bột là polysaccharide carbohydrate chứa hỗn hợp amylose vàamylopectin (tỉ lệ thành phần của amylose và amylopectin trong các loại củ, hạtngũ cốc thường khác nhau)

+ Amylose: có cấu tạo chuỗi không phân nhánh, mạch thẳng cấu tạo từcác gốc α–D-glucopyranosyl, liên kết với nhau bởi gốc α-1,4 glucoside, dàikhoảng 300 – 1000 gốc glucose, xoắn theo chiều lò xo mỗi xoắn có 6 gốcglucose tạo thành hình lục giác Cấu trúc xoắn được giữ vững nhờ các liên kếthidro được tạo thành giữa các nhóm OH tự do Bên trong xoắn có thể kết hợpvới các nguyên tử khác Cùng với amylopectin, các phân tử amylose tham gia tạo

nên cấu hình hạt tinh bột ở thực vật Ví dụ Amylose tạo thành màu xanh khi tácdụng với Iodine, nếu đun nóng liên kết hidro bị cắt đứt, chuỗi amylose bị duỗithẳng do bị tách ra khỏi amylose dung dịch mất màu xanh Amilose thườngđược phân bố ở phần bên trong của hạt tinh bột Dung dịch amylose có độ nhớtthấp hơn dung dịch amilopectin Amylose bị kết tủa bởi ancol butylic Amylose

có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Da Amylose được cấu tạo từ 200-1000phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạchxoắn dài không phân nhánh

+ Amylopectin: Là một polyme mạch nhánh, được cấu tạo từ các gốcα-D-glucopyranosyl liên kết với nhau bởi α-1,4 và α-1,6 glucozit Mức độpolyme hóa tử amylopectin có thể lên đến giá trị hàng triệu Cấu trúc phân mạchcủa nó bao gồm 1 nhánh trung tâm ( chứa liên kết 1-4 ) từ nhánh này phát ra cácnhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose Khối lượng phân tử củaamylopectin khoảng 500000 - 1 triệu Amylopectin được phân bố mặt ngoài hạttinh bột Dung dịch amylopectin có độ nhớt cao, khi đun nóng làm thay đổi sâusắc và không thuận ngịch cấu trúc phân tử amilopectin gây ra trạng thái hồ hoátinh bột

1.3.2 Glycogen

Glycogen cũng thuộc glucan, dễ tan trong nước là, polysaccharide dự trữ

ở người và động vật Phân tử glycogen có công thức chung là (C6H10O5)n cũngphân nhánh giống như phân tử amilopectin nhưng mức độ phân nhánh nhiều hơn.Phần lớn các gốc glucose trong phân tử kết hợp với nhau qua liên kết α -1,4

Tinh bộtDextrin + Oligosacharid Dextrin

DextrinMaltose Glucose

-amylasePulluulanse-amylaseAmyloglucosidase

glucozit , liên kết α-1,6-glucozit ở chỗ phân nhánh của phân tử Glycogen bịthuỷ phân dưới tác dụng của Enzyme amylase hoặc acid Khi thuỷ phân hoàntoàn glycogen nhận được α-D-glucose Glycogen hoà tan trong nước nóng, chomàu đỏ tím hoặc đỏ nâu với iot Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột Phân tửlượng ở trong khoảng 2– 3 triệu Da

1.4 Đặc tính và cơ chế tác dụng của amylase

Cơ chế tổng quát của enzyme amylase như sau:

1.4.1  -amylase

Enzyme -amylasecó khả năng phân cắt các liên kết -1,4 glucozit nộiphân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên, không trật tự nào cả Do khả năng dextrinhóa cao nên còn gọi là enzyme dịch hóa

Enzyme α-amylase tác dụng chậm lên tinh bột nguyên thể nhưng tác dụngmạnh lên tinh bột đã bị hồ hóa Quá trình thủy phân của tinh bột của enzymeamylase:

 Giai đoạn 1: dextrin hóa

Chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành mộtlượng dextrin, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh

 Giai đoạn 2: đường hóa

Các dextrin vừa được tạo thành bị thủy phân, tiếp tục tạo ra các dextrinphân tử thấp hơn, maltose, isomaltose và glucose

- Trọng lượng phân tử trung bình từ 40000 – 60000 Da.

- Bền nhiệt hơn so với các loại enzyme khác (do có ion Ca2+ giữ vaitrò ổn định cấu trúc bậc ba của phân tử enzyme)

- Bị kiềm hãm bởi các ion kim loại nặng Cu2+, Pb2+, Hg2+ Các ion

Mn2+,Na+,Mg2+ không ảnh hưởng đến hoạt tính

- Có thể thu nhận nấm mốc, vi khuẩn, thực vật

- Thường thể hiện hoạt tính trong vùng acid yếu Ví dụ:

 α-amylase của nấm mốc hoạt động ở pH 4,5 - 5,8

 α-amylase của vi khuẩn hoạt động ở pH 5,8 – 6,1

 α-amylase của đại mạch hoạt động ở pH 4,7 -5,4

- Những chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp α-amylase có ý

nghĩa công nghiệp: B.subtilis, B.licheniformis, A.oryzae.

1.4.2  -amylase:

Enzyme -amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết -1,4 glucozit, cắttuần tự từng gốc maltose từ một đầu không khử của mạch tinh bột Sản phẩm củaquá trình này chủ yếu là maltose.Enzyme này hầu như không có ở VSV, chỉ có ởhạt nảy mầm

Đặc tính của -amylase:amylase:

- β-amylase không có khả năng thủy phân tinh bột sống, mà chỉ cókhả năng thủy phân các tinh bột đã hồ hóa

- β-amylase vẫn giữ được hoạt tính khi không có Ca 2+ , và bị kiềmhãm bởi Cu 2+ , Hg 2+ ,urea, iodine, ozon,…

- β-amylase chịu nhiệt kém hơn α – amylase nhưng bền với acidhơn β-amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 70oC Nhiệt độ hoạt động thích hợp của β-amylase là 50-60oC

- β-amylase hoạt động pH thích hợp 4,2-5,6

1.4.3 γ - Amylase

Xúc tác thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside của phân tử tinh bột

và các polysaccharide tương tự Tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầukhông khử của mạch để tạo ra phân tử glucose

Đặc tính của γ – Amylase:

- Nhiệt độ hoạt động tối thích 50-600C, hầu như bị mất hoạt tính khiđun nóng trên 700C

- γ-amylase hoạt động pH thích hợp 4,5-5.

- γ-amylase bền trong acid kém bền trong ethanol, cetone.

- Không bị ức chế bởi các ion kim loại nặng Ag+, Hg 2+

Những chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp γ-amylase có ý nghĩa công

nghiệp: nấm mốc: A.niger, A.awamori, nấm men: Endomycopsis

1.4.4 Pullulanase

Có thể thủy phân các liên kết α - 1,6 của tinh bột, glucogen, pululan và

các dextrin tới hạn Có thể được thu nhận từ vi khuẩn Aerobacter aerogenes, Klebsiella Sản phẩm tạo thành sẽ là glucose.Enzyme này thường sử dụng kết

hợp với amyloglucosidase Hoạt tính tối ưu của chúng ở pH=6 và nhiệt độ là

600C Khi kết hợp vớiamyloglucosidase thì hoạt tính tối ưu ở pH= 4-5, nhiệt độ

Thủy phân liên kết 1,6-glucoside trong dextrin tới hạn và có thể tạo thànhisomaltose, panose làm đắng dịch thủy phân.Được tìm thấy trong canh trường

nấm sợi Asp.niger, Asp oryzae, Asp awamori.Sự có mặt của Transglucosylase

trong các chế phẩm amylase là điều không mong muốn

CHƯƠNG 2 CHỦNG NẤM MỐC Aspergillus oryzae

2 Tổng quan

Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào VSV trong môi trường.Quá trình này xảy ra ở điều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp Bảnchất của 2 quá trình này có thể nói là như nhau nhưng về mặt hình thức vàphương diện thì khác nhau hoàn toàn

Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn củaVSV Tự tham gia tổng hợp nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tự nhiên.Các VSV và vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất phức tạp,không đồng đều về chủng loại và về số lượng Mặt khác, quá trình lên men nàykhông được kiểm soát, bao gồm nhiều pha và không định hướng Sản phẩm lênmen là đa dạng, không ổn định Do dó, chất lượng sản phẩm kém không đồngnhất

Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lậpgiống VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh học, quátrình thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn (sản phẩm tạo

ra mang tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn giống VSV chođến cuối quá trình thu nhận sản phẩm) Do đó chất lượng sản phẩm được cảithiện

2.1 Giới thiệu chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

Asp oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớpAscomycetes ( nang khuẩn ) Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồmnhững sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có váchngang, chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ) Từ những sợi nằm ngangnày hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quansinh sản vô tính Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên cóthể nhìn thấy bằng mắt thường Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi làbọng Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tếbào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào

nhau, nên gọi là đính bào tử Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay

màu vàng hoa cau…

Đặc điểm của giống Asp.oryzae

Giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase, protease, pectinasa,

…), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột,gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bãsắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng…Màu do các bào tử già có màu sắc Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa vàphát tán khắp nơi, khi gặp điền thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới

Hình ảnh của nấm mốc Aspergillus oryzae

2.2. Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae

Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzymeamylase Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợpenzyme amylase này là tinh bột Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay cóthể mua trực tiếp từ nơi cung cấp nấm mốc giống

Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suấtchất lượng giống được đảm bảo chắc chắn Tuy nhiên, quá trình phân lập giốngnày có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung mộtchủng giống mới tại phòng thí nghiệm

Quá trình lấy mẫu:

 Có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đemchôn xuống đất

 Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rủ sạchcát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây

 Sau đó cho vào bao nyclon và mang về phòng thí nghiệm

Tiến hành thí nghiệm phân lập:

 Nghiền mẫu đối với những mẫu khoai tây

 Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào90ml nước cất vô trùng sau đó đảo trộn mẫu

 Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang 1 ốngnghiệm khác có chứa 90ml nước cất vô trùng Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo

 Hút 0,1ml cho vào đĩa pettri có chứa môi trường dinh dưỡng chọnlọc cho nấm mốc phát triển,môi trường PDA (Potato Dextro Agar)

 Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trườngđem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày

 Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này

sẽ xuất hiện những quầng sáng xung quanh khuẩn lạc

 Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khicấy Có tác dụng là chất chỉ thị cho tinh bột

 Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ốngthạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó cóthể dự trữ trong máy làm đông

Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (α- 1,4 –qui mô nhỏ)

 Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tửnấm

 Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịchhuyền phù

 Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tamgiác có chứa môi trường sinh trưởng của nấm:

Hồtinh bột 20ml

Với PH=6,5

 Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khửtrùng bởi Autoclave ở 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng.Sau đó đem ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút Saukhi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ,

để có hiệu quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quảnthích hợp

CHƯƠNG 3: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME α-AMYLASE

Thu nhận Amylase từ động vật phần lớn là từ dịch tụy tạng 98% tụy tạngđược cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc là tế bào tuyến Các tế bào này tiếtEnzyme tiêu hoá vào trong tá tràng

Thực vật

Được lấy từ nhiều nguồn như:

- Đại mạch (Hordeum sativum): có giống hai hàng và giống nhiều hàng(4,6 hàng), trong đó người ta sử dụng loại hai hàng để sản xuất malt làm bia,những loại còn lại để làm thức ăn cho gia súc

- Lúa (Oryse sativa L): Chủ yếu ở vùng Đông Nam Á

- Ngô (Zea mays): có nhiều loại ngô: ngô đá, ngô bột, ngô răng ngựa Hạtngô có màu trắng màu vàng hay màu hồng Ngô màu vàng do có sự hiện diệncủa carotenoid và zeaxanthine ở trong nội nhũ, ngô màu hồng là do trong nội nhũcủa ngô có anthocyanin

- Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, Rhizopus

- Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces.

Endomycopsy, Endomyces cũng tạo Amylase

- Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn Amylase như: Bac.

Polymyxa, Phytomonas destructans, Bact cassavanum, Clostridium acetobutylium, Pseudomonas saccharophila… Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả

năng sinh trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị

nhiễm VSV khác Đáng chú ý là Bac diastaticus, Bac stearothermophilus, Bac.

coagulans, Bac Circulans

- Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo Amylase mạnh mẽ, tuy

nhiên cũng có một số chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt Micromonospora

vulgaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ α-Amylase hoạt động ở 650C cùngvới proteinase và các Enzyme khác

Enzyme amylase có trong các tế bào sinh vật, động thực vật và VSV Hiệnnay việc sản xuất enzyme theo qui mô công nghiệp chủ yếu dựa vào vi sinh vật

So với động thực vật, sử dụng vi sinh vât để sản xuất enzyme có rất nhiều ưuđiểm sau:

 Tốc độ sinh sản của VSV rất mạnh: trong thời gian ngắn ta có thểthu được một lượng sinh khối rất lớn

 Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao: gắn liền vớitốc độ chuyển hóa cơ chất và tốc độ sinh sản và phát triển củaVSV

 VSV là giới sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo qui mô côngnghiệp: không phụ thuộc vào điều kiện khí hậu bên ngoài

 Nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme theo qui mô côngnghiệp rẻ tiền và dễ kiếm

 VSVcó thể tổng hợp cùng một lúc nhiều enzyme khác nhau

Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ sản xuất enzyme

 Quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy: giống tốt thì năngxuất enzyme thu được sẽ cao

 Quyết định đến hoạt tính enzyme: sử dụng hoạt tính riêng để sosánh và đánh giá chất lượng của enzyme

 Quyết định đến vốn đầu tư xây dựng nhà máy sản xuất enzyme:giống tốt, năng suất cao thì vốn đầu tư sẽ ít đi

 Quyết định giá thành sản phẩm: giống có chất lượng cao, chi phícho một đơn vị enzyme sẽ thấp hơn giống có chất lượng thấp.

Yêu cầu giống VSV trong công nghệ enzyme:

 Phải có khả năng sinh tổng hợp mạnh enzyme cần sản xuất

 Phải có khả năng thích ứng rất nhanh và phát triển mạnh

 Phải có khả năng sinh sản và phát triển mạnh

 Giống phải dễ dàng tách được ra khỏi môi trường nuôi cấy tạothuận lợi cho các quá trình công nghệ tiếp theo

3.1.1 Phương pháp nuôi cấy nấm mốc

Khái niệm nuôi cấy mặt

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện choVSV phát triển trên bề mặt môi trường

+ Nuôi cấy bề mặt trên bề mặt dịch thể: (dùng cho nhóm vi sinh vật hiếu

khí): tùy từng loại vi sinh vật khác nhau mà chọn môi trường thích hợp khácnhau Môi trường pha loãng với nồng độ thích hợp, sau đó bổ sung nguồnnitrogen (N), nguồn khoáng,… khi môi trường cho vào thiết bị lên men phải có

bề mặt thoáng, rộng Nuôi cấy theo phương pháp này đơn giản nhưng đòi hỏidiện tích sử dụng lớn, khó tự động hóa sản xuất Hiện nay phương pháp này ítđược sử dụng

+ Nuôi cấy sử dụng bể mặt môi trường bán rắn: Có thể dùng vi sinh vật

hiếu khí hoặc bán hiếu khí, kỵ khí ở phương pháp lên men này nguyên liệuthường được dùng là:

- Các loại hạt: thóc, ngô, nếp, đậu tương…

- Các loại mảnh: mảnh sắn, mảnh bắp…

- Các loại phế liệu hữu cơ: bã mía, trấu, cọng rơm rạ,…

3.1.1.1 Sơ đồ nuôi cấy

Thạch+nước dd

Đun tanChiết ống nghiệmThanh trùngCấy truyền

Nuôi 5-6 ngày

30-320C

Trộn đều bào tửMốc giống trên thạch nghiêng

Ngô mảnh hoặc gạo cám

Trộn nướcHấp chín

Làm tơi Để nguội 36-380CTrộn giống 0,5-1%

Nuôi mốc trên mành 60h

Dùng ngay hoặc sấy khô(400C)Mốc giống cho sản xuất

Bao gói, bảoquản

mốc

Gạo hoặc ngô mảnh

Bình tam giácThanh trùngCấy truyền

Nuôi 5-6 ngày 30-320CMốc giống trong bình tamgiácGiống A oryzae

Nước vô trùng

3.1.1.2 Giải thích quy trình

Nuôi cấy giống bao gồm:

1 Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống trong ống nghiệm

2 Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ)

3 Trên sàng, khay (nhân giống lớn)

Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng

Sau khi phân lập (từ tự nhiên, trong sản xuất, mẫu giống đã hư hỏng)thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển những mốc sợi (haylấy nấm mốc từ ống giống) sang ống thạch khác

Yêu cầu: ống giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn

lộn bất kỳ một loài vi sinh vật nào khác Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảođầy đủ dinh dưỡng

Nuôi cấy giống trong bình tam giác

Cách làm môi trường trong bình tam giác:

 Môi trường gạo: gạo tẻ loại tốt, nấu cơm như nấu bình thường, hạtcơm chín đều không quá nhão và không quá khô Độ ẩm khoảng 45% để nguộibớt rời thành từng hạt cho vào bình tam giác thành lớp dày khoảng 1cm Đậy nútbình tam giác bằng giấy chống ẩm Hấp thanh trùng ở P=1 atm trong vòng 30-45phút

 Môi trường ngô mảnh: Ngô mảnh có kích thước khoảng 0,2-0,5

mm cho nước vào theo tỷ lệ 90% trọng lượng so với ngô, trộn đều trong khay để1-2 giờ cho ngấm nước đều Bóp tơi cho vào bình tam giác khác thành lớp dày1cm Đậy nút bình bằng giấy chống ẩm Hấp thanh trùng đồng thời làm chin ởP=1 atm, 1200C, trong thời gian 60 phút, lấy ra để nguội lắc cho khỏi vón cục

 Môi trường cám: Chọn cám tốt, mới nhưng loại thô không cần mịnhạt, sau đó làm tương tự như đối với ngô mảnh

Thường sử dụng các bình tam giác dung tích 0,3-0,5 lít hay 1 lít có cổrộng Sau khi chuẩn bị môi trường trong bình thuỷ tinh ta tiến hành nuôi cấy nấmmốc Trước tiên cần phải chuẩn bị lấy 5ml nước vô trùng cho vào các ốngnghiệm Sau đó, đổ nước vô trùng cho bào tử hoà vào trong nước đồng thời cấychuyển chúng sang bình tam giác

Trung bình cứ một ống nghiệm có thể cấy chuyển sang 2-3 bình tam giác

có dung tích 1 lít, lắc cho giống phân bố đều trong môi trường và tiến hành nuôicấy chúng trong điều kiện thích ứng Thường nuôi khoảng 5-6 ngày là được Yêucầu cơ bản trong giai đoạn này là làm sao tạo được nhiều bào tử mạnh khoẻ.Trường hợp nào thấy bình bịnhiễm thì phải loại bỏ ngay

Nuôi cấy mốc trên mành sành

Chuẩn bị môi trường làm mốc trên khay: Nguyên liệu thường dùng là ngômảnh có kích thước 0,2-0,5mm Trộn với nước theo tỷ lệ 80-90% trọng lượng sovới ngô nếu hấp dưới áp lực cao Trộn xong để khoảng 3-4 giờ cho ngô ngấmnước đều rồi hấp chín Thời gian hấp khoảng 3-4 giờ dài hơn so với thời gian hấpcám hay gạo Nguyên liệu sau khi hấp phải chín đều, không được quá bết hoặcquá khô Độ ẩm còn lại 45-50% là vừa

Cách gieo cấy và nuôi mốc trên khay: Nguyên liệu dỡ ra, làm nguộinhanh Nếu ít có thể bóp bằng tay cho tơi ra, nếu nhiều cho qua máy đánh tơi vàdùng quạt thổi Sau khi làm nguội đến 26-280C thì trộn nước giống từ bình tamgiác vào với tỷ lệ 0,5-1% hoặc với tỷ lệ cao hơn

Sau khi trộn giống, ủ môi trường vào khay thành luống cao (0,3m) Đặt ởnhiệt độ 30-320C, độ ẩm 85-100% Thời gian ủ 6-8 giờ, nhiệt độ khối môi trườnglên tới 34-360C và bào tử đã nảy mầm gần hết nhưng chưa thành sợi dài Lúc nàycần rải môi trường thành lớp mỏng 2-3cm cần giữ cho nhiệt độ môi trườngkhông vượt quá 360C Lượng nhiệt tỏa ra nhiều nhất ở khoảng 10-14 giờ sau khitrộn giống Sau khi nuôi 34-36 giờ, nhiệt độkhối môi trường bắt đầu giảm, cầnphải điều chỉnh nhiệt độ lên 34-350C, để duy trì sự hình thành bào tử của nấmmốc

Thời gian nuôi mốc giống trên khay vào khoảng 60 giờ Nếu thấy hìnhthành bào tử chậm thì có thể kéo dài 70-72 giờ Mốc giống khi lấy ra thường có

độ ẩm 32-35% có thể dùng ngay làm giống cho công đoạn sản xuất Nếu khôngdùng ngay thì phải đem sấy khô đến độ ẩm 8%, giữ dùng dần hoặc là cung cấpgiống cho các nơi sản xuất