ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH TẮC NGHẼN MẠCH MÁU CHI BẰNG LIỆU PHÁP TẾ BÀO GỐC

Nghiên cứu này tiến hành cấy ghép đồng loại tế bào gốc nhằm đánh giá khả năng tác động của tế bào ghép lên sự phục hồi các mô tổn thương như mô mạch máu, mô cơ tại vùng tắc nghẽn mạch má

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ BÍCH NGỌC

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

1 XÁC NHẬN CỦA CBHD: (CBHD ký tên và ghi họ tên)

MỤC LỤC

1 Tính cấp thiết, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Thiếu máu cục bộ cấp tính (TMCBCT) là một biểu hiện của bệnh động mạch ngoại biên (BĐMNB) Bệnh nhân có tổn thương da, loét hay hoại tử mô do thiếu máu cục bộ Mục tiêu chính để điều trị bệnh nhân TMCBCT là giảm đau do thiếu máu cục bộ, chữa lành vết loét, ngăn ngừa mất chi, cải thiện chức năng và chất lượng cuộc sống của bệnh nhân và kéo dài sự sống

Tế bào gốc hoặc tế bào tiền thân được xác định là nguồn tế bào có tiềm năng điều trị mới có tác dụng kích thích sự tạo mạch máu Liệu pháp cấy ghép tự thân tế bào gốc hoặc tế bào tiền thân cho các bệnh thiếu máu cục bộ ngoại vi dường như trở thành một công cụ mới cho điều trị chứng thiếu máu cục bộ chi nghiêm trọng Các bằng chứng sơ bộ đã cho thấy tính khả thi, an toàn và hiệu quả trong một số điểm mấu chốt quan trọng nhằm phục hồi tổn thương do thiếu máu cục bộ

Tại Việt Nam, tắc nghẽn động mạch ngoại vi vẫn còn là căn bệnh khó điều trị, không chỉ ảnh hưởng tới chất lượng cuộc sống của người bệnh và gia đình mà còn ảnh hưởng đến toàn xã hội, chi phí điều trị tốn kém cũng là một gánh nặng lớn cho những người liên quan Các ứng dụng dùng tế bào gốc mới chỉ tiến hành trong điều trị bệnh lý về máu Một số khác đang được tiến hành cho các bệnh nhân tổn thương da, bỏng mắt, bệnh lý về xương Tuy nhiên, các ứng dụng này còn hạn chế ở quy mô nhỏ Đối với điều trị tắc nghẽn mạch máu bằng liệu pháp tế bào gốc, chưa có cơ sở nào trong nước có công trình công bố về hiệu quả điều trị

Nghiên cứu này tiến hành cấy ghép đồng loại tế bào gốc nhằm đánh giá khả năng tác động của tế bào ghép lên sự phục hồi các mô tổn thương như mô mạch máu, mô cơ tại vùng tắc nghẽn mạch máu

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện các liệu pháp điều trị bệnh, từ đó tìm ra những phác đồ trị liệu tiền lâm sàng, là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn để điều trị căn bệnh này và là cơ sở để mở rộng phạm vi thử nghiệm ở mức độ lâm sàng Nghiên cứu cũng tạo ra một số mô hình và phương pháp cấy ghép có tác động phục hồi các mô tổn thương

2 Tổng quan về các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước đã có đến nay về vấn đề khoa học mà đề tài đề cập đến

2.1 Nguồn tế bào

TBTT nội mô, TBG tạo máu và TBG trung mô được đặc trưng bởi khả năng sự tạo mạch máu mới và sửa chữa mô Cả ba loại tế bào này đều được phân lập từ tủy xương Ngoài ra TBTT nội mô còn có thể được thu nhận từ máu ngoại vi cũng như lách, TBG trung

mô có thể được phân lập từ mô mỡ ngoại vi (Pittenger 2004) và thành mạch (Abedin 2004) Đặc tính kiểu hình của cả hai loại tế bào này đều có thể được xác định nhờ hóa mô miễn dịch và phân tích chọn lọc tế bào biểu hiện phân tử bề mặt sử dụng phương pháp phân tách dòng chảy (flowcytometry) Tuy nhiên, sự thiếu các marker đặc trưng cho hai loại tế bào này khiến chúng trở nên khó xác định đặc tính Nhiều marker bề mặt của TBTT nội mô và TBG trung mô đều có trên TBG tạo máu

TBTT nội mô là một nhóm tế bào có nguồn gốc từ các cơ chất đa tiềm năng trong tủy xương Khi biệt hóa, chúng biểu hiện các chức năng chuyên biệt khác nhau trong hệ tuần hoàn (Dzau V.J 2005, Urbich M.F, 2004) Ở trạng thái biệt hóa, TBTT nội mô biểu hiện các marker của dòng nội mô như VE-cadherin, PECAM-1 (CD31) và eNOS (Urbich M.F, 2004) Ở người, sự biểu hiện của CD133 được tin là marker sớm của nguyên bào tạo mạch, việc mất marker này có sự trùng khớp với sự biệt hóa của TBTT nội mô thành tế bào chức năng có đặc tính của tế bào nội mô trưởng thành (Dimmerler S 2005, Dzau V.J 2005) TBTT nội mô được chứng minh có khả năng làm giảm nhiều biến chứng của các bệnh tim mạch (Dzau V.J 2005, Khakoo A.Y 2005)

TBG trung mô là một quần thể tế bào giống nguyên bào sợi, có nguồn gốc từ chất nền tủy xương, chiếm khoảng 0,001%-0,01% trong tổng số tế bào có nhân tủy xương TBG trung mô ở trạng thái chưa biệt hóa biểu hiện CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD106

và Sca-1, không biểu hiện các marker thông thường cho tế bào tạo máu và tế bào nội mô như CD14, CD31, CD34 và CD45 (Pittenger M.F 2004, Sally A Boxall và Elena Jones 2012)

Sự tái sinh mô nhờ tế bào gốc hoặc TBTT được coi như là sự duy trì hay hồi phục lại

hệ thống của nhiều cơ quan trong cơ thể trưởng thành Với những nghiên cứu và thành tựu thu nhận được về tiềm năng tái sinh mô, các TBG hoặc TBTT này được coi là một nguồn

quan trọng trong các ứng dụng điều trị mô tổn thương (Hideki Iwaguro và Takayuki Asahara)

Cấy ghép tế bào trở thành một phương pháp điều trị mới với việc sử dụng tế bào tiền thân nội mô bổ sung cho tế bào nội mô nội tại trong các mạch máu ở người trưởng thành Các mạch máu bị tổn thương do các trạng thái bệnh lý như tiểu đường, tăng cholesterol máu, hyperhomocysteinemia hay do tuổi tác có thể được sửa chữa nhờ chức năng của TBTT nội mô Các tế bào này có thể được huy động từ tủy xương, đưa vào trung tâm của mạch để tham gia quá trình hàn gắn tổn thương Sự tạo mạch được hình thành bởi sự hoạt hóa của

các tế bào nội mô tại chỗ và các tế bào tiền thân nội mô in situ hay TBTT nội mô được huy

động từ tủy xương

Với những đặc điểm như đã đề cập, TBTT nội mô và TBG trung mô hứa hẹn một tiềm năng khả quan cho liệu pháp điều trị bệnh tắc nghẽn động mạch ngoại vi nói riêng và các bệnh lý tổn thương mô nói chung

2.2 Liệu pháp tế bào trong tắc nghẽn mạch máuchi

Nhiều thí nghiệm trên động vật như chuột nhắt và chuột cống cũng như các động vật lớn khác được chứng minh là mô hình hiệu quả và khả thi cho liệu pháp tế bào nhằm phục hồi lại lưu lượng máu trong chi tắc nghẽn mạch Các thí nghiệm này đã cho thấy TBTT nội mô tuần hoàn tăng cao khi đáp ứng với chứng thiếu máu cục bộ (Shintani 2001, Takahashi 1999) Các tế bào này di cư, định vị trong các mao mạch và động mạch kẽ trong

mô hình thiếu máu cấp tính chi (Takahashi 1999, Asahara 1999) Chúng cũng có thể tác động theo con đường cận tiết nhờ sự tiết các nhân tố tạo mạch và cytokine (Kamihata 2001)

Những kết quả thu được từ liệu pháp này cho thấy các TBTT nội mô phát triển ex vivo khi

được cấy ghép vào chuột (bị phá tuyến ức) thiếu máu chi cục bộ có khả năng khôi phục lại lưu lượng máu và làm tăng mật độ mạch nhánh Hiệu quả cấy ghép cho thấy có khoảng 60% chi được cứu sống, trong khi đó ở các lô thí nghiệm chỉ có 7% (Kalka 2000) Một số nghiên cứu trên động vật thí nghiêm được tổng hợp trong Bảng 1:

Bảng 1: Tổng hợp các thí nhiệm trên mô hình động vật thiếu máu cục bộ sử dụng liệu pháp tế bào

Năm Tác giả Loại tế bào Đối tượng Kết quả

1997 Asahara TBTT nội mô Chuột nhắt Cải thiện lưu lượng máu,

người tăng mật độ mao mạch

2002 Iba Tế bào có nhân

2004 Kinnaird TBG trung mô Chuột nhắt Tăng dòng máu qua mạch

phụ, cải thiện chức năng chi, giảm teo cơ

2004 Niagara Nguyên bào cơ

Chuột cống Tạo mạch máu mới

2005 Iwase TBG trung mô,

tế bào có nhân

Chuột cống Cải thiện dòng máu

2006 Awad TBTT nội mô Chuột nhắt Hàn gắn và tăng trưởng

mạch máu

2006 Li Tế bào có nhân

máu ngoại vi

Chuột (nude)

Tăng mật độ mao mạch, giảm hoại tử chi, có sự tạo

tế bào bao quanh mạch

2007 Jeon Tế bào tủy

xơ vữa động mạch, có như vậy mới tiếp cận nhanh được phương cách điều trị trên các bệnh động mạch ngoại vi ở người

Các nghiên cứu ngẫu nhiên với cỡ mẫu lớn, các kiểm soát giả dược là cần thiết và hiện vẫn đang được tiến hành Các nghiên cứu khác liên quan tới nhiều loại tế bào khác nhau, liều lượng tối ưu, phương pháp phân lập tế bào, vai trò của các yếu tố kích khích tạo cụm tế bào (colony stimulating factor), hướng hoạt động và sự hỗ trợ của các tế bào làm giảm sự tiến triển của bệnh động mạch ngoại biên vẫn đang được tiến hành

Tại Việt Nam, năm 1995, bệnh viện Truyền máu - Huyết học thành phố Hồ Chí Minh

đã bắt đầu tiến hành ghép ca ghép TBG từ tủy xương đầu tiên để điều trị cho bệnh nhân bị bệnh về máu Năm 2002, bệnh viện tiến hành ghép TBG tạo máu có nguồn gốc từ máu dây rốn Đến nay, riêng bệnh viện đã tiến hành ghép được trên 80 ca TBG các loại Trên cả nước

đã có nhiều cơ sở y tế triển khai nghiên cứu ứng dụng ghép TBG trong trị liệu như bệnh viện trung ương Huế, Bệnh viện nhi Trung ương, Bệnh viện Quân đội Trung Ương

Tuy nhiên, đối với điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu ngoại vi sử dụng tế bào gốc cho tới nay, tại Việt Nam vẫn còn là một vấn đề mới

3 Mục đích nghiên cứu

- Xây dựng và đánh giá mô hình chuột tắc nghẽn mạch máu chi

- Phân lập và định danh tế bào tiền thân nội mô, tế bào gốc trung mô tủy xương chuột cho đồng ghép

- Đánh gia hiệu quả điều trị chuột tắc nghẽn mạch máu chi bằng liệu pháp ghép tế bào gốc từ tuỷ xương

4 Nội dung và phạm vi của vấn đề sẽ đi sâu nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu xây dựng và đánh giá mô hình chuột tắc nghẽn mạch máu chi

Xây dựng mô hình chuột tắc nghẽn mạch máu chi

Mô hình chuột thiếu máu chi được xây dựng theo quy trình được biến đổi từ quy trình của Robert S Crawford và cộng sự (2007) Chuột tắc nghẽn mạch máu được tạo bằng cách

thắt động mạch cung cấp máu nuôi chi, sử dụng kỹ thuật thắt dây thun

Đánh giá hiệu quả xây dựng mô hình chuột bệnh thiếu máu chi cục bộ

Chuột sau khi gây mô hình được đánh giá dựa trên các tiêu chí được đề xuất bởi Robert S Crawford và cộng sự (2007)

Đánh giá các chỉ tiêu sinh lí

o Đo lưu lượng máu bằng phương pháp chụp Doppler

o Đánh giá sự thay đổi hình thái, màu sắc chi

o Đánh giá sự phù nề chi bằng cách đo tỉ lệ khối lượng mô khô/ướt

o Mức độ sống sót của mô bằng phương pháp MTT

Đánh giá sự thay đổi ở mô và tế bào

o Nhuộm mô mô bằng Masson trichrome nhằm đánh giá mức độ tổn thương sợi cơ dựa trên kiểu hình của từng sợi cơ

Kết quả: Mô hình thiếu máu chi sau thắt động mạch đùi trên chuột nhắt trắng đạt

yêu cầu cho nghiên cứu

Nội dung 2: Thu nhận, tăng sinh và đánh giá 2 nguồn tế bào : tế bào gốc trung mô

và tế bào tiền thân nội mô từ tủy xương chuột

Tủy xương chứa nhiều loại tế bào gốc hoặc tế bào tiền thân gồm TBG tạo máu (<2,5%), nguyên bào tạo mạch/TBTT nội mô và TBG trung mô (<0,0001%)

Quần thể tế bào tiền thân nội mô có khả năng tái tạo mạch máu mới và quần thể TBG trung mô có khả năng sửa chữa mô hư hại được phân lập và xác định đặc tính như sau:

Phân lập tế bào tiền thân nội mô từ tủy xương chuột

Tế bào tiền thân nội mô từ tủy xương chuột được thu nhận và đánh giá đặc tính theo các phương pháp được biến đổi từ phương pháp của Odongua Sangidor (2010) và Burnt (2007)

Tế bào đơn nhân tủy xương sau khi thu nhận được nuôi trong môi trường đặc biệt cho

sự phát triển của tế bào tiền thân nội mô Các TBTT nội mô ứng viên được cấy chuyền 3-5 lần được khẳng định đặc tính thông qua các chỉ tiêu

- Khả năng tạo bào lạc (colony)

- Khả năng tạo cấu trúc hình ống : Sự tạo cấu trúc hình ống sử dụng Matrigel thường

được sử dụng để chứng minh hoạt động tạo mạch của các tế bào nội mô mạch in vitro

- Kiểu hình miễn dịch của tế bào : Quần thể TBTT nội mô dương tính với CD34/CD133 và âm tính với CD19/CD45

Phân lập tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột

Tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột được tiến hành thu nhận theo các phương pháp được biến đổi từ phương pháp của Gnecchi và Mel (2007) Các TBG trung mô ứng viên được cấy chuyền 3-5 lần được khẳng định đặc tính thông qua các chỉ tiêu:

- Khả năng bám dính vào bề mặt đĩa nuôi

- Khả năng biệt hóa của tế bào: các TBG trung mô được xác nhận dựa trên khả năng

biệt hóa in vitro thành tế bào tạo xương, nguyên bào tạo mỡ, tế bào tạo sụn hoặc một số

dòng tế bào khác

- Kiểu hình miễn dịch: TBG trung mô dương tính với CD73, CD44, CD105, CD90 và

âm tính với CD14, CD34, CD45

Kết quả: Quy trình thu nhận và nuôi cấy tăng sinh TBTT nội mô và quần thể TBG

trung mô đạt độ tinh sạch từ 90% trở lên

Nội dung 3: Nghiên cứu điều trị tắc nghẽn mạch máu chi bằng liệu pháp tế bào gốc

Đánh dấu tế bào ghép bằng chuyển gfp

Quy trình chuyển nhiễm virus mang gen gfp vào tế bào được thực hiện theo quy trình

được đề xuất bởi Burnt và cộng sự (2011)

Sự biểu hiện của GFP trong tế bào EPC được kiểm định bằng flowcytometry

Ghép tế bào vào chi tắc nghẽn mạch máu chuột

- Để đánh giá hiệu quả điều trị tắc nghẽn mạch máu chi, các thí nghiệm được tiến hành như sau:

o Thí nghiệm 1: Cấy ghép tế bào tiền thân nội mô tủy xương chuột vào chi tắc nghẽn mạch máu

o Thí nghiệm 2: Cấy ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột vào chi tắc nghẽn mạch máu

o Thí nghiệm 3: Cấy ghép kết hợp hai loại tế bào : tế bào gốc trung mô từ mô mỡ và

tế bào gốc tủy xương chuột vào chi tắc nghẽn mạch máu

o Thí nghiệm 4 (nghiệm thức đối chứng): tiêm PBS vào chi tắc nghẽn mạch máu của chuột

- Vị trí cấy ghép: tiêm trực tiếp vào mô

- Mật độ tế bào ghép: 105 -106 tế bào/ con

- Vị trí cấy ghép: tiêm trực tiếp vào vị trí thắt mạch máu

- Cỡ mẫu cho mỗi lô thí nghiệm ít nhất là 15 con, lặp lại 3 lần Số liệu được xử lý bằng phần mềm thống kê với độ tin cậy trên 95%

Đánh giá sự tác động của tế bào lên sự phục hồi chi tắc nghẽn mạch máu

Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm:

o Đánh giá sự lưu thông và lưu lượng máu bằng chụp Doppler

o Đánh giá sự hình thành mạch máu mới

o Đánh giá sự thay đổi cấu trúc mô bằng phương pháp nhuộm hóa mô và hóa mô miễn dịch

o Chứng minh vai trò của tế bào ghép vào sự hồi phục mô

ü Đánh giá sự tồn tại của tế bào ghép bằng phương pháp tách tế bào lưu dấu sử dụng hệ thống FACS calibur

ü Kiểm tra sự biệt hóa của tế bào ghép theo hướng tạo các tế bào thuộc cấu trúc mạch máu sử dụng hệ thống FACS calibur, trong đó các marker theo hướng tạo mạch (PECAM_CD31) và tạo cơ (Alpha-smooth muscle actin-ASMA) được biểu hiện đồng thời với GFP

5 Đối tượng, phương pháp nghiên cứu

5.1 Cách tiếp cận

- Tổng kết các kết quả nghiên cứu về khả năng sửa chữa các mô tổn thương của tế bào có nhân tủy xương trên thế giới, các phương pháp tạo mô hình chuột bệnh lý để đưa ra giả thuyết khoa học cho nghiên cứu

- Triển khai thực nghiệm các mô hình nghiên cứu và đánh giá kết quả

5.2 Đối tượng thí nghiệm và cỡ mẫu cho nghiên cứu

Đối tượng

+ Tế bào gốc trung mô tủy xương chuột

+ Tế bào tiền thân nội mô tủy xương chuột

+ Chuột bệnh tắc nghẽn mạch máu chi

Cỡ mẫu

+ Số lượng động vật cho 1 lần khảo sát tối thiểu là 15 con, số lần lặp lại tối thiểu là 3 lần

+ Tất cả các số liệu thu nhận được được xử lí loại bỏ giá trị bất thường và xử lí thống

kê với độ tin cậy trên 95%

5.3 Các phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Hình 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm chung

Các phương pháp thực hiện chính:

Phương pháp 1: Tạo mô hình chuột thiếu máu chi

Mô hình chuột thiếu máu chi được tạo theo quy trình được biến đổi từ quy trình của Couffinhal và cs (1998) Chuột trên 6 tháng tuổi được gây mê bằng thuốc gây mê zoletil 1,5 -2,1 mg/kg Động mạch chi được thắt và cắt ở hai vị trí: phía trên ngã ba động mạch chi (thắt sát ổ bụng) và nút thắt phía dưới có thể trên hoặc dưới ngã ba động mạch kheo Việc kiểm tra hiệu quả thắt mạch máu được đánh giá thông qua sự bắt màu dung dịch trypan blue

ở phía sau vùng thắt Nếu việc thắt chi thành công, dung dịch màu xanh sẽ không lưu thông qua được phần mạch máu phía sau vùng thắt, do đó chi sau không bắt màu xanh Ngược lại, chi sau sẽ bắt màu xanh

Phương pháp 2 : Đánh giá sự phù nề chi bằng cách đo tỉ lệ khối lượng mô khô/ướt