NGHIÊN cứu mối LIÊN QUAN GIỮA GEN APOE và rối LOẠN CHUYỂN hóa LIPID máu ở TRẺ EM TIỂU học tại một số TỈNH MIỀN bắc

Có nhiều nghiên cứu về mối liênquan giữa gen và RLCHLM đã được tiến hành trên thế giới, cho thấy RLCHLM liên quan đến sự hoạt động của rất nhiều gen như APOE, GALNT2, LDLR, APOA5, APOA4,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

BÙI THỊ THANH DUYÊN

NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA

GEN APOE VÀ RỐI LOẠN CHUYỂN HÓA LIPID

MÁU Ở TRẺ EM TIỂU HỌC TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Hiện nay, tình trạng RLCHLM đang ngày càng gia tăng, gây nhiều lo ngại cho

xã hội Một nghiên cứu ngẫu nhiên trên 2400 phụ nữ ở miền Tây nước Áo cho thấy

có đến 64,7% phụ nữ có cholesterol tổng số (TC) trong máu cao [85] Nghiên cứu vềRLCHLM ở người từ 25 đến 74 tuổi tại Hà Nội năm 2008 cho thấy, tỷ lệ rối loạn ítnhất một thành phần lipid máu là 59,8%; tỷ lệ tăng cholesterol đơn thuần chiếm47,2%; tỷ lệ tăng TG là 38,4%; tỷ lệ tăng phối hợp cholesterol và TG là 25,9% [9].Đặc biệt, tỷ lệ mắc RLCHLM ở trẻ em đang ngày càng tăng cao và tỷ lệ thuận với tỷ

lệ trẻ mắc bệnh béo phì [25] Ở trẻ thừa cân, béo phì 7 – 12 tuổi tại nội thành Hà Nộinăm 2003, có 66,7% tăng TG máu, 10,5% tăng cholesterol toàn phần và 5,7% tăngLDL-C [1] Một nghiên cứu năm 2009 trên học sinh 8 – 10 tuổi tại Hà Nội cho thấy

có 52,2% trẻ 8 – 10 tuổi bị RLCHLM, 57,6% trẻ 8 – 9 tuổi có nguy cơ mắc hội chứngchuyển hóa và 84,6% trẻ 10 tuổi bị mắc hội chứng chuyển hóa [7]

Nguyên nhân dẫn đến RLCHLM là do sự tương tác giữa các yếu tố nguy cơ từmôi trường (chế độ ăn uống nhiều chất béo bão hòa, ít vận động, do béo phì, đái tháođường…) và các yếu tố di truyền làm ảnh hưởng tới các chỉ số lipid máu Ở trẻ em,yếu tố di truyền được coi là nguyên nhân chủ yếu gây ra RLCHLM Nghiên cứu vềnhững cặp sinh đôi cùng trứng và gia đình cho thấy nồng độ HDL-C trong huyếtthanh do 40 – 60% yếu tố di truyền quyết định [28] Có nhiều nghiên cứu về mối liênquan giữa gen và RLCHLM đã được tiến hành trên thế giới, cho thấy RLCHLM liên

quan đến sự hoạt động của rất nhiều gen như APOE, GALNT2, LDLR, APOA5,

APOA4, APOC3, APOA, CETP Trong đó, gen APOE có mối liên quan rõ ràng nhất

đối với RLCHLM [26, 48, 62, 81] Gen APOE đóng vai trò trung tâm trong quá trình

chuyển hóa lipid đồng thời tham gia vào phân phối chất béo trong các mô, tế bào của

cơ thể [43]

Bên cạnh đó, ở các vùng địa lý khác nhau thì đặc điểm di truyền chủng tộc, cácyếu tố dinh dưỡng, hoạt động thể lực, kinh tế, xã hội là khác nhau Vì vậy, ảnh hưởngcủa gen đối với bệnh tật ở các dân tộc khác nhau cũng khác nhau [59] Việc phát hiệnsớm các gen nhạy cảm, có tác động xấu tới chuyển hóa lipid máu giúp cho việcphòng và ngăn ngừa sự xuất hiện biến chứng Ở trẻ em, điều này sẽ giúp cải thiệnnguy cơ tim mạch trong tương lai

Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về mối liên quan giữa gen APOE và

RLCHLM nhưng chủ yếu được thực hiện trên đối tượng người Châu Âu và người datrắng [27, 42, 63, 69] Các nghiên cứu ở người Châu Á còn quá ít [66, 70] Tại Việt

Nam, hiện nay đã có một số nghiên cứu về gen APOE nhưng chủ yếu là trên bệnh

Alzheimer ở người trưởng thành [12, 19] Các công trình nghiên cứu về mối liên

quan giữa gen APOE và RLCHLM ở trẻ em Việt Nam vẫn còn rất hạn chế Đã có

một nghiên cứu của Nghiêm Nguyệt Thu và cộng sự [70] được thực hiện trên nhómnhỏ gồm 348 bé gái 7 – 9 tuổi tại thành phố Hồ Chí Minh, nhưng chưa đủ để mangtính đại diện cho trẻ em Việt Nam

Xuất phát từ những lý do trên và để giải đáp vấn đề: Có hay không mối liên

quan giữa gen APOE và RLCHLM ở trẻ em Việt Nam; mối liên quan này có độc lập

với BMI hay không, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu mối liên quan giữa gen

APOE và rối loạn chuyển hóa lipid máu ở trẻ em tiểu học tại một số tỉnh miền Bắc”.

2 Lịch sử nghiên cứu

Gen APOE được sản xuất chủ yếu bởi gan và các đại thực bào trong các mô

ngoại vi; bởi các tế bào hình sao và hình đệm trong hệ thần kinh trung ương [60]

APOE là loại gen đa chức năng, đóng vai trò quan trọng tham gia quá trình điều hòa

miễn dịch và các quá trình trao đổi chất đặc biệt là quá trình chuyển hóa lipid Vì vậy,

gen APOE từ lâu đã được nghiên cứu khá nhiều trên thế giới và được xác định liên

quan trực tiếp đến hàng loạt bệnh ở người như rối loạn chuyển hóa lipid máu [42, 48,

51, 69, 70], bệnh Alzheimer [12, 19, 33, 44], xơ vữa động mạch [62], đái tháo đườngtype II [31], béo phì [78], khiếm khuyết chức năng nhận thức [38], HIV [30], tai biếnmạch máu não [64]…

Gen APOE được cho là đóng vai trò trung tâm trong quá trình chuyển hóa lipid

máu Trong điều kiện đời sống con người không ngừng được cải thiện và nâng cao,tình trạng RLCHLM cũng ngày càng tăng lên Chính vì vậy, mối liên quan giữa gen

APOE và RLCHLM cũng ngày càng được quan tâm và đi sâu nghiên cứu Tính đến

tháng 9/2015, trên cơ sở dữ liệu HuGE tra cứu ngày 25/09/2015 [89] đã có 3692 bài

báo công bố các nghiên cứu về gen APOE, trong đó có 120 bài liên quan đến các

bệnh về tim mạch, 90 bài liên quan đến bệnh mạch vành, 57 bài liên quan đến tănglipid máu, 43 bài liên quan đến tăng cholesterol, 33 bài liên quan tăng TG máu và 31

bài liên quan đến RLCHLM Các nghiên cứu về gen APOE đã bắt đầu xuất hiện từ

những năm 80 của thế kỷ XX

Tổng hợp các nghiên cứu này cho thấy, ảnh hưởng của gen APOE đến

RLCHLM là không đồng nhất giữa các độ tuổi, quần thể người và giới tính khácnhau Các nghiên cứu chủ yếu được thực hiện trên đối tượng người Châu và người da

trắng Nghiên cứu về mối liên quan giữa APOE và RLCHLM ở trẻ em vẫn còn rất

hạn chế, đặc biệt là các công trình nghiên cứu trong nước

3 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định tần số alen, sự phân bố kiểu gen của đa hình đơn nucleotide (Single

nucleotide polymorphism, SNP) rs429358 và rs7412 nằm trên gen APOE của đối

tượng nghiên cứu

- Phân tích mối liên quan của từng SNP rs429358 và rs7412 trên gen APOE với

RLCHLM và rối loạn từng thành phần lipid máu ở đối tượng nghiên cứu

- Phân tích ảnh hưởng kết hợp của 2 SNP rs429358 và rs7412 trên gen APOE

với RLCHLM và rối loạn từng thành phần lipid máu ở đối tượng nghiên cứu

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: 450 trẻ em tiểu học từ 6 – 11 tuổi của Hà Nội, HảiDương và Thái Nguyên

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2013 – tháng 8/2015

- Địa điểm nghiên cứu: Điều tra được tiến hành tại một số trường tiểu học trênđịa bàn Hà Nội, Hải Dương, Thái Nguyên Phân tích di truyền phân tử được tiến hànhtại Viện vệ sinh dịch tễ Trung Ương

5 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu mối liên quan giữa SNP rs429358, SNP rs7412 trên gen APOE và

sự kết hợp của hai SNP này với RLCHLM và rối loạn từng thành phần lipid máubằng phân tích đơn biến, đa biến ở trẻ em tiểu học Hà Nội, Hải Dương, Thái Nguyên

6 Đóng góp của đề tài

- Cung cấp số liệu về tần số kiểu gen và alen APOE trong quần thể và ảnh

hưởng của nó đối với RLCHLM ở trẻ em ở một số tỉnh ở miền Bắc

- Phương pháp xác định kiểu gen đảm bảo số liệu tin cậy và phù hợp với điềukiện Việt Nam Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên về xác định kiểu gen

APOE bằng gel polyacrylamide ở Việt Nam.

- Các kết quả của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về mở rộng bộgen người Việt Nam; là cơ sở cho tiên đoán bệnh, giúp phòng chống bệnh tật, nângcao sức khỏe cho người Việt Nam; đồng thời là tài liệu tham khảo trong giảng dạy vànghiên cứu cho lĩnh vực y sinh

7 Phương pháp nghiên cứu

- Điều tra, nghiên cứu thực tiễn trên mô hình nghiên cứu bệnh chứng

- Các phương pháp thu thập thông tin: Phương pháp tính tuổi, phương pháp đochiều cao đứng, phương pháp đo cân nặng và xác định chỉ số BMI, phương pháp đovòng bụng và vòng mông

- Phương pháp xét nghiệm sinh hóa máu

- Phương pháp tách ADN từ máu toàn phần

- Phương pháp xác định kiểu gen

- Phương pháp điện di

- Phương pháp giải trình tự gen

PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Tổng quan về lipid máu và RLCHLM

1.1 Lipid máu và lipoprotein

1.1.1 Khái niệm và các thành phần của lipid máu

1.1.2 Cấu trúc và các loại lipoprotein

1.2 Rối loạn chuyển hóa lipid máu

1.2.1 Định nghĩa

1.2.2 Phân loại

1.2.3 Nguyên nhân

* Nguyên nhân nguyên phát

Nguyên nhân nguyên phát dẫn đến RLCHLM là yếu tố di truyền

Các rối loạn nguyên phát là nguyên nhân chủ yếu gây ra RLCHLM ở trẻ em,không phải là nguyên nhân gây ra tỷ lệ lớn mắc RLCHLM ở người trưởng thành

* Nguyên nhân thứ phát

1.2.4 Hậu quả

1.3.Sự tương tác giữa gen và các yếu tố nguy cơ trong RLCHLM

2 Đại cương về gen APOE

2.1 Vị trí

2.2 Cấu trúc

2.3 Gen APOE là một gen đa hình đơn nucleotide

2.4 SNP rs429358 và rs7412 trên gen APOE

2.5 Vai trò của gen APOE trong chuyển hóa lipid

- Vai trò của APOE trong quá trình sản xuất lipoprotein giàu TG

- Vai trò của APOE trong cân bằng HDL nội mô

- Vai trò của APOE trong nội cân bằng lipoprotein trong huyết tương

- Vai trò của APOE trong nội cân bằng chất béo trong não

- Vai trò của APOE trong nội cân bằng chất béo trong mô mỡ

3 Một số nghiên cứu về mối liên quan của gen APOE SNP rs429358 và rs7412

tới RLCHLM ở trẻ em

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Trẻ em tiểu học 6 – 11 tuổi được chọn lựa dựa vào kết

quả điều tra sàng lọc trên 7.500 trẻ em tại 31 trường tiểu học của Hà Nội và 2400 trẻ

tiểu học của Hải Dương và Thái Nguyên từ đề tài “Nghiên cứu mối liên quan của

gen TMEM18 và APOE tới bệnh béo phì và rối loạn chuyển hóa lipid máu ở trẻ

em tiểu học” của Bộ Giáo dục & Đào tạo Hà Nội.

Tiêu chuẩn loại trừ: trẻ đang mắc bệnh cấp tính hoặc bệnh mãn tính như lao,

nhiễm HIV/AIDS hoặc đang điều trị rối loạn lipid máu kéo dài Các đối tượng khôngthu thập được đủ các thông tin cần thiết về mẫu máu cũng bị loại trừ khỏi nghiên cứu

2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2013 – tháng 8/2015.

Địa điểm nghiên cứu:

- Điều tra được tiến hành tại một số trường tiểu học trên địa bàn Hà Nội, HảiDương, Thái Nguyên

- Xét nghiệm sinh hóa thực hiện tại Bệnh viện Medlatec, Bệnh viện Đa khoatỉnh Hải Dương, Bệnh viện Đại học Y Thái Nguyên

- Phân tích di truyền phân tử và hoàn thiện nghiên cứu tại Viện vệ sinh dịch tễTrung Ương; Bộ môn Sinh lý người và động vật – Khoa Sinh, Đại học Sư phạm HàNội

3 Vật liệu nghiên cứu

3.1 Hóa chất

3.2 Trang thiết bị

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Thiết kế nghiên cứu

- Nghiên cứu bệnh chứng

4.2 Cỡ mẫu và quy trình chọn mẫu

4.3.Các phương pháp thu thập thông tin

- Phương pháp tính tuổi

- Phương pháp đo chiều cao đứng

- Phương pháp đo cân nặng

- Phương pháp tính chỉ số khối cơ thể (BMI – Body Mass Index)

- Phương pháp đo vòng bụng và vòng mông

4.4.Phương pháp xét nghiệm sinh hóa máu

Xét nghiệm TG, TC, LDL-C, HDL-C do Bệnh viện Medlatec, Bệnh viện Đa khoatỉnh Hải Dương, Bệnh viện Đại học Y Thái Nguyên thực hiện bằng phương phápchuẩn

4.5 Phương pháp tách ADN từ máu toàn phần

ADN tổng số được tách từ tế bào bạch cầu sử dụng bộ Kit Wizard® GenomicADN Purification (Promega Corporation, USA)

4.6 Phương pháp xác định kiểu gen

Tất cả các mẫu nghiên cứu được xác định kiểu gen bằng phương pháp PCR –RFLP (Polymerase Chain Reaction – Fragment Length Polymorphism)

4.7 Phương pháp điện di

4.7.1 Phương pháp điện di trên gel agarose

Tất cả các mẫu sản phẩm PCR đều được điện di trên gel agarose 2,5%, nhuộmvới RedSafe, sử dụng ΦX174DNA/HaeIII Markers, dung dịch đệm TBE 0,5XX174DNA/HaeIII Markers, dung dịch đệm TBE 0,5Xtrong thời gian thích hợp ở 100V

4.7.2 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide

Các mẫu sản phẩm ủ enzyme đều được điện di trên gel polyacryamide 12,5%,nhuộm với RedSafe, sử dụng ΦX174DNA/HaeIII Markers, dung dịch đệm TBE 0,5XX174DNA/HaeIII Markers, dung dịch đệm TBE 1Xtrong thời gian thích hợp ở 100V

4.8 Phương pháp giải trình tự gen

Sản phẩm PCR được tinh chế sạch Trình tự ADN được phân tích bằng cách sửdụng bộ kit hóa học BigDye® Terminator v3.1 từ Axil Scientific Pte Ltd., Singapore.Kết quả giải trình tự được so sánh với các kết quả phân tích kiểu gen bằng phươngpháp RFLP Độ phù hợp giữa hai phương pháp là 100%

5 Xử lý số liệu

6 Đạo đức nghiên cứu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu

Để hiểu rõ hơn về đối tượng nghiên cứu, chúng tôi phân tích một số đặc điểm

về giới tính, tuổi, các chỉ số nhân trắc và chỉ số lipid máu ở hai nhóm bệnh và nhómchứng Kết quả phân tích được thể hiện ở bảng 3.1

Kết quả phân tích cho thấy, nghiên cứu của chúng tôi có sự đồng nhất về giới và tuổi

ở hai nhóm nghiên cứu (P > 0,05)

Các chỉ số chiều cao, cân nặng, BMI, chu vi vòng bụng, chu vi vòng mông vàWHR ở nhóm bệnh có xu hướng cao hơn đáng kể so với nhóm chứng So sánh các

chỉ số lipid máu nhận thấy rằng, nhóm bệnh có nồng độ TG, cholesterol và LDL-Ccao hơn nhóm chứng; nồng độ HDL-C thấp hơn nhóm chứng Sự khác biệt này đều

có ý nghĩa thống kê với P < 0,05.

Bảng 3.1 Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu

a Các biến tuân theo phân phối chuẩn được biểu diễn bằng giá trị trung bình

và độ lệch chuẩn, P nhận được từ kiểm định Student’s t test.

b Các biến không tuân theo phân phối chuẩn được biểu diễn bằng trung vị và

25 th – 75 th percentile, P nhận được từ kiểm định Mann – Withney U test.

c Các biến tuân theo phân phối chuẩn sau khi đổi biến dạng Log10 được biểu diễn bằng Mean và 95% CI, P nhận được từ kiểm định Student’s t test.

2 Kết quả xác định kiểu gen bằng phương pháp PCR – RFLP

Chúng tôi đã tiến hành xác định kiểu gen của APOE bằng phương pháp PCR –

RFLP, kết quả được thể hiện qua hình 3.1

Hình 3.1 Kết quả xác định kiểu gen của APOE bằng phương pháp PCR – RFLP

A Kết quả điện di 6 mẫu sản phẩm PCR 244bp (giếng 2 – 7) trên gel agarose trước khi ủ với enzyme, giếng 8 là chứng âm (Master mix), giếng 1 là marker ΦX174DNA/HaeIII Markers, dung dịch đệm TBE 0,5XX174

DNA/BsuRI (HaeIII)

B Kết quả điện di 6 mẫu sản phẩm PCR sau khi ủ với enzyme trên gel polyacrylamide 12% (150V, 20mA, 10W trong 90 phút); giếng 1 – 3, 4 – 6 là các mẫu nghiên cứu, giếng 4 là marker ΦX174DNA/HaeIII Markers, dung dịch đệm TBE 0,5XX174 DNA/BsuRI (HaeIII).

Kết quả kiểu gen là sự kết hợp của các phân đoạn ADN sau khi ủ với enzyme

6 mẫu đại diện cho 6 kiểu gen được kiểm chứng bằng phương pháp giải trình

tự gen 100% kết quả giải trình tự trùng khớp với kết quả xác định kiểu gen bằngphương pháp PCR – RFLP

3 Tỷ lệ kiểu gen và alen của đa hình APOE

3.1 Tỷ lệ kiểu gen và alen của đa hình APOE tại từng SNP rs429358 và rs7412

Tất cả đối tượng nghiên cứu đã được xác định kiểu gen bằng bằng phương phápPCR – RFLP Kết quả tỷ lệ kiểu gen và alen trong nhóm bệnh và nhóm chứng ở từngSNP được trình bày lần lượt trong các bảng 3.2, 3.3

Bảng 3.2 Phân bố kiểu gen và alen của đa hình APOE rs429358

T 274 (91,3%) 550 (91,7%) 824 (91,6%)

C 26 (8,7%) 50 (8,3%) 76 (8,4%)Kết quả kiểm định quy

luật Hardy-Weinberg P = 0,368 P = 0,413 P = 0,899

Qua bảng 3.2 cho thấy, tỷ lệ kiểu gen và alen của đa hình APOE rs429358 đều

tuân theo quy luật Hardy-Weinberg ở cả nhóm bệnh, nhóm chứng và trên toàn mẫu với

giá trị P > 0,05 Kiểu gen T/T phổ biến nhất với tỷ lệ khá lớn, tương ứng là 84,0%,

83,7% và 83,7%; kiểu gen C/C chiếm tỷ lệ rất nhỏ lần lượt là 1,3%, 0,3% và 0,7%tương ứng ở nhóm bệnh, nhóm chứng và trên toàn mẫu Alen T chiếm đa số trong

mẫu nghiên cứu với tỷ lệ trên 91,0% cả ở từng nhóm và trên toàn mẫu Với P =

0,446, kết quả không cho thấy sự khác biệt về tỷ lệ kiểu gen và alen giữa nhóm bệnh

và nhóm chứng

Bảng 3.3 thể hiện phân bố kiểu gen và alen của đa hình APOE rs7412 Kết quả cho thấy tỷ lệ kiểu gen và alen của đa hình APOE rs7412 chỉ tuân theo quy luật Hardy-Weinberg ở các đối tượng thuộc nhóm chứng với P > 0,05 nhưng không theo quy luật này ở nhóm bệnh và trên toàn mẫu với P < 0,05.

Bảng 3.3 Phân bố kiểu gen và alen của đa hình APOE rs7412

C 267 (89,0%) 553 (92,2%) 820 (91,1%)

T 33 (11,0%) 47 (7,8%) 80 (8,9%)Kết quả kiểm định quy luật

Hardy-Weinberg P = 0,008 P = 0,354 P = 0,010

Tỷ lệ kiểu gen và alen của đa hình APOE rs7412 trên đối tượng nghiên cứu có

sự khác biệt với đa hình APOE rs429358 Ở đa hình này, kiểu gen chiếm đa số là C/C

với tỷ lệ 81,4%, 85,3%, 84,0%; trong khi đó kiểu gen T/T lại chỉ chiếm số ít với3,3%, 1,0%, 1,8% lần lượt ở nhóm bệnh, nhóm chứng và toàn mẫu Alen C chiếm ưuthế hơn alen T So sánh tỷ lệ kiểu gen và alen giữa hai nhóm nghiên cứu, chúng tôi

nhận thấy không có sự khác biệt nào với P = 0,178

3.2 Tỷ lệ kiểu gen và alen của đa hình APOE kết hợp cả hai SNP rs429358 và rs7412

Chúng tôi tiến hành phân tích sự phân bố kiểu gen và alen của đa hình APOE

tại cả hai SNP qua bảng 3.4

Bảng 3.4 Phân bố kiểu gen và alen của đa hình APOE

ε4/ε4 2 (1,3%) 1 (0,3%) 3 (0,7%)

Kiểu alen

ε2 33 (11,0%) 47 (7,8%) 80 (8,9%)ε3 241 (80,3%) 503 (83,9%) 744 (82,7%)ε4 26 (8,7%) 50 (8,3%) 76 (8,4%)Kết quả cho thấy, kiểu gen ε3/ε3 là phổ biến nhất trong quần thể nghiên cứu với

tỷ lệ lần lượt là 67,4%, 70,4% và 69,3%; kiểu gen ε4/ε4 là hiếm gặp nhất với tỷ lệ 1,3%,0,3% và 0,7% trong nhóm bệnh, nhóm chứng và trên toàn mẫu Nhìn vào sự phân bố củaalen, chúng tôi nhận thấy rằng, alen ε2 và ε4 có tỷ lệ gần tương đương nhau và tỷ lệ của