Nghiên cứu phát hiện các thay đổi gen ở nạn nhân bị phơi nhiễm dioxin và các thế hệ tiếp theo (f1, f2) của những nạn nhân bị phơi nhiễm

Mặc dù vậy, cho đến nay vẫn chưa có các nghiên cứu sâu hơn về sự thay đổi cấu trúc và chức năng của gen ở người, đặc biệt việc phân tích trình tự gen các phả hệ nạn nhân bị nhiễm dioxi

bộ y tế trường đại học y hà nội

chương trình 33

Báo cáo Tổng kết đề tài nhánh

Nghiên cứu phát hiện các thay đổi gen ở nạn nhân

bị phơi nhiễm dioxin và các thế hệ tiếp theo (F1, F2)

của những nạn nhân bị phơi nhiễm

Chủ nhiệm đề tài nhánh: TS Nông Văn Hải

Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học

Thuộc đề tài cấp nhà nước (CT 33):

Nghiên cứu các biến đổi về mặt di truyền, miễn dịch,

sinh hoá, huyết học và tồn lưu dioxin

trên các đối tượng phơi nhiễm có nguy cơ cao

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Nguyễn Văn Tường

Cơ quan chủ quản: Bộ Y tế

Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Y Hà Nội

Hà nội – 2003

5462-5

bộ y tế trường đại học y hà nội

chương trình 33

Báo cáo Tổng kết đề tài nhánh

đề tài cấp nhà nước

Đề tài nhánh:

Nghiên cứu phát hiện các thay đổi gen ở nạn nhân bị phơi nhiễm dioxin và các thế hệ tiếp theo (F1, F2) của những nạn nhân bị phơi nhiễm

Chủ nhiệm đề tài nhánh: TS Nông Văn Hải

Thời gian thực hiện: 2001 – 2003

Kinh phí được cấp: 275.500.000

Hà nội – 2003

Danh sách những người thực hiện chính

của đề tài Nhánh

Chủ nhiệm đề tài nhánh: TS Nông Văn Hải

Thư ký đề tài nhánh: TS Lê Thị Thu Hiền

Đề tài nhánh chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Lãnh

đạo Chương trình 33, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Viện Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Y Hà Nội, Học viện Quân y

và đặc biệt là PGS TS Nguyễn Văn Tường, GS TSKH Phan Thị Phi

Phi, GS TS Trịnh Văn Bảo, GS TS Lê Bách Quang, GS TS Nguyễn Văn Nguyên và các cán bộ Trường Đại học Y Hà Nội, Học viện Quân y

trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này

Môc lôc

Trang

II Tæng quan tµi liÖu

III §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

IV KÕt qu¶ vµ th¶o luËn

V Bµn luËn

VI KÕt luËn

VII Nh÷ng hiÖu qu¶ cña nghiªn cøu

VIII TµiliÖu tham kh¶o

IX Phô lôc

Các phần trong báo cáo gồm:

I Đặt vấn đề

Trong thời kỳ chiến tranh tại Việt Nam, từ năm 1961 đến năm 1972, Mỹ

đã sử dụng chất độc da cam (CĐDC) làm thuốc trụi lá (defoliant), trong đó có

chứa dioxin với nồng độ trung bình 2mg/kg (Kramarova et al., 1998) Tính

trên tổng số chất CĐDC, Mỹ đã sử dụng ở nước ta một lượng lớn dioxin (ước tính: 170-500 kg) Theo công bố mới đây nhất của các nhà khoa học tại trường

đại học Columbia (Mỹ), số lượng chất độc hoá học do Mỹ sử dụng tại chiến tranh Việt Nam còn cao hơn rất nhiều, trong đó lượng dioxin có thể cao hơn từ

2 đến 4 lần so với các công bố trước đây (Stellman et al., 2003) Nếu lấy con

số 4 g dioxin khi sử dụng trực tiếp có thể tiêu diệt toàn bộ nhân loại trên trái

đất thì đây là một con số hết sức khủng khiếp

Ô nhiễm dioxin do chiến tranh hoá học của Mỹ để lại đã và đang gây hậu quả hết sức nghiêm trọng đối với môi trường sống, hệ sinh thái và con người

Đặc biệt nghiêm trọng là hàng triệu người dân nước ta đã và đang chịu hậu quả nặng nề của dioxin Các thế hệ người Việt Nam hiện nay và kế tiếp có thể còn phải chịu những hậu quả khôn lường về sự huỷ hoại sức khoẻ, bệnh di truyền, ung thư và nhiều căn bệnh hiểm nghèo khác do ảnh hưởng trực tiếp hay gián tiếp của dioxin

Rất nhiều năm sau chiến tranh, các nghiên cứu của các nhà khoa học Việt Nam và Mỹ vẫn cho thấy nồng độ dioxin trong cơ thể người Việt Nam sống tại những vùng sinh thái bị nhiễm chất độc hoá học nặng như sân bay

Biên Hoà, vẫn rất cao (Schecter et al., 2000; Schecter et al., 2001) Các nghiên

cứu này cũng như nhiều nghiên cứu khác (Wiesmuller & Schlatterer, 1999) đã

củng cố thêm giả thuyết cho rằng dioxin đi vào cơ thể người theo chuỗi thức

ăn, chủ yếu là cá

Các nghiên cứu về dịch tễ học và bệnh học lâm sàng trên các nạn nhân CĐDC đã được các cơ sở cơ quan của Bộ Y tế (Trường Đại học Y Hà Nội, các Bệnh viện…), Uỷ ban 10/80 trước đây và Bộ Quốc phòng (Học viện Quân y) tiến hành từ hơn 20 năm trở lại đây và đã thu được các kết quả rất quan trọng (Hoàng Đình Cầu, 2000; Phan Thị Phi Phi và CS, 2000…)

Đồng thời, gần đây ảnh hưởng của dioxin trên người ở mức độ phân tử DNA đã bước đầu được quan tâm nghiên cứu ở nước ta DNA của một số đối tượng bị nhiễm độc đã được tách chiết và phân tích sơ bộ bằng kỹ thuật PCR (Lê Đình Lương và CS; Phan Thị Phi Phi và CS; Nguyễn Văn Nguyên, Lê Bách Quang và CS; Nguyễn Thị Ngọc Dao và CS; Phan Văn Chi và CS; Nông Văn Hải và CS; các tài liệu báo cáo đề tài hoặc chưa công bố) Mặc dù

vậy, cho đến nay vẫn chưa có các nghiên cứu sâu hơn về sự thay đổi cấu trúc

và chức năng của gen ở người, đặc biệt việc phân tích trình tự gen các phả hệ

nạn nhân bị nhiễm dioxin, trên cơ sở đó có những kết luận xác đáng về ảnh

hưởng của dioxin trên người ở mức độ gen

Từ tháng 8 năm 2001, đề tài nhánh (đề mục) “Nghiên cứu phát hiện các thay đổi gen ở nạn nhân bị nhiễm dioxin và các thế hệ tiếp theo (F1, F2) của những nạn nhân bị phơi nhiễm” do Viện Công nghệ Sinh học chủ trì,

thuộc đề tài do PGS TS Nguyễn Văn Tường (Trường ĐH Y Hà Nội) làm Chủ

nhiệm “Nghiên cứu các biến đổi về mặt di truyền, miễn dịch, sinh hoá, huyết học và tồn lưu dioxin trên các đối tượng bị phơi nhiễm” thuộc Chương trình

33, cấp Nhà nước, đã được phê duyệt và chính thức được tiến hành

Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài nhánh đặt mục tiêu: ứng dụng các kỹ thuật phân tử để phát hiện các

thay đổi về bộ gen nói chung, cũng như các thay đổi về cấu trúc và chức năng của một số gen chọn lọc ở các nạn nhân bị nhiễm dioxin và các thế hệ con cháu của họ Đưa ra các kết luận xác đáng về hiểm hoạ dioxin đối với con người cũng như có những kiến nghị cần thiết về biện pháp khắc phục những hậu quả lâu dài

Nội dung nghiên cứu (đã đăng ký)

Thu thập mẫu (máu toàn phần) của các phả hệ (3-10 phả hệ, mỗi phả hệ

5-10 cá thể) cựu chiến binh và người dân bị ảnh hưởng trực tiếp của dioxin (CĐDC) đã và đang có những biểu hiện bệnh lý và lâm sàng đặc trưng và các thành viên trong gia đình họ (bố, mẹ, anh, chị, em ruột, con, cháu, …) trong

đó có người bị ung thư máu, dị tật bẩm sinh, hoặc bị một trong những bệnh

đặc trưng có liên quan đến dioxin và những người khoẻ mạnh bình thường

(đối chứng) Tiến hành tách chiết, tinh chế và xử lý bảo quản lâu dài DNA và các sản phẩm gen từ các mẫu máu

Phân lập, xác định và so sánh trình tự nucleotit của các đoạn gen Cyp1A1

và P53 (exon 2-4, exon 5-7, và exon 8-9) từ các mẫu So sánh sự khác nhau về trình tự 2 gen này ở các mẫu, qua các thế hệ

Nghiên cứu tìm các yếu tố gây cảm ứng gen Cyp1A1

Xử lý số liệu bằng các phương pháp phần mềm vi tính cho phân tích gen Tổng kết, báo cáo khoa học, công bố kết quả về ảnh hưởng của dioxin lên

hệ gen và một số gen chọn lọc

II Tổng quan tài liệu

II 1 Cơ chế tác động của dioxin ở mức độ phân tử

Dioxin là tên gọi tắt của 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD),

là một chất siêu độc, thường lẫn tạp trong thành phần của các thuốc bảo vệ thực vật, cũng như sinh ra trong chất thải công nghiệp, các quá trình xử lý (đốt) rác thải, trong khói thuốc lá Xét về độc tính, dioxin chỉ đứng sau các chất thải phóng xạ Thời gian bán huỷ của dioxin trong cơ thể người là 8 năm rưỡi, thậm chí lâu hơn

Tác động của dioxin gây hậu quả hết sức nghiêm trọng đối với môi trường sinh thái và đặc biệt là đối với sức khoẻ con người

Những hậu quả trên người và động vật do dioxin gây ra bao gồm: các bệnh ung thư, suy giảm miễn dịch, rối loạn chức năng thần kinh, quái thai, dị tật bẩm sinh và nhiều bệnh tật khác

Những năm gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của Sinh học phân tử và Công nghệ gen, người ta đã và đang làm sáng tỏ được nhiều vấn đề trong cơ chế phân tử của tác động tức thời (trực tiếp) cũng như hậu quả lâu dài tiếp theo (gián tiếp) của dioxin đối với cấu trúc và chức năng của các gen và sản phẩm của chúng (protein/enzym) Có thể phân biệt các tác động này theo 2 nhóm:

A Sự rối loạn về chức năng các gen

Theo các số liệu nghiên cứu từ nhiều năm của các nhà khoa học trên thế giới, dioxin tác động trực tiếp lên tế bào chủ yếu thông qua một chất (protein) thụ cảm (thụ thể) có tên là aryl hydrocarbon receptor (AhR) Ngoài ra, có thể tồn tại cơ chế tác động khác (không qua AhR)

Tuy nhiên, cơ chế tác động thông qua AhR đã được nghiên cứu rất kỹ và

đã được khoa học thừa nhận Các nghiên cứu cho thấy khi tiếp xúc với dioxin, trong tế bào xảy ra sự biểu hiện tăng cường gen mã hoá AhR kèm theo các rối loạn về sự biểu hiện (thay đổi quá trình phiên mã - transcription) của hàng loạt gen tham gia vào quá trình điều khiển sự sinh trưởng của tế bào (cell growth control), cũng như các gen tham gia vào chu trình phân bào (cell cycle), như: TGF, cyclin A, c-myc

Thông qua AhR, dioxin hoạt hoá sự biểu hiện các gen, như: cytochrome P4501A1 (Cyp1A1), plasminogen activator inhibitor-2 (PAI-2)… Trong khi

đó, nó lại làm suy giảm (ức chế) biểu hiện gen mã hoá yếu tố sinh trưởng chuyển hoá TGF-beta2 (transforming growth factor -beta2) Kết quả là quá trình phân bào bị rối loạn gây nên các hậu quả tiếp theo rất đa dạng Dioxin làm thay đổi (ức chế, giảm biểu hiện) gen mã hoá glucose transporter- 4 (GLUT-4, protein vận chuyển đường glucose)

Đặc biệt nguy hiểm, dioxin tác động lên các gen của các tế bào sinh sản Nó bám vào chất thụ cảm hormone (hormone receptor) của tế bào, làm thay đổi chức năng và cơ chế di truyền của tế bào, gây ra hàng loạt hậu quả, như: dioxin làm thay đổi biểu hiện gen mã hoá 17-20 lyase Kết quả là lượng hormone của tế bào trứng như progesterone (P) và estradiol (E2) bị giảm dẫn

đến các hậu quả nghiêm trọng Dioxin tác động lên sự phát triển của tinh hoàn (gây teo) Có bằng chứng cho thấy, gen mã hoá Src kinase đóng vài trò quyết

định trong quá trình này Liên quan đến tác động của dioxin, một gen mới

được phát hiện mã hoá cho protein có tên là 25-Dx (thuộc siêu họ protein: cytokine/yếu tố sinh trưởng/chất thụ cảm prolactin) có thể gắn với progesterone (P), là chất thụ cảm của hormone này Tác động của dioxin lên các gen nhất định đôi khi còn phụ thuộc vào giới tính: chẳng hạn dioxin làm tăng hoạt tính tyrosine kinase (TK) ở con đực, trong khi lại làm giảm hoạt tính này ở con cái Dioxin có thể liên quan đến sự phát sinh và phát triển của nhiều bệnh ung thư, thông qua các thay đổi ở các gen quan trọng như p53, p27Kip1, p21/waf1, cdc2 p34 kinase và cdk4

Hiện nay, người ta đã thừa nhận: dioxin là chất gây ung thư!

B Tác động đột biến (độc gen - genotoxicity)

Mặc dù người ta vẫn cho rằng chưa có bằng chứng về đột biến gen trên người, các nghiên cứu trên chuột thực nghiệm xử lý dioxin cho thấy, khi xâm nhập vào tế bào, dioxin có thể chuyển hoá, tương tác với các protein-enzym và gen khác, gây nên các thay đổi trong DNA, dẫn đến các đột biến và thậm chí

tử vong sau 34 ngày

đặc biệt, thí nghiệm trên chuột còn cho thấy dioxin gây ra sự ôxy hoá các bazơ nitơ trong thành phần nucleic acid, chuyển đổi Guanosine thành 8- Hydroxydeoxyguanosine và quá trình sửa chữa phân tử sau đó không thành

công có thể dẫn đến sai lệch ở các vị trí của bazơ này trong gen (Shertzer et

al., 1998) Tình trạng bị ôxy thái quá (oxidative stress) (Shertzer et al.,

1998; Hong et al , 1998; Slezak et al., 2000; Hassoun et al., 2001) có thể

chính là một trong những cơ chế quan trọng gây ra những thay đổi gen (biến

dị và di truyền lại cho các thế hệ con cái) cần phải được tập trung nghiên cứu trên các nạn nhân bị nhiễm CĐDC

Giả thuyết về cơ chế phá huỷ DNA bởi dioxin thông qua việc tạo ra các

gốc tự do, và ảnh hưởng của quá trình sửa chữa DNA bị hỏng lên chu trình phân bào, sự phát sinh ung thư và đột biến gen được trình bày trên

Hình 1: Tác động của dioxin lên DNA thông qua việc tạo ra các gốc tự do

Sửa chữa DNA

Hoàn chỉnh

Không hoàn chỉnh

Ung thư và các bệnh di truyền DNA bị hỏng

Chết tế bào

Hình 2: Các ảnh hưởng của sự thay đổi DNA trong tế bào

Đây là cơ sở khoa học để chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu phân tích 3 gen quan trọng, bao gồm:

1 Gen mã hóa p53 (TP53), tham gia quá trình phân bào và áp chế

ung thư

2 Gen mã hóa Cyp1A1, tham gia chuyển hoá các chất độc

3 Gen mã hoá thụ thể Aryl Hydrocarbon (AhR), là yếu tố cảm ứng

dioxin

II.2 Tổng quan về các gen đã chọn

Gen m∙ hoá P53 - chất áp chế ung thư

Vai trò của P53: Người bảo vệ của genom (The guard of genome)

Khi kiểm tra thấy có sự sai hỏng DNA, p53 ngừng chu kỳ phân bào

tại các điểm/ trạm kiểm soát (checkpoint) và hoạt hóa các gen mã hóa các

enzym có chức năng sửa chữa sai hỏng DNA Nếu DNA được sửa chữa hoàn chỉnh, tế bào tiếp tục chu kỳ tế bào Còn nếu DNA không thể sửa chữa, tế bào

sẽ chết theo cơ chế chết theo chương trình (apoptosis)

Nếu p53 bị sai hỏng, hoặc mất chức năng, thì các tế bào mang DNA sai hỏng vẫn được nhân lên mang theo các đột biến có hại Đây là cơ chế gây ra ung thư Các nghiên cứu cho thấy hơn 50% trường hợp ung thư ở người là do

có sự sai hỏng của gen mã hóa p53 Và do đó p53 còn được gọi là chất áp chế

ung thư (Tumor suppressor)

Định vị tại locut 17p13 ở genom người

Cấu trúc của Gen p53

Khung đọc mở: 393 aa

Vùng gắn DNA đặc hiệu

Vùng oligomer hóa

Vùng phosphoryl hóa

Cơ chế cảm ứng p53 khi có sự sai hỏng DNA

Loại đột biến DNA cảm ứng: gẫy DNA tạo đầu bằng hoặc đầu dính tại

đầu 5' hoặc 3' Đột biến mất nucleotide ở một sợi không gây cảm ứng p53

Cơ chế tích luỹ p53 nội bào: 1) tăng hiệu quả dịch mã của mRNA p53

(theo cơ chế điều khiển sau phiên mã); 2) tăng độ bền (thời gian tồn tại)

protein p53 Vì rằng p53 có thời gian bán phân huỷ ngắn trong điều kiện bình

thường (5-20 phút) và cơ chế phân huỷ p53 là 1 quá trình tiêu dùng năng lượng theo con đường phân huỷ protein phụ thuộc ubiquitin

Cơ chế p53 ngăn cản chu kỳ tế bào tại các điểm/trạm kiểm soát (checkpoint): thông qua điều khiển phiên mã tăng hoặc giảm các gen có liên

quan

Điều khiển âm tính: p53 hạn chế quá trình phiên mã các gen thông

qua việc tương tác với các nhân tố phiên mã tạo thành phức hệ Phức hệ TBP (protein bám vùng TATA box promoter; là một tiểu đơn vị của nhân tố phiên mã TFIID), phức hệ p53-SP1-CBF (nhân tố bám promoter CCAAT)

p53-Điều khiển dương tính: p53 tăng cường phiên mã một số gen bằng

cách tương tác trực tiếp với vùng DNA gắn đặc hiệu với p53 Ví dụ: gen p21kip, GADD45 làm gián đoạn chu kỳ tế bào; gen Mdm2(Hdm2) khôi phục chu kỳ tế bào và gây tác dụng phản hồi (feedback) ức chế p53

Sự chết tế bào theo chưong trình (apoptosis)

Đây là một quá trình phức tạp thông qua nhiều con đường trao đổi kết quả là gây chết một tế bào nhất định và loại bỏ nó mà không gây các thương tổn mô và viêm nhiễm Quá trình này đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa mối cân bằng giữa sự sinh sản và sự chết của tế bào và được điều khiển bởi nhiều cơ chế khác nhau

Một trong các cơ chế gây chết tế bào là cơ chế phụ thuộc p53 Cơ chế này có mặt ở nhiều loại mô và có tính phụ thuộc loại mô Cơ chế giả định là p53 ức chế phiên mã gen Bcl-2 (nhân tố quy định sự tồn tại của tế bào chống lại apoptosis) và đồng thời tăng cường phiên mã gen Bax (tác nhân ức chế Bcl- 2)

Protein p53 được tổng hợp ở tất cả các loại mô tế bào và có tính bảo thủ cao trong quá trình tiến hóa Mặc dù không phải là phân tử thiết yếu cho sự tồn tại của tế bào nhưng p53 đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc duy trì

sự ổn định tính di truyền ở mức độ tế bào Điều này là vô cùng quan trọng vì rằng những thương tổn về di truyền sẽ gây ra sự phát triển của các khối u và gây ung thư Vai trò quan trọng của p53 như là một chất áp chế ung thư đã

được khẳng định thông qua nghiên cứu thống kê cho thấy tỷ lệ trong 6 người

bị suy giảm chức năng p53 thì 1 người bị phát triển bệnh thành ung thư

Protein p53 được hoạt hóa khi có sự thương tổn DNA và hoạt động như

là nhân tố phiên mã, có thể gắn với vùng DNA đặc hiệu (vùng tương tác p53)

và tăng cường phiên mã của các gen đích Trong trường hợp này, p53 hoặc gây gián đoạn chu kỳ tế bào hoặc cảm ứng sự apoptosis Cả 2 chức năng này

đều bảo vệ tế bào chống lại việc nhân và khuyếch đại các đột biến DNA trong quần thể tế bào

Sự tổn thương DNA và phản ứng của p53

Thông thường, sự gẫy phân tử DNA mạch đôi có thể gây phản ứng p53

Điều này được chứng minh bằng thí nghiệm vi tiêm một lượng nhất định phân

tử DNA vào nhân của các tế bào nuôi cấy bình thường Bằng việc sử dụng các phân tử DNA mang những đột biến nhất định, người ta đã chứng minh rằng các đứt gẫy phân tử DNA tạo đầu bằng hoặc đầu nhô 3’ hoặc 5’ đều có tác dụng gây phản ứng p53 như nhau Ngược lại, sự mất nucleotide trên một sợi

đơn thì không hoạt hóa và khởi phát phản ứng

Nồng độ p53 nội bào tăng lên tương ứng với thương tổn DNA Điều này không phụ thuộc vào quá trình phiên mã của gen mã hóa p53 mà liên quan

đến cơ chế điều hòa sau phiên mã, làm tăng hiệu quả dịch mã của các phân tử mRNA đã được tổng hợp Cơ chế điều hòa sau phiên mã rất quan trọng trong

điều hòa tổng thể sự biểu hiện của gen và đặc biệt cho phép phản ứng nhanh hơn so với điều hòa phiên mã Quá trình này liên quan đến tương tác protein- mRNA nội bào nhưng cơ chế cụ thể làm tăng nồng độ protein p53 thì chưa

được làm sáng tỏ

Tính ổn định của protein cũng có thể góp phần làm tăng nồng độ p53 tương ứng với các thương tổn DNA Phân tử p53 thông thường có thời gian tồn tại ngắn, với thời gian bán phân huỷ khoảng 5-20 phút tuỳ thuộc loại tế bào

Sự phân huỷ protein là một quá trình tiêu dùng năng lượng và có thể liên quan

đến hệ thống phân huỷ protein thông qua ubiquitin Điều này tương đồng với

sự tăng đột ngột nồng đột và giải thích sự tích luỹ p53 trong các tế bào khi thiếu hụt các thành phần của con đường ubiquitin

Cảm ứng sự gián đoạn chu kỳ phân bào

Việc tăng nồng độ protein p53 khởi phát hàng loạt phản ứng nội bào khi

có sự thương tổn DNA Sự biểu hiện của một gen đích đặc hiệu có thể được tăng cường hoặc áp chế phụ thuộc vào loại promoter điều khiển gen đó

áp chế biểu hiện gen: Các gen được điều khiển bởi các nhân tố phiên mã thì có thể bị áp chế sự biểu hiện Trong một số trường hợp, đó là kết quả

khi protein p53 tạo phức hợp với các nhân tố phiên mã này và làm bất hoạt hoá chúng Các gen bị áp chế bởi p53 bao gồm các gen bị điều khiển bởi promoter TATA; sự áp chế là do p53 gắn với TBP-protein bám hộp TATA, một tiểu đơn vị của nhân tố phiên mã TFIID Các nghiên cứu in vitro cho thấy tương tác p53-TBP ngăn cản sự phiên mã của các promoter rất nhỏ Các vùng chức năng nằm phía hai đầu phân tử protein p53 có thể tương tác với các vùng chức năng của TBP Protein E1A của adenovirus có thể phá vỡ mối tương tác p53-TBP qua đầu C của phân tử p53 và làm hạn chế quá trình ức chế phiên mã của p53

P53 cũng tương tác với các nhân tố phiên mã khác như nhân tố bám hộp CCAAT (CBF) và SP-1 Điều này chứng tỏ p53 áp chế sự phiên mã của những nhóm gen nhất định bằng việc phong toả các nhân tố phiên mã tương ứng của những gen này

Vùng bám DNA đặc hiệu:

Việc bám DNA đặc hiệu và sự hoạt hóa phiên mã là vai trò cơ bản của chất áp chế ung thư - p53 bình thường Protein p53 là phân tử tạo thành bởi các vùng chức năng (modular) và vùng gắn DNA đã được xác định là nằm với domain trung tâm phân tử Sự hoạt hóa phiên mã của p53 được điều khiển bởi

sự tương tác với nhân tố hoạt hóa đồng thời TAF40 và TAF60 (nhân tố liên kết TBP)

Vùng trình tự gắn đặc hiệu p53 được nghiên cứu kỹ nhất là đoạn DNA

chứa 2 lần lặp lại trình tự 5’PuPuPu[A/T][T/A] GpyPyPy 3’ Mỗi đoạn lặp

lại tiêu biểu cho 1 phần tương tác in vivo, mỗi nửa tương tác này có thể cách

nhau một chuỗi Nucleotide mà vẫn có thể gắn với p53 Phương pháp xác định khối lượng bằng kính hiển vi điện tử quét (STEM) đã cho thấy p53 tương tác với vùng DNA đặc trưng thông qua tetramer, bằng cách tạo liên kết giữa 4 phân tử p53 đã tạo thành một vòng uốn DNA Việc tetramer p53 gắn với DNA

được chứng minh lần đầu tiên bằng các nghiên cứu in vitro phân đoạn kích

thước và phân tích sự xê dịch băng điện di trên gel (gel shilf) Tuy nhiên, các

diễn biến trong tế bào thực tế có thể phức tạp hơn nhiều vì mỗi monomer

p53 đều có chức năng tăng cường phiên mã kiểu trans mặc dù không gắn

với DNA trong nghiên cứu in vitro

Sự gắn với vùng DNA đặc hiệu của p53 phụ thuộc vào cấu hình protein Dạng 1620+ (phản ứng với kháng thể đơn dòng Pab1620 phụ thuộc cấu hình) tương ứng với chức năng áp chế ung thư của p53, và đóng vai trò quyết định

đối với việc gắn với vùng DNA bảo thủ p53-CON in vitro Các thí nghiệm đối

kháng cho thấy p53 chuột có thể thay thế cho p53 người (hp53) trong phức hệ p53-DNA Điều này tương ứng với khả năng gắn của chuột p53 cao hơn hp53 trong phức hệ p53-DNA tại một nhiệt độ nhất định Các oligomer giữa p53

người và chuột cũng có thể gắn với DNA trong in vitro, và ái lức liên kết đã

được xác định vào khoảng 5x10-10M tương tự với ái lực của các oligomer của p53 người và chuột riêng rẽ

Đột biến mất chức năng của p53

Cho đến nay người ta đã biết đến 18584 đột biến khác nhau của gen P53 ( http://www.rubic.rdg.ac.uk/p53/analysis/ ) Một đột biến điểm vô nghĩa cũng có thể làm mất chức năng áp chế ung thư của p53 Trong các tế bào của người bị ung thư, gen p53 dường như cực kỳ nhạy cảm với các đột biến điểm nằm trong vùng lõi trung tâm (vùng gắn DNA) Thực tế, p53 được coi là gen

bị đột biến thường xuyên nhất trong quần thể người bị ung thư mà không phụ thuộc loại ung thư nào

Trong các tế bào ung thư, việc mất chức năng của một allen thường liên quan đến đột biến vô nghĩa trên allen kia Mặc dù các đột biến thường tập trung chủ yếu trên 25% của vùng mang mã, nhưng trong thực tế có rất nhiều các vùng nóng đột biến Các điểm nóng đột biến thì liên quan đến các loại ung thư đặc trưng Ví dụ, các codon 175, 248 và 273 là các điểm nóng đột biến thông thường tạo nên đột biến vô nghĩa, tuy nhiên bệnh ung thư carcinoma trên tế bào gan khi phơi nhiễm aflatoxin B thì thường liên quan đến đột biến tại codon 249 Các đột biến của gen p53 trên tế bào dòng tinh thường liên quan đến bệnh ung thư bẩm sinh còn gọi là hội chứng Li-Fraumeni

Ngoài các đột biến, protein p53 cũng có thể bị bất hoạt bởi các tương tác protein-protein đặc hiệu (ví dụ mdm-2) và các protein được mã hóa bởi DNA của virus gây ung thư biến nạp vào trong tế bào Thực tế, hiện tượng này gây ra khái niệm coi p53 là protein nội bào tạo phức hệ với kháng thể T lớn của virus SV40 gây ung thư ở người Protein E1B của các adenovirus loại 5 và E6 trong nhóm 16 và 18 của các virus gây ung thư u nhú ở người (HPV-16 và

-18) cũng tương tác với protein p53 kiểu dại Các protein E1B và kháng thể T lớn dường như tạo các phức hệ tương đối bền với p53 Ngược lại, HPV E6 làm p53 bị thuỷ phân nhanh chóng vởi hệ thống phụ thuộc ubiquitin

Chức năng của p53 thường rất nhạy cảm với các đột biến vô nghĩa và

điều này đã được làm sáng tỏ khi vùng chức năng lõi trung tâm nơi đóng vai trò liên kết với DNA đích được xây dựng mô hình cấu trúc bằng phương pháp tinh thể tia X Người ta đã xác định rõ ràng các đột biến gây mất chức năng bám DNA và các đột biến làm thay đôỉ cấu trúc không gian của protein p53

Mô hình cấu trúc phân tử đã chỉ ra rằng vùng chức năng bám DNA của p53 khác so với các protein bám DNA khác ở chỗ nó có cấu trúc tương đối

mở, đòi hỏi tạo thành cấu trúc kẹp kiểu sandwich B để định vị và định hướng các thành phần cấu trúc tương tác với DNA Cấu trúc kẹp B này tạo thành một nếp gấp dạng vòng-tấm-xoắn và tạo 2 vòng loop L2 và L3 Cấu trúc này được

định hướng và ổn định nhờ các tương tác của các chuỗi bên và sự tương tác 4 tiểu phần dạng nguyên tố kẽm (Zn) (thông qua 3 Cys và 1 His) Sự định hướng này có tính thiết yếu vì dạng vòng-tấm-xoắn và vòng loop L2, L3 tạo thành bề mặt gắn DNA của p53 Việc nhận diện vùng DNA đặc hiệu liên quan

đến cả các rãnh lớn và rãnh nhỏ của vùng DNA đích

Các đột biến vô nghĩa xảy ra trên khắp vùng liên kết với DNA với các

điểm nóng ở codon 175, 248 và 273 đều mã hóa arginine Mô hình cấu trúc tinh thể đã chỉ ra rằng các tương tác chuỗi bên của Arg175 có vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu hình đúng (cấu trúc không gian cấp 4) cần thiết cho việc gắn với DNA đặc hiệu Đột biến ở vị trí này làm mất tính ổn định của cấu trúc bậc 4 của p53 dẫn đến mất khả năng bám DNA và khả năng áp chế ung thư Đột biến thay thế Arg248 và Arg273 cũng gây mất khả năng bám DNA, nhưng trong trường hợp này không làm sai hỏng cấu trúc bậc 4 của p53 nên chứng tỏ rằng các vị trí này là nơi tương tác trực tiếp với phân tử DNA

Tóm lại, các đột biến cấu trúc làm sai hỏng cấu trúc bậc 4 của p53 nên mất tính bám DNA; trong khi đó các đột biến liên kết DNA là các đột biến sai

hỏng tại các axit amin quan trọng liên kết trực tiếp với DNA nên không làm sai hỏng cấu trúc không gian

P53 là một protein đa chức năng

Tính đa chức năng của p53 được giải thích một phần thông qua lịch sử nghiên cứu protein này Đầu tiên, p53 được coi là tác nhân gây ung thư nhưng

cuối cùng lại là chất áp chế ung thư Trong thực tế, dạng p53 kiểu dại có 3 dạng cấu trúc không gian khác nhau (phân biệt bằng phép lai miễn dịch) mỗi loại tương ứng với một kiểu chức năng điều khiển sự phát triển của tế bào Các dạng cấu trúc khác nhau có thể là do kết quả của: 1) sự thay đổi cấu hình bổ sung, 2) sửa đổi sau phiên mã, 3) tổ hợp khác nhau các exon trong mRNA (alternative splicing)

Tính linh động cấu trúc không gian là các cơ chế phân tử cho phép một protein có thể thực hiện các chức năng khác nhau Đặc tính này có thể là do các cơ chế điều hòa hoạt động p53 trong các phản ứng phát triển bình thường của tế bào và dường như đây là đặc tính cơ bản của p53 kiểu dại Người ta cũng cho rằng rất nhiều đột biến cấu trúc có thể giữ vững ổn định cấu hình của

p53 khi có phản ứng kích thích sinh trưởng tế bào Các nghiên cứu in vivo cho

thấy cấu trúc của p53 là đối tượng tấn công của các chất độc và của nguyên tố

Đồng, một kim loại độc Người ta giả thuyết rằng các cơ chế này điều khiển các cơ chế điều hòa nội bào cấu hình p53 để phản ứng tế bào với các tín hiệu

điều khiển sự sinh trưởng của tế bào và cũng phản ứng với các thương tổn DNA

Các sửa đổi sau phiên mã chủ yếu đối với protein p53 là sự phosphoryl hóa, và có các vị trí khác nhau tương ứng với các kinase đặc hiệu nằm ở đầu N

và đầu C của protein p53 Quá trình phosphoryl hóa có thể có hiệu quả quyết

định lên cấu hình protein Mặt khác, cơ chế này có thể tác động lên p53 theo các cách khác ví dụ như sự hoạt hóa của các hoạt tính gắn DNA đặc hiệu

Với các vị trí phosphoryl hóa phức nằm trên p53 và bản chất động lực của phản ứng phosphoryl hóa/ dephosphoryl hóa, phân tử p53 có các cơ chế thực hiện các chức năng là nhiệm vụ vô cùng quan trọng Người ta đã thu

được các bằng chứng gián tiếp như là quá trình phosphoryl hóa liên quan đến phản ứng tế bào đối với sự thay đổi DNA, và p53 được biết là cơ chất của các enzym kinase DNA-PK và JNK Một thí nghiệm quan trọng là hoạt tính DNA-PK liên quan đến quá trình sửa chữa những đứt gẫy của sợi kép DNA Tuy nhiên, vai trò của quá trình phosphoryl hóa phân tử p53 vẫn chưa được nghiên cứu rõ ràng

Cơ chế cắt gắn luân phiên của p53 chuột đã được nghiên cứu và cho thấy có sự thay thế 17 aa mới tại vị trí 26 aa nằm ở đầu C của phân tử p53 chưa cắt gắn Người ta đã xác định được 2 phân tử protein khác nhau trên tế

bào biểu mô của chuột và có thể được điều hòa khác nhau tuỳ thuộc thời điểm trong chu kỳ tế bào Sự khác biệt về chức năng giữa 2 biến dị của p53 do cắt gắn là ở chỗ phân tử p53 bị cắt gắn luân phiên không thể bám tốt lên sợi đơn ARN hoặc phân tử DNA

Tổng kết

Phân tử p53 kiểu dại bằng cách nào đó đã nhạy cảm và phản ứng đối với những sai hỏng DNA Phản ứng này gây ra sự tích luỹ protein p53 theo cơ chế điều khiển sau phiên mã Phân tử p53 tác động đến quá trình phiên mã của nhiều gen, hoặt bằng cách tương tác với các protein liên quan đến quá trình

điều hòa phiên mã của gen đó, hoặc bằng cách bám trực tiếp với phân tử DNA

và hoạt hóa kiểu trans gen đó Phân tử p53 hoặc gây ra sự gián đoạn chu kỳ tế bào hoặc gây apoptosis tuỳ thuộc loại tế bào Bằng cách ngăn chặn sự tăng sinh của các tế bào bị sai hỏng DNA, phân tử p53 đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc duy trì tính toàn vẹn của DNA và áp chế ung thư

Việc mất chức năng của p53 có liên quan đến sự phát triển của hơn nửa bệnh ung thư ở người, và p53 cũng là đối tượng nghiên cứu của các liệu pháp chống ung thư mới Một hướng nghiên cứu là sử dụng liệu pháp gen để duy trì cấu trúc kiểu dại của p53 Các lĩnh vực nghiên cứu trong tương lai quan trọng

để phát triển các liệu pháp chống ung thư liên quan p53 là việc xác định các cơ chế p53 phản ứng được tự hoạt hóa như thế nào khi có sự thương tổn DNA,

và xác định các cơ chế quyết định khi nào thì p53 làm gián đoạn chu kỳ tế bào, khi nào gây chết tế bào Nhiều nghiên cứu cho thấy p53 có khả năng áp chế ung thư Tuy nhiên, có bằng chứng cho thấy p53 là đa chức năng và thậm chí có chức năng kích thích sự sinh trưởng của tế bào Các hiểu biết đầy đủ về chức năng của p53 sẽ có ứng dụng đối với các bệnh liên quan đến ung thư, tái sinh và sửa chữa mô

Gen Cyp1A1/ Cytochrome P450

Các protein Cytochrome P450 ở người là các enzym chuyển hóa thuốc

và các enzym này được sử dụng để tổng hợp các phân tử cholesterol, steroid

và phân tử lipid quan trọng khác như prostacyclin và thromboxane A2 Hai chất này là sản phẩm trung gian của quá trình tổng hợp arachidonic acid Các

đột biến xảy ra trên các gen mã hóa cytochrome P450 hoặc sự thiếu hụt protein này là tác nhân gây một số bệnh nghiêm trọng ở người Ngoài ra, việc

cảm ứng một số gen P450 khác lại là nguyên nhân gây ra một số dạng ung thư vì các enzym này tham gia chuyển hóa các chất tiền gây ung thư thành các chất gây ung thư

Tên gọi cytochrome P450 là do các protein này đều chứa nhân Hem

và có một phổ hấp thụ đặc trưng Các protein cytochrome P450 ở động vật có

vú thường là protein bám màng Chúng được phát hiện lần đầu tiên tại thể microsome ở gan chuột Thể microsome là các thể tan đục được tạo thành khi nghiền nhỏ các tế bào và phân lập các cấu trúc màng vẫn hòa tan trong khi phần cặn tế bào và ty thể được lắng xuống Hỗn hợp này rất đục khi quan sát trên kính hiển vi quang học bởi vì chúng rất kém tán sắc Cách duy nhất để xác định phổ hấp thụ của các chất này là sử dụng thiết bị đặc biệt với phần tiếp nhận ánh sáng rất gần với cuvette và sử dụng một nguồn sáng gián đoạn trên các kính hiển vi khác nhau Bằng cách này các tạp chất gây nhiễu xạ khác

có thể được phân tách Trong hệ thống này, các thể tan có tính khử cao này

được phản ứng với khí CO trong cuvette sẽ cho một phổ hấp thụ tương đối mạnh ở bước sóng 450nm (do đó được gọi là P450 với P nghĩa là sắc tố, pigment) Đây được gọi là phổ biệt hóa CO khử Các phân tử CO liên kết chặt chẽ với nhân Hem chứa sắt sẽ cho 2 phổ hấp thụ khác nhau ở 2 cuvette khác nhau Phổ này được quan sát lần đầu tiên vào năm 1958

Các protein chứa nhân Hem khác không có tính chất đặc biệt này Nguyên nhân cytochrome P450 lại hấp thụ tại phổ này là do sự hình thành liên kết đặc biệt tại nhân Hem chứa ion sắt Bốn liên kết của sắt được hình thành với các nguyên tử N trong vòng Hem Do đó, nguyên tử Fe còn có khả năng tạo thêm 2 liên kết nữa phía trên và dưới mặt phẳng liên kết Trong các phân

tử cytochrome P450, liên kết thứ 5 tạo thành với anion lưu huỳnh (S-) Nguyên

tố S là từ cysteine tại vị trí bảo thủ trong trung tâm hoạt động của enzym

Cấu trúc tinh thể nhiễu xạ tia X của các phân tử P450 ở hơn mười loại vi

khuẩn đã được xác định (CYPs 51 [Mycobacterium], 55A1, 101A1, 102A1,

107A1 [eryF], 111A1, 119A1, 121A1 [P450Mt2], 152, 175A1) Các protein này có tính tan cao trong khi các protein P450 ở sinh vật nhân chuẩn lại có liên kết với màng Cấu trúc này tương tự như các bào quan có cấu trúc màng khác và có thể các protein này có các domain bám màng Protein cytochrome

P450 đầu tiên được làm tinh thể là từ Pseudomonas putida, một loại vi khuẩn

có khả năng sử dụng long não làm nguồn carbon duy nhất Chủng vi khuẩn

này được phát hiện trên đất dưới các cây long não Các protein này có hình dạng kiểu tam giác với nhân Hem được ẩn sâu bên trong Cấu trúc này cho phép ngăn cản bất cứ phân tử cơ chất hoặc sản phẩm, kể cả các phân tử nước

có thể tiếp xúc hoặc tách ra khỏi trung tâm hoạt động Do đó, người ta giả thuyết rằng có các cơ chế thay đổi cấu trúc các phân tử này để có thể mở một

số điểm tại các vị trí xúc tác Phần lớn của enzym này có cấu trúc giàu xoắn

α, phần còn lại là có cấu trúc nếp gấp β và các cấu trúc không lặp lại khác Các phân tử P450 của động vật có vú cũng có cấu trúc bậc hai tương tự nhưng

ở đầu N có miền (domain) bám màng Khi đầu N được loại bỏ khỏi phân tử protein thì nó vẫn liên kết với màng Protein CYP2C5 ở động vật có vú đã

được tinh thể hóa sau khi loại bỏ đoạn bám màng ở đầu N và thay thể trình tự

kỵ nước bên trong bằng đoạn peptid có tính tan cao hơn Cấu trúc nhiễu xạ tia

X của phân tử tinh thể này đã được xác định (Williams et al 2000) Bản mô

tả ngắn gọn các đặc điểm chính của phân tử này đã được công bố trước đó Cấu trúc này tương đồng với các cấu trúc enzym P450 tan của vi khuẩn nhưng

có một số khác biệt rõ rệt

Ngành công nghiệp dược phẩm rất quan tâm đến các cấu trúc tinh thể của P450 khi tạo phức với các dược phẩm, dựa trên đó người ta có thể cải tiến các dược phẩm này Ví dụ như sự thoả thuận giữa công ty dược hàng đầu thế giới AstraZeneca với công nghệ Astex nhằm xác định cấu trúc tinh thể của phức hợp các protein P450 người với các dược phẩm của công ty Việc ứng dụng các công nghệ của Astex để xác định cấu trúc 3 chiều của các enzym cytochrome P450 khi tạo phức với các hợp chất sẽ thúc đẩy nhanh quá trình cải thiện các hợp chất có dược tính và tăng cường khả năng điều trị lâm sàng của các dược phẩm này

Các protein cytochrome P450 xúc tác cho nhiều loại phản ứng nhưng quan trọng nhất là các phản ứng hydroxyl hóa Các enzym này gọi là các enzym oxy hóa đa chức năng hoặc các monooxygenase, bởi vì chúng phân tách một nguyên tử oxygen ra khỏi cơ chất và giải phóng nước Chúng khác với các dioxygenase có chức năng giải phóng phân tử oxygen

Các chất hóa học hoặc dược phẩm thường được gọi là các chất ngoại sinh Các cytochrome P450 đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi các chất ngoại sinh, được biệt là các dược phẩm có tính kỵ nước Quá trình trao đổi của các hợp chất này thường tiến hành theo 2 phase Trước tiên, quá

trình gắn một gốc chức năng có tác dụng như một vật nối với cơ chất Phản ứng này tạo ra các chất sửa đổi có tính tan tốt hơn do đó nó có thể chiết bằng dung dịch ure Rất nhiều P450 xúc tác phản ứng gắn gốc hydroxyl trong phase

I của phản ứng trao đổi thuốc Sau đó, gốc hydroxyl sẽ đóng vai trò như vị trí xảy ra các phản ứng tiếp theo trong phase II

Để có thể tiến hành các phản ứng xúc tác, các cytochrome P450 cần một nguồn cung cấp electron Việc bổ sung 2 electron (quá trình khử) vào nhân Hem chứa sắt sẽ làm dễ dàng phá vỡ liên kết giữa O-O Các electron

được cung cấp bởi một protein liên kết trực tiếp với P450 và truyền electron từ nhóm ngoại của protein Việc trao đổi electron giữa các protein này được gọi

là chuỗi truyền điện tử và nó tương tự với chuỗi phản ứng của phức hệ I đến

Trong ty thể, chuỗi truyền điện tử dài hơn Ferredoxin (còn gọi là adrenodoxin của tuyến thượng thận, nhưng 2 protein này được mã hóa bởi 2 gen khác nhau) là chất cho electron trực tiếp cho P450 ở ty thể (CYP11A1, CYP11B1, CYP11B2, CYP24, CYP27A1, CYP27B1, CYP27C1) Ferredoxin

có nhóm sulfur sắt thay thể flavin Tuy nhiên, ferredoxin bị khử bởi ferredoxin reductase (còn gọi là adrenodoxin reductase) chứa nhân flavin NADPH là nguồn cung cấp electron sau đó truyền đến ferredoxin reductase, ferredoxin và tới P450 Một số P450 cũng nhận electron từ cytochrome b5 Đây là một protein nhỏ cũng chứa nhân Hem và vùng liên kết màng và cần một đương lượng khử từ NADH

Hình 3: Sơ đồ cơ chế hoạt động của Cytochrome P450

steroid nucleus (1 thà

tein cytochrome P450 ở người chia làm 18 lớp và 43 dưới lớp

CYP1 trao đổi dược phẩm (3 dưới lớp, 3 gen, 1 pseudogene)

CYP2 trao đổi dược phẩm và steroid (13 dưới lớ

CYP3 trao đổi dược phẩm (1 dưới lớp, 4 gen, 2 pseudogenes)

CYP4 trao đổi arachidonic acid hoặc acid béo

udogenes)

CYP5 Thromboxane A2 synthase (1 dưới lớp, 1 gen)

CYP7A bile acid biosynthesis 7-alpha hydroxylase of

nh viên dưới lớp )

CYP7B 7-alpha hydroxylase dạng đặc hiệu não (1 dưới lớp)

CYP8A prostacyclin synthase (1 thành viên

CYP8B bile acid biosynthesis (1 thành viên dưới lớp)

CYP11 steroid biosynthesis (2 dưới lớp, 3 gen)

CYP17 steroid biosynthesis (1 dưới lớp, 1 gen) 17-alpha hydroxylase

CYP19 steroid bios

in D degradation (1 dưới lớp, 1 gen) CY

ưới lớp, 1 gen, 3 pseudogenes) lanosterol

ược trình tự của 57 gen CYP và 47 pseudogenes.

20, 21A1P, 21A2, 24, 26A1, 26B1, 26C1, 27A1, 27B1, 27C1, 39,

ACTH ACTH kích thích sự tạo thành

một protein liên kết là PPAR (peroxisome proliferator activated receptor) Khi

P21 steroid biosynthesis (1 dưới lớp, 1 gen, 1 pseudogene)

CYP24 vitam

P26A retinoic acid hydroxylase important in development (1 dưới lớp)

CYP26B probable retinoic acid hydroxylase (1 dưới lớp)

CYP26C probabvle retinoic acid hydroxylase (1 dưới lớp)

CYP27A bile acid biosynthesis (1 dưới lớp)

CYP27B Vitamin D3 1-alpha hydroxylase activates vitamin D3 (1 dưới lớp) CYP27C không rõ chức năng (1 dưới lớp)

CYP39 7 alpha hydroxylation of 24 hydroxy cholesterol (1 dưới lớp)

CYP46 cholesterol 24-hydroxylase (1 dưới lớp)

CYP51 cholesterol biosynthesis (1 d

14-alpha demethylase

Người ta đã xác định đ

1A1, 1A2, 1B1, 1C1P, 2A6, 2A7, 2A7PT (telomeric), 2A7PC(centromeric), 2A13, 2A18P, 2B6, 2B7P1, 2B7P2, 2B7P3, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2D7AP, 2D8P, 2E1, 2F1, 2F1P, 2G1P, 2G2P, 2J2, 2R1, 2S1, 2T2P, 2T3P, 2U1, 2W1, 3A4, 3A5, 3A5P1, 3A5P2, 3A7, 3A43, 4A11, 4A20, 4A21P, 4A22, 4B1, 4F2, 4F3, 4F8, 4F9P, 4F10P, 4F11, 4F12, 4F22, 4F23P, 4F24P, 4F25P, 4F26P, 4F27P, 4F28P, 4V2, 4X1, 5A1, 7A1, 7B1, 8A1, 8B1, 11A1, 11B1, 11B2, 17, 19,

46, 51, 51P1, 51P2, 51P3

P: pseudogene

Cảm ứng biểu hiện enzym P450

Các enzym P450 có các cơ chế điều hòa biểu hiện gen khác nhau Một

số gen này có thể được cảm ứng phiên mã bởi một tín hiệu hóa học Các hormone steroid được điều chỉnh chặt chẽ bởi các tuyến nội tiết Một trong những hormon cảm ứng biểu hiện các gen P450 là hormone tuyến giáp trạng

cAMP, chất này đóng vai trò là chất truyền tin thứ hai thông qua việc hoạt hóa các protein kinase, enzym xúc tác cho quá trình phosphoryl hóa các protein khác làm tăng quá trình phiên mã của gen

Một dạng điều hòa gen P450 khác là thông qua các chất tăng sinh cấu trúc peroxisome như clofibrate Các chất dược phẩm này hoạt động thông qua

các chất dược phẩm liên kết với các protein này thì nó sẽ di chuyển vào nhân, tạo phức với thụ thể retinoid X (RXR) và liên kết với trình tự DNA đặc trưng trong

Các thành viên trong họ protein CYP1 được cảm ứng bởi các hydrocarbon có vòng thơm Sự hoạt hóa này liên quan đến một thụ thể đặc

hiệu được gọi là thụ thể hydrocarbon thơm (aryl hydrocarbon receptor)

Protein thụ thể này liên

chuyển vào nhân để hoạt hóa quá trình phiên mã của gen nếu thiếu một protein vận c

protein này liên kết với nhau và tạo liên kết với phân tử DNA để hoạt hóa quá trình phiên mã

Một số hóa chất khác cũng cảm ứng P450 Ethanol cảm ứng các enzym CYP2E Phenobarbital cảm ứng các enzym CYP2B ở chuột lên 40-50 lần thông qua một thụ thể gọi là CAR CAR cũng tạo dimer với RXR như thụ thể PPAR Phức hệ này liên kết với trình tự phản ứng phenolbarbital trên phân

tử DNA để hoạt hóa các gen Đặc điểm chung của quá trình cảm ứng các enzym P450 này chứng tỏ chức năng của P450 trong việc giải độc cơ thể trước các hóa chất ngoại lai

năng của các nhóm cytochrome P450 ở người và các bệnh liên quan khuyết gen

Lớp protein CYP1 của P450 có thể hydroxyl hóa estrogen (CYP1A2

và 1B1) và oxi hóa uroporphyrinogen thành uroporphyrin (CYP1A2) dưới tác dụng của nhân Hem, nhưng chúng có thể tương tác với một số cơ chất nội sinh chưa xác định Các enzym này được cảm ứng bởi một số hydrocarbon đa vòng

có thể có trong khói thuốc lá hoặc thực phẩm

uan tâm nghiên cứu vì chúng có thể có chức năng hoạt hóa các chất sinh ung thư Nồng độ cao CYP1A2 có thể liên quan đến bệnh ung thư trực tràng Vì CYP1A2 được cảm ứng bởi khói thuốc lá nên có thể có mối liên quan giữa khói thuốc là và bệnh ung thư trực tràng

Gen Cyp1B1 đã được phát hiện là liên quan đến bệnh tăng nhãn áp

bẩm sinh (Stoilov et al., 1997; Benjjani et al., 1998; Stoilov et al., 1998; Plasilova et al., 1999) Cơ chất thông thường của enzym này hiện chưa xác

định nhưng người ta cho rằng loại P450 này có thể đóng vai trò nhất định trong việc loại bỏ các phân tử truyền tin Khi thiếu hụt gen Cyp1B1, cơ thể sẽ

bị duy

thuộc lớp lớn nhất của protein P450 Khoảng 1 phần 3

h do tương tác vớ

tiêu hóa thức ăn thì cần một hệ thống giải độc được mã

óa trong DNA Đây là giả thuyết về cuộc đấu tranh giữa thực vật và động vật

Gen CYP2B được cảm ứng bởi các thuốc an thần ở chuột Đây là protein P450 đầu tiên đ

thường dùng để chữa các vết loét Tính đa hình của gen này gây ra triệu chứng

m khác biệt này có thể dẫn đến các phản ứng khác nhau đối

trì nồng độ cao các phân tử tín hiệu để dẫn đến bệnh tăng nhãn áp Phân tử tín hiệu có thể có bản chất là steroid

Protein CYP2C19 tham gia trao đổi omerprazole, một loại dược phẩm

kém chuyển hóa thuốc với tần số cao ở người châu á (23%) so với người Caucasians (3-5%)

Tính đa hình của các gen P450 liên quan đến khả năng chuyển hóa dược phẩm

Các điểm nucleotide đa hình quần thể người chiếm khoảng 1% genom Các điể

u c và gen mã hóa cytochrome P450 là y

om người Tính đa hình của gen CYP2C19 làm thay đổi

mephenytoin của enzym ở người Caucasians, tính đa hình của các kiểu hình kém chuyển ho

ếm tới 23%

CYP2D6 là protein P450 được nghiên cứu kỹ nhất về đa hình trao

m Hiện nay, người ta đã xác định được ít nhất 72 alen khác nhau của gen CY

ne, Trazadone, Fluoxe

idine, Oxycodone, Propoxyphene oxycodone thuộc nhóm oxycontin là loại thuốc thường được sử dụng chống nghiện

ảm ứng bởi các chất có nhóm alcohol Tính đa

này có thể tăng gấp đôi nguy cơ mắc ung thư niêm mạc mũi do khói thuốc lá

trong các nhóm enzym chuyển hóa thuốc quan t

ong gan người CYP3A4 đã được chứng minh là tham gia trao

u Những người kém chuyển hóa thuốc do không có khả năng loại bỏ các dược phẩm ra khỏi cơ thể nên có thể mắc một số triệu chứng phản ứng thuốc nguy hiể

P2D6

Các cơ chất của enzym CYP2D6 bao gồm

• Antiarrhythmics: Flecainide, Mexiletine, Propafenone

• Antidepressants: Amitriptyline, Paroxetine, Venlafaxi

tine (Prozac)

• Antipsychotics: Clorpromazine, Haloperidol, Thoridazine

• Beta-Blockers: Labetalol, Timolol, Propanolol, Pindolol, Metoprolol

• Analgesics: Codeine, Fentanyl, Meper

Gen CYP2E1 được c

ủa gen này chủ yếu phổ biến ở người Tru

nhóm enzym P450 thứ hai liên

• Taxol (thuốc chữa ung thư),

• Warfarin (chất chống đông máu)

CYP5 là các enzym thromboxane A2 synthase Thromboxane A2 là một loại acid béo trong chu trình chuyển hóa arachidonic acid Arachidonic

acid có thể được chuyển hóa theo 2 con đường: con đường thẳng để tạo ra các leukotriene và con đường vòng để tạo ra prostaglandins và thromboxanes Cá enzym đầu tiên của con đường vòng này là cyclooxygenase 1 và 2 Các enzym này bị ức chế bởi aspirin và các thuốc chống viêm không có bản chất là steroid Aspirin sẽ acetyl hóa serin trong enzym và làm ngăn cản quá trình liên kết với arachidonic acid Các nghiên cứu gần đây cho thấy COX2 được cảm ứng trong quá trình viêm COX1 là thành phần bổ sung Sự khác biệt này hứng tỏ chất ức chế đặc hiệu COX2 có thể ngăn cản quá trình viêm trong khi

COX1 như duy trì sự gắn kết của các

nh đông máu Prostacyclin thì

A) gồm 3317 bp được công bố trên các ngân hàng trình tự gen quốc tế (access number: D16354) Gen mã hoá AhR có

11 exon, trong đó có 10 exon đã được công bố

đã được mọi người thừa nhận Các nghiên cứu cho thấy khi tiếp xúc với dioxin, trong tế bào xảy ra sự biểu hiện tăng cường gen mã hoá AhR kèm theo các rối loạn về sự biểu hiện (thay đổi quá trình phiên mã-transcription) của hàng loạt gen tham gia vào quá trình điều khiển sự sinh trưởng của tế bào (cell growth control), cũng như các gen tham gia vào chu trình phân bào (cell

Cyp1A1 và nhiều gen khác (bảng 1)

c

không ảnh hưởng đến các chức năng của

tế bào niêm mạc dạ dày Sau phản ứng đầu tiên này, sản phẩm được phân nhánh theo hai con đường tuỳ thuộc vào loại enzym cytochrome P450 Một nhánh sẽ tổng hợp thromboxane A2 nhờ sự tham gia của CYP5, nhánh kia sẽ tổng hợp prostacyclin nhờ CYP8A1 Thromboxane A2 gây ra sự đông tiểu cầu

và đó là nguyên nhân tại sao aspirin ngăn quá trì

hoạt đọng theo hướng ngược lại Đây là một chất chống đông máu Quá trình acetyl hóa của COX1 và COX2 trong tiểu cầu cực kỳ quan trọng vì tiểu cầu không có nhân và không thể tái tạo lại các enzym bị ức chế

Thụ thể Aryl hydrocarbon

Thụ thể Aryl Hydrocarbon (Aryl Hydrocarbon Receptor, AhR) là

một protein thuộc Họ PAS, có trình tự 848 axit amin, khối lượng phân tử 96

147 Da Trình tự gen (mRNA/cDN

Cơ chế tác động của dioxin thông qua AhR đã được nghiên cứu rất kỹ

cle)… AhR là một trong yếu tố

B c động của chất thụ cảm (thụ thể) diox AhR)

gen Hướng điều khiển

NAD(P)H:Quinone oxidoreductase 1 +

γ-aminolevulinic acid synthase +

Prostaglandin Endoperoxide H synthase 2 +

Có khả năng có sự điều khiển của AhR

Plasminogene activator inhibitor-2 +

c-fos + Jun-B + c-jun + Jun-D + Keratinocyte transglutaminase +/ ư

Phosphophenolpyruvate carboxykinase ư

T ransforming growth factor β1 ư

Peroxisome proliferator-activated receptor γ ư

Epidermal growth factor receptor ư

III Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

1 Nguyên tắc chọn đối tượng

- Gia đình cựu chiến binh có tiền sử bị phơi nhiễm rõ ràng

- Các gia đình bị phơi nhiễm đặc biệt đã và đang sống tại các điểm nóng

ng và GS.TS Nguyễn Văn N

uế

ác mẫu được mã hóa theo quy ước riêng của chúng tôi như sau: [tên

tỉnh+số thứ tự của phả hệ].[tên địa phương: huyện, xã, phường + số thứ

tự mẫu] Các phả hệ ở mỗi tỉnh được đánh số độc lập theo thứ tự bắt đầu từ 1

tính theo thời gian Số thứ tự của mẫu ở mỗi tỉnh được đánh số liên tục bắt đầu

từ 1 Ví dụ: DoN1.TD3 = Tỉnh Đồng Nai 1, Phường Trung Dũng, mẫu số 3

Các hồ sơ liên quan đến đối tượng cung cấp mẫu đã được hệ thống và lưu trữ mật theo Quyết định của Bộ trưởng Bộ Công an

Mỗi cá thể được thu nhận từ 5 - 10 ml máu toàn phần đông tự nhiên Các mẫu máu được sử dụng khoảng 5 ml để tách chiết DNA genom và phần còn lại được bảo quản ở -80oC để xây dựng ngân hàng máu

(đã có xác định nồng độ dioxin trong máu)

- Cựu chiến binh hoặc thành viên gia đình bị 1 trong các bệnh đặc trưng

do dioxin hoặc bị di tật bẩm sinh

2 Đối tượng

Được sự hỗ trợ và chỉ đạo chung của PGS TS Nguyễn Văn Tường- Chủ nhiệm đề tài, cũng như sự giúp đỡ của GS Lê Bách Qua

guyên, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thu thập mẫu máu của các gia

đình có nạn nhân với nguy cơ bị phơi nhiễm và các thành viên trong gia đình

họ cư trú tại Hà Tây, Thái Bình, Đồng Nai và Thừa Thiên – H

C

HTa1.C3

HTa1.C4 HTa1.C2

CCB 1971-74 Đường 9 Nam Lào

U lympho không Hodgkin

SN 1982 Thoát vị bẹn (Dị tật bẩm sinh)

HTa1.C1

SN 1974 uyến yên, dị dạng xương Suy t

bàn tay, lùn bẩm sinh

CCB 1969-75 Quảng Trị, Nam Lào, Biên Hòa Rám mặt

978 Nứt đôi cột sống

m

ThB1.VT24 ThB1.VT22

Hình 5 : Sơ đồ phả hệ Thái Bình 1 theo bệnh lý

CCB 1971-73 đường 9 Nam Lào

1990 Câm, không đi được

PN§B

1945 TCDD:163,8 ppt

PN§B

1954 TCDD:271,1 ppt

PN§B

1980 TCDD:87ppt

PN§B

1985

PN§B 1918

PN§B 1954

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Hoá chất

- Các hoá chất dùng để tách DNA tổng số, DNA plasmid, các enzym giới hạn… của các hãng Amersham Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Sigma (Mỹ), Merk (Đức)

- Hoá chất dùng cho PCR: đệm, MgCl2, dNTPs, Taq DNA polymerase, của hãng Fermentas

- Bộ hoá chất TOPO TA Cloningđ Kit của hãng InvitrogenTM

- Bộ hóa chất sinh chuẩn BigDyeđ Terminator v3.1 Cycle Sequencing

- Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật: LB lỏng, LB đặc, SOC

và thu lại bằng li tâm

Quy trình

DNA tổng số được tách chiết từ dịch máu toàn phần, đông tự nhiên theo phương pháp của Russel và Sambrook, 2001 có sửa đổi, bao gồm các bước sau:

Bước 1: Các mẫu máu đông lạnh được làm tan trên đá và hòa trong đệm rửa PBS vài lần

Bước 2: Cặn tế bào bạch cầu sau khi ly tâm 6600 vòng/phút, 15 phút,

được phá màng trong dịch đệm (0,01 M EDTA, 0,01 M Tris-HCl pH 7,5; 0,1

M NaCl; 2,1% SDS và 100àl /ml protease K) trong 3 giờ ở 56 0C

Bước 3: Loại protein và tạp chất bằng phenol và phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) Li tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C Thu dịch ở pha trên

Bước 4: Loại phenol còn sót lại trong dịch chiết bằng chloroform: isoamyl alcohol (24: 1) Lặp lại bước này 1 - 2 lần

Bước 5: Tủa DNA bằng EtOH 100% ở -200C qua đêm Li tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C Rửa tủa bằng EtOH 70% Làm khô, hoà tan tủa trong

Quy trình

- Hoà 0,8 g agarose trong 100 ml TAE 1X, đun sôi trong lò vi sóng cho tan hoàn toàn Để cho nhiệt độ hạ xuống khoảng 500C, đổ vào khuôn có đặt sẵn răng lược thích hợp Đợi cho thạch đông và ổn định trong vòng 1 giờ Sau

đó bỏ răng lược ra và đặt gel vào hộp điện di Đổ đệm TAE 1X sao cho mức

đệm cao hơn mặt gel từ 1 - 2 mm

- Trộn một lượng mẫu thích hợp với đệm tra mẫu (glyxerol 20%;

Tris-Cl 0,1 M pH 8; EDTA 0,01 M pH 8; bromophenol blue 0,25%) Điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100V, dòng 60 - 80 mA, trong thời gian khoảng 30 phút

- Nhuộm gel bằng Ethidium bromide 10 àg/ml trong khoảng 10 phút và

đặt trên máy lắc, sau đó rửa sạch mẫu

- Quan sát và chụp ảnh trên máy GEL - DOC

3.3.3 Nhân gen bằng kỹ thuật PCR

Nguyên tắc

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt

để tổng hợp các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có các dNTP

và cặp mồi đặc hiệu Các đoạn DNA mới được tạo thành lại được sử dụng làm khuôn Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA khuôn được nhân lên gấp bội, nhờ vậy có thể có đủ số lượng phục vụ cho những mục đích nghiên cứu tiếp theo

Quy trình

Mỗi một chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn sau:

- Giai đoạn biến tính: DNA mạch kép ban đầu tách thành hai mạch đơn

nhờ nhiệt độ cao

- Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ thích hợp, hai mồi sẽ tự bám vào hai

đầu của đoạn DNA đích theo nguyên tắc bổ sung

- Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng được tăng lên

khoảng 70 - 800 C là nhiệt độ thích hợp để cho Taq DNA polymerase kéo dài chuỗi

PCR được tiến hành với thể tích là 25 àl gồm các thành phần sau: 500

ng DNA tổng số; 10 pM mỗi primer; 0,625 unit Taq DNA polymerase; MgCl22,4 mM; dNTP 1 mM và đệm tương ứng với chu trình nhiệt thông thường trên máy luân nhiệt GenAmpđ PCR System 9700 như sau: 940C - 3 phút, 30 chu

kỳ (940C - 30 giây, 480C - 30 giây, 720C - 1 phút 20 giây), 720C - 10 phút, sau

đó giữ ở 40C

3.3.4 Các kỹ thuật dùng cho tách dòng gen

* Phản ứng ghép nối gen vào vector tách dòng pCRđ 2.1-TOPOđ

Phản ứng ghép nối được thực hiện theo TOPO TA Cloningđ Kit của hãng InvitrogenTM Đây là phương pháp và bộ sinh hoá tiêu chuẩn được thiết

kế đặc biệt để tách dòng gen mong muốn được nhân lên bằng Taq DNA polymerase và trong thời gian ngắn (khoảng 10 phút) Phương pháp này cho phép gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector nhờ hoạt động của topoisomerase

Thành phần phản ứng bao gồm: 4 àl sản phẩm PCR, 1 àl dung dịch muối (gồm NaCl 200 mM; MgCl2 10 mM) và 1 àl vector Để hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng từ 30 giây tới 30 phút

* Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt

Hòa 3 àl sản phẩm của phản ứng ghép nối vào mỗi ống tế bào khả biến

đã được để trong đá khoảng 30 phút sau khi lấy ra từ -840C, giữ trong đá 30 phút Sốc nhiệt ở 420C trong 2 phút sau đó chuyển ngay xuống 00C và giữ trong vòng 5 phút Bổ sung 0,3 ml môi trường SOC, nuôi lắc ở 370C trong 1giờ Sau đó cấy trải trên đĩa môi trường bao gồm: LB đặc, Amp (50 àg/ml), X-gal (40 àg/ml), IPTG (40 àg/ml), nuôi qua đêm ở 370C

Thành phần các môi trường nuôi cấy vi sinh vật:

- Môi trường LB lỏng: Bacto - Tryptone 10 g/l; Yeast extract 5 g/l; NaCl 10 g/l; 1, NaOH 2 mM

- Môi trường LB đặc Bacto - Tryptone 10 g/l; Yeast extract 5 g/l; NaCl

10 g/l; 1, NaOH 2 mM; Bacto - Agar 15 g/l

- Môi trường SOC: Tryptone 5%; Yeast extract 0,5%; NaCl 10 mM; KCl 2,5 mM; MgCl2 10 mM; MgSO4 10 mM; Glucose 20 mM

* Phương pháp tách DNA plasmid

Khuẩn lạc trắng thu được sau khi biến nạp được cấy chuyển, nuôi cấy

lắc đêm tế bào E coli trong 2 ml môi trường LB lỏng có bổ sung Amp (50

àg/ml) ở 370C, 200 v/p Ly tâm dịch nuôi cấy trên ở 6000 v/p, 7 phút Hoà tan cặn tế bào vi khuẩn trong 150 àl dung dịch I để lạnh Bổ sung 150 àl dung dịch II, đảo đầu ống eppendorf nhẹ nhàng Thêm 200 àl dung dịch III để lạnh,

đảo nhẹ và giữ trong đá 5 phút Thêm 500 àl dung dịch phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) rồi ly tâm 12000 v/p, 15 phút Hút dịch pha trên sang ống eppendorf mới và chiết tiếp bằng chloroform: isoamyl alcohol (24: 1) Bổ sung 50 àl CH3COONa 3 M pH 5,2 và 1 ml EtOH 100%, để lạnh -

200C trong 3 giờ và ly tâm 12000 v/p trong 15 phút để thu DNA Rửa chất kết tủa bằng EtOH 70%, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, làm khô và hoà trong

30 àl TE 0,01 M DNA plasmid sau đó được loại ARN và kiểm tra trên gel agarose 0,8%

Thành phần các dung dịch tách chiết DNA plasmid

- Dung dịch I: Glucose 50 mM; Tris-Cl 25 mM; EDTA 10 mM pH 8 (khử trùng, giữ ở 40C)

- Dung dịch II: NaOH 0,2M; SDS 1% (pha mới trước khi sử dụng)

- Dung dịch III: 60 ml Kali axetat: 11,5 ml axit axetic: 28,5 ml H2O (khử trùng, giữ ở 40C)

* Phản ứng cắt DNA plasmid bằng enzym giới hạn

Để khẳng định rõ các plasmid tái tổ hợp đã lựa chọn có mang sản phẩm PCR không, cần sử dụng enzym giới hạn để cắt kiểm tra

Thành phần phản ứng bao gồm: 20 ng DNA plasmid, 2 đơn vị EcoRI và

dung dịch đệm thích hợp cho enzym đó Tổng thể tích phản ứng là 8 àl Hỗn hợp phản ứng được ủ 370C qua đêm Sau đó điện di sản phẩm trên gel agarose 0,8%

3.3.5 Phương pháp xác định trình tự gen

Trình tự của các đoạn gen được xác định trên máy tự động ABI PRISMđ 3100 Avant Genetic Analyzer bằng cách sử dụng Bộ hóa chất sinh chuẩn BigDyeđ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Thành phần của phản ứng PCR đọc trình tự gồm: 3,2 pM mồi, 200 ng DNA plasmid, BigDye, đệm tương ứng trong tổng thể tích 15 àl với chu trình nhiệt trên máy luân nhiệt GenAmpđ PCR System 9700 như sau: 960C - 1 phút; 25 chu kỳ (960C - 10 giây, 500C - 5 giây, 600C - 4 phút); giữ ở 40C Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng phương pháp tủa EtOH/EDTA: bổ sung 5 àl EDTA 125 mM, 60 àl EtOH 100% và được để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Tiếp đó ly tâm 12000 v/p, 15 phút để kết tủa các đoạn DNA có trong đó, sau đó EtOH sẽ được loại

bỏ Bổ sung 60 àl EtOH 70% và ly tâm 10000 v/p trong 10 phút Làm khô kết tủa DNA, bổ sung 10 àl Hi-Di Formamide và biến tính tại 950C trong 5 phút Các mẫu được cho vào các giếng của khay đựng mẫu sau đó điện di trong ống mao quản 80 cm x 50 àm với polymer POP-4 của hãng ABI, Mỹ

Trình tự nucleotit của mỗi mẫu được xác định từ cả 2 chiều xuôi và ngược (sử dụng 2 loại mồi M13 Reverse và M13 Forward (-20)), được xử lý bằng các phần mềm ABI PRISMđ 3100-Avant Data Collection v1.0 và DNA sequencing Analysis

3.3.6 ứng dụng tin học trong thu thập và phân tích số liệu

Trình tự nucleotit của các đoạn gen nghiên cứu đã đ−ợc thu thập từ Ngân hàng EMBL tại địa chỉ http://srs.ebi.ac.uk với sự hỗ trợ của công cụ tìm kiếm BLAST Các trình tự đó đ−ợc chuyển về dạng format thích hợp của ClustalX (dạng Fasta) và PC/GENE (dùng tiện ích REFORM của PC/GENE)

để dùng làm dữ liệu đầu vào của các phần mềm này phục vụ cho việc thiết kế cặp mồi (dùng tiện ích PCRPLAN của PC/GENE) khuếch đại các đoạn gen từ DNA genom

Các phần mềm ABI PRISMđ 3100-Avant Data Collection v1.0 và DNA sequencing Analysis đ−ợc sử dụng để thu thập và xử lý các trình tự trong quá trình xác định trình tự trên máy tự động ABI PRISMđ 3100 Avant Genetic Analyzer Các kết quả trình tự nghiên cứu đ−ợc phân tích bằng bộ phần mềm SeqScapeđ v2.0 để xác định các điểm đột biến và đa hình so với các trình tự đã

đ−ợc công bố trên ngân hàng GenBank Chúng tôi sử phần mềm ClustalX, bộ phần mềm PC/GENE v1.8 và bộ phần mềm BioEdit v5.0.9 để đ−a ra các hình, bảng so sánh, thống kê cũng nh− phân tích hậu quả có thể của các đột biến

IV Kết quả nghiên cứu

IV.1 Thu thập mẫu và thiết lập ngân hàng DNA

Chúng tôi đã phối hợp tiến hành 4 chuyến đi lấy mẫu trong khuôn khổ

đề tài do GS Nguyễn Văn Tường ĐHYHN chủ nhiệm Chúng tôi thu thập khoảng 5 ml máu toàn phần đông tự nhiên ở mỗi cá thể thuộc nhóm Phơi Nhiễm và một số cá thể thuộc nhóm Chứng (mẫu được phân loại dựa trên hệ thống tính điểm của ĐHYHN) Đồng thời, chúng tôi tự thiết kế để thu thập thêm các mẫu cá thể thuộc một số phả hệ có các cá nhân có tiền sử phơi nhiễm và để lại di chứng dị tật ở các thế hệ sau

Ngoài ra, chúng tôi đã kết hợp với nhóm nghiên cứu của GS TS Nguyễn Văn Nguyên và GS TS Lê Bách Quang, Học viện Quân y tiến hành thu thập mẫu thuộc các phả hệ điển hình trên tại Hà Tây và Vũ Thư (Thái Bình)

Trong số các mẫu thu được, chúng tôi đã sử dụng 5 phả hệ tiêu biểu nhất của vùng này để báo cáo kết quả trong đề tài này Số mẫu đã thu thập

được phục vụ cho nghiên cứu được trình bày trên Bảng 2, trong đó:

Tổng số: 159 mẫu máu

Trong đó có: 105 mẫu máu thành viên của 27 gia đình (phả hệ)

Số thành viên trong gia đình đã thu máu, ít nhất là: 2 người

Số thành viên gia đình nhiều nhất trong đã thu máu, là: 9 người

Bảng 2 Bảng thống kê số mẫu máu đã thu thập được tại địa phương

hệ Yếu tố PN của vùng

1* Hoài Đức, Hà Tây 4 1 CCB phơi nhiễm tại

Đường Chín Nam Lào 2* Vũ Thư, Thái Bình 9 2 CCB phơi nhiễm tại

Đường Chín Nam Lào

3 Biên Hòa, Đồng Nai 87 12 Điểm nóng

4 Nam Đông, Thừa Thiên

- Huế

59 12 Vùng phơi nhiễm

(*) Kết hợp với HVQY

Chúng tôi đã hoàn thiện quy trình tách chiết và tinh sạch DNA genom

từ khoảng 5 ml máu toàn phần của mỗi cá thể để sử dụng cho nghiên cứu phân tích đột biến và bước đầu xây dựng được ngân hàng mẫu DNA

Các phả hệ chứa các mẫu có quan hệ huyết thống được thống kế theo các danh sách dưới đây

Phả hệ hà tây 1 (hta1)

Gia đình ông: Đỗ Xuân Tẹo

Địa chỉ: Xóm 3, Lại Yên, Hoài Đức, Hà Tây

STT/ Ký hiệu Họ và tên Năm

sinh Giới tính Triệu chứng Yếu tố phơi nhiễm/ Vùng Ghi chú

1/ HTa1.C1 Đỗ Xuân Tẹo 1947 Nam Ung th− lympho non-Hogkin PN/ chứng CCB

4/ HTa1.C4 Đỗ Xuân Giỏi 1981 Nam Thoát bị bẹn PN / chứng Con

Ghi chú

1/ThB1.VT22 Trần Khắc Ngọc 1945 Nam Bị rám mặt PN/ chứng

CCB 1969-11/1975: Quảng Trị, Nam Lào, Biên Hoà

PN/ chứng Con 4/ ThB1.VT25 Trần Thị Anh 1976 Nữ Vết rám đen trên mặt PN/ chứng Con

5/ ThB1.VT23 Trần Khắc Dũng 1978 Nam Nứt đôi cột sống PN/ chứng Con