Nghiên cứu những biến đổi di truyền (nhiễm sắc thể) ở các đối t ợng bị ảnh h ởng do phơi nhiễm với chất độc hóa học trong chiến tranh và các thế hệ tiếp theo (f1, f2) của họ

bộ y tế chương trình 33 trường đại học y hà nội báo cáo tổng kết đề tài nhánh Nghiên cứu những biến đổi di truyền nhiễm sắc thể ở các đối tượng bị ảnh hưởng do phơi nhiễm với chất độc h

bộ y tế chương trình 33 trường đại học y hà nội

báo cáo tổng kết đề tài nhánh

Nghiên cứu những biến đổi di truyền (nhiễm sắc thể) ở các

đối tượng bị ảnh hưởng do phơi nhiễm với chất độc hóa học trong chiến tranh và các thế hệ tiếp theo (F1, F2) của họ

CHủ NHIệM Đề TàI NHáNH: Gs Trịnh Văn Bảo

thuộc đề tài cấp nhà nước:

nghiên cứu các biến đổi về mặt di truyền, miễn Dịch,

sinh hoá, huyết học và tồn lưu dioxin trên các đối tượng phơi nhiễm có nguy cơ cao

chủ nhiệm đề tài: pgs.ts Nguyễn văn Tường

đặt vấn đề

Trong cuộc chiến tranh ở Việt Nam, quân đội Mỹ đã sử dụng các chất

độc hoá học, trong đó chủ yếu là các chất diệt cỏ và làm rụng lá Chất độc hoá học đã sử dụng từ năm 1961 đến năm 1972 trong chiến dịch Ranch Hand Trong thời gian này hơn 70.720m3 chất diệt cỏ và làm rụng lá đã

được rải xuống miền Nam Việt Nam với tổng diện tích bị rải chiếm 10% tổng diện tích miền Nam Việt Nam Khoảng 15 loại hoá chất đã được dùng trong đó có hơn 42 triệu lít chất da cam Trong chất da cam, ngoài 2,4 - D

và 2,4,5 - T là hai thành phần chính, còn có tạp chất 2,3,7,8 - tetrachloro dibenzo paradioxin còn gọi tắt là dioxin Dioxin là một chất cực độc Tổng lượng dioxin đã rải xuống miền Nam Việt Nam theo số liệu trước đây khoảng 170 kg trong chiến dịch Ranch Hand; theo công bố mới đây nhất, lượng Dioxin có thể cao hơn 2 – 4 lần so với công bố trước đây [26]

Hai cuộc hội thảo quốc tế về nhiều vấn đề khác nhau liên quan với chất diệt cỏ, làm rụng lá và dioxin đã được tổ chức ở thành phố Hồ Chí Minh (1983) và ở Hà Nội (1993) Hội nghị khoa học Việt Mỹ về chất da cam / dioxin dã được tổ chức vào tháng 3 năm 2002

Ngay từ những ngày đầu khi quân đội Mỹ sử dụng chiến tranh hoá học, một số nhà khoa học Việt Nam đã nghiên cứu đánh giá tác hại của cuộc chiến tranh này Uỷ ban 10/80 trước đây và Uỷ ban 33 hiện nay đã và

đang tiến hành các cuộc điều tra về hậu quả và nghiên cứu các biện pháp để khắc phục hậu quả của cuộc chiến tranh hoá học này

Trong các nghiên cứu đánh giá tác hại của chất độc, đánh giá đột biến nhiễm sắc thể là một trong các nghiên cứu sớm nhất Tôn Thất Tùng và Bạch Quốc Tuyên là những người Việt Nam nghiên cứu sớm nhất về vấn đề này và đã có những nhận xét khoa học rất có giá trị Thời gian sau đó, một

số tác giả Việt Nam cũng như nước ngoài đã tiếp tục nghiên cứu vấn đề này

Kể từ khi quân đội Mỹ ngừng rải chất độc hoá học ở miền Nam Việt Nam cho đến nay đã hơn 30 năm Cho đến nay ý kiến của các nhà khoa học về vấn đề độc học gen (genotoxic effect) còn chưa thống nhất

1

Với nhận thức: Việt Nam đã và đang chịu ảnh hưởng nặng nề của cuộc chiến tranh hoá học do quân đội Mỹ thực hiện, các nghiên cứu kỹ càng

và đồng bộ nhiều mặt tác hại và hậu quả của cuộc chiến tranh đó để có những nhận xét, kết luận thực tế ở Việt Nam nhằm chăm sóc, bảo vệ sức khoẻ cộng đồng Trong khuôn khổ đề tài cấp nhà nước "Nghiên cứu các biến đổi về mặt di truyền, miễn dịch, sinh hóa, huyết học và tồn lưu dioxin trên các đối tượng phơi nhiễm có nguy cơ cao" đề tài nhánh "Nghiên cứu các biến đổi về mặt di truyền… " được thực hiện với mục tiêu sau:

1 Xác định tần số các dạng đột biến nhiễm sắc thể ở nhóm chứng và nhóm phơi nhiễm

2 Xác định tần số trao đổi chromatid chị em ở nhóm chứng và nhóm phơi nhiễm

3 Xác định bộ nhiễm sắc thể ở một số đối tượng bị dị tật bẩm sinh

2

I tổng quan tài liệu

- Tế bào bị chết

- Vật chất di truyền trong tế bào bị biến đổi từ đó dẫn đến những tế bào bị đột biến

Có thể xếp các tác nhân độc hại trong môi trường thành ba nhóm:

- Nhóm các tác nhân gây đột biến (Mutagens): Gây biến đổi vật liệu

di truyền ở mức độ nhiễm sắc thể hoặc mức độ gen

- Nhóm các tác nhân gây ung thư (Carcinogens): Gây những biến đổi trong tế bào dẫn đến sự xuất hiện tế bào ung thư

- Nhóm các tác nhân gây quái thai (teratogens): Tác động vào tế bào trong các giai đoạn phát triển phôi thai dẫn đến các phôi thai dị dạng

Đặc điểm và tính chất của các chất gây đột biến

- Các chất gây đột biến có thể có bản chất là những tác nhân vật lý, tác nhân hoá học hoặc các tác nhân sinh học Danh mục các tác nhân gây

đột biến càng ngày càng được bổ sung Đặc điểm chung của các chất gây

đột biến là có khả năng gây tăng sinh các gốc tự do trong tế bào Một đích quan trọng của các gốc tự do là ADN của tế bào

3

- Các chất gây đột biến có thể tác động đến tế bào sinh dưỡng (soma) hoặc tế bào sinh dục (germ lines) Những đột biến ở tế bào sinh dưỡng chỉ tồn tại trong đời cá thể bị đột biến, còn những đột biến ở tế bào sinh dục có thể di truyền cho các thế hệ tiếp theo

- Đột biến ở tế bào sinh dưỡng hay tế bào sinh dục có thể là những

đột biến gen hoặc những đột biến nhiễm sắc thể Những đột biến đó có thể

là những đột biến ở từng gen, từng nhiễm sắc thể riêng biệt nhưng cũng có thể xảy ra ở cả bộ gen (genome)

- Phần lớn các đột biến sau khi xảy ra được tự sửa chữa để trở lại trạng thái bình thường, một số không tự sửa chữa được có thể dẫn đến những biến đổi của kiểu hình ở những mức độ khác nhau

1.2 Đột biến nhiễm sắc thể

Như đã biết nhiễm sắc thể chỉ hình thành rõ rệt khi tế bào phân chia, còn tế bào ở gian kỳ (interphasis) trong nhân tế bào chỉ có thể quan sát thấy chất nhiễm sắc (chromatine)

Vào năm 1956 Tjio và Levan [28] đã xác định chính xác số lượng nhiễm sắc thể ở tế bào soma của người là 2n = 46 Năm 1960 Moorhead và cộng sự [19] đã đề xuất phương pháp nuôi cấy tế bào lympho ở máu ngoại

vi của người để quan sát nhiễm sắc thể với sự sử dụng PHA (Phytohemagglutinin) được chiết xuất từ Phaseolus vulgaris để kích thích chuyển dạng lympho bào Từ đó đến nay, phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong các phòng di truyền tế bào để nghiên cứu nhiễm sắc thể với những cải tiến nhỏ tuỳ từng phòng thí nghiệm

1.2.1 Phương pháp nghiên cứu nhiễm sắc thể

1.2.1.1 Nghiên cứu nhiễm sắc thể ở gian kỳ

Như đã nêu ở trên, ở gian kỳ nhiễm sắc thể tồn tại ở dạng chất nhiễm sắc Đã có phương pháp chính được đề xuất để nghiên cứu NST ở gian kỳ này:

4

- Kỹ thuật phát hiện vật thể Barr: phát hiện chất nhiễm sắc giới tính (biểu hiện cho một NST X không hoạt động sinh lý) để tham gia xác định sự bất thường của cặp NST giới tính

- Kỹ thuật phát hiện vật thể Y: phát hiện vùng chất nhiễm sắc bắt màu huỳnh quang đậm của NST Y để tham gia xác định sự bất thường của NST

Y

- Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (FISH): phát hiện sự bất thường của một NST nào đó tùy thuộc vào Kit được dùng

1.2.1.2 Nghiên cứu NST ở tế bào đang phân chia

Đây là phương pháp chủ yếu để nghiên cứu đột biến NST

Tế bào thường được dùng để nghiên cứu NST là tế bào lympho ở máu ngoại vi Ngoài ra, người ta còn dùng tế bào tuỷ xương, tế bào bào thai, tế bào trong dịch ối, tế bào tua rau thai, tế bào máu cuống rốn…Yêu cầu của

kỹ thuật là

- Có nhiều tế bào đang phân chia

- Các tế bào tồn tại ở dạng kỳ giữa (metaphase) hoặc giữa kỳ đầu và

kỳ giữa (prometaphase) để có thể phân tích ở kính hiển vi quang học

- Và có cách nhuộm NST thích hợp để có thể phân tích các đặc điểm cần phân tích

- Nhuộm NST theo phương pháp nhuộm giemsa thông thường

Phương pháp nhuộm này được hầu hết các phòng thí nghiệm di truyền tế bào áp dụng vì đơn giản, NST hiện rõ nét, có thể phân biệt rõ các tổn thương nhỏ của NST như các đứt đơn (break) hoặc các chỗ nhạt (gap) Tuy nhiên, phương pháp nhuộm này trong nhiều trường hợp không đủ để xác định vị trí chính xác của các NST, nhất là các NST giống nhau như NST nhóm C, nhóm D…

- Nhuộm băng (Banding techniques)

Sự phân bố các chất dị nhiễm sắc (heterochromtine) và nhiễm sắc thực (euchromatine) là đặc trưng cho từng NST Khi xử lý NST bằng các phương pháp xử lý và nhuộm khác nhau trên các NSt sẽ hiện lên các băng sẫm và nhạt, các băng này đặc trưng cho từng NST và do vậy có thể xác

5

định chính xác vị trí của từng NST, tuỳ theo cách xử lý và nhuộm mà có tên tương ứng của các kỹ thuật băng: Băng G, sau khi xử lý NST được nhuộm bằng giemsa; băng Q, sau khi xử lý, NST được nhuộm bằng phẩm nhộm huỳnh quang (Quinacrine hoặc Quanacrine mustard); băng C: NST được nhuộm ở phần tâm (centromere); băng R: sự phân bố của các băng sẫm và nhạt ngược lại với băng G

- áp dụng kỹ thuật FISH với NST ở metaphase hoặc intermetaphase Thường được dùng để xác định một kiểu hình bất thường nào đó tương ứng với kit ADN đã có Sự bổ sung của ADN đích trên NST với kit ADN sẽ được phát hiện bằng phương pháp lai tại chỗ với các loại phẩm nhuộm huỳnh quang thích hợp

- áp dụng kỹ thuật nhân nhỏ ở tế bào lympho của người (Micronucleus test)

Kỹ thuật này được Countryman và Headle đề xuất vào năm 1976 [8] Nhân nhỏ được hình thành do sự kết đặc của các đoạn NST bị đứt không mang tâm động, hoặc do có các NST bị thất lạc trong quá trình di chuyển ở kỳ sau Có thể nói nhân nhỏ là hình ảnh của các rối loạn cấu trúc

và rối loạn NST xảy ra trong lần phân bào trước Nhân nhỏ chỉ biểu hiện ở các tế bào đang phân chia Nhân nhỏ có thể quan sát thấy ở tế bào tạo hồng cầu của tuỷ, ở tế bào lympho Với việc dùng cytochalasin B để ức chế sự phân chia của tế bào chất có thể quan sát các nhân nhỏ (nếu có đột biến) ở các tế bào có hai nhân

1.2.1.3 Phương pháp trao đổi chromatid chị em (Sister Chromatid Exchange = SCE)

Phương pháp này được Perry và cs đề xuất vào năm 1974

Bằng cách dùng 5 - Bromodeoxyuridin (5 - BrdU) và các tiền xử lý để nhuộm hai chromatid chị em, từ đó quan sát thấy các trao đổi giữa hai chromatid cũ và mới Sự trao đổi này thể hiện các biến đổi bên trong NST ở các locus tương đồng của hai chromatid bao gồm sự đứt ra và nối lại của từng phần của hai chromatid chị em trong chu kỳ tế bào Tần số trao đổi

6

chromatid chị em được sử dụng như một test nhạy cảm để đánh giá tác động gây đột biến của các tác nhân khác nhau

1.2.2 Phương pháp đánh giá đột biến NST

1.2.2.1 Lược sử xếp bộ NST của người

Để đánh giá đột biến NST, trước hết cần xác định cách xếp bộ NST (karyotype) Hội nghị các nhà di truyền tế bào học ở Denver (1960), ở London (1963) và ở Chicago (1965) đã thống nhất được các điểm chính sau

đây:

- 46 NST của người được xếp thành 7 nhóm: Nhóm A (3 cặp NST), nhóm B (2 cặp NST), nhóm C (6 cặp NST + NST X), nhóm D (3 cặp NST), nhóm E (3 cặp NST), nhóm F (2 cặp NST), nhóm G (2 cặp NST + NST Y)

- Các NST được xếp theo tiêu chuẩn: chiều dài tương đối của NST (giảm dần từ nhóm A đến nhóm G) và chỉ số tâm

- Một số ký hiệu NST trong trạng thái bình thường và trạng thái bị đột biến, ví dụ:

46, XX: Bộ NST của người nữ bình thường

46, XY: Bộ NST của người nữ bình thường

Sau khi có kỹ thuật băng trên NST, hội nghị ở Paris và các hội nghị

Di truyền học người sau đó đã bổ sung các ký hiệu mới Danh pháp NST của người đã được thông tin chi tiết trong ISCN 1995 [13]

1.2.2.2 Xếp loại các dạng đột biến NST của người

- Đột biến số lượng NST

+ Đa bội thể bao gồm cả đa bội nội sinh (endoreduplication)

+ Lệch bội (Aneuploidy) bao gồm các dạng monosomi, trisomi NST thường hoặc NST giới

- Đột biến cấu trúc NST

+ Nếu các tác nhân gây đột biến tác động vào NST ở giai đoạn sau khi ADN đã nhân đôi (vào giai đoạn G2 của chu kỳ tế bào) thì các đột biến

7

cấu trúc ở dạng chromatid (chromatide type) Đột biến cấu trúc dạng chromatid gồm: gap (hoặc khuyết, nhạt), đứt đơn (break), trao đổi chromatid tạo thành hình 3 cánh (triradial) hoặc 4 cánh (quadriradial)

+ Nếu các tác nhân gây đột biến tác động vào NST ở giai đoạn ADN chưa nhân đôi (vào giai đoạn G1 của chu kỳ tế bào) thì các đột biến cấu trúc

ở dạng nhiễm sắc thể (chromosome type) Đột biến cấu trúc dạng NST bao gồm:

- Gap kép hoặc isogap

- Đứt kép

- NST hình vòng (r = ring)

- NST hai tâm (d = dicentric)

- Nhân đoạn (dup = duplication)

- Các dạng NST chuyển đoạn (t = translocation)

- Các dạng NST đảo đoạn (inv = inversion)

- NST đều (i = isochromosome)

- Đứt đoạn nhỏ (minute)

- Hoặc các NST lạ (mar) chưa xác định rõ nguồn gốc

+ Trong một số trường hợp cả bộ NST (genome) bị nát vụn hoặc bắt màu không đều

1.3 Đột biến NST do tác động của chất da cam / Dioxin

1.3.1.Các nghiên cứu ở trong nước

Các nhà nghiên cứu Việt Nam là những người đầu tiên nghiên cứu tác động của các chất diệt cỏ và làm rụng lá, trong đó có chất da cam / dioxin lên NST của người

Người đầu tiên đặt vấn đề và thực hiện nghiên cứu là giáo sư Tôn Thất Tùng và giáo sư Bạch Quốc Tuyên Trong công trình nghiên cứu “Tác hại của việc sử dụng chất diệt cỏ liên tục và liều cao đến người dân thường Việt Nam” [33] đột biến NST đã được nghiên cứu Công trình đã được báo cáo ở Hội nghị chiến tranh hoá học do Liên đoàn những người làm khoa học

8

ở Orsay Paris tổ chức năm 1971 Năm 1973 Bạch Quốc Tuyên, Trịnh Kim Anh, Nguyễn Xuân Huyên và cs [34] đã công bố công trình nghiên cứu

“Chất làm rụng lá và đột biến NST” Công trình dã nghiên cứu đột biến NST

ở 54 nạn nhân bị nhiễm chất độc hoá học từ miền Nam ra nằm điều trị tại bệnh viện E Hà Nội Sau đó, Bạch Quốc Tuyên và cs đã thực hiện các nghiên cứu về NST ở một số người sống ở vùng đã từng bị rải chất độc hoá học ở Quảng Nam (năm 1978), ở huyện Hoài Nhơn tỉnh Bình Định (năm 1979), ở huyện Trà Mi, Quảng Nam (năm 1980) Trong báo cáo ở hội thảo quốc tế lần thứ nhất về "tác động lâu dài của chiến tranh hoá học ở Việt Nam", Bạch Quốc Tuyên và cs [35] đã tổng hợp các số liệu đã nghiên cứu (138 người bị phơi nhiễm, 177 người thuộc nhóm đối chứng) Các tác giả đã

có kết luận: "Các chất diệt cỏ làm rụng lá gây ra rối loạn NST với tần suất tăng cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng"

Năm 1980 Cung Bỉnh Trung đã bảo vệ luận án phó tiến sĩ y học với

đề tài: "Một số hậu quả di truyền tế bào học do chất độc hoá học Mỹ rải ở miền Nam Việt Nam [30]" Tác giả này cũng có nhận xét: ở những người bị phơi nhiễm với chất diệt cỏ làm rụng lá, tần số các dạng đột biến NST tăng cao Đột biến NST cũng được Cung Bỉnh Trung, Vũ Văn Diệu và Cs nghiên cứu ở những người trực tiếp bị nhiễm độc do chất hoá học rải ở miền Nam Việt Nam [31]

Đặc điểm của các nhà nghiên cứu của Việt Nam trong các công trình

Do cách nhìn nhận vấn đề khác nhau, thực hiện nghiên cứu ở các thời

điểm khác nhau, với các đối tượng với mức độ phơi nhiễm khác nhau nên còn có những kết luận khác nhau Hội thảo quốc tế lần thứ nhất đã có kết

luận như sau: "Công trình của các nhà khoa học Việt Nam rất hấp dẫn

9

nhưng vì tính gây tranh luận của các y văn đã xuất bản về kết quả di truyền của các chất diệt cỏ này nên cần có các nghiên cứu thêm ở phòng thí nghiệm"

Trong hội thảo quốc tế lần thứ hai (1993) về "Chất diệt cỏ trong chiến tranh, tác hại lâu đối với con người về thiên nhiên" một số bản báo cáo khoa học về di truyền tế bào học đã được trình bày Nguyễn Trần Chiến và Cs [7]

đã giới thiệu tần số trao đổi chromatid chị em và tần số một số dạng đột biến NST ở 9 người đã được xác định 2,3,7,8 - TCDD ở mô mỡ dao động từ 5,2ppt đến 34,8ppt Các tác giả thấy tần số SCE và tần số đột biến NST tăng cao ở những đối tượng này Umnova NV và Cs [36] ở Trung tâm nhiệt đới Việt Nga đã thông báo về tần suất chromatid chị em trong các lymphoxit máu ngoại vi được nuôi cấy của cư dân nông thôn tỉnh Sông Bé (nay là tỉnh Bình Dương) Bằng phương pháp nuôi cấy máu 72 giờ và 96 giờ các tác giả

đã ghi nhận sự tăng cao của tần suất tế bào có rối loạn NST, tăng cao tần số

đơn bội và SCE

Trịnh Văn Bảo và Cs [3] đã nghiên cứu NST ở thế hệ F1 và F2 của những người tiếp xúc với chất độc hoá học trong chiến tranh: 15 trẻ em là con của những cựu chiến binh đã bị rải CĐHH trực tiếp lên người (tuổi trung bình là (11 ± 5), 15 trẻ em là cháu của các cựu chiến binh đã bị rải CĐHH trực tiếp lên người và 12 trẻ em là cháu của các cựu chiến binh không bị phơi nhiễm với CĐHH, tuổi của hai nhóm sau tương đương nhau (3 ± 2) Tần số các dạng đột biến NST ở nhóm cháu của những người đã phơi nhiễm với CĐHH (F2B) và nhóm không phơi nhiễm với CĐHH (F2A) không có sự khác biệt Riêng nhóm con của những CCB đã phơi nhiễm với CĐHH (F1B) số tế bào có NST bị đứt đơn, đứt kép có phần cao hơn so với nhóm F2B Cũng trong hội thảo quốc tế lần thứ hai, Bourakov V.V và Cs [6]

đã cho thấy sự giảm tỷ lệ bắt chéo (Chiasma frequency) trong quá trình giảm phân ở chấu chấu (Locustes) tại những vùng bị rải CĐHH

Trong kết luận của hội thảo quốc tế lần thứ hai có câu "Dioxin có thể

ảnh hưởng tới các gen trên NST làm rối loạn NST và có thể được coi là tác nhân gây quái thai, sinh sản bất thường"

10

Sau hội thảo quốc tế lần thứ hai từ năm 1993 đến 1998 Trịnh Văn Bảo

và Cs đã tập trung vào đánh giá những biến đổi di truyền tế bào học và những bất thường sinh sản ở những cựu chiến binh và gia đình của các cựu chiến binh đã từng bị phơi nhiễm với chất dộc hoá học ở miền Nam Việt Nam Những nghiên cứu này được thực hiện sau khi quân đội Mỹ ngừng rải CĐHH ở miền Nam Việt Nam hơn 20 năm Trong báo cáo khoa học "Xét nghiệm di truyền tế bào học ở 100 cựu chiến binh bị bệnh" Trịnh Văn Bảo

và Cs [4] đã thông báo kết quả xét nghiệm NST cho 100 cựu chiến binh đã từng trực tiếp bị phơi nhiễm ví CĐHH trong chiến tranh ở miền Nam Việt Nam, những CCB này bị nhiều loại bệnh khác nhau nghi có liên quan với nhiễm độc dioxin: chloracne, viêm da thần kinh, da bị nổi mẩn và đổi màu sắc, suy nhược thần kinh… Kết quả xét nghiệm cho thấy tần số đột biến NST ở những người này ở ngưỡng bình thường, duy chỉ có một CCB bị viêm

da thần kinh cả 3 đứa con đều bị dị tật và nhiều rối loạn NST ở lympho bào nuôi cấy Trong một nghiên cứu khác Trịnh Văn Bảo và Cs [5] đã nghiên cứu đột biến NST ở các gia đình có nhiều con bị dị tật hoặc cháu bị dị tật

1.3.2 Các nghiên cứu ở nước ngoài

2,4 - D và 2,4,5 - T là hai thành phần tạo nên chất da cam nên đã có một số nghiên cứu di truyền tế bào học về hai chất này, chủ yếu là 2,4 - D, vì chất này được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp Johnson, 1971 [14] không thấy sự tăng cao của các dạng đột biến NST ở lympho bào của 10 công nhân sản xuất 2,4 - D; Andreasik và Cs, 1979 [1], Hửgstedt và Cs

1980 [11] cũng có nhận xét tương tự khi nghiên cứu NST từ lympho bào của

15 công nhân đóng gói 2,4 - D Nhưng Yoder và Cs, 1973 [37], cũng như Crossen và Cs, 1978 [9] đã quan sát thấy sự tăng cao của các dạng rối loạn NST ở lympho bào do tiếp xúc với các hoá chất trừ sâu có chứa 2,4 - D, nhất

là vào các thời vụ phải tiếp xúc nhiều Bằng phương pháp phân tích sự trao

đổi chromatid chị em Linnaimaa, 1983 [18] không thấy sự tăng cao tần số SCE/tế bào ở những người phơi nhiễm với 2,4 - D Lực thống kê của các nghiên cứu này còn bị hạn chế vì hầu hết các mẫu được nghiên cứu không

11

được đo độ 2,3,7,8 - TCDD và số mẫu trong các nghiên cứu còn nhỏ Chính vì vậy, các kêt luận còn mâu thuẫn và không nhất quán

Sau sự cố ở Seveso (Italy), các nhà khoa học đã thực hiện các điều tra, nghiên cứu về di truyền tế bào học Tenchini và Cs [27] đã thấy sự tăng cao

đáng kể tần số tế bào có rối loạn NST ở tế bào bào thai của các thai sẩy của các bà mẹ có thể phơi nhiễm với 2,3,7,8 - TCDD Nhưng Reggiani, 1980 [23] không thấy sự tăng cao tần số rối loạn NST ở 17 người bị chloracne sau

sự cố Seveso

Kaye và Cs, 1985 [16] thấy đột biến NST tăng cao ở 10 cựu chiến binh đã tham chiến ở Việt Nam, nhưng Mulcahy và Cs, 1980 [20] không thấy tần số rối loạn NST và trao đổi chromatid chị em tăng cao ở 15 cựu chiến binh tham chiến ở Việt Nam Zober và Cs, 1993 [38] đã phân tích tần

số các dạng đột biến NST và tần số SCE ở 27 công nhân có nồng độ 2,3,7,8

- TCDD trong máu trên 40ppt đã thấy; không có sự khác biệt về tân số gap,

đứt đơn, đứt kép, trao đổi chromatid và tần số tế bào có nhiều NST bị rối loạn giữa nhóm nghiên cứu và nhóm chứng Các tác giả thấy tần số trao đổi chromatid chị em / tế bào và tần số tế bào có trên 10 trao đổi chromatid tăng cao ở nhóm nghiên cứu Kaiumova và Cs, 1998 [15] đã nghiên cứu những dạng đột biến NST ở một số công nhân sản xuất chất diệt cỏ Năm 2002 trong hội nghị Dioxin ở Bacelona Nagayama [21] nghiên cứu tần số SCE ở những trẻ bú sữa mẹ nghi có Dioxin

1.4 Vấn đề di truyền qua người bố.

Trong hội thảo quốc tế lần thứ nhất và lần thứ hai về chất diệt

cỏ trong chiến tranh, vấn đề di truyền qua người bố đều được đề cập Nhiều thực nghiệm đã được thực hiện, Anderson [2] đã tập hợp các nghiên cứu đó thành chuyên đề: Male mediated F1 Abnormalities Liên quan với dioxin, Richads và Cs [24] cũng đã công bố bài báo khoa học "Male Reproductive Toxicity of Dioxin" ở Việt Nam sự tăng cao tần số bất thường sinh sản ở những cựu chiến binh miền Bắc bị phơi nhiễm với chất độc hoá học trong

12

chiÕn tranh ë miÒn Nam ViÖt Nam lµ mét dÉn chøng cho sù di truyÒn qua ng−êi bè

13

II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trong khuôn khổ của đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu các đặc điểm

về mặt di truyền, miễn dịch, sinh hoá, huyết học và tồn lưu dioxin trên các

đối tượng phơi nhiễm có nguy cơ cao” các đối tượng của từng đề tài nhánh

đều thực hiện chung trên cùng nhóm đối tượng chung

2.1 Địa điểm nghiên cứu:

Đợt nghiên cứu thứ nhất đã được thực hiện vào tháng 11 năm 2001 ở Biên Hoà - Đồng Nai ở đây có sân bay Biên Hoà; nhiều nghiên cứu với các mẫu đất ở sân bay Biên Hoà đã xác định có hàm lượng dioxin cao Đây cũng là thành phố công nghiệp với nhiều nhà máy, khu công nghiệp rộng lớn Ba phường của Biên Hoà là phường Trung Dũng, phường Tân Hạnh, phường Tân Phong đã được chọn làm địa điểm nghiên cứu Phường Trung Dũng tiếp giáp với sân bay Biên Hoà, nước từ sân bay chảy ra hồ Biên Hùng

Đợt nghiên cứu thứ hai đã được thực hiện vào tháng 6 năm 2002 ở Nam Đông – Thừa Thiên Huế Đây là vùng căn cứ địa cách mạng nằm trong dãy Trường Sơn nên quân đội Mỹ đã rải chất độc hoá học nhiều lần, nơi đây cũng có một sân bay nhỏ Đây cũng là vùng sốt rét lưu hành nhiều năm Người dân sống ở đây chủ yếu là dân tộc Ka Tu, mức sống thấp, trình độ văn hoá rất thấp Ba xã đã được lấy mẫu để nghiên cứu di truyền là Hương Sơn, Hương Hữu và Thượng Long

Đợt nghiên cứu thứ ba đã được thực hiện vào tháng 10 năm 2002 tại huyện An Hải – Hải Phòng Huyện này ở gần sân bay Cát Bi 4 xã/phường

đã được chọn làm địa điểm nghiên cứu là Tràng Cát, Cát Bi, Đằng Lâm và Nam Hải Địa điểm Hải Phòng được coi là địa điểm đối chứng vì trừ một số cựu chiến binh có phơi nhiễm với chất độc hoá học trong chiến tranh còn đa

số người dân ở đây không bị phơi nhiễm

14

2.2.Đối t−ợng nghiên cứu:

2.2.1 ở Biên Hoà - Đồng Nai

Các đối t−ợng nghiên cứu ở Biên Hoà - Đồng Nai đ−ợc chia thành hai nhóm: nhóm nguy cơ phơi nhiễm thấp và nhóm nguy cơ phơi nhiễm cao theo qui định chung của đề tài Bảng 2.1 giới thiệu đặc điểm của các nhóm nghiên cứu

Tổng số mẫu máu đã lấy để nghiên cứu các chỉ số di truyền tế bào học ở Biên Hoà - Đồng Nai là 62 mẫu, trong đó có 22 mẫu từ nam giới và

40 mẫu từ nữ giới

15

40 ± 10,50 Cao

39,50 ± 18,96

16

2.2.2 ở Nam Đông thành phố Huế

Các đối tượng được nghiên cứu ở huyện Nam Đông thuộc thành phố Huế được chia thành hai nhóm: nhóm nguy cơ phơi nhiễm thấp và nhóm nguy cơ phơi nhiễm cao phân theo bảng kiểm do Ban chủ nhiệm đề tài đề xuất, hộ gia đình có từ 60 điểm trở lên là hộ gia đình có nguy cơ cao

Bảng 2.2 trình bày đặc điểm của các nhóm đối tượng

Tổng số mẫu máu đã được lấy để nuôi cấy lympho bào phục vụ cho phân tích đột biến NST và SCE ở huyện Nam Đông là 124 mẫu trong đó có

69 mẫu nam và 55 mãu nữ Cũng ở Nam Đông 14 người trong 6 gia đình có người bị dị tật bẩm sinh và 4 phụ nữ được lấy mẫu sữa cũng đã được xét nghiệm NST và SCE

17

41 ± 9,58

29,81 ± 15,53

18

- A1.2: Cựu chiến binh như trên nhưng không có con bị dị tật

- A2: Cựu chiến binh ở miền Bắc cỏ tuổi đời đến khi nghiên cứu là ≤

40 tuổi, trong gia đình không có ai bị dị tật

- B1: Cựu chiến binh miền Bắc đã tham gia chiến đấu ở miền Nam, có con bị dị tật

- B2: Cựu chiến binh như B1 nhưng vợ đã bị tai biến sinh sản hoặc bản thân bị bệnh

- B3: Cựu chiến binh như B1 nhưng không có bất thường sinh sản, không có con bị dị tật

- E2: Con của cựu chiến binh bị dị tật

Số liệu về các nhóm này được trình bày trong bảng 2.3

19

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Lấy mẫu và chuyển mẫu về phòng thí nghiệm

- Các mẫu được lấy cùng một lần chung với các mẫu để phân tích các chỉ số huyết học, miễn dịch, hoá sinh Lượng máu được lấy cho mỗi người để phân tích di truyền tế bào học khoảng 2 –4 ml Máu được chống đông bằng heparin

- Mẫu máu được bảo quản trong lạnh và chuyển ngay trong ngày về phòng thí nghiệm bằng máy bay

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào và phương pháp đánh giá đột biến nhiễm sắc thể

3.3.2.1 Lympho bào máu ngoại vi được cấy theo phương pháp của Moorhead

có cải tiến Môi trường để cấy lympho bào là môi trường Karyomax complete (Gibco) Làm dừng phân bào ở kỳ giữa bằng Karyomax colcemid (Gibco)

Tiêu bản NST được nhuộm bằng phương pháp nhuộm giemsa thông thường và bằng phương pháp nhuộm băng G có xử lý bằng trypsin

2.3.2.2 Phương pháp đánh giá đột biến NST,

Đánh giá đột biến NST được thực hiện trên tiêu bản nhuộm giemsa thông thường và nhuộm băng G

Các tiêu bản NST được đánh giá theo các qui định quốc tế về xếp loại

đột biến và các danh pháp di truyền tế bào học (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature - ISCN) Các chỉ số chủ yếu được đánh giá là:

- Các tế bào có rối loạn số lượng NST

+ Các tế bào lệch bội (aneuploid cells): các nhân tế bào vẫn còn nền bào tương có chứa số NST dưới lưỡng bội (44 hoặc 45 NST) hoặc trên lưỡng bội (47- 48 NST)

21

+ Các tế bào đa bội (polyploid cells): các tế bào có chứa 69 hoặc 92 NST, các NST tương đồng trong tế bào có hình thái và bắt màu giống nhau Tế bào đa bội nội sinh cũng xếp vào nhóm này

- Các tế bào có rối loạn cấu trúc NST

Bao gồm các tế bào có rối loạn cấu trúc kiểu nhiễm sắc tử (chromatid type) và rối loạn cấu trúc kiểu nhiễm sắc thể (chromosome type)

+ Các rối loạn cấu trúc nhiễm sắc tử gồm:

* Gap (hay còn gọi là nhạt hoặc khuyết màu)

* Đứt (breaks)

* Trao đổi nhiễm sắc tử

+ Các rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể gồm:

* Isogap (hay còn gọi là nhạt hoặc khuyết màu kép hoặc gap kép)

* Đứt kép (isobreaks): bao gồm các NST bị mất đoạn, các đoạn không tâm, các minut

* NST hình vòng (ring) có tâm hoặc không tâm

* NST hai tâm (dicentric) hoặc đa tâm

(Các dạng rối loạn cấu trúc NST nêu trên có thể đánh giá xác định ngay khi phân tích NST ở kính hiển vi)

* Các tế bào mang NST chuyển đoạn (translocation), đảo đoạn (inversion), nhân đoạn (duplication), nhiễm sắc thể đều (isochromosome) chỉ

có thể phân tích khi lập karyotyp với NST đã được nhuộm băng

+ Các rối loạn cấu trúc của cả cụm NST

Tất cả các NST trong tế bào bị nát vụn hoặc bắt màu thuốc nhuộm không đều

Trung bình cho mỗi người 50 tế bào ở kỳ giữa được đánh giá ở kính hiển

vi và 3 karyotyp được lập

22

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy tế bào và phương pháp phân tích sự trao đổi nhiễm sắc tử (chromatid) chị em

2.3.3.1 Phương pháp nuôi cấy lympho bào để đánh giá tần số SCE

Về cơ bản phương pháp nuôi cấy tế bào giống như phương pháp nuôi cấy để đánh giá đột biến NST Để nhuộm SCE chúng tôi dùng phương pháp của Perry và Wolf (1974) [22]

- Vào giờ thứ 24 của quá trình nuôi cấy, 5 - BromodeoxyUridin (5BrdU)

được cho vào môi trường nuôi cấy với nồng độ 10àg/ml Tế bào được thu hoạch vào giờ thứ 72

- Tiêu bản được nhuộm với dung dịch Hoechst 33258 nồng độ 0,5àg/ml,

xử lý đèn UV trong 2 giờ và dung dịch 2 SSC Tiêu bản được nhuộm bằng giemsa 5%

23

III kết quả và nhận xét

Sự phân bố của các đối t−ợng đ−ợc phân tích NST ở các địa điểm đ−ợc

trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Phân bố nhóm đối t−ợng nghiên cứu ở các địa điểm

Số mẫu đ−ợc đánh giá NST Số mẫu đ−ợc

đánh giá SCE

Địa điểm

Nhóm Nam Nữ Nam Nữ Biên Hoà Đồng Nai

An Hải – Hải Phòng

- Tràng Cát

+ A1.1, A1.2

+ A2 + B1, B2, B3, E2

- Nam Hải

+ A1.1, A1.2 + A2

+ B1, B2, B3, E2

- Cát Bi

+ A1.1, A1.2 + A2

+ B1, B2, B3, E2

- Đằng Lâm

+ A1.1, A1.2

+ A2 + B1, B2, B3, E2

Tổng cộng ở cả ba địa điểm (Biên Hoà, Nam Đông, An Hải) số nam giới

được đánh giá NST là 187 người, số nữ giới là 110 người, số nam giới được

đánh giá tần suất SCE là 86 người, số nữ giới là 56 người Ngoài các đối tượng

được thống kê ở trong bảng 3.1, còn một nhóm gồm những thành viên các gia

đình có người bị dị tật

3.1.Đánh giá tần số rối loạn nhiễm sắc thể

3.1.1 ở Biên Hoà - Đồng Nai

Trong quá trình đánh giá các tiêu bản ở các địa điểm nghiên cứu, chúng tôi không gặp các tế bào có rối loạn cụm, các tế bào đa tổn thương, các tế bào

25

có đảo đoạn hoặc nhân đoạn NST Vì vậy trong bảng thống kê dưới đây không ghi các dạng đột biến đó So sánh tần số các dạng đột biến NST ở nam và nữ của các nhóm, chúng tôi không thấy sự khác biệt do giới, nhận xét này cũng thống nhất với các kết quả nghiên cứu trước đây Do vậy trong phần phân tích

đột biến chúng tôi không tách ra thành nhóm nam, nhóm nữ, chúng tôi tập trung vào phân tích rối loạn ở các nhóm có nguy cơ cao và nhóm có nguy cơ thấp Các đối tượng được nghiên cứu hầu hết ở độ tuổi 16 - 60, vì vậy khi so sánh chúng tôi so với nhóm chứng ở độ tuổi này [28]

* ở Trung Dũng

Bảng 3.2: Tần số các dạng rối loạn NST ở các đối tượng nghiên cứu

Số tế bào với dạng rối loạn NST Nhóm nguy cơ cao

1.23 0.76 0.15 0.38 0.53 0.46 0.0 0.0 0.15

300

18

4.00 0.66 0.0

1.66 0.66 0.0 0.66 0.33 0.33 0.0 0.0 0.0

26

Nhận xét:

- ở nhóm nguy cơ thấp, tần số các dạng rối loạn NST đều không có sự khác biệt so với nhóm chứng ở người Việt Nam

- ở nhóm nguy cơ cao, tần số các dạng rối loạn NST nhìn chung không

có sự khác biệt so với nguy cơ thấp nhưng tần số tế bào đa bội và tần số trao

đổi nhiễm sắc tử (chromatid exchange) tăng cao

- Trong nhóm nguy cơ cao có hai trường hợp đột biến có thể là do đột biến trong quá trình phát sinh giao tử, đó là trường hợp Down thuần 47, XY, +21 và trường hợp Down do chuyển đoạn NST 14 và NST 21 Điều đặc biệt cần chú ý là hai trường hợp này đều là con của những ông bố có tần số tế bào

đa bội cao

* ở Tân Phong

Bảng 3.3: Tần số các dạng rối loạn NST ở các đối tượng nghiên cứu

Số tế bào với dạng rối loạn NST

1.37 0.58 0.0 0.39 0.39

480

30

4.31 0.83 0.0

1.04 0.62 0.0 0.20 0.41

27

0.20 0.0 0.0 0.0

Nhận xét:

Tỷ lệ các dạng đột biến NST ít không có sự khác biệt giữa hai nhóm phơi nhiễm cao và nhóm phơi nhiễm thấp Tần số các dạng rối loạn đều trong ngưỡng bình thường

* ở Tân Hạnh

Bảng 3.4: Tần số các dạng rối loạn NST ở các đối tượng nghiên cứu

Số tế bào với dạng rối loạn NST Nhóm nguy cơ cao

1.42 0.47 0.0 0.0 0.47 0.0 0.0 0.0 0.0

195

12

3.48 0.51 0.0

1.02 0.0 0.0 0.51 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

28

Nhận xét:

Cũng giống như Tân Phong tần số các dạng đột biến NST đều ở ngưỡng bình thường, không thấy xuất hiện các dạng đột biến trầm trọng như đa bội, trao đổi nhiễm sắc tử, NST hai tâm…

Tổng hợp các số liệu của Biên Hoà - Đồng Nai

Bảng 3.5: Trình bày tổng hợp các số liệu đ∙ thu được

từ các nhóm ở Biên Hoà - Đồng Nai

Số tế bào với dạng rối loạn NST

Nhóm nguy cơ cao

n = 40

Nhóm nguy cơ thấp

1.28 0.69 0.09 0.44 0.54 0.09 0.0 0.0 0.09

975

60

3.89 0.71 0.0

1.23 0.51 0.0 0.41 0.30 0.20 0.0 0.0 0.0

Nhận xét chung:

- Tần số tế bào đa bội tăng cao ở các nhóm nguy cơ cao hơn so với nhóm

có nguy cơ thấp và tăng cao hơn rõ ràng so với nhóm chứng Sự tăng cao tần số

tế bào đa bội không có ở nhiều đối tượng mà chỉ tập trung vào một số đối tượng thuộc nhóm nguy cơ cao, hai người trong nhóm này sinh con bị dị tật

- Ngoài tần số tế bào đa nội tăng cao, ở nhóm có nguy cơ cao số tế bào

có trao đổi nhiễm sắc tử, số đoạn không tâm và isogap cũng tăng cao so với nhóm có nguy cơ thấp nhưng chưa có ý nghĩa thống kê

- Ngoài các dạng đột biến đã nêu ở trên, tần số các tế bào với các dạng

đột biến còn lại được nghiên cứu không có sự khác biệt giữa hai nhóm

3.1.2 ở Huyện Nam Đông – Huế

* ở Hương Sơn

Bảng 3.6: Tần số các dạng rối loạn NST ở các nhóm thuộc x∙ Hương Sơn

Số tế bào với dạng rối loạn NST Nhóm nguy cơ cao

1.11 0.67 0.0

900

60

4.66 0.52 0.0

0.33 0.44 0.0

30

0.33 0.22 0.0 0.0 0.0 0.0

1.18 0.52 0.0 0.19 0.39 0.06 0.0 0.0 0.0

500

30

4.40 0.80 0.0

1.40 0.60 0.0 0.20 0.20 0.0 0.0 0.0 0.0

1.16 0.38 0.29 0.19 0.38 0.38 0.0 0.0 0.0

460

30

4.13 0.65 0.0

1.08 0.65 0.0 0.21 0.0 0.43 0.0 0.0 0.0

33

Tæng hîp c¸c sè liÖu ë Nam §«ng - HuÕ

1.15 0.53 0.07 0.17 0.41 0.17 0.0 0.0 0.0

1860

120

4.46 0.75 0.0

1.29 0.53 0.0 0.10 0.21 0.21 0.0 0.0 0.0

-TÇn sè c¸c d¹ng rèi lo¹n NST kh«ng cã sù kh¸c biÖt gi÷a nhãm nguy c¬ cao vµ nhãm nguy c¬ thÊp

34