Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật

Các gen mã hóa nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn nhưng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen c

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

Nguyễn Duy Phương

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA NHÂN

TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN

CỦA THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

Nguyễn Duy Phương

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA NHÂN

TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN

CỦA THỰC VẬT

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 62420116

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS Phạm Xuân Hội

2 GS.TS Phan Tuấn Nghĩa

Hà Nội – 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Phạm Xuân Hội và GS.TS Phan Tuấn Nghĩa

Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được tác giả nào công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Hà Nội, ngày 20 tháng 02 năm 201

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Duy Phương

6

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Xuân Hội (Viện Di truyền Nông nghiệp), GS.TS Phan Tuấn Nghĩa (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) và TS Narendra Tuteja (Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ sinh học Quốc tế, New Delhi, Ấn Độ) là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành bản luận

án này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

đạo Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về tất cả các thủ tục cần thiết trong quá trình học tập và thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật - Hóa sinh (Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN) đã giảng dạy trong suốt khóa học và tập thể cán bộ nghiên cứu của Bộ môn Bệnh học Phân tử (Viện DTNN), nhóm nghiên cứu của

TS Narendra Tuteja và các bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho tôi

để hoàn thành luận án tốt nghiệp này

Tôi xin được cảm ơn gia đình và người thân đã luôn ở bên cạnh tôi, quan tâm, cảm thông và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án

Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn tới Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đã cấp kinh phí nghiên cứu thông qua Đề tài mã số 106.06-2011.69 và Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ Sinh học Quốc tế (Italy) đã hỗ trợ về mặt tài chính và khoa học thông qua Chương trình học bổng

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 4

DANH MỤC BẢNG 7

DANH MỤC HÌNH 8

MỞ ĐẦU 10

Chương 1: TỔNG QUAN 13

1.1 HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT 13

1.1.1 Giới thiệu chung về hạn hán 13

1.1.2 Ảnh hưởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp 13

1.1.3 Ảnh hưởng của hạn hán đối với thực vật 14

1.1.4 Đáp ứng của thực vật với điều kiện hạn 16

1.1.5 Cơ sở phân tử của đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật 19

1.2 ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG GEN TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN 25

1.2.1 Promoter cảm ứng với điều kiện hạn 25

1.2.2 Điều hòa hoạt động gen sau phiên mã 27

1.2.3 Điều hòa dịch mã 30

1.2.4 Phân vùng mRNA trong tế bào chất 30

1.2.5 Điều hòa sau dịch mã 31

1.2.6 Vai trò điều hòa hoạt động gen của RNA không mã hóa 32

1.3 VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TRONG ĐÁP ỨNG HẠN 33

1.3.1 Nhân tố phiên mã AP2/ERF 35

1.3.2 Nhân tố phiên mã NAC 36

1.3.3 Nhân tố phiên mã WRKY 37

1.3.4 Một số nhân tố phiên mã khác 38

1.4 NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA LÚA BẰNG

CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN THỰC VẬT 40

1.4.1 Nghiên cứu chuyển gen vào lúa 40

1.4.2 Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn 43

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47

2.1 VẬT LIỆU 47

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 47

2.1.2 Chủng vi sinh vật 47

2.1.3 Vector và oligonucleotide 47

2.1.4 Hóa chất 49

2.1.5 Thiết bị 49

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49

2.2.1 Xử lý mẫu thực vật 49

2.2.2 Tách chiết, định lượng DNA/RNA 50

2.2.3 Nhân dòng gen OsNLI-IF vào vector pGEM-T 53

2.2.4 Thiết kế vector biểu hiện gen OsNLI-IF 55

2.2.5 Sàng lọc gen từ thư viện cDNA 58

2.2.6 Tạo kháng thể đa dòng kháng protein OsNLI-IF tái tổ hợp 65

2.2.7 Tạo cây chuyển gen biểu hiện OsNLI-IF 68

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN C U & THẢO LUẬN 72

3.1 PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ Ở LÚA 72

3.1.1 Tổng hợp thư viện cDNA thứ cấp 72

3.1.2 Phân lập gen mã hoá nhân tố phiên mã bằng kỹ thuật Y1H 73

3.1.3 Nhân dòng gen mã hóa protein OsNLI-IF 77

3.2 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN OsNLI-IF 80

3.2.1 Biểu hiện của gen OsNLI-IF trong các điều kiện stress phi sinh học 80

3.2.2 Hoạt tính liên kết đặc hiệu với đoạn DNA đích của OsNLI-IF 84

3.2.3 Hoạt tính hoạt hóa quá trình phiên mã của OsNLI-IF 88

3.2.4 Nghiên cứu protein tương tác với OsNLI-IF 93

3.3 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNLI-IF 98

3.3.1 Thiết kế hệ vector biểu hiện pCAMBIA1301 98

3.3.2 Thiết kế hệ vector biểu hiện pBI101 103

3.4 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG CÂY CHUYỂN GEN 107

3.4.1 Biến nạp vector biểu hiện vào A tumefaciens LBA4404 107

3.4.2 Nghiên cứu biểu hiện của OsNLI-IF trong cây thuốc lá 108

3.4.3 Nghiên cứu biểu hiện của OsNLI-IF trong cây lúa chuyển gen 121

KẾT LUẬN 132

KIẾN NGHỊ 133

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 134

TÀI LIỆU THAM KHẢO 135

PHỤ LỤC 147

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

3-AT 3-Amino-1, 2, 4-triazole

A thaliana Arabidopsis thaliana

A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

ABRE Yếu tố đáp ứng acid abscisic chứa trình tự ACGT

(ACGT-containing abscisic acid response element)

BSA Albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin) CBB Coomassie Brilliant Blue

cDNA DNA ung (complementary deoxyribonucleic acid)

Ct Chu kỳ ngƣỡng (threshold cycle)

(dehydration responsive element-binding protein)

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

HSP Protein sốc nhiệt (Heat shock protein)

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

LB Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Luria-Bertani

LEA Protein hình thành trong giai đoạn phát triển muộn của

phôi (late embryogenesis abundant)

MOPS Acid 3-(N-morpholino) propansulfonic

mRNA Messenger ribonucleic acid

MS Môi trường nuôi cấy thực vật Murashige & Skoog MS-R Môi trường MS nuôi cấy lúa

MS-T Môi trường MS nuôi cấy thuốc lá

NAA 1-naphthaleneacetic acid

NACRS Trình tự nhận biết protein NAC (NAC recognition

sequence) NLI-IF Nhân tố tương tác với yếu tố tương tác LIM trong

nhân (nuclear LIM interactor-interacting factor)

OD Mật độ quang học (optical density)

ORF Khung đọc mở (open reading frame)

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction)

PEG Polyethylene glycol

transcription polymerase chain reaction)

S cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

SDM Môi trường dinh dưỡng tối thiểu (synthetic defined

medium)

SDS-PAGE Điện di gel polyacrylamide (SDS -

Polyacrylamide gel electrophoresis)

TF Nhân tố phiên mã (transcription factor)

Ti-plasmid Plasmid gây khối u (tumor inducing plasmid)

-Trp/-Ura/Leu/-His/-Ade Môi trường khuyết dưỡng không có Triptophan/

Uracil/ Leucine/ Histidine/ Adenine X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Y1H Kỹ thuật lai phân tử trong tế bào nấm men dựa trên

tương tác DNA-protein (yeast one hybrid) Y2H Kỹ thuật lai phân tử trong tế bào nấm men dựa trên

tương tác protein-protein (yeast two hybrid)

(yeast extract – manitol)

destrose (yeast extract peptone dextrose)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Gen mã hóa nhân tố phiên mã tăng cường tính chịu hạn của lúa 46

Bảng 2.1: Trình tự các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu 48

Bảng 2.2: Thành phần gel polyacrylamide chứa SDS 66

Bảng 2.3: Thành phần môi trường MS cơ bản 69

Bảng 3.1: Kết quả sàng lọc thư viện cDNA xử lý stress bằng kỹ thuật Y1H 75

Bảng 3.2: Protein liên kết với đoạn DNA đích JRC0332 và JRC0528 76

Bảng 3.3: Kết quả sàng lọc thư viện cDNA xử lý stress bằng kỹ thuật Y2H 96

Bảng 3.4: Protein tương tác với OsNLI-IF sàng lọc từ thư viện cDNA 96

Bảng 3.5: Tỉ lệ nảy mầm của dòng thuốc lá T1 trên môi trường MS 111

Bảng 3.6: Tỉ lệ nảy mầm của dòng thuốc lá T1 trên môi trường có Hygromycin 112

Bảng 3.7: Kết quả phân tích PCR các dòng thuốc lá T1 113

Bảng 3.8: Tỉ lệ phục hồi sau xử lý stress hạn các dòng thuốc lá 120

Bảng 3.9: Kết quả chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn A tumefaciens 123

Bảng 3.10: Kết quả sàng lọc các dòng lúa chuyển gen T1 124

Bảng 3.11: Tỉ lệ cây lúa chuyển gen phục hồi sau xử lý hạn 130

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Mạng lưới các nhân tố phiên mã tham gia đáp ứng stress 34

Hình 2.1: Mô hình thí nghiệm xử lý stress hạn cây chuyển gen 50

Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector pCAM-35S/OsNLI-IF 57

Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế vector pBI-Lip9/OsNLI-IF và pBI-Ubi/OsNLI-IF 58

Hình 2.4: Sơ đồ vector HybriZAP-2.1 và vector pAD-GAL4-2.1 59

Hình 2.5: Sơ đồ phương pháp sàng lọc thư viện cDNA bằng Y1H 62

Hình 2.6: Sơ đồ phương pháp sàng lọc thư viện cDNA bằng Y2H 64

Hình 3.1: Chuẩn hoá nồng độ thư viện cDNA thứ cấp 72

Hình 3.2: Kiểm tra thư viện cDNA thứ cấp bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc 73

Hình 3.3: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện trong nấm men 74

Hình 3.4: Nhân bản đoạn gen OsNLI-IF bằng kỹ thuật PCR 78

Hình 3.5: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF 79

Hình 3.6: Trình tự OsNLI-IF trong vector tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF 80

Hình 3.7: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các điều kiện môi trường bất lợi 82

Hình 3.8: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pAD-GAL4 85

Hình 3.9: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp pAD/OsNLI-IF 86

Hình 3.10: Khả năng liên kết DNA đặc hiệu của OsNLI-IF trong nấm men 87

Hình 3.11: Ghép nối OsNLI-IF vào vector YEpGAP 89

Hình 3.12: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp YEpGAP/OsNLI-IF 90

Hình 3.13: Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF trong nấm men 91

Hình 3.14: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pGBKT7 94

Hình 3.15: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp pGBKT7/OsNLI-IF 94

Hình 3.16: Sơ đồ quá trình điều hòa hoạt động chức năng của OsNLI-IF 97

Hình 3.17: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pRT101 99

Hình 3.18: PCR và cắt giới hạn pRT/OsNLI-IF-S và pRT/OsNLI-IF-AS 100

Hình 3.19: Ghép nối cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào pCAMBIA1301 101

Hình 3.20: PCR và cắt giới hạn pCAM/OsNLI-IF-S và pCAM/OsNLI-IF-AS 102

Hình 3.21: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pBI-Ubi và pBI-Lip9 104

Hình 3.22: PCR khuẩn lạc mang pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF 104

Hình 3.23: PCR và cắt giới hạn pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF 105

Hình 3.24: PCR khuẩn lạc mang pCAM/OsNLI-IF-S và pCAM/OsNLI-IF-AS 107

Hình 3.25: PCR khuẩn lạc mang pBI-Lip9/OsNLI-IF và pBI-Ubi/OsNLI-IF 108

ấu trúc gen 35S:OsNLI-IF vào cây thuốc lá 109

Hình 3.27: PCR kiểm tra các dòng thuốc lá tái sinh 110

Hình 3.28: Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực Ni-NTA 114

Hình 3.29: Kiểm tra kháng thể IgG tinh sạch 115

Hình 3.30: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các dòng thuốc lá chuyển gen T1 116

Hình 3.31: Khả năng sinh trưởng của các dòng thuốc lá chuyển gen T1 118

Hình 3.32: Khả năng chống chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen 119

ấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF vào lúa 122

Hình 3.34: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các cây lúa chuyển gen T1 126

Hình 3.35: Hình thái của cây lúa chuyển gen T1 giai đoạn 3 lá non 128

Hình 3.36: Khả năng phục hồi sau xử lý stress hạn của cây lúa chuyển gen T1 129

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Hạn là yếu tố môi trường gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp, làm giảm năng suất, sản lượng cây trồng và dẫn tới tình trạng mất an ninh lương thực Đặc biệt, trong bối cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy ra ngày càng thường xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, nhiều lúc vượt quá tầm kiểm soát của con người Chính vì vậy, việc nghiên cứu các gen liên quan tới tính chịu hạn để tiến tới tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng chịu hạn có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với việc duy trì và tăng sản lượng nông nghiệp, góp phần giữ ổn định an ninh lương thực quốc gia

Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen và sự biểu hiện của các gen liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã Các nhà khoa học đã chứng minh được chức năng quan trọng của nhóm gen điều khiển trong việc tăng cường tính chịu hạn ở thực vật

Do đó, việc nghiên cứu phân lập và đặc tính gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn đang trở thành xu hướng triển vọng và nhận được

sự quan tâm đặc biệt Hàng loạt gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn đã được xác định và chuyển vào các giống cây trồng khác nhau Các gen

mã hóa nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn nhưng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác, dẫn tới làm tăng cường khả năng chịu hạn của thực vật Nhiều cây trồng chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã đã được chứng minh tăng cường khả năng chịu hạn so với cây không chuyển gen

Ở Việt Nam, trong khoảng 10 năm trở lại đây, các nghiên cứu về phân lập gen chịu hạn mục tạo giống cây trồng chống chịu hạn bằng công nghệ chuyển gen thực vật đã được một số phòng thí nghiệm quan tâm Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu về gen chống chịu stress môi trường nói chung và chống chịu hạn nói riêng đều sử dụng các nguồn gen từ nước ngoài hoặc các gen đã được công bố bởi các nhóm nghiên cứu khác trên thế giới Cho đến nay, chúng ta vẫn

chƣa có một nghiên cứu cơ bản hoàn chỉnh nào về phân lập và nghiên cứu chức năng gen liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật, đặc biệt là nhóm gen

mã hóa nhân tố phiên mã

, chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ “Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập và xác định trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF điều khiển tính chịu hạn từ lúa

- Nghiên cứu một số đặc tính của gen mã hóa nhân tố phiên mã

OsNLI-IF phân lập đƣợc trên cây lúa chuyển gen mô hình

3 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu

Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF

liên quan tới đáp ứng chống chịu hạn của lúa Oryza sativa L (Pusa Basmati 1)

nội dung chính:

- Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF liên quan đến chống chịu điều kiện bất lợi ở lúa

- Nghiên cứu đặc điểm chức năng của protein OsNLI-IF

- Thiết kế các hệ vector biểu hiện gen OsNLI-IF trong tế bào thực vật

- Nghiên cứu biểu hiện OsNLI-IF trong cây chuyển gen mô hình

4 Địa điểm nghiên cứu

Các nghiên cứu của luận án đƣợc thực hiện tại 3 địa điểm chính:

- Bộ môn Bệnh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam)

- Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật thuộc Trung tâm Kỹ thuật di truyền và Công nghệ sinh học Quốc tế (Ấn Độ)

5 Đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam thực hiện một cách có hệ thống về

nghiên cứu cơ bản theo định hướng ứng dụng gen OsNLI-IF chưa được xác định chức năng Gen OsNLI-IF được chứng minh mã hóa một nhân tố phiên mã hoạt

động cảm ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi như hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao và

có khả năng tăng cường tính chịu hạn trong các cây chuyển gen mô hình (thuốc lá/

lúa) Ngoài ra, các vector biểu hiện gen OsNLI-IF được điểu khiển bởi các promoter hoạt động liên tục (35S và Ubiquitin) và hoạt động trong điều kiện stress (Lip9) đã

được chuyển vào cây mô hình để nghiên cứu biểu hiện gen

6 Ứng dụng thực tiễn của luận án

Kết quả nghiên cứu của luận án lần đầu tiên đã chứng minh vai trò tăng

cường tính chịu hạn của gen OsNLI-IF trong các dòng cây chuyển gen Trên cơ sở kết quả của luận án, các vector biểu hiện gen OsNLI-IF do luận án tạo ra đang được

nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan trọng như ngô, đậu tương, bông…

để chọn tạo các giống cây chuyển gen chịu hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT

1.1.1 Giới thiệu chung về hạn hán

Nước là thành phần cơ bản nhất của sự sống, tất cả mọi sinh vật đều cần có nước để duy trì sự sống Chính vì vậy, nguồn nước trong môi trường sống rất quan trọng đối với đời sống của sinh vật Đặc biệt đối với thực vật, nước có vai trò sống còn, quyết định sự tồn tại và phát triển của thực vật Nhu cầu về nước của thực vật phụ thuộc vào từng loài và từng giai đoạn phát triển của chúng

Hạn đối với thực vật là khái niệm được dùng để chỉ trạng thái thiếu nước do môi trường gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn cụ thể, làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Trong nông nghiệp, hạn hán được xác định khi đất không có đủ độ ẩm và lượng mưa không đủ cung cấp cho mùa màng, làm cho cây trồng không đủ độ ẩm để duy trì sự tăng trưởng

và sản lượng trung bình Ảnh hưởng của hạn hán trong nông nghiệp rất khó

ước lượng vì tính phức tạp trong sự tăng trưởng cây trồng và khả năng xuất hiện của các nhân tố khác như sâu bọ, cỏ dại, đất kém màu mỡ và sự ô nhiễm môi trường cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và năng suất của cây trồng [20]

Các yếu tố gây hạn của môi trường như thành phần thổ nhưỡng, thời tiết, khí hậu, nhiệt độ, gió nóng… gây nên hiện tượng thiếu nước của cây, nguyên nhân chính là do sự mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa tế bào và môi trường, dẫn đến sự thiếu hụt nước trong tế bào Tùy theo mức độ, hạn được chia ra thành ba loại: hạn không khí, hạn đất và hạn toàn diện Đối với mỗi loại sẽ gây ra những ảnh hưởng khác nhau, nhẹ thì giảm năng suất, nặng thì có thể dẫn đến tình trạng hủy hoại cây trồng, mùa màng [20, 105]

1.1.2 Ảnh hưởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp

Trong các yếu tố bất lợi của môi trường, hạn hán là nhân tố chính và phổ biến nhất gây ảnh hưởng tiêu cực đến sản xuất nông nghiệp Do biến đổi khí hậu (BĐKH) toàn cầu, hiện nay các vùng canh tác phải đối mặt với hạn hán chiếm khoảng 1% tổng diện tích đất nông nghiệp và được dự báo sẽ tăng lên 30% vào cuối

thế kỉ 21 [126] Mức độ ảnh hưởng của hạn hán trong nông nghiệp phụ thuộc vào tần suất, cường độ, tính khắc nghiệt và tính nhạy cảm của đối tượng cây trồng Ảnh hưởng của hạn hán đối với nông nghiệp có thể diễn ra theo chu kỳ hoặc thậm chí là mãi mãi, do tác động tới chất lượng sản phẩm, giảm năng suất, tăng nguy cơ nhiễm bệnh và các dịch hại do sâu bọ, tăng chi phí tưới tiêu, dẫn tới làm mất sản lượng cây trồng và giảm thu nhập của người nông dân Tác động của hạn hán làm sản lượng lúa gạo tụt giảm; lượng gạo dự trữ thấp đã buộc các quốc gia xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới (trong đó có Việt Nam) phải áp dụng chính sách hạn chế xuất khẩu để đảm bảo an ninh lương thực quốc gia, trong khi nhu cầu nhập khẩu gạo của các quốc gia khác (đặc biệt là Trung Quốc) tăng cao Đây chính là nguyên nhân tạo ra cơn sốt gạo năm 2008, đẩy giá gạo lên mức cao kỷ lục mới (>1.000 USD/tấn) và gây ra những tác động tiêu cực đến đời sống kinh tế [3, 134].

Việt Nam với nền kinh tế chủ yếu dựa vào sản xuất nông nghiệp cũng là một trong số các quốc gia nằm trong vùng chịu ảnh hưởng nặng nề của hiện tượng BĐKH Theo dự báo của FAO, do tác động của hạn hán, sản lượng lúa gạo hai vụ xuân và vụ mùa trên khắp cả nước, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Hồng

sẽ có xu hướng giảm dần, có thể giảm tới 12,5% vào năm 2050 và 16,5% vào năm 2070 Hệ quả của các tác động này là áp lực ngày càng tăng đối với giá lúa gạo trên thị trường thế giới do Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu gạo quan trọng nhất trên thế giới Chính vì vậy, các chính sách tăng trưởng xanh và toàn diện trong ngành nông nghiệp để đối phó với hạn hán phải được chính phủ xem là vấn đề trọng tâm cần giải quyết và cần có sự tham gia của tất cả các thành phần trong xã hội [135]

1.1.3 Ảnh hưởng của hạn hán đối với thực vật

Môi trường khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật ở tất cả các cấp độ, từ hình thái tới phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển [38]

Hạn hán khi xảy ra sẽ gây ảnh hưởng đầu tiên tới quá trình trao đổi nước với môi trường và quá trình kiểm soát hàm lượng nước trong cơ thể của thực vật Đây là quá trình được điều hòa bởi nhiều yếu tố khác nhau như lượng nước dự trữ trong

mô, thế nước của lá, khả năng hoạt động của khí khổng, tốc độ bay hơi nước, nhiệt

độ lá và tán lá Khi tiếp xúc với hạn hán, thế nước trong lá, hàm lượng nước trong

cơ thể, tốc độ thoát hơi nước và độ dẫn của khí khổng đều bị giảm, trong khi nhiệt

độ lá tăng lên Một số loài thực vật duy trì hiệu quả sử dụng nước (tỉ số giữa trọng lượng khô và lượng nước tiêu thụ) trong giai đoạn hạn hán bằng cách giảm sự mất nước Tuy nhiên, khi hạn hán xảy ra trong phạm vi rộng và quy mô lớn, hiệu quả sử dụng nước của phần lớn các loài thực vật đều giảm rõ rệt [16, 38]

Sự mất cân bằng trao đổi nước trong điều kiện hạn làm giảm sức trương tế bào, dẫn tới những ảnh hưởng về sinh trưởng và phát triển của thực vật Ở thực vật bậc cao, khi cây bị thiếu nước nghiêm trọng, quá trình kéo dài tế bào bị ức chế do dòng nước từ xylem dẫn tới các tế bào đang trong quá trình nguyên phân bị cản trở

Hệ quả là thực vật bị giảm chiều cao, giảm diện tích che phủ của lá và cuối cùng dẫn tới giảm khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối [16, 38]

Ở các loài thực vật bậc cao, sự thiếu hụt nước trong môi trường đất thường làm giảm khả năng sử dụng, hấp thụ, vận chuyển và trao đổi chất dinh dưỡng Khi

bị hạn hán, rễ không thể hấp thu và vận chuyển chất dinh dưỡng tới thân, do đó ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất của tế bào Ngoài ra, tốc độ thoát hơi nước giảm trong điều kiện hạn cũng làm giảm khả năng hấp thụ và hiệu quả sử dụng chất dinh dưỡng của thực vật [16, 38]

Để giảm sự thoát hơi nước trong điều kiện môi trường khô hạn, thực vật thường có một số cơ chế thích nghi như đóng khí khổng, giảm tiết diện lá, thu hẹp

độ che phủ tán lá hay tăng tính nhạy cảm của lá non Tuy nhiên, đây lại là những yếu tố gây ảnh hưởng trực tiếp tới bộ máy quang hợp vì ngăn cản dòng CO2 đi vào

lá và làm giảm quá trình cố định cacbon, dẫn tới sự giảm khả năng tổng hợp và tích lũy sinh khối của thực vật Ngoài ra, do bị thiếu nước, thể tích tế bào giảm, độ nhớt của tế bào chất tăng làm tăng tính tương tác giữa các phân tử và ảnh hưởng tới hoạt động chức năng của các enzyme và các thành phần sắc tố của bộ máy quang hợp [16, 38] Ngoài ra, sự ức chế phản ứng phosphoryl hóa và tổng hợp ATP từ ADP cũng là một yếu tố ảnh hưởng tới quá trình quang hợp Cùng với đó,

sự thay đổi khả năng sử dụng CO2 của diệp lục (do đóng khí khổng) cũng là một nguyên nhân làm giảm hoạt động bộ máy quang hợp [38]

Khả năng đồng hóa CO2 giảm trong điều kiện môi trường khô hạn dẫn tới hệ quả làm tăng tính nhạy cảm của thực vật với những tổn thương do ánh sáng mặt trời gây nên Đồng thời, khi quá trình quang hợp bị ảnh hưởng còn gây ra sự dư thừa điện tử, là nguyên nhân chính làm sản sinh các dạng oxy (ROS) gây độc

tế bào, bao gồm các gốc anion superoxide, hydroxyl, hydro peroxide, alkoxy (RO) và oxy nguyên tử ROS được hình thành theo cả hai cơ chế phụ thuộc và không phụ thuộc enzyme ROS có thể được tạo ra dưới dạng sản phẩm phụ trong chuỗi truyền điện tử của lục lạp, ti thể và màng tế bào chất Bên cạnh đó, trong tế bào có rất nhiều enzyme tham gia vào các phản ứng sinh ROS như xanthine oxidase, superoxide dismutase, peroxidase, catalase, amino acid oxidase, glucose oxidase Sự tích lũy ROS trong điều kiện hạn có thể gây ra rất nhiều các tổn thương cho tế bào: peroxide hóa lipid gây tổn thương màng tế bào, oxy hóa và phân giải protein, bất hoạt enzyme, phân giải DNA… [38]

Hô hấp cũng là một quá trình sinh lý bị ảnh hưởng bởi những tác động của hạn hán Khi môi trường đất trở nên khô hạn, bộ máy hô hấp của các tế bào rễ (nơi tiêu thụ sản phẩm cacbon được cố định từ quá trình quang hợp nhiều nhất trong cơ thể thực vật) tăng cường hoạt động rất mạnh nhằm duy trì sự sinh trưởng, tích lũy sinh khối và thực hiện các hoạt động chức năng quan trọng của rễ Tuy nhiên, tốc

độ quang hợp thường bị giới hạn do ảnh hưởng của sự khô hạn, chính điều này đã gây nên hiện tượng mất cân bằng các nguồn cacbon trong cơ thể thực vật, dẫn tới giảm quá trình tổng hợp ATP và tăng sản sinh ROS gây độc tế bào [38]

1.1.4 Đáp ứng của thực vật với điều kiện hạn

Trong môi trường tự nhiên, thực vật đối phó với điều kiện khô hạn hán bằng rất nhiều đáp ứng khác nhau để duy trì sự sống Đối với cây trồng, “chịu hạn” được định nghĩa là khả năng sinh trưởng, ra hoa và cho sản lượng cao trong điều kiện nguồn cung cấp nước không đầy đủ Môi trường khô hạn làm xuất hiện hàng loạt các phản ứng không đặc trưng trong tế bào, dẫn tới hàng loạt các tổn thương cho cơ

thể thực vật Để đối phó với điều kiện hạn hán, trước tiên thực vật sẽ khởi động cơ chế phòng vệ chống lại sự thiếu hụt nước, sau đó sẽ là một loạt các cơ chế ở các cấp

độ khác nhau Đáp ứng của thực vật với điều kiện hạn có thể chia thành ba loại: đáp ứng hình thái, đáp ứng sinh lý và đáp ứng hóa sinh [18, 38]

1.1.4.1 Đáp ứng hình thái

Đáp ứng hình thái là một cơ chế thích nghi của thực vật với điều kiện môi trường hạn hán kéo dài Ở mức độ hình thái, thực vật đáp ứng lại với điều kiện hạn bằng hai khả năng: trốn hạn (escape) và tránh hạn (avoidance) [38]

Trốn hạn là cách thực vật rút ngắn chu kỳ sống hay thời gian sinh trưởng để

có thể sinh sản trước khi môi trường trở nên khô hạn Thay đổi thời gian ra hoa là một dấu hiệu quan trọng chứng tỏ sự thích nghi của thực vật với môi trường, thường xuất hiện khi thời gian sinh trưởng bị giới hạn bởi điều kiện hạn và nhiệt độ cao Trong nông nghiệp, việc kết hợp thời gian sinh trưởng của cây trồng với thời gian đất có độ ẩm cao là yếu tố quyết định tạo ra sản lượng thu hoạch cao [17, 38]

Tránh hạn là cơ chế thực vật thay đổi linh hoạt kiểu hình để giảm thiểu sự mất nước, đồng thời duy trì lượng nước hấp thụ vào cơ thể trong điều kiện hạn hán Khi môi trường trở nên khô hạn, thực vật phát triển một hệ rễ dày và đâm sâu để có thể hấp thụ đầy đủ lượng nước cho quá trình sinh trưởng Ở một số loài thực vật thuộc họ cọ, ví dụ như cây dừa còn có hiện tượng thay đổi đường kính và cấu trúc thân để đáp ứng với điều kiện môi trường hạn hán Ngoài ra, để giảm sự thoát hơi nước, thực vật thường hạn chế số lượng, tiết diện và độ che phủ của lá Trong điều kiện nhiệt độ cao, sự hình thành các lớp bảo vệ trên bề mặt lá như lông tơ cũng là một cơ chế giúp giảm nhiệt độ và tốc độ thoát hơi nước trên bề mặt lá, đồng thời tăng mức độ phản xạ ánh sáng để bảo vệ lá [38]

1.1.4.2 Đáp ứng sinh lý

Các đáp ứng tức thì trong thời gian ngắn của thực vật khi cơ thể bị thiếu nước do khô hạn chủ yếu liên quan tới các đáp ứng sinh lý Để thích nghi với điều kiện môi trường khô hạn, thực vật chủ yếu tập trung vào việc duy trì thế nước trong các mô, cơ quan quan trọng Tích lũy và dự trữ nước trong cơ thể là phương thức

thích nghi phổ biến nhất của các loài thực vật với stress hạn Hạn chế sự thoát hơi nước thông qua hoạt động đóng khí khổng (qua trung gian acid abcisic) cũng là một

cơ chế đáp ứng nhanh với hạn của thực vật Một số biến đổi thích nghi trong điều kiện hạn thường thấy ở thực vật như hình thành mô xốp dự trữ nước, thay đổi tính thấm biểu bì, cuốn lá và rụng lá để giảm thoát hơi nước Bên cạnh đó, để bù đắp lượng nước bị thiếu hụt do môi trường khô hạn, rễ thực vật đã phát triển đặc tính hướng nước rất nhạy, giúp thực vật có thể phát hiện ra các tầng đất có gradient nước cao và hướng sự phát triển các nhánh rễ tới những vị trí này [18]

Thực vật có khả năng đối phó với stress hạn bằng cách giảm hoạt động trao đổi chất Một số loài thực vật còn có khả năng duy trì các chức năng sinh học trong điều kiện thế nước thấp Thực vật C4 thích nghi với hạn hán nhờ khả năng giảm thiểu sự mất hơi nước trong quá trình cố định CO2 (thông qua cơ chế tích lũy CO2vào ban đêm), do đó chỉ sử dụng một lượng nước rất ít so với với thực vật C3 [18]

Một đáp ứng sinh lý phổ biến khác của thực vật với điều kiện hạn là điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhờ quá trình tổng hợp mới một số hợp chất như đường, acid amin, glycine-betaine Các hòa tan trong nước có khả năng bắt giữ các phân tử nước trong giai đoạn môi trường khô hạn, đồng thời không gây độc tế bào hay cản trở trao đổi chất của tế bào khi tích lũy ở nồng độ cao [18]

1.1.4.3 Đáp ứng hóa sinh

Đáp ứng hóa sinh đầu tiên của tế bào nhâ với các loại stress sinh học (biotic) và phi sinh học (abiotic) là sản sinh ra ROS Ở thực vật, quá trình sản sinh ROS là một đáp ứng phòng vệ sớm của tế bào với stress hạn ROS bao gồmsuperoxide, peroxide ốc hydroxyl, được tạo ra trong quá trình trao đổi chất bình thường liên quan đến oxy và đóng vai trò quan trọng đối với các con đường truyền tín hiệu của tế bào Quá trình hoạt hóa oxy xảy ra theo hai cơ chế: (i) cơ chế đảo chiều quay của các electron không bắt cặp và (ii) cơ chế khử đơn cực Theo cơ chế thứ nhất, nguyên tử oxy ở trạng thái “triplet” khi hấp thụ đủ năng lượng sẽ đảo chiều quay của một điện tử không bắt cặp để tạo ra trạng thái “singlet” với hai điện tử quay ngược chiều Cơ chế hoạt hóa oxy thứ hai trải qua các phản ứng khử đơn cực

oxy tạo thành superoxide, peroxide hydro, gốc hydroxyl và nước Trong điều kiện hạn hán, các ROS hoạt động như những phân tử tín hiệu thứ cấp để khởi động các phản ứng phòng vệ của tế bào Tuy nhiên, khi hàm lượng ROS tăng cao trong giai đoạn tế bào bị stress hạn sẽ gây ra các tổn thương oxy hóa cho tế bào Do có tính phản ứng rất mạnh, các ROS có thể gây peroxide hóa lipid, phân giải protein, oxy hóa DNA và thậm chí có thể gây chết tế bào Để giảm thiểu ảnh hưởng của stress oxy hóa sinh ra trong điều kiện môi trường khô hạn, thực vật đã hình thành một hệ thống bảo vệ chống oxy hóa rất phức tạp, bao gồm các enzyme (ví dụ như superoxide dismutase, catalase, peroxidase, ascorbate peroxidase, glutathione reductase…) và các thành phần không phải enzyme (ví dụ như glutathione, acid ascorbic, carotenoid ) ROS được loại

bỏ khỏi tế bào theo cả hai cơ chế phụ thuộc và không phụ thuộc enzyme, trong đó sử dụng enzyme là cơ chế hiệu quả nhất để chống lại stress oxy hóa [13, 16, 38]

1.1.5 Cơ sở phân tử của đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật

Đáp ứng chống chịu hạn của thực vật được thực hiện thông qua một chuỗi các quá trình rất phức tạp, với sự tham gia của hàng loạt yếu tố: ABA, citokinin, auxin, ethylene khởi đầu chuỗi truyền tín hiệu; canxi và IP3 đóng vai trò chất truyền tín hiệu thứ cấp; các chất hòa tan, protein sốc nhiệt (HSP), protein LEA, osmotin, protein chống oxy hóa, aquaporin là các yếu tố trực tiếp tham gia đáp ứng stress Quá trình đáp ứng với điều kiện môi trường khô hạn của thực vật có thể chia thành 3 giai đoạn: nhận tín hiệu, dẫn truyền tín hiệu đáp ứng chống chịu [13]

Nhận tín hiệu là bước đầu tiên để thực vật đáp ứng với stress môi trường Một “cảm biến stress” phải có khả năng phát hiện những thay đổi của điều kiện môi trường và dẫn truyền tín hiệu stress khởi đầu đến đúng đích tế bào Mỗi một loại kích thích của môi trường sẽ tạo ra một thông tin đặc trưng gửi tới tế bào thực vật

và thực vật nhận biết thông tin này thông qua rất nhiều loại thụ thể khác nhau Tuy nhiên, hầu hết các thụ thể nhận tín hiệu môi trường và cơ chế nhận biết tín hiệu cho tới nay vẫn chưa được xác định Cho tới nay, các nhà khoa học vẫn cho rằng rễ là

cơ quan có khả năng cảm nhận stress hạn của môi trường và ABA là phân tử tín hiệu nội sinh có vai trò then chốt trong quá trình này [18, 95] Một số nghiên

cứu trên cây mô hình Arabidopsis thaliana cho thấy histidine kinase AtHK1 cũng

có thể liên quan tới quá trình cảm nhận tín hiệu thay đổi áp suất thẩm thấu Sự biểu hiện của AtHK1 kéo theo sự biểu hiện của một số nhân tố phiên mã đáp ứng stress (ví dụ như AREB1, ANAC, DREB2A) và các protein này đóng vai trò là yếu tố điều hòa dương tính của đáp ứng chống chịu hạn và mặn theo cả hai con

đường phụ thuộc và không phụ thuộc ABA ở A thaliana Tuy nhiên, những bằng

chứng cụ thể chứng minh vai trò của các protein này vẫn chưa được tìm ra Dựa trên thực tế các nhân tố môi trường như hạn, mặn và lạnh đều dẫn tới sự thay đổi

về áp suất thẩm thấu và kích thích tế bào thực vật sinh ra các đáp ứng đặc trưng, điều này có thể chứng minh sự tồn tại của các thụ thể cảm nhận áp suất thẩm thấu riêng biệt cho từng con đường dẫn truyền tín hiệu stress [13, 18, 41]

Con đường truyền tín hiệu stress của môi trường được khởi động khi tế bào thực vật nhận được kích thích ngoại bào Sau khi các thụ thể trên màng tế bào nhận biết tín hiệu stress hạn và các protein màng xử lý tín hiệu, tế bào sẽ sản sinh ra các phân tử tín hiệu thứ cấp thông qua các phản ứng enzyme đặc trưng Phân tử tín hiệu thứ cấp được chia thành ba loại cơ bản: (i) các phân tử kị nước (ví dụ như diacylglycerol, IP3 và phosphatidylinositol) liên kết với màng và có thể khuếch tán từ màng sinh chất vào vùng cận màng để phản ứng và điều hòa các protein đáp ứng trên màng; (ii) các phân tử ưa nước (ví dụ như cAMP, cGMP và Ca2+) nằm trong tế bào chất (iii) các phân tử khí (ví dụ như NO và CO) có thể khuếch tán xuyên qua tế bào chất và màng tế bào Ngoài ra, các ROS sinh ra trong điều kiện stress hạn cũng đóng vai trò là phân tử tín hiệu thứ cấp trong con đường truyền tín hiệu của tế bào tới

bộ máy đáp ứng stress Một số loại phân tử tín hiệu khác được dự trữ trong các bào quan riêng và có thể được giải phóng nhanh chóng khi cần thiết như Ca2+ [13, 41]

Phân tử tín hiệu thứ cấp thường khởi đầu bằng một chuỗi các phản ứng phosphoryl hóa protein và cuối cùng tác động tới các protein đích trực tiếp tham gia vào đáp ứng thích nghi stress hoặc các nhân tố phiên mã điều khiển một nhóm gen chức năng đặc trưng Các protein do các gen này mã hóa có thể tham gia vào quá trình tổng hợp các phân tử điều hòa như ABA, ethylene và acid salicylic để

tiếp tục khởi động một vòng truyền tín hiệu thứ cấp khác Quá trình truyền tín hiệu đòi hỏi các điều kiện chính xác về không gian và thời gian đối với tất cả các phân

tử tín hiệu Chính vì vậy, ngoài các thành phần trực tiếp dẫn truyền tín hiệu, trong

tế bào còn có những phân tử nhất định tham gia vào quá trình biến đổi, đóng gói hoặc cấu thành các thành phần tín hiệu Các phân tử hỗ trợ này bao gồm các yếu

tố biến đổi protein, ví dụ như enzyme lipid hóa, methyl hóa, glycosyl hóa và ubiquitin hóa protein… [13]

Phosphoryl hóa protein là một trong những cơ chế chính thực vật kiểm soát các quá trình tế bào nhằm đáp ứng với các tín hiệu stress của môi trường Protein kinase liên quan tới đáp ứng stress của thực vật được chia thành hai nhóm chính: protein kinase hoạt hóa mitogen (mitogen-activated protein kinase – MAPK)

và protein kinase phụ thuộc canxi (calcium-dependent protein kinase – CDPK) Cả hai nhóm protein này đều liên quan tới quá trình đáp ứng với nhiều loại stress môi trường khác nhau (trong đó có stress hạn) và đều được hoạt hóa rất nhanh ngay sau khi tế bào tiếp xúc với yếu tố stress [13, 41]

Chuỗi truyền tín hiệu MAPK đặc trưng bởi sự tham gia của ba thành phần protein kinase, bao gồm MAPKKK (mitogen-activated protein kinase kinase kinase), MAPKK (mitogen-activated protein kinase kinase) và MAPK Chu trình phosphoryl hóa MAPK liên kết với rất nhiều loại phân tử tín hiệu thứ cấp thông qua sự tương tác với các loại kinase khác hoặc protein G Một số nghiên cứu đã chứng minh H2O2 và một số ion kim loại nặng như đồng, kẽm có thể hoạt hóa con đường truyền tín hiệu MAPK Tuy nhiên, hầu hết các phân tử tín hiệu thứ cấp hoạt hóa con đường MAPK vẫn chưa được tìm ra [13, 41]

Con đường dẫn truyền tín hiệu stress khởi đầu bởi Ca2+

có sự tham gia của nhiều loại protein kinase liên kết canxi khác nhau, bao gồm CaM (calmodulin), CBL (calcineurin B-like protein), CIPK (calcineurin B-like-interacting protein kinase) và CDPK Quá trình hoạt hóa các protein này phụ thuộc vào nồng độ Ca2+ trong tế bào chất và khả năng liên kết với Ca2+ Các phân tử CDPK hoạt hóa đáp ứng tín hiệu bằng cách phosphoryl hóa các cơ chất đặc trưng (ví dụ như sucrose synthase ở lúa, ngô và

đậu tương) Tuy nhiên, cũng như con đường MAPK, hầu hết các đích tác động của các CDPK cho đến nay vẫn chưa được phát hiện và nghiên cứu [13, 41, 52]

ABA là hormone có vai trò rất quan trọng, được tích lũy với hàm lượng lớn khi thực vật đáp ứng với stress hạn Hai chức năng được nghiên cứu nhiều nhất của ABA trong đáp ứng stress hạn là đóng khí khổng và điều hòa biểu hiện của một nhóm lớn các gen đáp ứng stress Chính vì vậy, quá trình dẫn truyền tín hiệu stress hạn thường liên quan chặt chẽ với quá trình dẫn truyền tín hiệu ABA Trong tế bào thực vật tồn tại song song hai con đường truyền tín hiệu stress: phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA Nhiều nghiên cứu đã chứng minh ABA có khả năng hoạt hóa nhiều loại protein kinase Các protein kinase sau đó sẽ tiếp tục hoạt hóa các nhân tố phiên mã thông qua quá trình phosphoryl hóa để điều khiển sự biểu hiện của các gen chức năng đáp ứng stress hạn [41]

Để đáp ứng lại tín hiệu stress hạn, tế bào thực vật tăng cường sự biểu hiện của hàng loạt các gen liên quan tới đáp ứng chống chịu Dựa vào chức năng trong đáp ứng chống chịu hạn, có thể chia sản phẩm protein của các gen chức năng này thành một số nhóm: protein tham gia vào quá trình tổng hợp chất hòa tan, enzyme chống oxy hóa, protein sốc nhiệt, protein LEA (late embryogenesis abundant protein), aquaporin, polyamin, protein tham gia ổn định cấu trúc màng, protein tham gia vào các quá trình tổng hợp, phân giải và sửa chữa [13, 52]

Chất hữu cơ hòa tan là những hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ, tính tan cao

và không gây ảnh hưởng tới các hoạt động trao đổi chất bình thường của tế bào khi tích lũy với nồng độ cao trong tế bào chất Hợp chất hữu cơ hòa tan được tổng hợp trong quá trình đáp ứng stress hạn của tế bào được chia thành ba nhóm chính: các acid amin (ví dụ như proline), hợp chất amin bậc IV (ví dụ như glycine betaine, polyamine, dimethyl sulfonioproprionate) và polyol/đường (ví dụ như mannitol, galactinol, sorbitol, sucrose, trehalose) [13, 38, 52] Các hợp chất hữu cơ hòa tan bảo

vệ tế bào thông qua nhiều phương thức khác nhau như phân bố để điều chỉnh áp suất thẩm thấu, hấp dẫn/giữ nước cho tế bào, duy trì sức trương tế bào, khử tính độc của các chất oxy hóa, giữ ổn định màng và cấu trúc tự nhiên của protein và enzyme Tuy

nhiên, cho tới nay, cơ chế bảo vệ chính xác của các hợp chất hữu cơ hòa tan được tổng hợp trong đáp ứng stress hạn của thực vậ [38, 52]

Bên cạnh các hợp chất hữu cơ hòa tan, trong điều kiện stress hạn, tế bào thực vật còn tích lũy các ROS với nồng độ cao Hệ thống khử độc ROS của tế bào thực vật được chia thành hai loại: hoạt động phụ thuộc enzyme và không phụ thuộc enzyme [13] Các enzyme tham gia chống oxy hóa bao gồm superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), ascorbate peroxidase (APX) và glutathione reductase Các enzyme thuộc hệ thống này có thể trực tiếp loại bỏ ROS hoặc tham gia vào quá trình tổng hợp các hợp chất chống oxy hóa không phải là enzyme Việc duy trì hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa ở mức cao giúp tế bào tăng khả năng chống lại các tổn thương oxy hóa, nhờ đó tăng khả năng chống chịu hạn của thực vật [16] Hệ thống bảo vệ chống oxy hóa không sử dụng enzyme bao gồm các hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ như glutathione, acid ascorbic, carotenoid, tocopherol Các hợp chất này thường hoạt động kết hợp với nhau để bảo vệ hệ thống màng quang hợp trong điều kiện stress oxy hóa Ví dụ, sắc tố β-carotene trong lục lạp có khả năng giảm nhanh trạng thái triplet của diệp lục để ngăn cản quá trình sản sinh oxy nguyên tử, qua đó bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương do oxy hóa; sắc tố α-tocopherol cũng có khả năng bảo vệ lipid và các thành phần khác trên màng lục lạp theo cả hai cơ chế vật lý và hóa học, nhờ đó bảo vệ cấu trúc và chức năng của quang hệ II [13, 16, 38]

Một hợp chất khác có chức năng bảo vệ tế bào thực vật trong điều kiện stress hạn là các protein sốc nhiệt (HSP) Đây là một loại chaperone phân tử

n tham gia vào quá trình tổng hợp, vận chuyển, biến đổi và phân giải protein trong nhiều chu trình tế bào trong điều kiện stress Nhiều nghiên cứu đã chứng minh HSP không chỉ được tổng hợp khi tế bào bị sốc nhiệt mà còn được tích lũy trong các điều kiện stress muối, oxy hóa và hạn Quá trình phân giải protein xảy ra trong điều kiện hạn do thể tích tế bào bị giảm và khả năng tương tác của protein với các yếu tố phân giải tăng Khi đó, HSP sẽ có nhiệm vụ duy trì và sửa chữa cấu trúc của các protein chức năng, đồng thời tham gia vận

chuyển các protein sai hỏng tới bộ máy phân giải để loại bỏ khỏi tế bào Một số

nghiên cứu về chuyển gen HSP đã chứng minh vai trò tăng cường tính chống chịu

hạn của HSP trong cây chuyển gen và trong tế bào nấm men [13, 52]

Protein LEA là một họ lớn các protein được biểu hiện nhiều ở giai đoạn phát triển phôi muộn và trong nhiều điều kiện stress khác nhau như hạn, mặn, lạnh, nóng

và ABA Đặc điểm chung của protein LEA là ưa nước, bền nhiệt và biểu hiện gen đáp ứng ABA Chức năng của protein LEA cho tới nay vẫn chưa được làm rõ, tuy nhiên hầu hết các nhà nghiên cứu đều cho rằng protein này hoạt động như những phân tử liên kết nước trong các quá trình tạo phức hóa ion và duy trì ổn định cấu trúc màng tế bào và các đại phân tử Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh việc chuyển gen mã hóa protein LEA đã giúp tăng cường khả năng chống chịu hạn của cây chuyển gen Điều này chứng tỏ vai trò quan trọng của protein LEA trong đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật [13, 38, 52]

Aquaporin là nhóm protein thuộc họ protein xuyên màng có tính bảo thủ cao Aquaporin tham gia vào quá trình vận chuyển nước qua màng bằng cách tạo ra các

lỗ dẫn nước trong lớp lipid kép của màng, giúp tăng tốc độ hấp thu nước Protein này được biểu hiện nhiều trong các tế bào thuộc mô đang sinh trưởng và mô rễ Các nghiên cứu về vai trò của aquaporin vẫn được thực hiện nhiều năm qua, tuy nhiên mối tương quan giữa aquaporin và khả năng chống chịu hạn của thực vật vẫn chưa được làm sáng tỏ Nghiên cứu ở cấp độ gen cho thấy sự biểu hiện của gen mã hóa aquaporin được điều hòa dương trong điều kiện stress hạn và điều hòa âm trong điều kiện stress mặn, chứng tỏ mức độ tích lũy aquaporin dường như liên quan tới đáp ứng của tế bào với thế nước của môi trường ngoại bào [13, 38]

Các polyamine như putrescine, cadaverine, spermidine và spermine là các hợp chất chứa hai hoặc nhiều nhóm amin hoạt động như những nhân tố sinh trưởng của thực vật Polyamine liên quan tới nhiều quá trình sinh lý khác nhau, bao gồm cả quá trình sinh trưởng - phát triển của thực vật và quá trình đáp ứng stress Vai trò của polyamine trong đáp ứng chống chịu hạn có liên quan tới khả năng khử ROS và điều hòa quá trình phiên mã của các gen chức năng [13]

Ngoài các hợp chất trực tiếp tham gia vào các quá trình điều hòa áp suất thẩm thấu, liên kết nước, khử độc…, các protein/enzyme tham gia vào các quá trình tổng hợp, phân giải và sửa chữa cũng có vai trò nhất định giúp bảo vệ tế bào chống lại điều kiện khô hạn Ví dụ ố kéo dài chuỗi 1-α (elongation factor 1-α) là một thành phần không thể thiếu trong quá trình sinh tổng hợp protein và được tích lũy với hàm lượng rất cao trong quá trình đáp ứng stress ở thuốc lá, chứng tỏ vai trò của protein này đối

với đáp ứng chống chịu của tế bào Ở A thaliana và đậu Hà Lan, hàm lượng mRNA

của các gen mã hóa các protein tương đồng với protease và ubiquitinase (thành phần chính của bộ máy phân giải protein) tăng lên rõ rệt trong điều kiện hạn và mặn [13] Đây có thể là một cơ chế giúp tế bào loại bỏ các protein bị sai hỏng do stress và tái sử dụng nguồn nitơ [116] Bên cạnh đó, do tác động của stress hạn, các gốc acid amin trong phân tử protein có thể bị biến đổi bởi các quá trình như deamin hóa, isomer hóa hay oxy hóa Để hạn chế ảnh hưởng của các quá trình này, tế bào cũng tăng cường tổng hợp các enzyme sửa chữa như L-isoaspartyl methyl transferase biến đổi gốc L-isoaspartyl (trong các protein bị sai hỏng do stress) thành gốc L-aspartyl Đặc biệt, ở rêu, tế bào đáp ứng với stress hạn chủ yếu theo cơ chế sửa chữa protein Các thực tế trên chứng tỏ trong tế bào luôn có sự chuyển đổi linh hoạt giữa hoạt động của hai bộ máy bảo vệ/sửa chữa và phân giải protein trong đáp ứng stress hạn [116]

1.2 ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG GEN TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN Ở THỰC VẬT

Thực vật thích nghi với môi trường sống nhờ khả năng điều hòa nhanh biểu hiện của các gen chức năng Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh quá trình điều hòa biểu hiện gen đóng một vai trò quan trọng trong đáp ứng của thực vật với các điều kiện stress phi sinh học, trong đó có hạn hán [39]

1.2.1 Promoter cảm ứng với điều kiện hạn

Thực vật kiểm soát toàn bộ các quá trình sinh trưởng, phát triển và đáp ứng thích nghi môi trường bằng một mạng lưới các con đường điều hòa hoạt động gen Trong tế bào thực vật có rất nhiều quá trình đáp ứng stress được điều hòa ở cấp độ phiên mã gen thông qua tương tác giữa nhân tố phiên mã (đã được hoạt hóa bởi tín

hiệu stress) với yếu tố điều hòa đặc trưng (cis-acting element) Các yếu tố điều hòa

này thường nằm trong hoặc gần vùng promoter, phía trước và cách vị trí khởi đầu phiên mã khoảng một nghìn nucleotide trở lại Vùng điều khiển của gen thực vật có thể mang nhiều yếu tố điều hòa khác nhau và tương tác với nhiều nhân tố phiên mã (điều khiển quá trình phiên mã) khác nhau Cùng một nhân tố phiên mã có thể hoạt động với vai trò là yếu tố ức chế hay hoạt hóa gen tùy thuộc vào nồng độ và sự tương tác với protein khác trong phức hệ điều hòa gen [52, 65]

ABA là một hormone rất quan trọng điều hòa các đáp ứng của thực vật với các điều kiện stress Hàm lượng ABA trong tế bào ảnh hưởng tới quá trình điều hòa hoạt động của rất nhiều gen chức năng liên quan tới đáp ứng chống chịu hạn Chính

vì vậy, cơ chế điều hòa phiên mã của các gen đáp ứng stress hạn cũng được chia thành ba dạng: phụ thuộc ABA, không phụ thuộc ABA và cả hai [52]

Con đường điều hòa hoạt động gen phụ thuộc ABA có hai loại: “trực tiếp” và

“gián tiếp” [52] Loại thứ nhất liên quan tới yếu tố cis ABRE - yếu tố đáp ứng ABA

(ABA-responsive element) Yếu tố ABRE chứa motif T/CACGTGGG với trình tự lõi của G-box là ACGT, được hoạt hóa trực tiếp nhờ liên kết với các nhân tố phiên mã thuộc nhóm bZIP như EMBP-1 (ở lúa mì), TAF-1 (ở thuốc lá) [52, 64] Yếu tố ACGT được phát hiện thấy có trong vùng promoter của rất nhiều gen đáp ứng ABA,

tuy nhiên chức năng vẫn chưa được làm sáng tỏ Hai yếu tố cis khác cũng liên quan

tới con đường điều hòa hoạt động gen phụ thuộc ABA “gián tiếp” là MYBRS (trình

tự nhận biết MYB – A/TAACCA và C/TAACG/TG) và MYCRS (trình tự nhận biết MYC - CANNTG) Các yếu tố này được hoạt hóa nhờ liên kết với ABA hoặc các nhân tố phiên mã thuộc họ MYB/MYC cảm ứng hạn như AtMYC2 và AtMYB2 [52]

Con đường điều hòa hoạt động của các gen đáp ứng stress hạn không phụ

thuộc ABA có liên quan tới yếu tố cis DRE (dehydration-responsive element) [52]

Yếu tố DRE có trình tự lõi A/GCCGAC được phát hiện trong vùng promoter của

nhiều gen cảm ứng hạn, mặn, lạnh và nóng, ví dụ như RD29A [122] Hai yếu tố cis

khác tương tự với yếu tố DRE là yếu tố CRT (C-repeat) và

LTRE (low-temperature-responsive element) cũng được phát hiện có trong vùng

promoter của một số gen đáp ứng stress không phụ thuộc ABA như cor15a, kin1,

cor6.6 và cor47/rd17 Trong trình tự của các yếu tố cis này đều có chứa một motif

bảo thủ CCGAC được lặp lại nhiều lần, quyết định khả năng đáp ứng stress của promoter [17, 52] Các protein CBF/DREB (C-repeat binding factor/ DRE-binding) thuộc họ nhân tố phiên mã AP2/ERF (APETALA2/ERE binding factor) liên kết với yếu tố DRE/CRT/LTRE trong vùng promoter của nhiều gen đáp ứng stress hạn và mặn tại vị trí motif CCGAC để hoạt hóa sự biểu hiện của các gen này [52]

Một nhóm nhân tố phiên mã điều hòa biểu hiện gen đáp ứng stress khác có liên quan tới cả hai con đường phụ thuộc và không phụ thuộc ABA đã được phát hiện, bao gồm các nhân tố phiên mã thuộc họ NAC (NAM, ATAF, and CUC),

WRKY, RING finger và ZF (zinc-finger) [52] Yếu tố cis tương tác với các nhân tố

phiên mã này cho đến nay vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ Một số nhân tố phiên

mã thuộc nhóm protein NAC của A thaliana và lúa đã được chứng minh liên kết đặc hiệu với yếu tố cis NACRS (NAC recognition sequence) có chứa trình tự lõi CATGTG nằm trong vùng promoter của gen ERD1 [86, 113] Tran và nhóm nghiên

cứu [113] đã xác định được một nhân tố phiên mã đáp ứng hạn và mặn thuộc nhóm

ZF, đặt tên là ZFHD1 (zinc finger homeodomain 1), có khả năng liên kết đặc hiệu

với yếu tố cis ZFHDRS (ZFHD recognition sequence) chứa trình tự lõi CACT

AAATTGTCAC Các gen được hoạt hóa bởi ZFHD1 đều chứa một motif bảo thủ TT/AAATT trong vùng promoter

1.2.2 Điều hòa hoạt động gen sau phiên mã

1.2.2.1 Cải biến mRNA sau phiên mã

Các gen mã hóa protein phiên mã tạo ra các phân tử tiền mRNA Tiền mRNA sau đó được gắn mũ G, gắn đuôi poly-A và cắt ghép trước khi dịch mã thành sản phẩm protein Nhiều nghiên cứu đã chứng minh quá trình cải biến mRNA

có liên quan đến đáp ứng chống chịu stress của thực vật [39]

Protein SR (serine/arginine-rich protein) là một loại protein liên kết RNA, có trong thành phần cấu trúc spliceosome và hoạt động như một yếu tố điều hòa quá trình cắt nối luân phiên tiền mRNA của sinh vật nhân

chuẩn Ở cây A thaliana, stress nhiệt độ và hạn có tác dụng điều hòa quá trình

cắt ghép luân phiên tiền mRNA của nhiều gen mã hóa protein SR khác nhau [39] Protein STA1 là một nhân tố điều hòa quá trình cắt nối luân phiên và

nhiều mRNA liên quan đến tính chống chịu stress lạnh của A thaliana Đột biến gen Sta1 gây ảnh hưởng đến quá trình cắt ghép mRNA của gen Cor15A, dẫn

tới làm giảm khả năng chống chịu mặn, lạnh và khả năng đáp ứng ABA của cây [68] Hai tiểu phần CBP20 và CBP80 trong phức hệ gắn mũ (Cap-Binding Complex) cũng được xác định có liên quan tới quá trình cắt ghép luân phiên tiền mRNA của một số gen đáp ứng stress hạn [98]

RBP (RNA binding protein) là nhóm protein liên kết mRNA có vai trò điều hòa trực tiếp hoặc gián tiếp quá trình phiên mã của các nhân

tố phiên mã khác Một trong số các chức năng quan trọng của RBP là tham gia vào quá trình cắt ghép mRNA và có liên quan tới đáp ứng stress của thực vật Các protein RBP liên quan tới đáp ứng yếu tố stress, bao gồm cả stress hạn, đã được nghiên cứu bao gồm AtGRP7, AtRZ, AtTZF1, OsGRP1, OsDEG10, OsRZ2, NtGRP [39] Dưới điều kiện stress, RBP có thể điều hòa quá trình cải biến tiền mRNA và giúp ổn định cấu trúc phân tử mRNA trong quá trình vận chuyển Ngoài

ra, protein này còn hoạt động như những phân tử chaperone, điều khiển quá trình tương tác RNA-RNA, giúp quá trình cải biến mRNA diễn ra hiệu quả [39, 60] UBA là một loại protein liên kết mRNA khác có vai trò ổn định cấu trúc mRNA và tham gia vào quá trình cắt ghép tiền mRNA Sau khi được phosphoryl hóa, UBA1

có khả năng liên kết và bảo vệ cấu trúc của các phân tử mRNA mã hóa protein chống mất nước dehydrin, giúp bảo vệ tế bào khỏi stress hạn [71]

Dựa vào các nghiên cứu trên cây chuyển gen, Zhang và nhóm nghiên cứu [129]

đã xác định được hoạt động của protein CPFS30 (Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor) trong quá trình gắn đuôi poly-A mRNA có liên quan tới khả

năng chống chịu stress oxy hóa Cây A thaliana bị bất hoạt gen CPFS30 có khả

năng chống chịu stress oxy hóa cao hơn so với cây bình thường Điều này chứng tỏ một protein tham gia vào quá trình polyadenin hóa mRNA có thể gây ảnh hưởng tới đáp ứng chống chịu stress của thực vật [129]

1.2.2.2 Phân giải và duy trì mRNA trong tế bào chất

Mức độ tích lũy mRNA phản ánh mức độ biểu hiện của gen đích và được điều hòa không chỉ bởi quá trình phiên mã mà còn được quyết định bởi thời gian tồn tại của mRNA trong tế bào chất, liên quan tới hai quá trình phân giải và duy trì tính bền vững của mRNA Cơ chế điều hòa mRNA này có sự tham gia của hai phức hệ: phức hệ PB (processing body) liên quan đến quá trình phân giải mRNA và phức hệ

SG (stress granule) liên quan tới quá trình duy trì tính bền vững của mRNA Hai phức hệ này cùng tồn tại trong tế bào chất và tương tác với nhau để điều hòa thời gian tồn tại của mRNA Một vài nghiên cứu gần đây đã chứng minh cơ chế điều hòa mRNA này cần thiết đối với đáp ứng stress của thực vật [58]

Quá trình phân giải mRNA diễn ra trong phức hệ PB, bắt đầu bằng phản ứng cắt đuôi poly-A, loại bỏ mũ G và sau đó exoribonuclease sẽ phân giải mRNA theo chiều 5’-3’ hoặc 3’-5’ Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh một

số thành phần của bộ máy phân giải mRNA ảnh hưởng đến khả năng chống chịu stress của thực vật Phức hệ CCR4-CAF1 có vai trò xúc tác chính trong phản ứng loại bỏ đuôi pol-A được xác định có liên quan tới các đáp ứng stress phi sinh học

và sinh học của thực vật AtCAF1 cảm ứng biểu hiện khi tế bào bị tổn thương và

khi gây đột biến gen AtCaf1 làm tăng khả năng chịu mặn của cây A thaliana

[117] XRN4 là một loại exoribonuclease có liên quan đến đáp ứng stress phi sinh học DCP1, DCP2, DCP5 và VARICOSE là các protein có vai trò loại bỏ

mũ G của mRNA trong trong phức hệ PB, đồng thời cũng liên quan tới đáp ứng stress hạn của thực vật [83]

Phức hệ SG là một thành phần quan trọng của bộ máy điều hòa hoạt động gen, tham gia điều hòa hàm lượng mRNA tích lũy trong tế bào chất Phức hệ SG chứa các nhân tố khởi đầu dịch mã, protein liên kết đuôi poly-A và một số protein liên kết RNA có chức năng bảo vệ và dự trữ mRNA TSN là một protein liên kết mRNA nằm trong phức hệ SG, có chức năng bảo vệ mRNA khi tế bào đáp ứng với

stress [83] Ở A thaliana, TSN có vai trò quan trọng với đáp ứng chống chịu stress

mặn nhờ khả năng duy trì hàm lượng mRNA của một số gen đáp ứng stress [40]

1.2.3 Điều hòa dịch mã

Ở tất cả các loài sinh vật, cơ chế điều hòa dịch mã cho phép tế bào kiểm soát lượng protein được tổng hợp ra từ phân tử mRNA tương ứng Trong từng điều kiện cụ thể, hiệu quả dịch mã của mỗi loại mRNA được xác định thông qua lượng mRNA liên kết với ribosome trong phức hệ dịch mã polysome và chủ yếu liên quan tới các yếu tố nằm trong vùng không dịch mã ở đầu 5’ và 3’ của mRNA (5’UTR và 3’UTR) Ở thực vật, quá trình dịch mã của mRNA bị thay đổi khi tế bào đáp ứng với các điều kiện bất lợi của môi trường bên ngoài, bao gồm stress nhiệt độ, mặn, hạn, thiếu oxy và mầm bệnh [39] Một nghiên cứu về mRNA của

hơn 2.000 gen ở cây A thaliana đã cho thấy đa số các phân tử mRNA giảm sự

hình thành phức hệ polysome trong điều kiện stress hạn [56] Phân tích DNA microarray cũng chỉ ra rằng quá trình dịch mã của khoảng 200 gen bị điều hòa ức chế bởi điều kiện stress thiếu sucrose Ngoài ra, quá trình điều hòa dịch mã cũng

được xác định có vai trò quan trọng trong đáp ứng stress thiếu oxy của A thaliana

Tất cả các nghiên cứu này chứng tỏ thực vật có cơ chế điều hòa quá trình dịch mã của các gen chức năng để đáp ứng với các thay đổi của điều kiện môi trường, trong đó có stress hạn [39]

1.2.4 Phân vùng mRNA trong tế bào chất

Gần đây, một cơ chế điều hòa hoạt động gen sau phiên mã đã được phát hiện trong tế bào sinh vật nhân chuẩn, đó là quá trình phân vùng mRNA trong tế bào

chất Branco-Price đã chứng minh tế bào cây A thaliana khi gặp stress thiếu oxy có

hiện tượng giảm mạnh quá trình dịch mã trong khi tốc độ phiên mã mRNA không thay đổi Điều này chứng tỏ trong điều kiện stress oxy, tế bào đã có cơ chế ức chế

khởi đầu dịch mã và cô lập tạm thời các phân tử mRNA [83] Cơ chế điều hòa này

cũng được phát hiện ở cây cà chua khi gặp stress nhiệt, một nhóm mRNA tập hợp với các protein đặc trưng tạo thành một vùng riêng trong tế bào chất phân biệt với vùng hoạt động của phức hệ SG, gọi là HSG (Heat Stress Granules) Quá trình này khiến cho các phân tử mRNA bị tách bộ máy dịch mã của tế bào và do đó ức chế tạm thời quá trình dịch mã [39] Tuy nhiên, cơ chế định vị mRNA

khác nhau trong tế bào chất và điều hòa các phân tử mRNA này trở lại quá trình dịch mã cho tới nay vẫn chưa được làm sáng tỏ

1.2.5 Điều hòa sau dịch mã

Ở thực vật, quá trình biến đổi protein sau dịch mã có vai trò quan trọng liên kết các thành phần trong mạng lưới truyền tín hiệu stress phức tạp của tế bào Một

số quá trình biến đổi protein sau phiên mã có liên quan tới cơ chế đáp ứng stress hạn của thực vật đã được xác định bao gồm phosphoryl hóa, ubiquitin hóa, sumoyl hóa, poly ADR-ribosyl hóa và farnesyl hóa [127]

Quá trình phosphoryl hóa bởi protein kinase (PK) và dephosphoryl hóa bởi protein phosphatase (PP) là cơ chế điều hòa sau dịch mã phổ biến nhất trong tế bào thực vật, điều hòa sự biểu hiện của rất nhiều gen cảm ứng điều kiện hạn Một số họ

PK liên quan đến đáp ứng stress đã được nghiên cứu như MAPK (mitogen-activated protein kinase), CDPC (Ca2+-dependent protein kinase), CIPK (calcineurin B-like – interacting protein kinase) và SnRK2 (Snf1-Related protein kinase) Các PK này tham gia vào đáp ứng stress của tế bào bằng cơ chế phosphoryl hóa các thành phần của chuỗi truyền tín hiệu, dẫn tới hoạt hóa các nhân tố phiên mã điều hòa sự biểu hiện của các gen đáp ứng stress trong nhân tế bào [31, 127]

Quá trình biến đổi protein sau dịch mã bởi ubiquitin không chỉ quan trọng đối với các hoạt động chức năng bình thường của tế bào thực vật mà còn liên quan tới cơ chế đáp ứng stress môi trường Ubiquitin hóa là một quá trình gắn protein ubiquitin (dài 76 cid amin) vào gốc serine trên phân tử protein đích nhờ hoạt động của 3 enzyme (E1, E2 và E3) hoạt hóa ubiquitin Chức năng chính của quá trình ubiquitin hóa là vận chuyển protein đích tới proteasome để phân giải Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh quá trình ubiquitin hóa có liên quan tới các con đường truyền tín hiệu trong đáp ứng điều kiện stress môi trường Một số

họ enzyme E3, ví dụ như RING-H2 zinc finger E3, Ring E3, C3H2C3-type RING E3, RING- E3 và U-box E3, tham gia vào quá trình điều hòa đáp ứng chống chịu điều kiện hạn của thực vật theo các cơ chế khác nhau, có thể phụ thuộc hoặc không phụ thuộc ABA [31, 127]

Vai trò của quá trình poly ADP ribosyl hóa protein đối với các đáp ứng chống chịu hạn của thực vật được xác định nhờ nghiên cứu chức năng của enzyme

PARG1 (poly ADP ribose glycohydrolase) Cây A thaliana đột biến gen parg1 bị

mất khả năng đóng khí khổng trong điều kiện hạn hán, tế bào dễ bị tổn thương hơn với stress áp suất thẩm thấu và giảm khả năng chống chịu hạn [70] Điều này chứng

tỏ quá trình poly ADP ribosyl hóa protein có liên quan tới cơ chế đáp ứng chống chịu điều kiện stress, ít nhất là stress hạn, của thực vật

Farnesyl hóa protein là quá trình liên kết các gốc C15-prenyl vào carboxyl tận cùng của protein đích và được xác định có vai trò điều hòa âm tính quá trình truyền tín hiệu hormone ABA Enzyme xúc tác cho quá trình farnesyl hóa là farnesyltransferase, một heterodimer có 2 tiểu đơn vị α và β Nghiên cứu trên cây

Brassica napus cho thấy khi gen ERA1 (mã hóa tiểu đơn vị β của farnesyltransferase)

giảm mức độ biểu hiện sẽ làm tế bào tăng tính nhạy cảm với ABA, thúc đẩy cơ chế đóng khí khổng khi cơ thể bị thiếu nước, dẫn tới tăng khả năng chống chịu hạn [127]

1.2.6 Vai trò điều hòa hoạt động gen của RNA không mã hóa

Nhóm RNA không mã hóa tham gia vào quá trình điều hòa hoạt động gen bao gồm các loại sRNA (small RNA), ví dụ như miRNA và siRNA, là những sợi RNA đơn dài 20 – 24 nucleotide sRNA điều hòa sự biểu hiện của gen đích bằng cách tác động đến hàm lượng mRNA, biến đổi sợi nhiễm sắc và methyl hóa DNA tại vị trí của gen đích trên NST [83] Ở thực vật, khi cơ thể gặp phải các yếu tố bất lợi của môi trường, trong tế bào tích lũy một lượng lớn sRNA, chứng tỏ loại phân tử này có vai trò quan trọng đối với quá trình đáp ứng stress của tế bào [30, 58]

Nghiên cứu trên cây A thaliana cho thấy trong số 117 miRNA được phân

tích có 17 miRNA cảm ứng với điều kiện stress 5 loại miRNA bao gồm miR393, miR402, miR397b, miR319c và miR169g cảm ứng biểu hiện với stress hạn, trong khi miR169 giảm biểu hiện theo con đường điều hòa phụ thuộc ABA [127] Ở ngô, các miRNA thuộc họ miR156, miR164, miR167 và miR396 giảm biểu hiện khi tế bào nồng độ muối cao, trong khi các thành viên của họ miR162, miR168, miR395 và miR474 được biểu hiện rất mạnh [33] Gần đây, Zhou

và nhóm nghiên cứu [131] đã xác định được ở lúa có 16 miRNA được điều hòa âm

và 8 miRNA được điều hòa dương bởi stress hạn Một số họ miRNA như miR171, miR319 và miR896 thuộc cả hai nhóm gen được điều hòa âm và dương bởi stress hạn Rất nhiều các nghiên cứu tương tự trên các đối tượng khác như đậu tương, mía,

Populus, Panicum virgatum và Medicago cũng đã phát hiện rất nhiều miRNA bảo

thủ và không bảo thủ có liên quan tới đáp ứng điều kiện hạn [127]

Ngoài miRNA, một số loại siRNA khác cũng được chứng minh có vai trò trong đáp ứng các điều kiện stress liên quan đến áp suất thẩm thấu (hạn, mặn, ABA) Nat-siRNA (natural antisense siRNA) là một loại siRNA được sinh ra do sự gối chồng lên nhau của hai mRNA của hai gen khác nhau Borsani và nhóm nghiên cứu [21] đã chứng minh các đoạn nat-siRNA sinh ra từ phản ứng cắt mRNA của hai

gen có một phần trình tự giống nhau là P5CDH và SRO5 có vai trò điều hòa quá

trình sinh tổng hợp proline (thông qua cơ chế điều hòa biểu hiện enzyme P5CDH)

trong đáp ứng stress mặn ở cây A thaliana Một nghiên cứu khác thực hiện trên cây

lúa mì cũng đã xác định được 4 siRNA được điều hòa biểu hiện bởi các yếu tố stress môi trường [123] Các nghiên cứu này chứng tỏ vai trò nhất định của siRNA trong đáp ứng stress nói chung và stress hạn nói riêng của thực vật

1.3 VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TRONG ĐÁP ỨNG STRESS HẠN

Nhân tố phiên mã (Transcription factor - TF) là các protein hoạt động kết hợp với một số yếu tố điều hòa khác, bao gồm các protein cải biến/thay đổi cấu trúc sợi nhiễm sắc, để điều hòa tương tác của RNA polymerase với DNA [23] Trong hệ gen thực vật có khoảng 7% gen mã hóa TF, trong số đó có rất nhiều gen liên quan đến đáp

ứng chống chịu stress Ở A thaliana có khoảng 1.500 TF liên quan tới các quá trình

điều hòa biểu hiện gen, trong đó có nhiều TF điều hòa biểu hiện đáp ứng các điều kiện

bất lợi của môi trường, bao gồm cả hạn hán [23] Các TF này tương tác với yếu tố cis

nằm trong vùng promoter của các gen chức năng đáp ứng stress, từ đó hoạt hóa sự biểu hiện của các gen chức năng này để tham gia vào quá trình chống chịu stress của tế bào Một số TF đóng vai trò là yếu tố điều hòa chính của các con đường truyền tín hiệu và điều hòa hoạt động gen trong phản ứng thích nghi với điều kiện stress Trong tế bào,

các TF không hoạt động độc lập mà kết hợp với nhau và với nhiều protein khác Mỗi nhân tố phiên mã là một nút liên kết giữa nhiều con đường điều hòa khác nhau, tạo thành một mạng lưới điều hòa hoạt động gen rất phức tạp trong tế bào (Hình 1.1) [74]

Hình 1.1: Mạng lưới các nhân tố phiên mã tham gia đáp ứng stress [74]

Ghi chú: Nhân tố phiên mã đáp ứng điều kiện hạn được chia thành hai nhóm phụ thuộc

ABA (màu đỏ) và không phụ thuộc ABA (màu đen) Các nhân tố phiên mã hoạt hoá (mũi tên màu xanh) hoặc ức chế (đường màu đỏ) sự biểu hiện của một số gen đích (ô màu vàng)

Các TF tham gia trong mạng lưới điều hòa hoạt động gen đáp ứng stress hạn

đã biết cho tới nay được xác định thuộc hầu hết các nhóm TF lớn của thực vật, trong

đó được nghiên cứu nhiều nhất là các nhóm AP2/ERF (APETALA responsive element binding factor), NAC (NAM/ATAF1/CUC2) và WRKY Ngoài

2/ethylene-ra, một số nhân tố phiên mã thuộc các nhóm khác như MYB/MYC (myeloblastosis oncogene/ myelocytomatosis oncogene), bZIP (basic leucine zipper) hay ZF (C2H2-type zinc finger) cũng được chứng minh có tham gia vào quá trình điều hòa hoạt động gen đáp ứng điều kiện stress hạn ở thực vật [23, 74]

1.3.1 Nhân tố phiên mã AP2/ERF

AP2/ERF là một họ nhân tố phiên mã đặc trưng của thực vật, với khoảng 145

thành viên ở A thaliana và 163 thành viên ở lúa Tất cả các TF thuộc họ AP2/ERF

đều có một domain liên kết DNA bảo thủ (AP2/ERF) chứa khoảng 60 gốc acid amin được gọi là GBD (GCC-box binding domain) Cấu trúc của TF AP2/ERF bao gồm 3 chuỗi xoắn β đối song song ở đầu N (nhận biết trình tự DNA đích) và 1 chuỗi xoắn α ở đầu C Mỗi nhóm TF AP2/ERF nhận biết và liên kết với một hay một số trình tự DNA đích khác nhau trên vùng promoter của các gen đáp ứng stress tùy thuộc vào các trình tự tín hiệu nằm ở cả đầu N và đầu C của domain liên kết DNA của TF Họ AP2/ERF được chia thành 4 phân họ chính, bao gồm AP2, RAV (related to ABI3/VP1), ERF và DREB, trong đó phân họ DREB (với khoảng 56 thành viên) được nghiên cứu nhiều nhất Phân họ DREB được chia thành 6 nhóm nhỏ (từ A1 đến A6) và đã được xác định có liên quan đặc biệt tới các đáp ứng chống chịu stress môi trường của thực vật nhờ khả năng nhận biết và liên kết với

các yếu tố cis như DRE, CRT, LTRE hay GCC-box có trong trình tự promoter của

nhiều gen đáp ứng stress hạn, mặn, lạnh và nóng [74]

Nhóm TF DREB A1 bao gồm 6 thành viên, trong đó DREB1A, DREB1B và DREB1C được xác định cảm ứng với stress lạnh, DREB1D cảm ứng với điều kiện hạn và ABA, DREB1E và DREB1F được biểu hiện trong nồng độ muối cao Một số nghiên cứu đã chứng minh các TF nhóm DREB1 có khả năng tăng cường sức chống

chịu hạn của cây lúa chuyển gen Biểu hiện của DREB1A dưới sự điều khiển của một

promoter cảm ứng stress đã cải thiện đặc tính trổ bông, giúp tăng sản lượng thu hoạch trong điều kiện hạn của dòng lúa chuyển gen so với dòng đối chứng [74] Nhóm DREB A2 có 8 thành viên, trong đó được nghiên cứu nhiều nhất là DREB2A và DREB2B Cả hai TF này đều được điều hòa biểu hiện rất mạnh trong điều kiện stress (hạn, mặn và lạnh) theo con đường không phụ thuộc ABA [74] Cây lúa chuyển gen

biểu hiện tăng cường OsDREB2A cũng có tỉ lệ sống sót cao hơn so với cây đối chứng

trong điều kiện hạn và mặn TF thuộc các nhóm DREB khác mặc dù chưa được nghiên cứu nhiều nhưng cũng đã được chứng minh có liên quan tới đáp ứng stress và

tăng cường khả năng chống chịu stress cho cây chuyển gen Ví dụ, biểu hiện của ABI4 (nhóm A3) dẫn tới sự hoạt hóa của hơn 100 gen khác theo con đường phụ thuộc ABA [74]; RAP2.1 (nhóm A5) được xác định là một nhân tố ức chế phiên mã

có vai trò kiểm soát quá trình đáp ứng stress hạn và lạnh [34]; RAP2.4 (nhóm A6) là một nhân tố hoạt hóa quá trình phiên mã của các gen đáp ứng stress hạn, ánh sáng và ethylen qua trung gian là yếu tố DRE và ERE (ethylene responsive element) [73]

1.3.2 Nhân tố phiên mã NAC

Protein NAC là một trong những họ TF lớn đặc trưng của thực vật, với

khoảng 110 thành viên ở A thaliana và 150 thành viên ở lúa [50] Các TF thuộc họ

NAC tham gia vào rất nhiều hoạt động chức năng quan trọng trong quá trình phát

triển và đáp ứng stress của thực vật Nghiên cứu hệ gen của A thaliana cho thấy toàn bộ các gen NAC đều cảm ứng với ít nhất một loại yếu tố stress phi sinh học,

bao gồm hạn, mặn, lạnh và ABA Protein NAC chứa domain NAC đặc trưng đóng vai trò liên kết DNA, bao gồm 168 gốc acid amin tạo thành 1 chuỗi xoắn β kép đối song song và 2 chuỗi xoắn α nằm hai bên Trình tự bảo thủ WKATQTD nằm trên chuỗi β có vai trò chính quyết định đặc tính lên kết DNA của protein NAC Protein NAC điều hòa hoạt động promoter của các gen đáp ứng stress nhờ đặc tính liên kết với yếu tố NACBS (NAC-binding site) (5’-TTNCTGA/G-3’) có trình tự lõi được xác định là CGTG/A [74]

Một số TF NAC thuộc phân nhóm III-3 có tên là ATAF hay SNAC responsive NAC) đã được nghiên cứu khá chi tiết ANAC019, ANAC055 và RD26 là

(stress-ba thành viên thuộc nhóm này, đã được chứng minh cảm ứng biểu hiện trong điều kiện hạn, mặn và ABA Các protein này liên kết với promoter và hoạt hóa sự biểu hiện của

một số gen đáp ứng stress hạn (ví dụ như ERD1), qua đó tăng cường khả năng chống

chịu hạn của cây chuyển gen mô hình [112] ATAF1 cũng là một TF có ảnh hưởng đến

khả năng chống chịu hạn của cây A thaliana Ngoài ra, các TF của phân nhóm SNAC

cũng tham gia vào quá trình cảm nhận tín hiệu stress hạn của tế bào thực vật [74]

Gần đây đã có nhiều nghiên cứu chứng minh TF NAC có vai trò tăng cường khả năng chống chịu hạn của một số loại cây lương thực, đặc biệt là các protein