Nghiên cứu quy trình tách chiết, phân tích ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi mẹ để chẩn đoán trước sinh

Năm 1997, Lo và cộng sự đã phát hiện ADN tự do của thai nhi cell free fetal DNA: ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ được coi là một phát hiện mang tính đột phá trong phát triển các

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Triệu Tiến Sang

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ

ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Triệu Tiến Sang

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá

nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Trần Văn

Khoa và PGS.TS Đinh Đoàn Long

Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Nghiên cứu sinh

Triệu Tiến Sang

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc tới

PGS.TS Trần Văn Khoa – Chủ nhiệm Bộ môn Sinh học và Di truyền y học

– Học viện Quân y, Trưởng phòng Công nghệ Gen và Di truyền tế bào –

Trung tâm nghiên cứu Sinh Y dược – Học viện Quân y và PGS.TS Đinh

Đoàn Long – Chủ nhiệm Bộ môn Y dược học cơ sở , Phó Chủ nhiệm Khoa Y

Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình

nghiên cứu để hoàn thành luận án tiến sĩ

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân – Chủ

nhiệm Bộ môn Di truyền học, các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS Hoàng Văn Lương – Phó

giám đốc Học viện Quân y, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Sinh y Dược –

HVQY; PGS.TS Nguyễn Duy Bắc, Phó Phòng Công nghệ Gen và Di truyền

tế bào và các đồng chí, đồng nghiệp tại Bộ môn Sinh học và Di truyền y học; cùng các đồng chí tại Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế bào – Trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dược học – Học viện Quân y đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu gen và protein – Đại học Y Hà Nội, Phòng Xét nghiệm Di truyền – Bệnh Viện Từ Dũ và Trung tâm Nghiên cứu Sinh Y Dược – Học viện Quân y đã cung cấp mẫu phục vụ cho các nghiên cứu của luận án

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và tất cả những người thân, bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Nghiên cứu sinh Triệu Tiến Sang

CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt

ADN Deoxyribonucleic Acid Acid Deoxyribonucleic

AFP Alpha-fetoprotein Alpha-fetoprotein

AIHW Australian Institute of Health and

Welfare

Viện sức khỏe và phúc lợi Úc

ATP Adenosine Triphosphate Adenosine Triphosphate

FISH Fluorescence in-situ hybridization Lai tại chỗ huỳnh quang

fNRBCs Fetal nucleated red blood cells Tế bào hồng cầu có nhân của

phôi thai

KSSG Khoảng sáng sau gáy

MACS Magnetic activated cell sorting Phân loại tế bào hoạt hóa từ tính

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi nhờ polymerase

PUBS Percutaneous umbilical cord

STR Short Tandem Repeat Lặp lại liên tiếp đoạn ngắn

Taq –

polymerase

Thermus aquaticus polymerase

TBE Tris - Boric – EDTA Tris - Boric – EDTA

TOP Termination of pregnancy Đình chỉ thai

β hCG Beta_human chronic

gonadotropin

Beta_human chronic gonadotropin

2 Bảng 1.2 Các Kít sử dụng kỹ thuật NIPT ứng dụng tại Mỹ 34

3 Bảng 2.1 Thành phần hóa chất của bộ QIAamp ADN blood Mini

6 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen mồi ngoài và

mồi trong gen SRY và chu trình nhiệt nhân gen GAPDH

51

7 Bảng 2.5 Trình tự mồi và đầu dò của phản ứng định lượng huỳnh

quang gen DYS14 và GAPDH

52

8 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime-PCR 53

9 Bảng 2.7 Công thức và ứng dụng của các chất gắn trên bề mặt

hạt từ tính

54

10 Bảng 2.8 Các locus STR trên các NST 13, 18, 21 và NST X, Y 57

11 Bảng 2.9 Thành phần và thể tích của phản ứng QF-PCR 58

12 Bảng 2.10 Chu trình nhiệt của phản ứng QF-PCR 58

13 Bảng 2.11 Các thành phần cho 1 mẫu điện di 59

14 Bảng 2.12 Chu trình nhiệt biến tính sản phẩm PCR cho điện di

mao quản

59

15 Bảng 2.13 Phân tích tỷ lệ các peak huỳnh quang STR 61

16 Bảng 2.14 Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR

hoặc Realtime PCR

62

17 Bảng 3.1 Nồng độ ADN (ng/µl) của phương pháp tách bằng

nhiệt và phương pháp tách bằng bộ Kít Qiagen

63

18 Bảng 3.2 Kết quả số bản copy gen DYS14 (A: copy/ml) và nồng

độ gen DYS14/GAPDH (B: %) ở các tuần 6 đến 12 của thai kỳ

của các trường hợp thai nam

71

19 Bảng 3.3 Kết quả số bản copy gen GAPDH (A: copy/ml) ở các

tuần 6 đến 12 của thai kỳ của các trường hợp thai nữ

72

20 Bảng 3.4 So sánh kết quả của kỹ thuật Nested PCR, Realtime

PCR với siêu âm ở tuần thứ 16/ sau sinh (A)

75

21 Bảng 3.5 Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và 76

Realtime-PCR ở 6 tuần tuổi thai

22 Bảng 3.6 Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và

Realtime-PCR ở 7 tuần tuổi thai

76

23 Bảng 3.7 Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và

Realtime-PCR ở tuổi thai >8 tuần

77

24 Bảng 3.8 Độ nhạy và độ đặc hiệu của 2 kỹ thuật Realtime PCR

và Nested PCR ở các tuần tuổi thai

77

25 Bảng 3.9 Kết quả nhân gen SRY (trước sinh: A) và kiểm chứng

sau sinh (B) của 189 mẫu nghiên cứu tuổi thai từ 7+6 đến 9+2

85

26 Bảng 3.10 Kết quả nồng độ ADN biến thiên sau sinh 87

27 Bàng 3.11 Nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ

mang thai nam bình thường

98

28 Bảng 3.12 Nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ

mang thai nam bất thường

99

29 Bảng 3.13 Kết quả sàng lọc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh 107

30 Bảng 3.14 Kết quả sàng lọc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne 110

31 Bảng 3.15 Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen RhD 111

32 Bảng 3.16 Kết quả chẩn đoán nhóm máu Rh của thai nhi ở tuần

thứ 8

112

33 Bảng 3.17 Kết quả thử nghiệm trên các tế bào phôi thai tự do 116

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT TRANG

2 Hình 1.2: Nguyên tắc của phản ứng Nested PCR (PCR lồng) 25

3 Hình 1.3 Phương pháp Real-time PCR với mẫu dò TaqMan 26

4 Hình 1.4 Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong

Realtime-PCR

27

8 Hình 2.4 Các chất gắn trên bề mặt ha ̣t từ tính 54

9 Hình 2.5 Phân tích kết quả QF-PCR bình thường 59

10 Hình 2.6 Phân tích tính kết quả tỷ lệ giữa các alen 60

11 Hình 2.7 Ảnh phân tích kết quả QF-PCR locus bị Trisomy 61

12 Hình 3.1 Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu 65

13 Hình 3.2 Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu

15 Hình 3.4 Phân tích đường chuẩn của gen DYS14 và gen GAPDH 70

16 Hình 3.5 Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 6 tuần tuổi từ mẫu 269 đến

24 Hình 3.9 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 269 81

25 Hình 3.10 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 277 82

26 Hình 3.11 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 296 83

27 Hình 3.12 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 551 84

28 Hình 3.13 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do sau khi sinh 88

29 Hình 3.14 Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF64

(tương ứng mẫu nghiên cứu BT05) nam bình thường

90

30 Hình 3.15 Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF 61

(tương ứng với mẫu DT 02) nam mang hội chứng Down

92

31 Hình 3.16 Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR điện di mao

quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT02 với các cặp mồi extra

Marker 21

93

32 Hình 3.17 Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF56

(tương ứng với mẫu DT03) mang hội chứng Klinefelter

94

33 Hình 3.18 Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT03

(QF56) với các mồi extra marker trên locus X, Y

95

34 Hình 3.19 Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT08

mang hội chứng Edward

96

35 Hình 3.20 Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai của mẫu số 831 101

36 Hình 3.21 Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai của mẫu số 837 102

37 Hình 3.22 Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu

nghiên cứu 964 với các locus trên NST giới tính X, Y

DMD ở tuần thứ 8

42 Hình 3.27 Ảnh điện di kiểm tra nhóm máu Rh của thai nhi 112

43 Hình 3.28 Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai của mẫu số DT01 114

44 Hình 3.29 Ảnh điện di sản phẩm QF-PCR của mẫu DT01 mang hội

chứng Down

115

MỤC LỤC

TRANG

1.2 TÌNH HÌNH DỊ TẬT BẨM SINH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT

THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHÔNG

2.2.1 Phương pháp tách chiết ADN tự do và phương pháp nhân gen PCR

2.2.2 Phương phân lập tế bào phôi thai tự do, phương pháp nhuộm tế bào

bằng kỹ thuật FISH, phương pháp QF-PCR chứng minh sự tồn tại của tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ

53

3.1 TÁCH CHIẾT ADN PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI

3.1.1 Tách chiết ADN tự do trong máu ngoại vi của mẹ 63

3.1.3 Định lượng số bản copy của ADN phôi thai trong máu ngoại vi của

3.1.4 Biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ 81

3.1.5 Nhân gen SRY trên 189 bệnh nhân nghiên cứu 85 3.1.6 Biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ

3.1.7 Đối chiếu nồng độ ADN phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ với kết

3.2 PHÂN LẬP TẾ BÀO PHÔI THAI TRONG MÁU NGOẠI VI CỦA

MẸ

100

3.2.1 Phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ 100

3.2.2 Nhân gen SRY sau khi phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi

3.3 ỨNG DỤNG ADN PHÔI THAI TỰ DO VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI

3.3.1 Sàng lọc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh từ ADN phôi thai tự do 105

3.3.2 Sàng lọc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne từ ADN phôi thai tự do 108

3.3.3 Xác định sự bất đồng nhóm máu Rh giữa mẹ và thai nhi từ ADN

MỞ ĐẦU

Dị tật bẩm sinh (DTBS) đã và đang là một vấn đề y tế không chỉ thu hút sự quan tâm của các chuyên gia sản khoa mà còn thu hút sự quan tâm của toàn xã hội Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO), tỷ lệ DTBS khoảng 1,73% trẻ sơ sinh Ở Việt Nam, một số nghiên cứu trước đây cho thấy tỷ lệ DTBS vào khoảng 2,4% đến 3,6% Hiện nay, việc điều trị các DTBS vẫn còn hết sức khó khăn và phức tạp Các DTBS đa số đều không thể chữa khỏi hoặc kết quả điều trị rất hạn chế Thai nhi sau khi sinh ra kém phát triển cả về thể lực và trí lực, thiếu khả năng lao động hay tự chăm sóc, kém hòa nhập với xã hội Chính vì vậy, việc chẩn đoán trước sinh để tư vấn, dự phòng và xâm lấn vẫn là biện pháp hàng đầu, hết sức cần thiết nhằm làm giảm tỷ lệ DTBS Việc nghiên cứu ứng dụng các phương pháp chẩn đoán trước sinh các DTBS đã được quan tâm phát triển từ lâu Nhờ vậy, đã có nhiều phương pháp truyền thống như siêu âm sản khoa, test sàng lọc bộ ba (triple test)… Đây là những phương pháp không xâm lấn nhưng kết quả chẩn đoán thường muộn

và có độ đặc hiệu thấp [1],[3],[4],[7] Bên cạnh đó, các phương pháp như chọc hút nước ối, sinh thiết nhau thai, lấy máu cuống rốn để phân tích di truyền thai nhi… có

độ đặc hiệu cao hơn, nhưng nhược điểm là có xâm lấn, gây tỷ lệ tai biến cho thai phụ và thai nhi như sẩy thai, rò ối, thai chết lưu, đẻ non, … [2],[5],[9]

Năm 1969, Walknowska và cộng sự đã phát hiện sự có mặt của tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của người mẹ [130] Năm 1997, Lo và cộng sự đã phát hiện ADN tự do của thai nhi (cell free fetal DNA: ADN phôi thai tự do) trong huyết tương mẹ được coi là một phát hiện mang tính đột phá trong phát triển các phương pháp chẩn đoán trước sinh mới [85] Phát hiện này vô cùng quan trọng, mở

ra một hướng đầy triển vọng trong chẩn đoán trước sinh bằng biện pháp không xâm lấn Nồng độ ADN tự do trong máu ngoại vi của mẹ có sự khác biệt giữa các tuổi thai và phụ thuộc vào từng cá thể Sự tồn tại của ADN phôi thai tự do ở các thời điểm khác nhau, ảnh hưởng rất nhiều tới chất lượng ADN phôi thai tự do tách được

và nó ảnh hưởng tới các chẩn đoán dị tật di truyền khi sử dụng các vật liệu di truyền này Do vậy, việc nghiên cứu thời điểm thích hợp để tách được ADN hiệu quả cao

và sớm nhất có vai trò quyết định thành công của phép chẩn đoán sớm DTBS từ máu ngoại vi của mẹ Sự tồn tại ADN phôi thai tự do và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ sau khi sinh cũng là một vấn đề quan trọng, ảnh hưởng tới khả năng chẩn đoán di tật bẩm sinh ở các lần sinh sau Hiện nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào phát triển và áp dụng biện pháp chẩn đoán phân tử trên tế bào phôi thai tự do lưu hành trong máu mẹ và ADN phôi thai tự do lưu hành trong máu ngoại

vi của mẹ Vì vậy, chúng tôi tiến hành luận án: “Nghiên cứu tách chiết, phân tích ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi mẹ để chẩn đoán trước sinh”

nhằm mục đích đảm bảo hiệu quả tách ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ ứng dụng chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp không xâm lấn

Các mục tiêu chính của đề tài gồm có:

1 Tách chiết và xác định nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại

vi của mẹ

2 Phân lập tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ

3 Ứng dụng ADN phôi thai và tế bào phôi thai lưu hành trong máu ngoại vi của mẹ để:

- Sàng lọc phát hiện giới tính thai để tư vấn một số bệnh di truyền liên kết với nhiễm sắc thể giới tính

- Xác định sự bất đồng nhóm máu Rh giữa mẹ và con

- Bước đầu chẩn đoán một số bất thường số lượng nhiễm sắc thể

Đối tượng và các nội dung nghiên cứu chính gồm có:

Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Các mẫu máu ngoại vi của các phụ nữ mang

thai bị dị tật và mang thai không bị dị tật

Nội dung nghiên cứu của đề tài: (i) Tách chiết và xác định nồng độ ADN phôi

thai trong máu mẹ; Nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng ADN phôi thai tự do trong máu theo thai kỳ và thời gian tồn tại của chúng sau khi sinh; Kiểm tra, đánh giá xác định thời điểm sớm và thích hợp nhất để phân tích ADN phôi thai trong máu mẹ; (ii) Phân lập tế bào phôi thai trong máu mẹ; Kiểm tra, đánh giá chứng minh sự tồn tại của tế bào phôi thai trong máu mẹ; (iii) Ứng dụng ADN phôi thai và tế bào

phôi thai lưu hành trong máu ngoại vi của mẹ để bước đầu sàng lọc một số bệnh như: bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, loạn dưỡng cơ Duchenne, xác định sự bất đồng nhóm máu Rh giữa mẹ và con và bước đầu chẩn đoán bất thường số lượng NST

Kết quả của đề tài có một số đóng góp mới như sau:

- Xác định được nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ để ứng dụng chẩn đoán trước sinh ở thời điểm thích hợp nhất trong thời gian phát triển của thai kỳ

- Phân lập tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ, ứng dụng cho chẩn đoán các DTBS

- Góp phần sàng lọc và chẩn đoán sớm một số bệnh di truyền trước sinh bằng biện pháp không xâm lấn thai

Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài

- Góp phần làm sáng tỏ sự tồn tại ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ ứng dụng trong sàng lọc và chẩn đoán trước sinh các bệnh di truyền ở Việt Nam

- Cung cấp một công cụ hữu hiệu góp phần giảm thiểu các trường hợp sinh con bị bệnh di truyền, DTBS, gián tiếp giảm gánh nặng cho gia đình, xã hội và nâng cao sức khỏe cộng đồng

Về bố cục của luận án

Luận án gồm 135 trang, trong đó có các phần Mục lục (3 trang), Mở đầu (3 trang), Tổng quan tài liệu (38 trang), Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (18 trang), Kết quả và bàn luận (55 trang), Kết luận và kiến nghị (2 trang) Các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (15 trang), vớ i 134 tài liệu bằng 2 thứ tiếng: tiếng Việt (18 tài liệu) và tiếng Anh (116 tài liệu) Luận án có 33 bảng và 44 hình

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 KHÁI NIỆM DỊ TẬT BẨM SINH

DTBS (congenital malformation - DTBS) là tên gọi chung của các bệnh có sẵn trước khi sinh DTBS là những bất thường về cấu trúc hoặc chức năng bẩm sinh gây khuyết tật về thể chất hoặc tinh thần DTBS có thể do bất thường di truyền, tai biến trong tử cung hay rối loạn trong quá trình hình thành và phát triển của phôi, thai Nhiều DTBS vẫn không rõ nguyên nhân

Các nhà nghiên cứu đã xác định được hàng nghìn các DTBS khác nhau Hiện nay, các DTBS là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu cho trẻ sơ sinh trong năm đầu tiên của cuộc đời Hầu hết các DTBS xảy ra trong 3 tháng đầu của thai kỳ [1],[8]

Trẻ bị DTBS có thể phải phẫu thuật hoặc được điều trị bằng các biện pháp y

tế khác Ngày nay, các bác sĩ có thể chẩn đoán nhiều DTBS trong bụng mẹ Điều này giúp cho các bác sĩ có thể điều trị hoặc thậm chí sửa chữa một số vấn đề trước khi em bé được sinh ra

Nguyên nhân gây ra DTBS:

Đến nay, các chuyên gia y khoa vẫn chưa xác định được hết các nguyên nhân gây nên dị tật cho thai nhi Họ chỉ có thể ghi nhận được những yếu tố liên quan như: di truyền, rối loạn nhiễm sắc thể do các tia xạ, hóa chất…, sử dụng thuốc không đúng cách

Một số loại DTBS thường gặp ở trẻ sơ sinh: dị tật tim bẩm sinh, chân vẹo,

môi chẻ, sứt môi, thiếu chi hoặc chân tay dị dạng, hội chứng Down

1.2 TÌNH HÌNH DỊ TẬT BẨM SINH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

Dị tật bẩm sinh (DTBS) là một vấn đề lớn không chỉ đối với ngành sản khoa mà còn thu hút được sự quan tâm của toàn xã hội Trên phạm vi toàn thế giới

có trung tâm thông tin quốc tế và hệ thống giám sát bất thường sinh sản (ICBDMS: International Clearing – House for Birth Defects Monitoring System) thực hiện điều

tra về bất thường sinh sản Việt Nam cũng như các nước trên thế giới đã nghiên cứu tình hình sinh sản, các bất thường sinh sản ở các khu vực khác nhau trên lãnh thổ, tại các trung tâm y tế lớn và ở các nhà hộ sinh, trạm y tế xã, phường…

1.2.1 Tình hình DTBS trên thế giới

Theo thống kê từ năm 1995 đến 1999, ước tính khoảng 5% các trường hợp mang thai ở Úc và chấm dứt thai kỳ với các DTBS lớn, các trẻ bị dị tật từ 0 đến 14 tuổi chiếm khoảng 13% Các trẻ dị tật khi sinh cũng là nguyên nhân tử vong hàng đầu ở Úc, với khoảng 25% trẻ sơ sinh tử vong là do bị dị tật khi sinh (Viện Sức khỏe và Phúc lợi Úc AIHW thống kê năm 2002) Trẻ dị tật khi sinh là do yếu tố di truyền (bao gồm cả các sai lệch nhiễm sắc thể), môi trường và các nguyên nhân khác, hoặc sự kết hợp của những yếu tố này Người ta ước tính khoảng 65 đến 75% các trẻ dị tật là không rõ nguyên nhân Khoảng 15 - 25% các dị tật khi sinh có nguyên nhân di truyền và khoảng 10% là do môi trường (Brent, 2001) [92] Marden

và cộng sự, 1964 tại Hoa kỳ là người đầu tiên nghiên cứu tỷ lệ DTBS trên 4.412 trẻ

sơ sinh trong ngày đầu sau sinh cho thấy tỷ lệ DTBS nhỏ là 14,7% và DTBS lớn là 2,04% Cứ 20 trẻ mới sinh có từ hai dị tật trở lên thì 90% các trường hợp này có một hay nhiều dị tật lớn [91] Cũng tại Hoa kỳ năm 1980, Chung và cộng sự nghiên cứu trên 52.332 trẻ sơ sinh thấy tỷ lệ DTBS là 15,27% khi mới sinh ra và sau 1 năm

là 18,93% [47],[45] Tại Hoa Kỳ từ năm 1999-2001 theo báo cáo của Canfield và cộng sự năm 2006, dị tật bẩm sinh ảnh hưởng đến khoảng 3% của tất cả các ca sinh,

là một nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ sơ sinh [41]

Tại Vương quốc Anh, cơ quan giám sát DTBS đã hoạt động tại Burmingham

từ năm 1949 và trên toàn lãnh thổ Anh từ năm 1963 sau vụ thai nhi bị dị tật do chất Thalidomide Nghiên cứu của Boyd và cộng sự, 2004 trên cơ sở số liệu của 4 vùng nước Anh với số lượng hàng năm là 109.000, thời gian từ năm 1991-1999 cho thấy

tỷ lệ DTBS lớn là 2,1% ở trẻ mới đẻ và các bệnh viện phụ sản DTBS này gây ra tỷ

lệ chết chu sinh của trẻ từ trước, trong khi snh và sau khi sinh là 2,1% [35] Theo kết quả thống kê của Stephensen và cộng sự năm 2002 thống kê từ năm 1990-1999 tại Iceland có 740/44.013 trẻ sinh ra bị dị tật tim bẩm sinh (1,7% trẻ đẻ sống) [119]

Tại Nigeria, theo Abudu và cộng sự báo cáo năm 1988 tỷ lệ DTBS khoảng 2,1% ở trẻ mới đẻ và DTBS gây ra 16% chết chu sinh [19] Kết quả nghiên cứu của Himmetoglu và cộng sự ở Thổ Nhĩ Kỳ năm 2002 cho thấy tần suất DTBS chung là 1,11% và tần suất dị tật ống thần kinh là 0,27% [76] Nghiên cứu trong giai đoạn

1994 – 1998 tại Singapore, các tác giả Shi và cộng sự thấy tần suất DTBS là 1,39% trên tổng số trẻ sơ sinh [114] Theo thống kê của tác giả Tan và cộng sự năm 2005,

từ năm 1994 – 2000 tại Singapore, tổng cộng 7.870 trẻ sinh được báo cáo với tỷ lệ trẻ bị dị tật vào khoảng 23,99/1.000 ca sinh sống [121] Năm 1996, mười năm sau thảm hoạ Chernobyl (1986) các tác giả Lazjuk và cộng sự nghiên cứu các số liệu thu thập về DTBS ở các vùng bị ảnh hưởng bức xạ ion hoá (ionizing Radiation) của nước Cộng hoà Belarut cho thấy tỷ lệ DTBS là 4,9% [82]

Phân tích về tỷ lệ mắc các dị tật bẩm sinh tại Cộng hòa Czech trong giai đoạn

2000 - 2008 Có 119.570 trẻ đẻ sống vào năm 2008 (61.326 bé trai và 58.244 bé gái) Trong đó có 4.664 ca sinh sống với một dị tật bẩm sinh (ở độ tuổi dưới một năm), bao gồm 2.754 trẻ em trai và 1.910 trẻ em gái Tỷ lệ trung bình bị dị tật là 390,06 (449,08 bé trai và bé gái ở 327,93) trên 10.000 trẻ đẻ sống Trong 1994 -

2006, có 1.238.398 trẻ em được sinh ra, trong đó có hơn 42.000 trẻ mang một dị tật bẩm sinh Trong giai đoạn 2000 - 2006, số trẻ bị dị tật bẩm sinh từ 3.600 – 3.800 trường hợp một năm, trong khi năm 2007 và 2008 năm số trẻ bị dị tật lên trên 4.600 trường hợp mỗi năm Một nguyên nhân làm tăng tỷ lệ trẻ bị dị tật bẩm sinh tại Cộng hòa Czech đó là độ tuổi sinh đẻ của người mẹ trên 35 tuổi [117]

Dị tật bẩm sinh là nguyên nhân chính gây tử vong cho trẻ sơ sinh và trẻ dưới năm tuổi cũng như tật suốt đời trong số những người sống sót Tại Thái Lan, 21% các ca tử vong ở trẻ sơ sinh do dị tật bẩm sinh Theo Pangkanon và cộng sự năm

2014 thống kê cho thấy 3.696/67.813 sinh ra vẫn sống bị dị tật (8.28% của tổng số

ca sinh sống ở Thái Lan) được chẩn đoán dị tật bẩm sinh Tỷ lệ bị dị tật lớn là 26,12/1.000 ca sinh sống Năm dị tật bẩm sinh thường gặp nhất là dị tật tim bẩm sinh, dị tật chân tay, hở hàm ếch, hội chứng Down, và não úng thủy [101]

Theo thống kê của tác giả Dai L và cộng sự (2011) đã báo cáo năm 2009 ở Trung Quốc có hơn 1,3 triệu trẻ sinh ra sống mang dị tật (chiếm 8% số trẻ sinh ra ở Trung Quốc) [52] Ở Đài Bắc, hội chứng ba nhiễm sắc thể số 18 là một hội chứng gây dị tật thứ 2 ở trẻ sơ sinh, với khoảng 1/3.000 tới 1/8.000, tuổi thọ của các trẻ này phần lớn dưới 1 năm tuổi Theo tác giả Lin H và cộng sự (2006), trong giai đoạn từ năm 1988-2004 tại Đài Bắc có 39 trường hợp mang hội chứng 3 nhiễm sắc thể số 18 [83] Tại Philippines, theo Padilla C và cộng sự cho thấy dị tật bẩm sinh được xếp vào nhóm 20 nguyên nhân tử vong hàng đầu suốt đời và đã là nguyên nhân đứng hàng thứ ba gây tử vong của trẻ mới sinh Trong giai đoạn từ năm 1999-

Tại Ukraine, theo tác giả Khoshnood và cộng sự đã nghiên cứu cho thấy tỷ lệ

tử vong chu sinh vào khoảng 1/1.000 trẻ sinh Tỷ lệ trẻ sinh ra bị dị tật đã giảm xuống từ năm 2004 đến năm 2008 là 10% (từ 1,05/1.000 giảm xuống 0,94/1.000 lần sinh) [78]

1.2.2 Tình hình DTBS ở Việt Nam

Ở Việt Nam, từ giữa thế kỷ XX đã có những nghiên cứu tình hình DTBS Nguyễn Huy Cận, Bùi Thị Tía [5] nghiên cứu DTBS trong các năm 1963 và 1966 thấy tỷ lệ DTBS là 0,87% và 0,80% Phạm Gia Đức [12] tổng kết tình hình DTBS tại bệnh viện Phụ sản Hà Nội trong từ năm 1958-1970 thấy tỷ lệ DTBS là 2,43% Phan Thị Hoan [14] tổng kết tình hình DTBS ở 4 tỉnh đồng bằng sông Hồng và tại bệnh viện Phụ sản Hà Nội trong 5 năm từ năm 1991 -1995 Kết quả nghiên cứu cho thấy tần suất DTBS tại các nhóm dân cư đồng bằng sông Hồng là 19,63‰ ± 1,39‰

và ở các trẻ mới đẻ tại bệnh viện Phụ sản Hà Nội là 3,4‰ ± 0,83‰ Nghiên cứu

DTBS của Nguyễn Thị Phượng [17] tại bệnh viện Nhi Trung Ương (Hà Nội) trong

19 năm (1981- 1999) cho thấy tỷ lệ DTBS trong số bệnh nhi nhập viện ở các năm 1981-1990 là 3,6%, trong giai đoạn 1991-1996 tỷ lệ này là 11,9% và giai đoạn 1998-1999 tỷ lệ DTBS là 12,4% bệnh nhi nhập viện Theo báo cáo của Đào Thị Chút về DTBS tại Hải Phòng thì tỷ lệ DTBS là 0,4% trẻ sơ sinh [8]

Ở Miền Nam Việt Nam, những nơi bị ảnh hưởng của chất độc Da cam Dioxin do quân đội Hoa kỳ rải xuống trong chiến tranh chống Mỹ và ở các vùng miền Bắc mà người dân bị ảnh hưởng của chất độc hoá học Dioxin thì tỷ lệ DTBS cao hơn nhiều so với các vùng khác trong cả nước Kết quả nghiên cứu của Huỳnh Thị Kim Chi [6] tại sông Bé cho thấy tỷ lệ DTBS là 2,4% Ngô Gia Thạch, Trịnh Văn Bảo [18] nghiên cứu trên 6661 hồ sơ sơ sinh trong các năm từ 1973 – 1979 cho thấy tỷ lệ DTBS là 1,08% Trịnh Văn Bảo nghiên cứu tại khoa sản Bệnh viện Bạch Mai trong các năm 1999-2003 có tỷ lệ DTBS là 1,31% [1],[3] Trong các căn nguyên gây ra DTBS, căn nguyên do di truyền chiếm 14 - 20%, trong đó căn nguyên do đột biến gen chiếm khoảng 1% Các DTBS do căn nguyên di truyền thường gặp gồm có: Hội chứng Down, loạn dưỡng cơ Duchenne, tan máu di truyền Thalassemia, Haemophilia [1],[13]

-Như vậy, các công trình nghiên cứu trên thế giới cũng như tại Việt Nam đều cho thấy tỷ lệ DTBS là tương đối cao Do đó, chẩn đoán trước sinh mang lại nhiều lợi ích trong sàng lọc và tư vấn y học nhằm giảm thiểu các trường hợp sinh con bị dị tật cũng như tai biến sản khoa, góp phần làm tăng chất lượng dân số và giảm gánh nặng cho gia đình, xã hội và nâng cao sức khỏe cộng đồng nói chung Chính vì vậy,

từ lâu nhiều nhà khoa học trên thế giới và thời gian gần đây các nhà khoa học trong nước cũng đã tập trung nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật chẩn đoán trước sinh để phát hiện và ngăn ngừa sớm các DTBS

1.3 MỘT SỐ DỊ TẬT BẨM SINH THƯỜNG GẶP

1.3.1 Đặc điểm một số bệnh di truyền do bất thường số lượng nhiễm sắc thể

Hội chứng Đao (HCĐ): HCĐ là một tập hợp các bất thường bẩm sinh,

trong đó nổi bật là tình trạng chậm phát triển trí tuệ, khuôn mặt bất thường và đặc trưng, một số bất thường nội tạng có thể gặp như bất thường hệ tim mạch, tiêu hóa… và thường làm gia tăng số trẻ chết trong năm năm đầu tiên HCĐ xuất hiện với tần suất từ 1/700 – 1/1.200 ở trẻ sơ sinh Từ năm 1933, người ta đã nhận ra mối tương quan của tuổi mẹ và khả năng trẻ có HCĐ Nếu như tần suất HCĐ là 1/1.500

ở bà mẹ dưới 25 tuổi thì tần suất này có thể tăng lên tới 1/1.000 khi bà mẹ 30 tuổi

và 1/100 khi bà mẹ 40 tuổi Yếu tố tuổi của cha ít có liên quan hơn đến HCĐ Căn nguyên cơ bản của HCĐ là tình trạng bất thường số lượng nhiễm sắc thể (NST) thông qua việc dư một NST trong cặp 21 Tần số chết trong 5 năm đầu là 50%, chỉ

có 8% sống được tới 40 tuổi, 2,6% sống được tới 50 tuổi [1],[3],[7]

Hội chứng Edwards (Trisomy 18): Lần đầu tiên cũng được một nhóm các

nhà di truyền học người Anh đứng đầu là Edwards mô tả đầy đủ năm 1960 Tần số xuất hiện của bệnh khoảng 1/7.000 lần sinh Bệnh gặp ở nữ nhiều hơn nam Các trẻ trisomy 18 được sinh ra thường là thiếu cân (trọng lượng trung bình khoảng 2kg), trong khi thai lại thường bị già tháng Các biểu hiện lâm sàng ở hội chứng này đa dạng như ở hội chứng Patau Do có nhiều dị tật ở nhiều hệ cơ quan, nên thời gian sống của các trẻ trisomy 18 không được lâu Có tới 60% các trường hợp bị chết trước 3 tháng (trong đó có 30% là trước 1 tháng) Chỉ 1/10 đứa trẻ bị bệnh là sống được đến 1 tuổi [1],[3],[7],[123],[124]

Hội chứng Patau (Trisomy 13): Lần đầu tiên được Patau cùng các cộng sự

mô tả đầy đủ vào năm 1960 Trong dân cư, tần số xuất hiện bệnh vào khoảng 1/5.000 trẻ sơ sinh, tỷ lệ trai và gái bị bệnh là gần như nhau Một trong những dấu hiệu điển hình nhất của hội chứng Patau là xẻ môi trên và vòm miệng ở 75% các trường hợp, các rãnh xẻ thường là ở cả hai bên Trong tất cả các trường hợp trisomy

13, đều có sự tổn thương của hệ thống thần kinh Những dị tật bên ngoài nhìn thấy được của não có thể có ở 85% bệnh nhân, trong số đó ổn định nhất là vô não (63,4%), có 75% trường hợp vô não kèm theo đầu bé và các tổn thương khác Do có quá nhiều dị tật nặng nề, nên những trẻ trisomy 13 thường không sống được lâu, 80-

90% bệnh nhân bị chết trong vòng 1 tuổi, trong đó 40% là chết trong vòng 1 tháng sau sinh [1],[3],[7],[123],[124]

Hội chứng Klinefelter (47,XXY): Là dạng bệnh nhiễm sắc thể giới tính hay

gặp nhất ở nam giới với tần số khoảng 1,5:1000 lần sinh con trai và thường gặp trong các trường hợp người mẹ lớn tuổi với tuổi trung bình trên 32,3 Những biểu hiện lâm sàng ở tuổi niên thiếu của bệnh nhân Klinefelter chỉ nhận thấy được ở sự giảm trí tuệ nhẹ, học đọc và viết khó khăn, người yếu nhưng lại thường có chiều cao lớn hơn các trẻ cùng lứa do chân dài Tuổi thọ của những bệnh nhân này bình thường, thiểu năng sinh dục, tăng nguy cơ rối loạn tâm thần [1],[3],[7],[123],[124]

Hội chứng Trisomy X (47,XXX): Hội chứng Trisomy X được gặp trong

dân cư với tần số chung vào khoảng 1,3:1.000 lần sinh con gái Những biểu hiện bên ngoài nói chung rất khó phân biệt người bệnh với những người bình thường do không có những biến đổi rõ ràng về hình thái cũng như về trí lực và thể lực Tuy nhiên, ở những người bệnh cũng có một số bất thường về chức năng sinh sản ở phụ

nữ như vô kinh thứ phát, rối loạn kinh nguyệt, tắt kinh sớm, tỷ lệ mắc bệnh tâm thần phân liệt cao Những phụ nữ Trisomy-X vẫn có khả năng sinh đẻ song nguy cơ các bất thường nhiễm sắc thể ở con cái cao hơn những người bình thường Cơ sở di truyền của hội chứng Trisomy-X là trong bộ nhiễm sắc thể của người bệnh bị thừa 1 nhiễm sắc thể giới tính X so với các phụ nữ bình thường Kiểu nhân khi dạng bệnh thuần là 47,XXX; Còn kiểu nhân ở dạng bệnh khảm là 47,XXX/46,XX [1],[3],[7],[123],[124]

Hội chứng Monosomi X (hội chứng Turner – thể một X): Tần số chung

của bệnh được xác định vào khoảng 0,7:1.000 lần sinh con gái Tỷ lệ trong số các thai sảy là 1:13 Khoảng 90% các thai có bất thường kiểu Turner bị sẩy thai sớm Xét nghiệm không thấy có nội tiết tố nữ estrogen và pregnandiol, tăng FSH, 17-cetosteriod thường thấp Những nghiên cứu di truyền tế bào đã xác định được khoảng trên 50% kiểu nhân ở hội chứng Turner khi dạng bệnh thuần là 45,X; số còn lại ở dạng khảm và có rối loạn cấu trúc NST X khi dạng bệnh khảm là 45,X/46,XX

hoặc 45,X/47,XXX Ngoài ra có thể gặp thể 45,X/46,XY, người bệnh bất thường cơ quan sinh dục ngoài, biểu hiện hoặc có hình thái nam hoặc mơ hồ giới tính hoặc hình thái nữ hoàn toàn [1],[3],[7],[123]

1.3.2 Đặc điểm một số bệnh di truyền do đột biến gen được nghiên cứu trong

đề tài

Tăng sản thượng thận bẩm sinh: Tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (gọi

tắt là CAH-Congenital Adrenal Hyperplasia) là một loại bệnh di truyền liên quan đến rối loạn hormon của tuyến thượng thận (cortisol, aldosterone) Bệnh không phổ biến, với tần suất mắc bệnh là 1/12.000-15.000 trẻ em sơ sinh [7],[123],[124] Bệnh chủ yếu do đột biến gen CYP21A2, di truyền theo cơ chế di truyền gen lặn nằm trên nhánh ngắn NST số 6 (6p.21.3) Khi đột biến dẫn đến thiếu enzyme 21-hydroxylase gây các thể bệnh khác nhau, đặc biệt là gây nam hóa cơ quan sinh dục nữ

Đối với bé gái còn nhỏ tuổi mắc bệnh CAH có âm vật phình to có thể trông giống dương vật cỡ nhỏ Ngoài ra, khe hở giữa các môi âm vật có thể hơi đóng lại, che khuất đường vào âm đạo Thường thì người ta có thể nhìn thấy một lỗ hở Cả đường tiểu lẫn đường âm đạo đều chung nhau một lỗ Tuy nhiên, các cơ quan bên trong lại khá bình thường Âm đạo, tử cung và buồng trứng đều hoạt động tốt, nữ bị bệnh CAH thường vẫn có khả năng sinh con Việc chẩn đoán và điều trị thai nhi bị CAH chỉ có thể thực hiện được nếu người mẹ trước đây có con mắc bệnh CAH, vì biết rằng đứa con gái tiếp theo cũng có thể bị bệnh Trong trường hợp này, người

mẹ được chỉ định uống thuốc Dexamethasone mỗi ngày 3 lần, từ khi người mẹ biết mình có thai và không được muộn hơn sau 9 tuần kể từ ngày đầu tiên của chu kỳ kinh nguyệt gần nhất Sau ngày đầu tiên của chu kỳ kinh nguyệt gần nhất từ 10 đến

11 tuần, người mẹ sẽ được lấy mẫu sinh thiết nhau thai (nhung mao màng đệm - CVS) hoặc nước ối thai nhi sau tuần thứ 14 để làm xét nghiệm Mục đích của xét nghiệm là để xác định giới tính của thai, và để xác định xem thai nhi có bị mắc bệnh CAH hay không [7],[123],[124] Sau khi đã chuẩn hóa được kỹ thuật tách chiết ADN phôi thai tự do và kỹ thuật PCR nhân gen SRY, chúng tôi tiến hành thử

nghiệm sàng lọc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh trước sinh ở tuần thứ 8 của thai kỳ trên cơ sở sàng lọc giới tính thai nhi Đối với các trường hợp thai dương tính với gen SRY sau khi nhân PCR sẽ không chỉ định dùng thuốc Dexamethason, còn các bệnh nhân âm tính với gen SRY sẽ được các bác sĩ tiếp tục chỉ định cho dùng thuốc Dexamethason đến tuần thứ 16 của thai kỳ để tránh trường hợp nam hóa khi thai nhi mang gen bệnh CAH Đến tuần này các bác sĩ siêu âm lại và chọc ối với các thai âm tính với gen SRY để chẩn đoán có bị bệnh CAH hay không để tiếp tục phác

đồ điều trị bệnh bằng Dexamethason nữa và dừng thuốc khi không bị bệnh

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne: Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy - DMD) là một trong những bệnh loạn dưỡng cơ - di truyền

phổ biến nhất với tỷ lệ mắc khoảng 1/3.500 trẻ trai sơ sinh Bệnh DMD có đặc trưng

là thoái hoá và gây suy yếu cơ một cách tuần tiến dẫn đến tàn tật và tử vong do suy tim và bội nhiễm phổi Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh được nhận biết ở giai đoạn trẻ từ 2 đến 3 tuổi Các bệnh nhân được coi như mắc thể nặng nếu phải ngồi xe lăn, mất khả năng tự đi lại trước tuổi 12, bệnh nhân có thể sống tới 26 tuổi Gen DMD nằm trên vai ngắn NST X (Xp21) di truyền theo cơ chế di truyền lặn liên kết NST

X Do vậy bệnh di truyền có thể do ông ngoại mang gen di truyền chéo cho cháu trai, hoặc do các mẹ mang gen di truyền gen bệnh cho con trai, sự tồn tại của gen gây bệnh DMD này có thể do người bị bệnh di truyền lại hoặc do người mang gen

di truyền lại trong quần thể Một phần nhỏ nguyên nhân gây bệnh DMD là do đột biến mới Việc chẩn đoán chính xác bệnh DMD có tầm quan trọng rất lớn, là tiền đề

và cơ sở cho việc phòng bệnh chủ động bằng tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh cho gia đình người bệnh và điều trị bằng liệu pháp gen trong tương lai [7],[110],[123],[124] Ở đây việc chẩn đoán sớm giới tính thai nhi trong trường hợp gia đình có tiền sử bị bệnh DMD rất có ý nghĩa trong y học, giúp bác sĩ di truyền tư vấn trước sinh thai nhi có nguy cơ mắc bệnh DMD hay không Nếu thai nhi là nữ thì không có khả năng bị bệnh nếu người cha bình thường, còn thai nhi là nam thì

có khả năng 50% không bị bệnh và 50% bị bệnh do gen di truyền từ mẹ

Bất đồng nhóm máu Rh giữa mẹ và con: Ở phụ nữ nhóm máu Rh-, lấy

chồng nhóm máu Rh+, các con có thể có nhóm máu Rh+ hoặc Rh- Nếu thai nhi Rh+, khi sinh lần đầu một lượng nhỏ hồng cầu của máu thai nhi có thể lọt qua nhau thai vào cơ thể mẹ, trong máu của mẹ sẽ xuất hiện kháng thể kháng Rh+ Nhưng ở những lần có thai sau lượng kháng thể kháng Rh+ có sẵn trong máu của người me ̣ tấn công hồng cầu thai nhi (nếu thai nhi mang nhóm máu Rh+) gây tan máu của thai nhi Vì vậy, gây sảy thai, đẻ non, thai chết lưu Phân tích tính chất di truyền của yếu tố Rh cho biết yếu tố này di truyền theo tính trô ̣i , bởi vâ ̣y có thể coi mô ̣t cách đơn giản rằng nhóm máu này bị chi phối bởi hai alen R và r Người Rh+ có kiểu gen là

RR hoă ̣c Rr , người Rh- chỉ có kiểu gen là rr Thâ ̣t ra khi nghiên cứu chi tiết huyết thanh đă ̣c hiê ̣u của người me ̣ miễn di ̣ch do đã được truyền máu cho thấy rằng có nhiều kháng thể Rh khác nhau với các phản ứng khác nhau của kháng nguyên Rh

Vì vậy , người ta có thể phân huyết thanh kháng Rh ra loa ̣i kháng C , kháng E và kháng D ; trong số đó huyết t hanh kháng D quan tro ̣ng nhất [7],[123],[124] Xác định được nhóm máu Rh thai nhi ở các thai phụ có nhóm máu Rh-, chẩn đoán Rh+

sẽ giúp dự phòng bất đồng nhóm máu Rh mẹ và thai nhi

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH

1.4.1 Các phương pháp sàng lọc dị tật trước sinh

1.4.1.1 Siêu âm

Siêu âm: là một kỹ thuật không gây đau sử dụng sóng âm để tạo ra hình ảnh của các cơ quan và các cấu trúc bên trong cơ thể Đây là kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh được sử dụng rất phổ biến Siêu âm đo độ mờ da gáy thai nhi: thường tiến hành vào khoảng tuần thứ 11 - 14 của thai kỳ Siêu âm đo độ mờ da gáy cho phép đánh giá xem thai nhi có nguy cơ mắc Hội chứng Down hay bị các bất thường khác về nhiễm sắc thể hay không Việc đánh giá rủi ro này được dựa trên tuổi của thai phụ,

độ mờ của da gáy, xương mũi thai nhi [7], [40], [65], [102], [104]

Siêu âm vào giữa ba tháng giữa: Các bệnh viện thường có siêu âm vào giữa

ba tháng giữa, lần siêu âm này thường được thực hiện vào khoảng từ tuần thai thứ

16-20 Siêu âm giai đoạn này kiểm tra: hình thái bên ngoài của thai nhi, xương sống, bụng, thận, bàng quang của thai nhi, nhau thai, cuống rốn và nước ối, kích thước đầu bụng và xương đùi

1.4.1.2 Sàng lọc test bộ hai (Double test)

Sàng lọc bộ hai là một trong các test của biện pháp sàng lọc dựa vào một số chất đặc trưng của thai DTBS có ở trong máu của thai phụ (AFP, ß-hCG, uE3, PAPP-A và inhibin-A) còn gọi là sàng lọc bằng huyết thanh mẹ Phương pháp này

có giá trị cao trong việc sàng lọc một số thai DTBS được biết đến từ đầu những năm

1980 Tỉ lệ phát hiện thai Down của các biện pháp sàng lọc huyết thanh hiện nay có thể tới hơn 90% tổng số thai bị Down ở tất cả các thai phụ tham gia sàng lọc Double test đánh giá bằng cách định lượng các chất ở các tuổi thai khác nhau (AFP, ß-hCG) hoặc (AFP và uE3) hoặc (hCG và PAPP-A) AFP (alpha-fetoprotein)

là protein được sản xuất bởi bào thai hCG: một loại hormon được sản xuất trong nhau thai uE3: Unconjugated Estriol: là một estrogen (một dạng hormone) được sản xuất bởi cả bào thai và nhau thai.Trong đó sử dụng các marker là ß-hCG

và PAPP-A có thể tiến hành sàng lọc ngay từ quý I của thai kì và hiệu quả sàng lọc tới 70% số thai Down Ngoài ra với một số DTBS khác thì tỉ lệ phát hiện của biện pháp này thấp hơn một chút [7], [27], [44], [71], [105]

Hiện nay, ở VN cũng như thế giới thường sử dụng phần mềm để tính toán nguy cơ dựa vào kết quả định lượng các chất trong máu mẹ Sàng lọc trước sinh bằng sàng lọc huyết thanh mẹ nên kết hợp với một số yếu tố khác như tiền sử gia đình có người DTBS, tiền sử sinh con DTBS, tiền sử sẩy thai, thai chết lưu hay dựa vào tuổi mẹ hoặc siêu âm thai Không nên chỉ dựa vào một yếu tố sàng lọc huyết thanh mẹ để xác định thai có nguy cơ cao bị DTBS Có thể chỉ định Double Test ở tất cả các thai phụ có thai trong quý đầu (giữa tuần thứ 9 đến tuần thứ 11) của thai kỳ Đặc biệt, những thai phụ có các đặc điểm như: tiền sử gia đình có người

bị DTBS, trên 35 tuổi, nhiễm virus trong thời kỳ mang thai… Trong trường hợp thai

có độ mờ da gáy gần giá trị ngưỡng 3 mm, nên làm Double Test để giúp đánh giá chính xác hơn nguy cơ hội chứng Down [7],[27], [44], [71], [105]

Sự khác nhau của các giá trị β-hCG tự do (mU/mL) và PAPP-A (mU/mL) được một phần mềm máy vi tính chuyên dụng tính toán hiệu chỉnh theo: tuổi mẹ (năm), tuổi thai (tuần + ngày), cân nặng của mẹ (kg), chủng tộc, tuổi thai, chiều dài đầu mông và độ mờ da gáy đo bằng siêu âm,… để thành một đơn vị đa trung bình MoM (multiple of median) và mức độ nguy cơ của các hội chứng trên được tính toán từ các giá trị đa trung bình ấy Giá trị bình thường của các thông

số β-hCG tự do và PAPP-A máu thai phụ sau khi hiệu chỉnh đều bằng 1 MoM Giá trị ngưỡng (cut-off) thấp và cao của các thông số để đánh giá nguy cơ DTBS như sau: β-hCG tự do < 0,4 hoặc > 2,5 MoM; PAPP-A < 0,4 MoM Xét nghiệm này không có khả năng phát hiện tất cả các bất thường nhiễm sắc thể Nó chỉ cảnh báo thai có nguy cơ tăng đối với một số dị tật nêu trên Nếu Double Test chỉ ra nguy cơ DTBS cao (dương tính), cần phải tiến hành chẩn đoán xác định bằng sinh thiết nhung mao màng đệm nhau thai hoặc chọc ối Nếu thai có nguy cơ DTBS ở mức ranh giới, cần thử tiếp Triple Test ở quý II của thai kỳ để đánh giá mức độ nguy cơ

rõ ràng hơn

1.4.1.3 Sàng lọc bộ ba (Triple test)

Triple test là loại xét nghiệm sàng lọc sử dụng máu mẹ để tìm hiểu nguy cơ

một số rối loạn bẩm sinh ở thai Triple test còn được gọi là bộ 3 xét nghiệm, bởi vì chúng cho biết 3 chỉ số: hCG, AFP và uE3 Từ đó có thể tính được nguy cơ khuyết tật của bào thai

Xét nghiệm thường được thực hiện trong tuần thứ 15-20 của thai kỳ, bằng cách phân tích mẫu máu của mẹ Do đó, nó không ảnh hưởng đến sức khỏe của mẹ

và bé Kết quả xét nghiệm có thể được trả lại cho thai phụ sau vài ngày Ngoài kết quả xét nghiệm máu, các nguy cơ dị tật bào thai còn được định lượng trên các yếu

tố như tuổi tác, cân nặng, chứng tiểu đường hoặc những bất thường về gen của người mẹ… Tất cả thai phụ đều có thể được chỉ định làm Triple test nhưng phổ biến

hơn với các trường hợp sau: Thai phụ có tiền sử gia đình về dị tật bào thai, 35 tuổi hoặc trên 35 tuổi, sử dụng thuốc hoặc chất gây nghiện nguy hiểm trong thời gian mang thai, mắc chứng tiểu đường và phải tiêm insulin, mắc chứng bệnh truyền nhiễm trong thời gian mang thai, tiếp xúc với phóng xạ, Những thai phụ đã kiểm tra double test ở quý 1 của thai kỳ với thai có nguy cơ DTBS ở mức ranh giới (borderline risk) cần phải thử tiếp triple test để đánh giá mức độ nguy cơ rõ ràng hơn Triple test không có khả năng giúp phát hiện tất cả các DTBS, nghĩa là không thể phát hiện tất cả các dị tật ống thần kinh hoặc các dị tật khác của nhiễm sắc thể

Nó chỉ có thể cảnh báo người thày thuốc rằng hiện tại thai có nguy cơ tăng đối với một số dị tật và rằng chọc ối cần phải được xem xét thực hiện để chẩn đoán xác định Đôi khi, để tăng độ nhạy của triple test, người ta sử dụng test 4 "quad test" bằng cách đo và tính toán thêm Inhibin A vào các thông số β-hCG, AFP và uE3 của triple test [7], [44], [105]

1.4.2 Các phương pháp chẩn đoán dị tật trước sinh

1.4.2.1 Phương pháp chẩn đoán xâm lấn

*Phương pháp lấy vật liệu di truyền Muốn chẩn đoán bất thường nhiễm sắc thể, đầu tiên phải lấy được các vật liệu di truyền từ thai nhi Có thể dùng các phương pháp:

- Chọc hút nước ối (Amniocentesis)

- Sinh thiết nhau thai (Chrionic Villus sampling)

- Lấy máu cuống rốn (Percutaneous umbilical cord blood sampling)

a) Chọc hút nước ối (Amniocentesis)

Là thủ thuật chọc kim vào buồng ối để hút nước ối ra làm xét nghiệm Năm

1968, người ta đã phát hiện được rối loạn nhiễm sắc thể ở hội chứng Down nhờ phương pháp này Tuy nhiên phương pháp này cho phép chẩn đoán muộn (tuổi thai

từ 15 – 18 tuần tuổi trở lên) và gây ra những tai biến nhất định như chọc hút thất bại; nguy cơ đối với thai: sẩy thai (0,5-1%), rò ối (1%), nhiễm khuẩn ối (0,5 – 1,5/1.000), chảy máu, phản ứng kháng nguyên kháng thể Rh, gây biến dạng xương

khớp, nguy cơ đối với mẹ: chảy máu vào ổ bụng do chọc vào các mạch máu ở đoạn dưới tử cung hay động mạch thượng vị dưới, đau bụng (8% - Henrion và Para) do huyết tụ [63],[71],[120]

Nước ối là một bệnh phẩm quan trọng cho phép làm một số phân tích để thăm dò tình trạng của thai: các xét nghiệm sinh hóa của nước ối, các xét nghiệm về miễn dịch, các xét nghiệm về vi sinh y học và đặc biệt là xét nghiệm nuôi cấy tế bào nước ối để làm nhiễm sắc thể đồ thai nhi trong những trường hợp thai nhi có bất thường về hình thái trên siêu âm Chọc hút nước ối là một trong những phương pháp lấy bệnh phẩm của thai nhi, bằng cách đưa một kim vào buồng ối qua thành bụng dưới sự hướng dẫn của siêu âm hoặc là không, để hút nước ối

Năm 1966, Edwards đã chẩn đoán được giới tính của cặp song sinh 1 nam và

1 nữ từ nước ối Từ khi ứng dụng các phương pháp và các phương tiện vào chẩn đoán trước sinh thì chọc hút nước ối càng trở lên cần thiết Người ta đều thừa nhận rằng, về mặt kỹ thuật thì đây là một phương pháp lấy bệnh phẩm thai nhi đơn giản,

dễ làm, hiệu quả và ít biến chứng nhất [59]

Từ khi ứng dụng phương pháp siêu âm hình thái thai nhi vào chẩn đoán trước sinh nhằm phát hiện các dị dạng về hình thái của thai nhi thì chọc hút nước ối càng đóng vai trò quan trọng, giúp các nhà chẩn đoán trước sinh tìm hiểu các nguyên nhân cũng như xác định sự liên quan của các bất thường hình thái thai nhi và các tổn thương nhiễm sắc thể, giúp cho việc quyết định thái độ xử trí đối với thai nghén thông qua sự phân tích kết quả nhiễm sắc thể đồ thai nhi bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào nước ối [5],[15]

Chọc hút nước ối không gây đau nên không cần phải sử dụng thuốc giảm đau cho sản phụ trước khi chọc Hiện nay, chọc hút nước ối được thực hiện dưới hướng dẫn của siêu âm, số lượng nước ối được lấy ra theo tuổi thai 1ml/1 tuần tuổi thai cho thai dưới 15 tuần, trung bình 20ml Số lần chọc hút nước ối trung bình là một lần, thời gian chọc hút nước diễn ra nhanh trong vòng 1-2 phút Nước ối được đựng vào một ống đặc biệt sau đó gửi đến phòng xét nghiệm nuôi cấy để làm các xét nghiệm

trên Hầu như không có tai biến nào xảy ra đối với sản phụ cũng như thai nhi trong

và sau khi làm thủ thuật

Nghiên cứu của Trần Danh Cường và cộng sự (2009) trên 300 thai phụ thuộc nhóm nguy cơ cao có tuổi thai trên 16 tuần được chọc hút nước ối tại Bệnh viện Phụ sản Hà Nội Các chỉ định chính là triples test (+) (25%), siêu âm thai bất thường (17%) và tăng độ mờ da gáy (KSSG) (11%) Thủ thuật đơn giản, tiến hành an toàn, không có tai biến Kết quả cho thấy tỷ lệ bất thường NST là 7,3%, trong đó cao nhất

là hội chứng Down (4,3%), hội chứng Edwards (1,3%), hội chứng Turner (0,66%) [9]

b) Sinh thiết nhau thai (Chorionic Villus Sampling)

Kỹ thuật sinh thiết nhau thai được Brambati và Simoni (1982) thực hiện bằng cách sinh thiết nhau thai qua cổ tử cung dưới sự hướng dẫn của siêu âm tức thời đã xét nghiệm và chẩn đoán được hội chứng Down ở thai tuần thứ 11 Năm 1997, Hahnemann và cộng sự đã chẩn đoán nhiễm sắc thể qua sinh thiết nhau thai cho 192 thai phụ [74] Tại Bệnh viện Từ Dũ, sinh thiết nhau thai và cấy dài ngày với những thai kỳ 11-13 tuần ở 29 trường hợp [16] Phương pháp này có thể tiến hành trong 3 tháng đầu của thai kỳ Tuy nhiên tỷ lệ sẩy thai là 2 – 3%, chảy máu âm đạo (7 - 10%), ngoài ra còn gây nhiễm khuẩn và dị tật cho thai nhi Các tế bào lông nhau được phân tích bằng các phương pháp khác nhau Xét nghiệm phổ biến là làm nhiễm sắc thể đồ của thai Có nghiên cứu cho thấy tăng tần suất và mức độ nghiêm trọng của dị tật ngắn chi ở trẻ em sinh ra sau khi làm thủ thuật được tiến hành trước

10 tuần hay 70 ngày tuổi thai) [4] Để có thể áp dụng sinh thiết nhau thai trong chẩn đoán tiền sản cần phải tiến hành thêm nhiều nghiên cứu nữa trên nhiều đối tượng để đánh giá về tỷ lệ sẩy thai, khả năng gây dị tật cho thai do thủ thuật sinh thiết gây ra sau đó kiểm tra sự chính xác của kết quả nuôi cấy nhau thai [90]

c) Lấy máu cuống rốn (Cordocentesis hay Percutaneous umbilical cord blood sampling (PUBS))

Kỹ thuật lấy máu cuống rốn qua da tương tự như chọc hút nước ối, nhưng chỉ thay việc lấy dịch ối bao xung quanh thai bằng lấy máu thai nhi Siêu âm quyết định

vị trí của kim đưa vào bánh nhau và kim sẽ đi xuyên qua thành bụng, thành tử cung

để vào trong tĩnh mạch thai trong dây rốn, nơi mà máu của thai nhi được lấy ra Kỹ thuật này thực hiện được rất muộn (khi thai nhi đã trên 18 tuần) và đòi hỏi chuyên môn cao, khó phổ biến rộng rãi Phương pháp này cũng gây nguy cơ sẩy thai 1-2% [37]

*Phân tích vật liệu di truyền từ các mẫu xâm lấn: dịch ối, nhau thai, máu cuống rốn

Sau khi lấy được các vật liệu di truyền của thai nhi như trên, người ta tiến hành các phân tích về di truyền để chẩn đoán bằng một trong hai phương pháp sau:

a Phương pháp di truyền học tế bào (phân tích nhiễm sắc thể) bằng nuôi cấy

tế bào ối, tế bào nhau thai hay các tế bào bạch cầu lympho để xác định nhiễm sắc thể đồ của thai nhi

- Về nuôi cấy tế bào ối: Dịch ối là hỗn hợp tế bào đồng nhất, phụ thuộc các giai đoạn phát triển của rau thai, gồm các tế bào màng ối, tế bào da tiết niệu, hô hấp,

tế bào máu mẹ và thậm chí có thể có cả tế bào máu thai nhi nên phân tích tế bào ối được xem như phương pháp thuận tiện nhất, đáng tin cậy nhất [3],[7]

- Nuôi cấy tế bào nhau thai: người ta nuôi cấy các tế bào thai nhi lấy từ nhau thai

- Nuôi cấy bạch cầu Lympho: là phương pháp thường quy để nghiên cứu nhiễm sắc thể người

Quá trình nuôi cấy tế bào, người ta dùng các thuốc kích thích phân bào PHA cùng Colchicine hoặc Colcemid để tích lũy nhiều tế bào đang phân chia ngừng ở kì giữa- kì mà nhiễm sắc thể trong tế bào co ngắn cực đại, có cấu trúc điển hình nhất, thuận lợi cho nghiên cứu Muốn xác định từng cặp nhiễm sắc thể trong nhiễm sắc thể đồ sau nuôi cấy phải áp dụng kỹ thuật nhuộm băng (băng G, băng Q, băng R, C, T…) [68],[127]

b Phương pháp di truyền học phân tử bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (FISH)

FISH là 1 kỹ thuật tế bào phân tử, dùng một trình tự ngắn của chuỗi ADN sợi đơn, gọi là mẫu ADN dò (được đánh dấu bằng huỳnh quang) Một mẫu ADN dò được lai với các ADN đích trên nhiễm sắc thể của tế bào gian kì hoặc các nhiễm sắc thể ở kì giữa, kết quả được đọc trên kính hiển vi huỳnh quang Một mẫu ADN dò sẽ lai với 2 vị trí trên 2 nhiễm sắc thể của cặp nhiễm sắc thể tương đồng trong nhân tế bào sinh dưỡng Nếu mẫu dò lai với 3 vị trí thay vì 2 vị trí như bình thường trên nhiễm sắc thể 21 chứng tỏ bệnh nhân có biểu hiện hội chứng Down

Nhờ kỹ thuật này có thể phát hiện những bất thường do đoạn gen nhỏ gây ra với độ phân giải cao Phương pháp này còn phát hiện được cả bất thường nhiễm sắc thể ở gian kì mà không cần tiến hành nuôi cấy tế bào và nhuộm băng nhiễm sắc thể Tuy nhiên giá thành của kỹ thuật này cao hơn nhiều so với kỹ thuật nuôi cấy thông thường Đồng thời đòi hỏi thiết bị, chuyên môn cao và mất nhiều thời gian để đọc kết quả nên không thể triển khai rộng rãi trên quy mô lớn [57],[68],[94]

FISH dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic trên NST mong muốn bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với các trình tự đích đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào) Quy trình thực hiện kỹ thuật FISH bao gồm các bước cơ bản sau:

- Chuẩn bị mẫu và đầu dò

- Cố định mẫu

- Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào

- Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai

- Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang trực tiếp)

- Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả

Hình1.1: Các bước chính của kỹ thuật FISH

c Phương pháp nhân gen PCR:

Trong nghiên cứu này có dùng kỹ thuật Nested PCR để chứng minh sự có mặt của ADN phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ Phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng với kỹ thuật realtime PCR Nguyên tắc của kỹ thuật này là sử dụng 2 cặp mồi để khuếch đại đoạn gen đích Cặp mồi ngoài khuếch đại đoạn gen

có kích thước dài hơn, đoạn gen này bao phủ cả đoạn sản phẩm gen của cặp mồi trong Sản phẩm của cặp mồi ngoài được dùng là mẫu ADN khuếch đại của cặp mồi trong

Ưu điểm của kỹ thuật này là sản phẩm khuếch đại của cặp mồi trong rất đặc hiệu và không bắt cặp vào các trình tự không mong muốn Bình thường số chu kỳ khuếch đại của mồi ngoài không quá lớn để tránh trường hợp sản phẩm của mồi trong bắt phải trình tự gen không mong muốn Số chu kỳ khuếch đại của mồi trong nhiều hơn số chu kỳ khuếch đại của mồi ngoài, nhưng số chu kỳ khuếch đại của mồi trong không vượt quá 45 chu kỳ

Hình 1.2: Nguyên tắc của phản ứng Nested PCR (PCR lồng)

Real-time PCR là một cải biến của phương pháp PCR dựa trên chức năng

5’-3’ polymerase của Taq ADN polymerase do Holland và cộng sự công bố năm

1991 Trong phản ứng Real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào ADN mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX )

Tác nhân liên kết với mạch đôi ADN: Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm ADN mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với ADN mạch đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này

và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn (so với trạng thái tự do trong dung dịch)

Nguyên tắc của kỹ thuật Realtime – PCR sử dụng Taqman probe: Trong kỹ

thuật này, Realtime-PCR mix ngoài các thành phần cơ bản của PCR mix, còn chứa

2 thành phần quan trọng để probe có thể phát huỳnh quang được khi có sự hiển diện

của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ADN đích, đó là (1) Taqman probe, là những

oligonucleotides có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu ADN đích và trình tự này dài khoảng 24-30 nucleotides với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang (còn gọi là Reporter) còn đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi là quencher) để hấp thụ

được ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter (2) Enzyme Taq polymerase có hoạt

tính 5’-3’ exonuclease để có khả năng thủy giải cắt bỏ probe khi probe này bắt cặp nên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzyme kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung

Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe được minh họa bằng hình 1.3

Hình 1.3 Phương pháp Real-time PCR với mẫu dò TaqMan

Có thể tóm tắt cơ chế này như sau: (1): khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ ADN đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra được từ reporter ở đầu 5’sẽ bị quencher ở đầu 3’ của

probe hấp phụ, ống thử nghiệm sẽ không phát huỳnh quang khi nhân đƣợc nguồn sáng kích thích

Hình 1.4 Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Realtime-PCR

(2) Khi bắt đầu xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe

sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị

enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà

reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát đƣợc huỳnh quang khi

nhận được nguồn sáng kích thích Càng nhiều sản phẩm khuếch đại thì số lượng reporter tự do càng nhiều, đến một lúc nào đó cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích

Cuối cùng xác định số bản copy tác nhân đích có trong mẫu thử hay bệnh phẩm dựa vào hệ số pha loãng mẫu và hệ số tách chiết ADN hay ARN của phương pháp chuẩn bị mẫu trước khi thực hiện PCR

Cụ thể phương pháp tính toán số bản copy của ADN đích ban đầu trong ống phản ứng dựa vào đường biểu diễn chuẩn như sau:

- Đường biểu diễn chuẩn cho được một hàm số biểu thị mối tương quan giữa chu kỳ ngưỡng Ct với Log10 của số lượng bản ADN đích ban đầu có trong ống phản ứng (X= log10Sq) Hàm số đó là Y = [Slope (X) ] + intercept, và các thông số Slope và intercept đều hiển thị trên biểu đồ chuẩn

- Từ hàm số này, người làm thí nghiệm sẽ biết được tại sao máy tính hiển thị được Sq, đó là nhờ tính toán từ Sq = 10[(Ct – intercept)/Slope]

STR (Short Tandem Repeat) là các trình tự lặp lại thường thuộc các đoạn

không mã hoá trên ADN Đó là các vùng siêu biến của bộ gen với các đơn vị lặp có chiều dài từ 2-7 nucleotid Các đoạn ADN có trình tự lặp lại này khác nhau về kích thước Sự đa hình của các STR xuất phát từ sự thay đổi số lượng các đơn vị lặp lại, dẫn đến sự đa dạng chiều dài của các alen trong gen đích [20],[23],[31],[38], [62],[64],[68]

Khi tiến hành kỹ thuật PCR, các alen STR có thể được khuếch đại và phân biệt rõ ràng trên hình ảnh điện di polyacrylamid Bình thường một cá thể có 2 NST trong mỗi cặp tương đồng nên mỗi locus STR sẽ có tối đa 2 alen, một alen có nguồn gốc từ mẹ và alen còn lại có nguồn gốc từ bố Trong trường hợp số alen nhiều hơn

2, chứng tỏ có sự bất thường trên NST đó Chính vì thế, phương pháp nhân gen PCR các locus STR có thể ứng dụng trong xác định bất thường NST thông qua xác định số lượng alen của locus trên NST cần khảo sát

Trong xác định bất thường NST thể các locus STR cần thoả mãn các yêu cầu sau:

- Thứ nhất: Locus STR phải có tính đa hình và tỉ lệ dị hợp tử cao

- Thứ hai: Locus STR phải có kích thước ngắn (vì có tính bền vững cao hơn, ít bị đứt gẫy hơn khi có sự tác động của điều kiện tự nhiên và khuếch đại PCR dễ dàng hơn)

Gần đây người ta đã phát hiện ra các trình tự lặp ngắn STR có tính đa hình cao ở một số locus nhất định trên nhiễm sắc thể số 13, 21, 18, X, Y Nhờ đó khi tiến hành phản ứng nhân gen PCR những locus này, chúng ta có thể xác định được số lượng các alen trên hình ảnh điện di Do bất thường số lượng alen tương ứng với bất thường các nhiễm sắc thể này nên phương pháp này có thể ứng dụng để chẩn đoán hội chứng bất thường nhiễm sắc thể một cách nhanh chóng và chính xác mà không phải nuôi cấy tế bào[89],[90]

Kỹ thuật QF-PCR được gọi là phản ứng chuỗi Polymer hóa huỳnh quang định lượng dùng để khuyếch đại các STR Đây là phương pháp xác định các dị tật

về gen và nhiễm sắc thể hiệu quả nhanh chóng hơn so với các phương pháp khác Bằng sử dụng các cặp mồi huỳnh quang, các đoạn ADN được khuyếch đại có thể được quan sát thấy và định lượng được thông qua diện tích các peak trên hệ thống máy quét tự động Các trường hợp bình thường được chỉ ra là các peak có tỷ lệ 1:1 (Adinolfivà cộng sự, 1997) [20].

Cả FISH và QF-PCR đều cho kết quả nhanh (chỉ trong 24-48h) hơn so với phương pháp phân tích nhiễm sắc thể Tuy nhiên hiện nay cả hai kỹ thuật chỉ phát hiện được bất thường một số nhiễm sắc thể (Bianchi, Evans và cộng sự, 2002) [30]

QF-PCR có một ưu điểm hơn FISH, QF-PCR có thể thực hiện được trên số lượng tế bào ít và việc phân tích dễ dàng tự động hóa do vậy có thể xử lý nhiều mẫu trong cùng một thời gian, toàn bộ quá trình thực hiện trong khoảng 30 phút FISH

có thể sử dụng các đầu dò thương mại, nhưng QF-PCR có thể phát hiện được các trường hợp mẫu có nhiễm máu mẹ mà FISH không thể thực hiện được Dựa trên những kết quả đó, QF-PCR ngày càng được sử dụng để trở thành công cụ bổ trợ