Tiểu luận Tổng hợp và nghiên cứu hoạt tính sinh học của vật liệu y sinh hydroxyapatite (HA) từ vỏ trứng

Vật liệu y sinh xương nhân tạo Hydroxyapatite Ca 10 PO 4 6 OH 2 HA Có rất nhiều loại vật liệu y sinh khác nhau, riêng nhóm vật liệu y sinh sử dụngnhư vật liệu xương nhân tạo có thể kể

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT

TS Bùi Xuân Vương Mai Thị Tuyết / D12HH01

Lê Thị Thu Thắm / D12HH01

Võ Oanh Kiều / C12HO01

Lê Thị Hồng Trâm / C12HO01

Qua đây nhóm sinh viên làm đề tài NCKH xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy Bùi Xuân Vương, người đã trực tiếp hướng dẫn nhóm nghiên cứu, rèn luyện cho nhóm cách thức thực hiện - quản lý công việc trong hoạt động NCKH

1/4/2014

NCKH

THUYẾT MINH ĐỀ TÀI……….7

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……… 12

1.1 Vật liệu y sinh……… 12

1.1.1 Khái niệm:……….12

1.1.2 Phân loại:……… 12

1.1.3 Vật liệu y sinh xương nhân tạo Hydroxyapatite Ca10(PO4)6(OH)2 (HA)… 12

1.2 Tính chất lý hóa của vật liệu y sinh HA……… 14

1.3 Sự tương hợp sinh học và hoạt tính sinh học của vật liệu HA……….15

1.4 Ứng dụng……… 15

1.4.1 Ứng dụng của HA dạng bột kích thước nano………15

1.4.2 Ứng dụng của HA dạng màng……… 16

1.4.3 Ứng dụng của HA dạng bột như vật liệu xương nhân tạo……….17

1.4.4 Ứng dụng của HA dạng composit……….17

II CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP HYDROXYAPATITE HA……… 17

2.1 Phương pháp kết tủa……….17

2.2 Phương pháp sol-gel……….19

2.3 Phương pháp siêu âm hoá học……… 19

2.4 Phương pháp phun sấy……… 19

2.5 Phương pháp điện hoá……… 20

2.6 Phương pháp thuỷ nhiệt………21

2.7 Phương pháp composit ………21

2.8 Phương pháp phản ứng pha rắn tổng hợp HA……… 23

CHƯƠNG 2 TỔNG HỢP VẬT LIỆU Y SINH HA TỪ VỎ TRỨNG………… 24

I THỰC NGHIỆM TỔNG HỢP HA TỪ VỎ TRỨNG……… 24

1.1 Nguyên liệu và hóa chất……… 24

1.2 Dụng cụ và thiết bị .24

II THỰC NGHIỆM “ IN VITRO” 29

III PHƯƠNG PHÁP LÝ HÓA ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

I NHIỄU XẠ TIA X PHÂN TÍCH VẬT LIỆU HA TỔNG HỢP TỪ VỎ TRỨNG TRƯỚC VÀ SAU THỰC NGHIỆM ‘‘IN VITRO’’ 31

II ẢNH SEM PHÂN TÍCH VẬT LIỆU HA TỔNG HỢP TỪ VỎ TRỨNG TRƯỚC VÀ SAU THỰC NGHIỆM ‘‘IN VITRO’’ 33

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 38

DANH SÁCH HÌNH

NCKH TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU 1 Page 3

Hình 1.1 Một số hình ảnh ứng dụng của vật liệu Hydroxyapatite (HA)……… 13

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của phân tử HA……… 14

Hình 1.3 Thuốc bổ sung calcium sử dụng nguyên liệu HA dạng vi tinh thể… 16

Hình 1.4 Sơ đồ nguyên lý của phương pháp kết tủa……… 18

Hình 1.5 Sơ đồ nguyên lý của phương pháp phun sấy……… …… …… .19

Hình 1.6 Sơ đồ nguyên lý của phương pháp điện hóa……… 20

Hình 1.7 Sơ đồ nguyên lý của hệ thiết bị phản ứng thủy nhiệt……… 21

Hình 1.8 Sơ đồ tổng hợp composit HA - CS………22

Hình 2.1 Nung vỏ trứng……… 25

Hình2.2 Dung dịch sau khi cô cạn……… 26

Hình 2.3 Lọc bỏ tạp chất trong dd Ca(NO3)2 26

Hình 2.4 Dung dịch đang khuấy trên máy từ………27

Hình 2.5 Rửa sản phẩm bằng nước cất…… 27

Hình 2.6 Bột HA thu được sau khi nung ở 1000oC……… 28

Hình 2.7 Sơ đồ tổng hợp HA………28

Hình 3.1 Giản đồ nhiễu xạ tia X của HA tổng hợp từ vỏ trứng………31

Hình 3.2 Giản đồ nhiễu xạ tia X của HA tổng hợp sau 5 ngày ngâm trong SBF 32

Hình 3.3 Ảnh SEM của HA tổng hợp từ vỏ trứng……… 34 Hình 3.4 Ảnh SEM của HA tổng hợp sau 5 ngày ngâm trong dung dịch SBF….36

Bảng 2.1 Quy trình nung vỏ trứng theo các chế độ nhiệt……….24Bảng 2.2 Nồng độ các ion trong dung dịch SBF (10-3 mol/l)……… 29Bảng 2.3 Hàm lượng các chất trong dung dịch thành phần Ca-SBF và P-SBF….30

NCKH TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU 1 Page 5

1.1.2 Phân loại:

Dựa vào tương tác giữa vật liệu và môi trường cơ thể, người ta chia vật liệu ysinh ra 2 loại chính là vật liệu hoạt tính sinh học và vật liệu trơ sinh học [2] Vậtliệu hoạt tính sinh học là loại vật liệu khi cấy ghép trong cơ thể con người sẽ xảy racác tương tác hóa học giữa vật liệu với môi trường sống Vật liệu trơ sinh học làvật liệu khi đưa vào cơ thể con người chúng không có bất cứ một tương tác hóahọc nào với môi trường sống

1.1.3 Vật liệu y sinh xương nhân tạo Hydroxyapatite Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 (HA)

Có rất nhiều loại vật liệu y sinh khác nhau, riêng nhóm vật liệu y sinh sử dụngnhư vật liệu xương nhân tạo có thể kể đến như: các vật liệu calcium phosphate(tricalcium phosphate Ca3(PO4)3; hydroxyapatite Ca10(PO4)6(OH)2 hay biphasiccalcium phosphate), các vật liệu thủy tinh hoạt tính sinh học (CaO - SiO2 - Na2O -

P2O5 ), các xi măng y sinh, các kim loại trơ như Ti, Ni…Trong đó Hydroxyapatite(HA) là một trong những vật liệu đa năng được sử dụng với mục đích cấy ghépxương do nó giống với thành phần khoáng vô cơ trong xương của cơ thể conngười

Hiện nay HA đã và đang được nghiên cứu và phát triển vì những tính chất quantrọng của nó như có hoạt tính sinh học và độ tương thích sinh học cao với các tếbào và các mô, tạo liên kết trực tiếp với xương non dẫn đến sự tái sinh xươngnhanh mà không bị cơ thể đào thải Sự ra đời của vật liệu y sinh HA và hiệu quảcủa nó trong y học nói chung và ngành phẫu thuật chỉnh hình nói riêng, được ghinhận như là một thành tựu lớn trong lĩnh vực khoa học vật liệu.

NCKH TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU 1 Page 7

Hình 1.1 Một số hình ảnh ứng dụng của vật liệu Hydroxyapatite (HA)

1.2 Tính chất lý hóa của vật liệu y sinh HA [3-7]

Về tính chất vật lý, HA có công thức phân tử đầy đủ là Ca10(PO4)6(OH)2 hoặc có thể viết rút gọn dưới dạng Ca5(PO4)3OH, khối lượng mol phân tử là 1004,60 (g/pt), khối lượng riêng 3,156 (g/cm3) HA nóng chảy tại nhiệt độ 1760 (oC) và sôi ở 2850(oC) Độ cứng theo thang Mohs bằng 5

Công thức cấu tạo của phân tử HA được thể hiện ở hình dưới đây, có thể nhậnthấy phân tử HA có cấu trúc mạch thẳng, các liên kết Ca - O là liên kết cộng hoátrị Hai nhóm OH- được gắn với hai nguyên tử P ở hai đầu mạch:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của phân tử HA

Về mặt hoá học, HA có một số tính chất như: Có khả năng kết hợp với cấu trúcxương và tác động tốt đến sự phát triển bên trong của xương mà không làm đứt gãyhay phân hủy xương HA không phản ứng với kiềm nhưng phản ứng với axit tạothành các muối của calcium và nước:

HA không bền nhiệt, dễ bị phân hủy trong khoảng nhiệt độ 800 ÷ 1200°C Tuỳtheo tỷ lệ cấu tạo của HA, tạo thành oxyapatit theo phản ứng:

Ngoài ra HA có thể bị phân hủy thành các chất khác trong nhóm calciumphosphate tùy theo từng điều kiện Ví dụ: HA có thể tạo thành β-TCP hay tetracalcium phosphate theo các phương trình phản ứng dưới đây:

NCKH TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU 1 Page 9

1.3 Sự tương hợp sinh học và hoạt tính sinh học của vật liệu HA

Vật liệu HA có tính tương thích sinh học cao với cơ thể con người vì tỷ lệ Ca/Ptrong phân tử HA đúng như tỷ lệ của Ca/P trong xương và răng của người Ở dạngbột mịn kích thước nano, HA là dạng calcium phosphate dễ được cơ thể hấp thụnhất Ở dạng màng và dạng xốp, HA có thành phần hoá học và các đặc tính giốngxương tự nhiên, các lỗ xốp liên thông với nhau làm cho các mô sợi, mạch máu dễdàng xâm nhập [5]

Hoạt tính sinh học của HA thể hiện ở chỗ sau khi cấy ghép, chúng sẽ tan ra dotương tác với môi trường cơ thể, sau đó các ion Ca2+, PO43- và OH- trong môitrường sẽ kết tủa trên bề mặt vật liệu để hình thành một lớp khoáng HA mới làmcầu nối cho sự gắn kết miếng ghép xương và xương tự nhiên [8-9]

1.4 Ứng dụng vật liệu y sinh HA

Vật liệu HA có nhiều ứng dụng trong y học, phẫu thuật chỉnh hình, làm răng giả,cấy ghép xương, làm chất dẫn thuốc…

1.4.1 Ứng dụng của HA dạng bột kích thước nano

Do lượng calcium hấp thụ thực tế từ thức ăn mỗi ngày tương đối thấp nên rấtcần bổ sung calcium cho cơ thể, đặc biệt cho trẻ em và người cao tuổi Calcium cótrong thức ăn hoặc thuốc thường nằm ở dạng hợp chất hoà tan nên khả năng hấpthụ của cơ thể không cao và thường phải dùng kết hợp với vitamin D nhằm tăngcường việc hấp thụ và chuyển hoá calcium thành HA Có thể bổ sung calcium cho

cơ thể người bằng cách dùng thức ăn, thuốc tiêm hoặc truyền huyết thanh… Mộtphương pháp hữu hiệu là sử dụng HA ở dạng bột mịn, kích thước nano để bổ sung

calcium Với kích thước cỡ 20 - 100nm, HA được hấp thụ trực tiếp vào cơ thể màkhông cần phải chuyển hoá thêm [10].

Hình 1.3 Thuốc bổ sung calcium sử dụng nguyên liệu HA dạng vi tinh thể

1.4.3 Ứng dụng của HA dạng bột như vật liệu xương nhân tạo

NCKH TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU 1 Page 11

Như đã trình bày ở trên, vật liệu ceramic HA có tính tương thích và hoạt tínhsinh học cao Nhờ có khả năng đặc biệt này HA được ứng dụng đặc biệt rộng rãitrong y sinh học cấy ghép xương như: chế tạo răng giả và sửa chữa những khuyếttật của răng như tram răng, chế tạo những chi tiết để ghép xương và sửa chữanhững khuyết tật của xương [13].

1.4.4 Ứng dụng của HA dạng composit

Bản chất của gốm xốp và màng HA là có độ bền cơ học thấp Một giải pháp đểtăng độ bền cơ học là tạo ra một tổ hợp ceramic composit bằng cách phân tán HAbột vào các polyme phân hủy sinh học như collagen, chitosan, xenlulo, đườngsacaro… Vật liệu ở dạng này được sử dụng làm các chi tiết cấy ghép xương chấtlượng cao, làm kẹp nối xương hoặc có thể làm chất truyền dẫn thuốc Việc sử dụngcác polyme sinh học làm chất nền tạo điều kiện cho việc gia công, chế tạo các chitiết dễ dàng hơn Mặt khác, các polyme này còn có khả năng liên kết với các tế bàosinh học thông qua các nhóm chức OH, NH2, CH3COOH…của mình Đây cũng là

ưu điểm vượt trội của vật liệu composit chứa HA [14]

1.2 Các phương pháp tổng hợp Hydroxyapatite HA

1.2.1 Phương pháp kết tủa

Đây là phương pháp chế tạo HA ở dạng bột hoặc dạng màng từ dung dịch chứacác tiền chất ban đầu khác nhau như: Ca(NO3)2, (NH4)2HPO4, (NH4)3PO4, NH4OH,Error: Reference source not found, Error: Reference source not found… Ưu điểmcủa phương pháp kết tủa là có thể điều chỉnh được kích thước của hạt HA theomong muốn [15-16]

Nguyên lý của quá trình tổng hợp HA này là sự kết tủa các ion Error: Referencesource not found và Error: Reference source not found trong các muối dễ tan trongnước theo một trong các phản ứng hóa học sau:

Sơ đồ nguyên lý của phương pháp kết tủa được thể hiện qua hình 1.4.

foundvới các hợp chất tạo gel như Error: Reference source not found, Error:Reference source not found, được chuẩn bị theo tỷ lệ nhất định vào nước cất.Khuấy và gia nhiệt dung dịch này đến nhiệt độ 60 – 700C trong khoảng 3 – 4 giờ,gel có chứa hợp chất HA sẽ được tạo thành Sau đó, sấy gel ở nhiệt độ khoảng

1200C trong vòng 24 giờ và nung ở nhiệt độ 750 – 9000C khoảng 1 giờ HA bộtnhận được có kích thước trung bình khoảng 20nm, độ tinh thể khoảng 97% [17-18]

1.2.3 Phương pháp siêu âm hoá học

Để chế tạo HA bột có kích thước siêu mịn, có thể tiến hành phản ứng hoá họctrong môi trường sóng có cường độ lớn như vi sóng hay sóng siêu âm Phươngpháp kết tủa tổng hợp HA có sự trợ giúp của sóng siêu âm có thể tổng hợp đượcvật liệu HA có kích thước nanomet [19]

1.2.4 Phương pháp phun sấy

Hình

1.5

Sơ

đồ

nguyên lý của phương pháp phun sấy

Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng dung dịch chứa các ion Error:Reference source not found và Error: Reference source not found (tỷ lệ Ca/P =

1,67) phun vào thiết bị cùng với khí nén Tốc độ phun dung dịch được điều chỉnhbằng áp suất khí nén và dòng khí khô sao cho phản ứng tạo HA xảy ra hoàn toàn,bột HA được sấy khô khi rơi đến đáy của cột thuỷ tinh gia nhiệt Sản phẩm HAdạng bột được lấy ra định kỳ qua bộ phận lắng tĩnh điện Đây là phương pháp hiệnđại chế tạo bột HA năng suất cao, phù hợp với quy mô sản xuất vừa và lớn [20].

1.2.5 Phương pháp điện hoá

1.2.6 Phương pháp thuỷ nhiệt

Vật liệu HA được tổng hợp theo phương pháp thuỷ nhiệt thông qua sản phẩmtrung gian CaO từ Error: Reference source not found Phản ứng thuỷ nhiệt tiếptheo trong hệ thiết bị ở nhiệt độ khoảng 2000C, áp suất 10 - 15atm, thời gian 24 -

48 giờ [16, 19]

NCKH TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU 1 Page 15

Error: Reference source not found

Sản phẩm phụ Error: Reference source not foundtrong phản ứng trên cũng bịthuỷ nhiệt tạo HA theo các phản ứng xảy ra sau:

dễ dàng hơn Mặt khác các polyme này còn có khả năng liên kết với các tế bào sinhhọc thông qua các nhóm chức của mình Đây cũng là ưu điểm vượt trội của vật liệu

composit chứa HA [14] Hình 1.8 mô tả tóm tắt quá trình tổng hợp HA bằngphương pháp composit với polymer chitosan (CS).

NCKH TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU 1 Page 17

NCKH TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU 1 Page 19

Dung dịch CS (CS + axit acetic)

Không chế pH =11

Hình 1.8 Sơ đồ tổng hợp composit HA – CS

1.2.8 Phương pháp phản ứng pha rắn tổng hợp HA

Đây là phương pháp tổng hợp HA trên cơ sở thực hiện phản ứng pha rắn ở nhiệt

độ cao theo các phản ứng hóa học sau [4,6,15-16]

Error: Reference source not found

Phương pháp phản ứng pha rắn thường dùng để chế tạo HA dạng khối xốp Hỗnhợp nguyên liệu rắn ban đầu được ép nén để tạo ra các chi tiết có hình dạng và độxốp mong muốn Sau phản ứng, sản phẩm vẫn giữ nguyên được hình dạng và cấutrúc xốp ban đầu Chính nhờ những ưu điểm này mà phương pháp phản ứng pharắn này thích hợp cho việc chế tạo các chi tiết ghép xương phức tạp

Các phương pháp nêu trên là những cơ sở khoa học trong việc tổng hợp vật liệu

y sinh HA Trên cơ sở các phương pháp trên, chúng tôi xây dựng một quy trìnhriêng để tổng hợp vật liệu nay từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền là vỏ trứng Chương 2

sẽ trình bày chi tiết quy trình này

CHƯƠNG 2 TỔNG HỢP VẬT LIỆU Y SINH HA TỪ VỎ TRỨNG

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị

- Erlen 250ml, Betker 500ml, Pipet, Chén sứ , Đũa thủy tinh, Buret, Bóp cao su, Giấy lọc, Ống đong 500ml, Tủ hút, Máy khuấy từ, Máy đo pH, Lò nung, Máy sấy, Cân phân tích

2.1.3 Quy trình thực nghiệm

Vỏ trứng sau khi thu gom, tách màng, rửa sạch bằng nước cất và đun sôi trong khoảng thời gian 20 phút Sau đó vỏ trứng được đập nhỏ và bỏ vào lò nung theo 3 giai đoạn nhiệt:

Bảng 2.1 Quy trình nung vỏ trứng theo các chế độ nhiệt

Hình 2.1 Nung vỏ trứng

Trong giai đoạn đầu vỏ

trứng được nung tới 450oC và

NCKH TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU 1 Page 21

giữ nguyên trong khoảng thời gian là 1 giờ nhằm loại bỏ các thành phần hữu cơcủa vỏ trứng Giai đoạn 2 nhiệt độ được nâng lên 600oC và vỏ trứng được nungtrong 1 giờ nhằm loại bỏ hoàn toàn thành phần hữu cơ và các tạp chất ra khỏi vỏtrứng Giai đoạn cuối, vỏ trứng được nung từ 600oC lên 900oC và giữ nguyên ở

900oC trong 30 phút nhằm phân hủy phần khoáng canxicacbonat thành canxioxit

và giải phóng khí cacbondioxit theo phản ứng sau:

CaCO3 CaO + CO2

Sau khi nung xong, vỏ trứng chỉ còn lại khoáng CaO được hòa tan trong dungdịch axit nitric đậm đặc HNO3 68% Phản ứng tỏa nhiệt và được thực hiện trong tủhút Cô cạn dung dịch bằng cách đun trên ngọn lửa đèn cồn

CaO + HNO3 Ca(NO3)2 + H2O

Ca(NO3)2 thu từ quá trình lọc

bên trên được cho từ từ vào

điamonihidrophotphat (NH4)2HPO4 để tổng hợp vật liệu HA Hỗn hợp phản ứng

NCKH TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU 1 Page 23

được khuấy bằng máy khuấy từ trong khoảng 5h Duy trì pH = 10 trong suốt quátrình phản ứng bằng cách thêm dung dịch NH3 Sản phẩm thu được có dạng dungdịch màu trắng sữa Dưới đây là phản ứng tổng hợp HA:

10Ca(NO3)2 + 6(NH4)2HPO4 + 8NH4OH →Ca10(PO4)6(OH)2 + 20NH4NO3 + 6H2O

Hình 2.4 Dung dịch đang

khuấy trên máy từ

Rửa sản phẩm nhiều lần

bằng nước cất để loại bỏ NH3

dư thừa, để lắng dung dịch

sau đó loại bỏ bớt nước

Hình 2.5 Rửa sản phẩm bằng

nước cất

Sản phẩm sau khi rửa sạch

bằng nước cất được cho vào

tủ sấy ở 120oC trong 8h để

bay hơi hoàn toàn nước Bột

sản phẩm thu được tiếp tục nung trong thời gian 5h ở 1000oC nhằm kết tinh hoàntoàn vật liệu HA