Phát hiện thiếu glucose 6 phosphat dehydrogenase và phân tích dạng đột biến gen của nó ở một số dân tộc ng ời việt nam

Từ thực tế này, việc tìm một phương pháp đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng phát hiện thiếu G6PD trong mọi hoàn cảnh, điều kiện để từ đó phân tích dạng đột biến gen, nâng cao hiểu biết bệnh ở mứ

Báo cáo tổng kết đề tài Nghiên cứu khoa học

Trường Đại học Y Hà Nội

************

Báo cáo tổng kết đề tài Nghiên cứu khoa học

Cấp quản lý đề tài: Bộ Y tế

Tên đề tài:

Phát hiện thiếu glucose-6-phosphat dehydrogenase

và phân tích dạng đột biến gen của nó ở một số

dân tộc người việt nam

Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Y Hà Nội

Tên đề tài:

Phát hiện thiếu glucose-6-phosphat dehydrogenase

và phân tích dạng đột biến gen của nó ở một số

dân tộc việt nam

Những người thực hiện:

1 PGS.TS Trần Thị Chính Trường Đại học Y Hà Nội

2 GS Vũ Triệu An Trường Đại học Y Hà Nội

3 PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Dao Viện Công nghệ Sinh học

4 PGS.TS Đoàn Hạnh Nhân Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng TW

5 TS Tạ Thị Tĩnh Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng TW

6 TS Hoàng Hạnh Phúc Viện Nhi Trung ương

7 ThS Huỳnh Thị Diễm Thuý Bệnh viện Đa khoa Đà Nẵng

8 ThS Đỗ Thị Tuyên Viện Công nghệ Sinh học

9 ThS Nguyễn Minh Hùng Viện Sốt rét - Côn trùng - Ký sinh trùng

10 ThS Lý Bích Thuỷ Viện Công nghệ Sinh học

11 BSCKII Nguyễn Văn Hoà Bệnh viện Việt Nam - Cu Ba, Quảng Bình

12 BS Lê Ngọc Anh Trường Đại học Y Hà Nội

13 ThS Nguyễn Trường Giang Viện Công nghệ Sinh học

14 GS Kaoru Nishiyama Đại học Tổng hợp Kobe - Nhật Bản

Thời gian thực hiện: 10/2002 - 09/2005

Tổng số kinh phí thực hiện: 200.000.000 đồng

Phần A: Tóm tắt các kết quả chính của đề tài 1

1 Kết quả chủ yếu đạt được của đề tài 1

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu và tình hình thiếu G6PD 13

1.2.2 Biểu hiện lâm sàng, xét nghiệm, chẩn đoán và điều trị 15

1.2.3 Cơ sở gen học của thiếu G6PD, mối liên quan của nó

với đặc tính hoá sinh và các thể lâm sàng

1.3.4 Kỹ thuật phân tích gen - Kỹ thuật PCR-MPTP 26

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 29

3.1 Một số yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật Formazan 41

3.1.1 Xác định các điều kiện của phản ứng Formazan 41

3.2 Tỷ lệ thiếu G6PD ở các dân tộc 48

3.3 Kết quả phân tích gen thiếu G6PD 51

3.3.1 Kết quả tách chiết ADN từ bạch cầu máu ngoại vi 51

3.3.2 Kết quả kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR-MPTP 52

3.3.4 Các dạng đột biến gen G6PD ở 6 dân tộc 55

4.2 Về kỹ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng phát

hiện thiếu hụt G6PD

60

4.2.1 Các điều kiện của phản ứng Formazan 60

4.2.4 Độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật Formazan 62

4.5.3 Về các dạng đột biến gen G6PD của người Việt Nam ở

các dân tộc trong nghiên cứu

G6PD Gluco 6 Phosphat Dehydrogenase

PCR Polymerase Chain Reaction

PCR-SSP PCR - sequence specific primer

PCR-SSO PCR - sequence specific oligonucleotide

RCLB Red Cell Lysis Buffer

UGT1A1 UDP - glucuronyl transferase

WCLB White Cell Lysis Buffer

WHO World Health Organization

Chúng tôi xin bày tỏ lòng cám ơn chân thành tới các nhà khoa học:

- GS.TS Nguyễn Thu Nhạn - Nguyên Viện trưởng Viện Nhi trung ương

- GS.TS Nguyễn Công Khanh - Nguyên Viện trưởng Viện Nhi trung ương

- BS Nguyễn Thị Ngọc Phượng - Giám đốc Bệnh viện Từ Dũ - TP.HCM

- GS.TS Văn Đình Hoa - Trưởng Bộ môn MD-SLB -Trường ĐHYHN

- PGS.TS Nguyễn Văn Tường - Nguyên Phó Vụ trưởng Vụ KHĐT - BYT

- ThS Nguyễn Thị Quỳnh Mai - Phòng Quản lý NCKH - Trường ĐHYHN

đã giúp đỡ chân tình nhóm nghiên cứu trong tổ chức và tạo điều kiện cho việc lấy máu của một số dân tộc Sự giúp đỡ quí báu này đã hỗ trợ cho chúng tôi hoàn thành tốt nội dung nghiên cứu của Đề tài

Thay mặt nhóm nghiên cứu Chủ nhiệm Đề tài

PGS.TS Trần Thị Chính

Phần A:

Tóm tắt các kết quả chính của đề tài

1 Kết quả chủ yếu đạt được của đề tài:

Thiếu Glucose 6 Phosphate Dehydrogenase (G6PD) là bệnh lý enzym hồng cầu hay gặp nhất ở người, số người thiếu G6PD trên toàn thế giới có khoảng trên 400 triệu [41,78] Bệnh thường gây ra tình trạng thiếu máu tan huyết sau sử dụng một vài loại thuốc, thức ăn hay nhiễm khuẩn [52] Thiếu G6PD là bệnh di truyền qua nhiễm sắc thể (NST) giới tính Locus gen quy

định cấu trúc của G6PD nằm trên nhánh dài vùng 2 băng 8 của NST X (Xq.28) [66b,77] Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử thì cơ sở gen học của thiếu G6PD, các dạng đột biến gen của nó ngày càng được sáng tỏ Mỗi dạng đột biến gây ra những bệnh cảnh và mức độ nặng nhẹ khác nhau trước sự tấn công của thuốc và các chất oxy hoá [52,71] Theo y văn thế giới tỷ lệ thiếu G6PD cũng như các dạng đột biến gen của nó có sự khác nhau giữa các dân tộc và vùng địa lý Châu á, trong đó có Việt Nam, được xếp vào khu vực có tỷ lệ thiếu G6PD cao (0,5 - 30%) [20,65,82] ở nước ta,

từ những năm 70 đến nay đã có những nghiên cứu về thiếu G6PD của một

số dân tộc và địa phương, đặc biệt ở những vùng có sốt rét lưu hành [14,20, 22,23,24,25] Tuy nhiên các công bố chỉ dừng lại ở mức độ tỷ lệ thiếu Từ thực tế này, việc tìm một phương pháp đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng phát hiện thiếu G6PD trong mọi hoàn cảnh, điều kiện để từ đó phân tích dạng đột biến gen, nâng cao hiểu biết bệnh ở mức độ gen phân tử, khuyến cáo những tai biến có thể xảy ra cho những người mang gen bệnh là hết sức cần thiết

Do vậy, mục tiêu của đề tài là:

1 Xác định những điều kiện thích hợp ứng dụng kỹ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng phát hiện thiếu G6PD

2 Xác định tỷ lệ thiếu G6PD ở một số dân tộc người Việt Nam: Người Kinh - Hà Nội, Mường - Hoà Bình, Katu - Huế, Raglai - Khánh Hoà, Tày - Cao Bằng và Khánh Hoà, Rục - Quảng Bình

3 ứng dụng kỹ thuật PCR-MPTP tìm dạng đột biến gen G6PD ở một số trường hợp thuộc các dân tộc này

1.1 Đóng góp mới của đề tài:

- Trên cơ sở kỹ thuật Formazan bán định lượng phát hiện thiếu G6PD trong phòng thí nghiệm của tác giả Hisaichi Fujii và cộng sự, chúng tôi đã chuẩn lại một số điều kiện để có thể triển khai kỹ thuật này trong phòng thí nghiệm và ngoài phòng thí nghiệm - ở cộng đồng

- Sử dụng kỹ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng đã xác định được tỷ

lệ thiếu G6PD của 6079 người thuộc 6 dân tộc Kinh, Mường, Katu, Raglai, Tày, Rục của Việt Nam

- Đã phát hiện được 8 dạng đột biến gây thiếu G6PD ở 6 dân tộc người Việt Nam trong nhóm nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR-MPTP

- Đã góp phần nâng cao hiểu biết ở mức độ gen, phân tử của bệnh di truyền gây thiếu G6PD, một bệnh lý enzym hồng cầu hay gặp nhất

- Bổ sung vào bản đồ thế giới về các dạng đột biến gây thiếu G6PD của người Việt Nam

1.2 Kết quả cụ thể:

- Kỹ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng phát hiện thiếu G6PD có độ nhạy, độ đặc hiệu tương ứng là 100% và 81,08% so với kỹ thuật định lượng

ở các điều kiện xét nghiệm ngay hoặc bảo quản mẫu dưới 7 ngày (nhiệt độ

40C), nhiệt độ phản ứng 250C đến 370C, thời gian đọc kết quả sau 24 giờ

- Sử dụng kỹ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng đã phát hiện được tỷ

lệ thiếu G6PD chung của nhóm nghiên cứu là 4,80% (292/6079 người), trong đó của người Kinh - Hà Nội 1,59%; Mường - Hoà Bình 16%; Katu - Huế 10,96%; Raglai - Khánh Hoà 2,42%; Tày - Cao Bằng, Khánh Hoà 14,15% và người Rục - Quảng Bình 18,92%

- Tỷ lệ thiếu G6PD của nam ở hầu hết các dân tộc đều cao hơn ở nữ (p

<0,01) trừ dân tộc Katu - Huế và Rục - Quảng Bình (p>0,05)

- Sử dụng kỹ thuật PCR-MPTP đã phát hiện được 8 dạng đột biến gen từ

107 trong tổng số 292 trường hợp thiếu G6PD của 6 dân tộc nghiên cứu Đó

là, G6PD Gaoha ở exon 2, nucleotid 95AặG làm acid amin 32 HisặArg; G6PD Viangchan, Chatham và Chinese-5 ở exon 9 nucleotid 871 GặA, acid amin 291 ValặMet, nucleotid 1003 GặA, acid amin 335 AlaặThr

và nucleotid 1024 CặT, acid amin 342 LeuặPhe; G6PD Union ở exon 11 nucleotid 1360 CặT, acid amin 454ArgặCys; G6PD Canton và Kaiping ở

exon 12 nucleotid 1376 GặC, 459 ArgặLeu, nucleotid 1388 GặA, acid amin 463 ArgặHis; cuối cùng là G6PD Silent ở exon 11 nucleotid 1311 CặT nhưng không làm thay đổi acid amin Tyrosin

- Các dạng đột biến gây thiếu G6PD ở người Kinh là 7 trong số 8 dạng đã tìm thấy trừ G6PD Chinese-5; Người Mường gặp chủ yếu G6PD Union (8/18 trường hợp) không gặp G6PD Gaoha, Chatham và Kaiping; Người Katu hầu hết là G6PD Viangchan/Silent (20/21 trường hợp) còn 1 trường hợp là G6PD Union; người Raglai gặp 2 dạng G6PD Viangchan (14/18) và G6PD Canton (4/18); người Tày gặp G6PD Viangchan, Canton và Kaiping; người Rục có 1 trường hợp là G6PD Viangchan

1.3 Hiệu quả về đào tạo:

- Đã đào tạo thành công 2 Thạc sỹ Y học (đạt Xuất sắc)

- Đã hoàn thành 1 luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Y khoa (đạt Xuất sắc)

1.4 Hiệu quả kinh tế:

- Kỹ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng phát hiện thiếu G6PD có thể triển khai ngoài phòng thí nghiệm một ngày được 160 đến 200 mẫu, ngày hôm sau vào giờ đó đọc kết quả, giá thành 8000 đ/mẫu thay vì kỹ thuật định lượng 50.000 đ/mẫu

- Phát hiện thiếu G6PD sẽ thông báo cho người bệnh hoặc người nhà (nếu là trẻ nhỏ) qua đó đến thầy thuốc để phòng tránh nguy cơ tan máu sau sử dụng thuốc, thức ăn hay nhiễm khuẩn; thông báo danh mục những loại thuốc cần tránh Hỗ trợ công tác chăm sóc sức khoẻ ban đầu, giảm bớt thiệt hại về sức khoẻ, kinh tế cho người bệnh và cho xã hội

- Phân tích dạng đột biến gen sẽ thông báo cho người mang gen bệnh về mức độ nặng nhẹ của bệnh qua đó lưu ý mức độ nguy cơ tai biến khi tiếp xúc với các tác nhân oxy hoá

1.5 Hiệu quả về x∙ hội:

Từ thực tế điều tra và kết quả nghiên cứu thu được đã cho thấy những dân tộc ít người, sống biệt lập, có những tập quán riêng, ít giao lưu thường

có tỷ lệ thiếu G6PD cao như 2 dân tộc Rục - Quảng Bình hay Katu - Nam

Đông, Huế Rất tiếc chúng tôi không có điều kiện khai thác quan hệ gia

đình của những người thiếu G6PD ở những dân tộc này, nhưng với dân tộc

Raglai - Khánh Hoà hay Mường - Hoà Bình chúng tôi đã phát hiện có những gia đình cả bố, mẹ, các con đều thiếu G6PD thậm chí cùng bị một dạng đột biến Do vậy, nếu đưa phát hiện thiếu G6PD vào chương trình sàng lọc sơ sinh thì ngoài hiệu quả kinh tế, người bệnh không phải vào bệnh viện vì tai biến tan máu mà chúng ta còn có thể đưa ra những lời khuyên di truyền trước hôn nhân, hay những lưu ý cho các bà mẹ thiếu G6PD dạng

đột biến nặng đã sinh con, đặc biệt sinh con trai có tình trạng vàng da sơ sinh bệnh lý kéo dài, vàng da nhân não Từ đó có thể giảm bớt tỷ lệ thiếu, giảm bớt nỗi lo cho mỗi gia đình và rộng ra cho cả xã hội

1.6 Hiệu quả khác:

- Đề tài có 9 công bố được đăng ở: Tạp chí Nghiên cứu Y học, trường Đại học Y Hà Nội - 03 bài; Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật - 03 bài; Nhà xuất bản Nông nghiệp - 01 bài, Tạp chí Hoá sinh Y Dược học - 02 bài Đã tham gia nhiều Hội nghị khoa học: Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ 2

về Nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông nghiệp và Y học; Hội nghị Miễn dịch toàn quốc hàng năm; Hội thảo về Hoà hợp mô Việt - Pháp, Hội nghị Khoa học Hoá sinh Y dược học toàn quốc

- Những kết quả về dạng đột biến gen gây thiếu G6PD sẽ góp phần cung cấp thêm thông tin cho những nghiên cứu về dân tộc, nhân chủng học của người Việt Nam

2 áp dụng thực tiễn:

- Đề xuất đưa phát hiện thiếu G6PD vào chương trình sàng lọc sơ sinh ở nước ta

- Sử dụng kỹ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng phát hiện thiếu G6PD

đơn giản dễ thực hiện, giá thành rẻ có thể thực hiện ở nhiều cơ sở y tế

- Thông báo danh mục thuốc cần tránh cho những người thiếu G6PD Hiện nay ở Hà Nội đã có một số trẻ thiếu G6PD có sổ y bạ kèm theo danh mục những thuốc cần tránh để lưu ý các bác sỹ khi cháu bị mắc bệnh đến Viện

điều trị

3 Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu đề cương N/C đã được phê duyệt

3.1 Tiến độ:

- Ngày 10/06/2002, Bộ trưởng Bộ Y tế phê duyệt (QĐ số 2209/QĐ-BYT)

- Ngày 22/10/2002 bắt đầu được phân bổ kinh phí nghiên cứu: 30.000.000đ

- Ngày 11/06/2004, được cấp kinh phí lần cuối

- Hoàn thành số liệu, tháng 05/2005

- Tháng 05 - 10/2005 sử lý số liệu và viết báo cáo nghiệm thu

3.2 Thực hiện mục tiêu nghiên cứu:

Thực hiện đầy đủ và vượt hơn so với nội dung nghiên cứu đề ra ban đầu Đó

là kết quả của sự hợp tác tốt giữa trường Đại học Y Hà Nội, Viện Sốt rét -

Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương và Viện Công nghệ sinh học thuộc Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia cùng với trường Đại học Tổng hợp Kobe - Nhật Bản

3.3 Sản phẩm tạo ra so với dự kiến đề cương

- Dự kiến sử dụng kỹ thuật Formazan bán định lượng trong phòng thí nghiệm phát hiện thiếu G6PD trên 3000 trẻ sơ sinh người Kinh - Hà Nội và

500 người Mường - Hoà Bình (tổng số 3500 người) Tiếp đó sử dụng kỹ thuật PCR-MPTP phân tích 50 trường hợp để phát hiện dạng đột biến gen gây thiếu G6PD

- Đã thực hiện phát hiện thiếu G6PD bằng kỹ thuật Formazan bán định lượng trong phòng thí nghiệm và ở cộng đồng trên 6079 người Trong đó người Kinh - Hà Nội 3835 người; Mường - Hoà Bình 626 người; Katu - Huế

356 người; Raglai - Khánh Hoà 828 người; Tày - Cao Bằng và Khánh Hoà

212 người và Rục - Quảng Bình 222 người Kết quả tìm được 292 người thiếu G6PD và phân tích gen được 107 trường hợp

4 Đánh giá việc sử dụng kinh phí:

- Tổng kinh phí được duyệt cấp: 200.000.000đ

+ Thu thập mẫu, thuê khoán chuyên môn: 55.000.000đ

- Kinh phí sự nghiệp khoa học cấp: 100%

- Toàn bộ kinh phí đã được thanh toán và quyết toán vào tháng 03/2005

5 Các ý kiến đề xuất:

- Nên cấp 1/2 tổng kinh phí từ đầu để các đề tài chủ động triển khai nghiên cứu sớm (hoá chất, dụng cụ cần thiết để có thể hoàn chỉnh kỹ thuật, triển khai sớm) tránh cấp muộn, cuối năm cấp và đòi hỏi phải quyết toán ngay

- Trong nghiên cứu nên có sự hợp tác giữa trường và các Viện có những thế mạnh liên quan với đề tài điều đó sẽ giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu

- Đề nghị cấp trên ủng hộ việc đề xuất đưa phát hiện thiếu G6PD vào trong chương trình sàng lọc trẻ sơ sinh ở Việt Nam

Phần B:

các kết quả nghiên cứu của đề tài

Đặt vấn đề

Glucose 6 Phosphat Dehydrogenase (G6PD) là một enzym nằm trên

bề mặt hồng cầu, enzym then chốt mở đầu cho chu trình Hexose monophosphat NADPH - một coenzym được tạo ra trong chu trình này có vai trò quan trọng giúp bảo vệ tính toàn vẹn của hồng cầu chống lại các tác nhân oxy hoá [52,71]

Locus gen mã hoá cho phân tử G6PD nằm trên nhiễm sắc thể X, những biến đổi gen G6PD sẽ dẫn đến những thay đổi về số lượng, cấu trúc, chức năng G6PD từ đó hoạt tính enzym sẽ bị ảnh hưởng mà chủ yếu là giảm sút

Thiếu G6PD là bệnh lý enzym hồng cầu hay gặp nhất, khoảng 400 triệu người mang gen bệnh này Đây là bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính X, mẹ truyền cho con trai [3,41,52,53,66b,77,78] Đã có nhiều công trình nghiên cứu về tỷ lệ thiếu hụt, cấu trúc, đặc tính, các dạng phân tử

… của G6PD, những biểu hiện lâm sàng, xét nghiệm, của người bị thiếu G6PD Từ những năm 1980, với sự phát triển của công nghệ sinh học phân

tử, cơ sở gen học của các dạng đột biến G6PD đã dần được sáng tỏ, kể từ đó

nó được công bố liên tục ở nhiều nước, nhiều châu lục [29,46,51,52,60,63, 65,78,80] Các nghiên cứu cho thấy mỗi dạng đột biến G6PD có thể gây ra những bệnh cảnh, mức độ tan máu nặng nhẹ khác nhau như: vàng da, đái huyết sắc tố, suy thận có thể dẫn tới tử vong trước sự tấn công của các tác nhân có tính oxy hoá như một số thuốc, thức ăn hay nhiễm khuẩn [32,44, 51,56,65,71,78]

Theo y văn thế giới, tỷ lệ thiếu và các dạng đột biến G6PD có sự khác nhau giữa các chủng tộc và vùng lãnh thổ [37,50,52,53,60,64,62, 65,79] Châu á, trong đó có Việt Nam được xếp vào khu vực có tỷ lệ thiếu G6PD cao [20,23,52,65,] ở nước ta, từ những năm 1970 đến nay có nhiều công bố về tỷ lệ thiếu G6PD ở một số dân tộc và một số vùng địa lý, chủ

yếu những vùng có sốt rét lưu hành Nhìn chung các nghiên cứu chỉ dừng lại ở mức độ tỷ lệ thiếu G6PD [14,19,20,22,23,24,25]

Để có những hiểu biết đầy đủ hơn, cao hơn về thiếu G6PD của người Việt Nam, đã đến lúc cần có những nghiên cứu sâu hơn, ở mức độ gen, phân tử Trong chiến lược nâng cao chất lượng sức khoẻ toàn dân, cùng với những biện pháp can thiệp sớm từ khi trẻ còn trong bụng mẹ, chẩn đoán trước sinh, những nghiên cứu về G6PD có thể giúp đưa ra những lời khuyên

di truyền trước hôn nhân, trước khi sinh con … Cho đến nay, chương trình sàng lọc thiếu G6PD và một số bệnh khác cho trẻ sơ sinh đã và đang được triển khai tại nhiều nước trên thế giới ở nước ta, nội dung này mới chỉ ở giai đoạn bắt đầu với chương trình suy giáp tại Hà Nội [19]

Trong tương lai, nhằm đưa việc phát hiện thiếu G6PD vào chương trình sàng lọc sơ sinh, việc tìm kiếm một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có thể triển khai ở mọi điều kiện, cơ sở là rất cần thiết Cùng với nó việc xác định được các dạng đột biến gen G6PD ở các dân tộc, các vùng miền của Việt Nam sẽ rất có ý nghĩa trong nghiên cứu y học cơ sở và y học lâm sàng Với những ý tưởng này, chúng tôi tiến hành đề tài với các mục tiêu:

1 Xác định những điều kiện thích hợp ứng dụng kỹ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng phát hiện thiếu G6PD

2 Xác định tỷ lệ thiếu G6PD ở một số dân tộc người Việt Nam: Người Kinh - Hà Nội, Mường - Hoà Bình, Katu - Huế, Raglai - Khánh Hoà, Tày - Cao Bằng và Khánh Hoà, Rục - Quảng Bình

3 ứng dụng kỹ thuật PCR-MPTP tìm dạng đột biến gen G6PD ở một số trường hợp thuộc các dân tộc này

động vật đến thực vật [18,73] Năm 1936, G6PD lần đầu tiên được tách chiết và làm sạch từ hồng cầu người [40] ở Việt Nam từ những năm 1980 Nguyễn Hữu Chấn đã có những nghiên cứu về các thuộc tính của G6PD [3, 4,5,6,71] Từ đó đến nay, y học đã có nhiều hiểu biết về cấu trúc phân tử, hoạt tính sinh học, các biến thể của enzym và các dạng đột biến gen của nó [6,53,57]

1.1.1 Cấu trúc: G6PD là một enzym rất đa dạng, có cấu trúc bậc bốn

phức tạp [4]

Cấu trúc bậc một phân tử G6PD: là chuỗi polypeptid gồm 515 acid

amin liên kết với nhau bằng những liên kết peptid Khối lượng phân tử của

nó là 59265 Daltons [48,52,56,66] Trình tự acid amin đã được giải mã, tính

đồng nhất của trình tự này thay đổi tuỳ theo từng vùng Vùng có tính đồng nhất cao được cho là vùng có chức năng quan trọng (hay còn gọi là trung tâm hoạt động) của enzym, ở người vùng này nằm trong khoảng từ acid amin 188 đến 291 của chuỗi polypeptid [33]

Cấu trúc bậc cao hơn: G6PD có cấu trúc không gian là các dạng

dimer, tetramer Dạng cấu trúc không gian mới đảm bảo cho enzym hoạt

động được Sự trùng hợp của các monomer thành các dimer và các dạng cao hơn có hoạt tính xúc tác cần sự có mặt của NADP Như vậy, NADP

được gắn với enzym vừa như là một phức hợp cấu trúc vừa như là một cơ chất của phản ứng [30] NADP chính là chất cộng tác (coenzym) của enzym G6PD Mỗi dimer có hai vị trí gắn NADP Tại vị trí gắn NADP xúc tác, NADP gắn lỏng lẻo và dễ dàng bị khử thành NADPH Tại vị trí gắn NADP

chức năng, NADP gắn chặt chẽ hơn và cần thiết để duy trì cấu trúc oligo hoạt động của enzym Bốn acid amin liên quan đến vị trí gắn NADP cấu trúc là: Cys 385, Lys 386, Arg 387 hoặc Arg 393 Còn vị trí gắn NADP xúc tác được cho là Lys 47 [33] Ngoài ra, Persson và cs cho rằng còn có hai vị trí gắn NADP nữa ở các acid amin 242-248 và 38-44 NADP không chỉ là cơ chất cho enzym mà còn ổn định G6PD bằng việc ngăn cản sự chuyển enzym ở dạng dimer thành dạng monomer không hoạt động [33] G6PD là một enzym có tính không đồng nhất và đa dạng phân tử, bằng phương pháp phân tích hoá sinh người ta đã mô tả có 442 dạng phân tử khác nhau Tính không đồng nhất của G6PD thể hiện ở sự chuyển dạng cấu trúc tuỳ thuộc vào điều kiện của môi trường, như ở pH thấp thì chủ yếu là dạng tetramer,

pH kiềm nhẹ thì là dạng dimer, ở pH trung tính thì tỷ lệ hai dạng đó gần bằng nhau Trong hồng cầu người thì dạng dimer chiếm ưu thế hơn và là dạng hoạt động chủ yếu của enzym [33,66]

Hình 1.1: Cấu trúc bậc 4 của phân tử G6PD

1.1.2 Chức năng:

G6PD là một enzym oxy hoá khử, enzym then chốt, mở đầu và điều khiển tốc độ con đường Hexosemonophosphate (Pentose phosphate), có ký hiệu quốc tế là: 1.1.1.49 [3,17,33] Chức năng quan trọng của nó là tạo ra NADPH để chống lại các tác nhân oxy hoá và vì vậy G6PD có ý nghĩa lớn trong việc bảo vệ màng hồng cầu, góp phần đảm bảo thời gian sống bình thường của hồng cầu, đáp ứng nhu cầu oxy của cơ thể

Sự chuyển hoá glucose theo con đường Hexosemonophosphate xảy ra

ở các mô song song với con đường đường phân nhưng chiếm tỉ lệ thấp hơn nhiều (7% - 10%) Con đường này tuy không cung cấp nhiều năng lượng nhưng cung cấp nhiều NADPH, đồng thời cung cấp ribose 5-phosphat sử

dụng cho quá trình tổng hợp acid nucleic [17] ở hồng cầu và một số tế bào khác như: gan, tuyến mỡ, tuyến sữa thời kì hoạt động sự chuyển hóa glucose theo con đường Hexosemonophosphate lại chiếm ưu thế, đặc biệt trước một tác nhân oxi hoá bất ngờ thì sự giáng hoá glucose theo con đường này lại tăng lên gấp hai mươi đến ba mươi lần thậm chí cao hơn nữa [17,47]

Trong con đường này G6PD oxy hoá G-6-P thành gluconolacton, với coenzym là NADP, chất nhận hydro và trở thành NADPH [17,52] NADPH là một coenzym khử-chất cho hydro, cần cho phản ứng của nhiều con đường sinh tổng hợp khác nhau và liên quan mật thiết với một chuỗi phản ứng tiếp theo để bảo vệ hồng cầu như tái tạo thành glutathion dạng khử (GSH) từ glutathion dạng oxy hóa (GSSG), khử MetHb thành Hb Chính đây là nguồn gốc chủ yếu cung cấp NADPH cho hồng cầu [56] Chức năng chính của hồng cầu là vận chuyển oxy Hồng cầu là nơi xảy ra nhiều quá trình chuyển hóa Toàn bộ những chuyển hóa trong hồng cầu phần lớn đều nhằm đảm bảo chức năng vận chuyển oxy và bảo vệ các cấu tử hồng cầu chống lại quá trình oxy hóa của các tác nhân khác nhau Vì chứa nhiều oxy, nên cấu trúc của hồng cầu thường xuyên có nguy cơ bị oxy hóa và rất nhạy cảm với các quá trình oxy hóa, do đó chúng rất dễ bị hủy hoại Đặc biệt trong hồng cầu thiếu các con đường tổng hợp NADPH khác, nên khả năng sống sót của hồng cầu trước sự công kích của tác nhân oxy hoá từ môi trường phụ thuộc vào hiệu quả hoạt động của con đường hexose monophosphat

6-phospho-Hình 1.2: Vị trí và vai trò của G6PD trong hồng cầu

Km của G6PD với NADP rất thấp, khoảng 2-4 àmol/l và enzym bị ức chế cạnh tranh mạnh bởi NADPH Vì vậy, tỉ lệ NADPH/NADP trong hồng cầu tự điều hòa tốc độ của phản ứng enzym Trong thời kỳ trơ, tỉ lệ này rất cao, và G6PD gần như bị ức chế hoàn toàn NADPH hoạt động thông qua phản ứng chuyển GS-SG thành GSH với sự tham gia của enzym glutathion reductase GSH tạo thành sẽ ngăn cản quá trình peroxid các cấu tử của hồng cầu, trực tiếp bảo vệ hồng cầu trước sự tấn công của các tác nhân oxy hóa Ngoài ra để bảo vệ hồng cầu còn có các cơ chế khử khác, ví dụ như quá trình khử MetHb cùng đồng thời diễn ra nhờ hệ thống enzym methemoglobin reductase (MetHbR), mà cần coenzym là NADP và NADPH Khi NADPH bị oxi hoá, GS-SG bị khử thành GSH, NADPH được chuyển thành NADPvà G6PD trở nên hoạt động, khử NADPthành NADPH [17,52,83] Khi hồng cầu thiếu G6PD con đường hexose mono phosphat bị ngưng trệ, NADPH sẽ không được tạo thành, dẫn đến GSH không đủ và kết quả là việc bảo vệ hồng cầu không hiệu quả Đặc biệt, khi hồng cầu bị tấn công bởi các tác nhân oxy hóa Quá trình oxy hóa vốn xảy ra rất mạnh trong hồng cầu lúc này sẽ có nguy cơ làm tăng quá trình peroxy hoá các cấu

tử của nó GSH sẽ càng không đủ cho nhu cầu của quá trình chuyển hóa, sẽ làm thay đổi chức năng của màng hồng cầu và hemoglobin bị biến tính Hb

bị oxy hoá thành một hợp chất không bền HbH2O2 với hàm lượng khá cao

và rất độc cho hồng cầu Lúc này, lượng Glutathion dạng khử vốn đã giảm,

sẽ không còn đủ khả năng khử hợp chất này HbH2O2 sẽ bị chuyển thành MetHb và Choleglobin Thể Heinz xuất hiện do sự kết tủa của Hemoglobin,

nó gắn vào màng hồng cầu gây nên hình thái bất thường của hồng cầu Thêm vào đó vì nếu thiếu G6PD nên lượng NADPH không đủ cũng làm giảm khả năng chống quá trình peroxy hóa lớp lipid màng tế bào, hiện tượng này cũng đóng góp vào cơ chế gây tổn thương màng làm vỡ hồng cầu [18]

1.1.3 Những điều kiện ảnh hưởng đến hoạt động của G6PD:

Hoạt động của G6PD bị ảnh hưởng mạnh bởi nồng độ các chất nội bào như: cơ chất (substrate), đồng yếu tố (cofactor), các sản phẩm (products), những ion hydrogen, các cation kim loại [18,48,66]

- Nhiệt độ: enzym bắt đầu biến tính nhẹ từ 400C, đến 600C thì hoạt tính của enzym còn lại không đáng kể

- Độ pH: pH kiềm nhẹ sẽ làm cho nồng độ dạng dimer cao và enzym

sẽ hoạt động tốt nhất, bởi vậy có mặt một lượng nhỏ NaHCO3 sẽ giúp enzym phản ứng tốt hơn, pH tối ưu của G6PD là 8,0

- Nồng độ của cơ chất, cofactor, chất tạo thành cũng ảnh hưởng tới hoạt đọng của enzym Sự trùng hợp của enzym từ dạng monomer sang dạng dimer và các cấu trúc bậc cao hơn cần có sự có mặt của NADP, chất vừa là cơ chất vừa là cofactor

- Khi ở ngoài cơ thể, để đảm bảo cho enzym hoạt động tốt thì vấn đề bảo quản là hết sức quan trọng G6PD là một enzym không bền vững dễ bị mất hoạt tính, nhưng nếu hồng cầu được rửa và bảo quản nguyên vẹn trong dung dịch NaCl 0,9% ở nhiệt độ lạnh (40C) ngay thì sau 24 giờ, hoạt độ enzym chưa bị thay đổi Trái lại, nếu hồng cầu chỉ bảo quản dưới dạng máu toàn phần ở 40C (tiêu chuẩn trữ máu) thì 24giờ sau hoạt độ enzym sẽ giảm 17% hoạt tính [18]

- Ion Mg2+ là ion đặc hiệu cho hồng cầu người, với nồng độ 0,01 mol/l thì hoạt độ enzym là 100%, ion kim loại này đóng vai trò tạo phức hợp giữa enzym và cơ chất

1.2 Bệnh thiếu G6PD:

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu và tình hình thiếu G6PD:

Từ thời xa xưa người ta đã nhận thấy có một bệnh cảnh liên quan đến thiếu hụt G6PD hồng cầu Đầu tiên những nhà triết học Hy Lạp và nhà toán học Pythagoras đã cảnh báo với những học trò của mình về mối nguy hiểm khi ăn đậu fava Tiếp sau đó một nhóm các nhà y học ở miền nam Italia và

Sardinia đã phát họa hình ảnh lâm sàng của Favism (tan máu xảy ra ở một

số người sau khi ăn đậu fava) [66] Vào khoảng những năm 1950, Ernest

Beutler đã đưa ra nhận xét về sự tan máu xảy ra sau khi dùng một số thuốc,

mà điển hình là primaquine, một thuốc chống sốt rét [66,83] Sau đó, 1956 Carson và cộng sự đã khám phá ra rằng những người nhạy cảm với primaquine có hoạt độ của enzym G6PD hồng cầu rất thấp [18,66] Cho đến nay, đã có những hiểu biết đáng kể về enzym G6PD và các hình thái lâm sàng cũng như cơ sở sinh học phân tử liên quan đến thiếu hụt G6PD Mỗi biến thể dẫn đến mức độ thiếu enzym khác nhau và chúng liên quan đến mức độ nặng nhẹ của tan máu trên lâm sàng: thiếu máu tan máu mạn tính [16], thiếu máu tan máu cấp, thứ phát sau dùng thuốc, hay là hoàn toàn

không triệu chứng Những kỹ thuật sinh học phân tử gần đây đã khám phá

được cấu trúc gen của enzym bình thường và đột biến Phân tích trình tự nucleotid và acid amin của G6PD người bình thường và cADN (comple-mentary DNA) của nó đã được xác định Đến nay hơn 442 biến thể (variant) đã được xác định bằng kỹ thuật enzym học theo qui trình chuẩn (WHO), 140 đột biến (mutation) đã được xác định ở mức độ ADN [33,57]

Đến nay các nghiên cứu trên thế giới cho thấy có khoảng 400 triệu người thiếu G6PD, bệnh gặp ở tất cả các dân tộc [41,78] Tần xuất thiếu hụt G6PD khác nhau rất nhiều theo từng dân cư và vùng lãnh thổ Cao nhất

là ở Địa Trung Hải, Châu Phi và Nam á- khu vực nằm trong vùng dịch tễ sốt rét, ít gặp hơn ở vùng Bắc Âu Tỉ lệ thiếu G6PD ở Châu Phi là 20% (Trong đó Angola: 17-7%; Camerun: 20%; Gana: 24%; Kenya: 2-25%; Nigeria: 10-27%); ở Châu Mỹ, cao nhất là người da đen: 10-11%; Venezuela: 2-12%; ở người Do Thái tỉ lệ này lên đến 70%, một tỉ lệ được cho là cao nhất từ trước đến nay [52] ấn Độ: 4,57% [64]; Đảo Solomon (Châu úc): 8,4-14,4% [37] Miền Nam ý: 6-7%; Đảo Halmahera ở Indonesia: 3,7% [53,62,79]

Hình 1.3 Bản đồ phân bố G6PD trên thế giới

Đông Nam Châu á, tỉ lệ thiếu hụt G6PD dao dộng từ 0,5-30% ở Lào 7,2%; Thái Lan 7-33%; Indonesia 3,7%; Myanmar 4,4%; Philippin 8-12%; Đài Loan và Nam Trung Quốc 2-16% [50,62,65]

Theo bản đồ phân bố bệnh thiếu hụt G6PD của WHO, Việt Nam nằm trong vùng có tỉ lệ này dao động từ 0,5 - 30% [20,65,82] Những nghiên cứu về thiếu hụt G6PD đầu tiên ở Việt nam phải kể đến các tác giả như: Ngô Gia Thạch, Hoàng Văn Sơn, Nguyễn Hữu Chấn Tỉ lệ thiếu hụt G6PD tại Việt Nam cũng rất khác nhau tuỳ từng vùng và từng dân tộc [23,24] Theo nghiên cứu của tác giả Đoàn Hạnh Nhân và cs [20]: cao nhất là nhóm dân tộc Mường (31%), tiếp đến dân tộc Thổ (22,6%), các dân tộc Thái (19,3%), rất thấp ở dân tộc Kinh (0,5%) và dân tộc H’mông (0.3%) Tỉ lệ thiếu G6PD ở nhóm dân tộc Mường tại Kim Bôi, theo nghiên cứu của Hoàng Văn Sơn (1978) là 24% [23]; Theo nghiên cứu của Huỳnh Thị Diễm Thuý (2004), ở người Kinh Hà Nội và quanh Hà Nội là 1,63% [25]; ở các tỉnh phía nam theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Phượng tỉ lệ thiếu hụt G6PD là 5,5% [22]

1.2.2 Biểu hiện lâm sàng, xét nghiệm, chẩn đoán và điều trị thiếu G6PD:

Bình thường những người thiếu G6PD không có biểu hiện lâm sàng nhưng khi tiếp xúc với các chất oxy hóa mới xuất hiện các triệu chứng của cơn tan máu Tùy thuộc vào dạng thiếu hụt G6PD cũng như tính chất của các chất oxy hóa mà tan máu sẽ nhiều hay ít từ đó dẫn đến biểu hiện bệnh nặng hay nhẹ Khi các hồng cầu bị vỡ, Hb giải phóng ra huyết tương và mất chức năng vận chuyển oxy, cơ thể có thể rơi vào tình trạng thiếu oxy Ngoài

ra, tỷ lệ MetHb tăng cao, chuyển hoá các chất, đặc biệt là chuyển hoá glucid xảy ra theo chiều hướng yếm khí, cơ thể bị nhiễm toan do tăng sinh các sản phẩm acid của quá trình này Tuỳ thuộc vào loại đột biến mà hoạt

độ G6PD của người bệnh khác nhau, cùng với tính chất của từng tác nhân oxy hoá và các bệnh di truyền đồng thời như đột biến gây thiếu glucose-phosphate isomerase - GPI [81], đột biến gây thiếu UDP - glucuronyl transferase - UGT1A1 (Bệnh Gilbert [67]) mà mức độ của các triệu chứng lâm sàng khác nhau Biểu hiện lâm sàng của những người thiếu G6PD có nguồn gốc Châu á dường như khác với Người Mỹ gốc Châu Phi [50]

Lâm sàng liên quan đến thiếu G6PD có thể gặp là vàng da sơ sinh bệnh lý [2,27,28,52,53,58] Thiếu hụt G6PD là một nguyên nhân gây ra

hiện tượng này Vàng da sơ sinh được tìm thấy đầu tiên ở những đứa trẻ Phương Đông và Địa Trung Hải Đây là một hiện tượng sinh lý, liên quan tới đặc điểm về chuyển hoá bilirubin trong cơ thể trẻ trong những ngày đầu sau sinh, xảy ra khoảng 70% trẻ đủ tháng và 80% trẻ thiếu tháng [72] Nhưng thường do nhiều nguyên nhân khác nhau trẻ có thể bị vàng da quá mức, trở thành vàng da bệnh lý ở Mỹ hàng năm có khoảng 4-5% trẻ sơ sinh bị vàng da bệnh lí, ở Châu Âu khoảng 6%, Châu á thường cao hơn, khoảng 14% Tình trạng lâm sàng nặng nhất của vàng da bệnh lí sơ sinh là vàng da nhân não Thiếu G6PD ngày nay được biết đến như là một yếu tố nguy cơ của vàng da nhân não, nặng nề nhất với dấu hiệu tổn thương não [67] ở nước ta cho đến nay tỉ lệ vàng da có tổn thương não vẫn còn rất cao Vào những năm 1996-2000, tại Viện Nhi Trung Ương tỉ lệ này khoảng 25%, trong số đó có tới 13,7-33,9% là có dấu hiệu tổn thương não [2] Tại bệnh viện Nhi Đồng I, thành phố Hồ Chí Minh số trẻ vàng da có tổn thương não tăng từ 147 năm 1995 lên 238 trường hợp năm 1997 [27,28] Trên thế giới đã có những nghiên cứu về vàng da sơ sinh liên quan đến thiếu hụt G6PD Có nhiều ca vàng da sơ sinh được phát hiện thiếu G6PD được công

bố [67,70,74,76] ở Đài Loan và Quảng Châu vàng da sơ sinh liên quan đến thiếu G6PD lên tới 20 - 40%, trong khi ở Mỹ lại ít gặp [50] Những trẻ bị thiếu hụt G6PD có mức bilirubin huyết thanh cao hơn đáng kể so với nhóm chứng Mức bilirubin tăng cao đặc biệt ở ngày thứ ba sau sinh Loại thiếu hụt G6PD lớp 3 thường có biểu hiện vàng da sơ sinh [47] Ví dụ loại đột biến G6PD Aures thường gặp vàng da với tần suất cao [53] Khi thiếu G6PD được di truyền đồng thời với đột biến gen UPGT1A1 (bệnh Gilbert) thì nguy cơ cao dẫn đến vàng da nhân [55,56,67,81]

Xét nghiệm máu: hồng cầu giảm, Hematocrit giảm, Hb giảm, soi hồng

cầu không cần nhuộm phát hiện được thể Heinz [6], tăng hồng cầu lưới (5 - 15%) Định lượng bilirubin trong máu tăng

Xét nghiệm nước tiểu: Hb niệu (+), trụ hồng cầu (-)

Kỹ thuật tế bào: Nghiên cứu sâu hơn bằng xét nghiệm hồng cầu có

thể phát hiện 2 dòng hồng cầu ở những người nữ dị hợp tử Định lượng enzym ở 2 dòng hồng cầu cho kết quả khác nhau do hiện tượng bất hoạt nhiễm sắc thể X [18,52,54] Dirk Roos nghiên cứu một bệnh nhân thiếu

G6PD Vonledam đã phát hiện thấy 94% số hồng cầu có hoạt độ G6PD bằng không và 6% số hồng cầu còn lại có hoạt độ chỉ bằng 1/20 so với bình thường [47]

Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng tan máu ở những người thiếu G6PD:

- Do dùng thuốc [52,53,83]: Vào trong những năm 50 của thế kỷ trước Ernet Beutler đã phát hiện ra hiện tượng tan máu sau khi nghiên cứu một số bệnh nhân sử dụng thuốc chống sốt rét là primaquin Sau đó qua những nghiên cứu người ta đã khám phá ra rằng không chỉ primaquin mà sau sử dụng một số thuốc khác có tính oxy hoá cũng gây nên hiện tượng tan máu: aspirin (thuốc giảm đau), procainamide (thuốc điều trị bệnh tim mạch), DDS (diệt khuẩn) ở những người thiếu G6PD do không tổng hợp

đủ NADPH nên khi sử dụng những loại thuốc này sẽ dẫn đến vỡ hồng cầu Triệu chứng tan máu dẫn đến vàng da thường xảy ra vào ngày thứ 2, 3 sau khi dùng thuốc ở nước ta từ năm 1978 đã có thông báo viết về những trường hợp tan huyết cấp do sử dụng thuốc sốt rét trên bệnh nhân cơ địa thiếu G6PD

- Ngoài ra hiện tượng tan máu còn được biết đến sau khi bệnh nhân

sử dụng một số loại thức ăn có tính oxy hóa cao như rượu vang đỏ, các sản phẩm từ đậu tương và đặc biệt là đậu Fava dẫn đến hội chứng Favism

Hội chứng favism đã được biết đến từ thời Pythagoras ở một số người

khi ăn đậu Fava, sau 24 giờ, có thể xuất hiện hiện tượng tan máu nhiều khi rất dữ dội Sau đó nhiều nghiên cứu cho thấy rằng tình trạng này có liên quan đến thiếu hụt G6PD Đa số xảy ra ở những cá thể thiếu G6PD nặng nhưng đôi khi cũng có thể gặp ở người thiếu hụt nhẹ ở những bệnh nhân này thường thấy Hb niệu xuất hiện trong vài ngày Song không phải trường hợp thiếu G6PD nào cũng có biểu hiện bệnh sau khi ăn đậu Fava [52,56, 83] Người ta đã phát hiện ra trong đậu Fava có 2 thành phần liên quan trực tiếp đến hiện tượng tan máu là glucosidevicine và dividine Aglycone của chúng được thay thế bởi prymidine dẫn đến tổn thương oxy hóa do xu hướng oxi hóa tự phát [80]

- Do nhiễm trùng, đái tháo đường [52,53]: Quá trình nhiễm trùng

thường kích hoạt tan máu Đái tháo đường giai đoạn toàn phát sẽ khởi phát những đợt tan máu ở bệnh nhân

Chẩn đoán [52,83]:

Thiếu G6PD cần được xem xét ở những trường hợp thiếu máu tan máu: Trẻ đẻ non, thiếu cân, gia đình đã có trẻ bị vàng da, nếu được cả những người bị các bệnh nhiễm trùng, có sử dụng một số thuốc và thực phẩm có tính oxy hoá, sống ở vùng có tỷ lệ thiếu hụt G6PD cao …

Chẩn đoán xác định: Đánh giá tình trạng thiếu hụt G6PD bằng phương pháp định tính, bán định lượng hay định lượng Có ý kiến cho rằng ngay khi tan máu, hồng cầu non và hồng cầu lưới chiếm ưu thế, những tế bào này có hoạt tính enzym cao hơn tế bào già, vì vậy việc xác định hoạt độ enzym nên trì hoãn vài tuần sau đợt tan máu đến khi mức enzym thấp trở lại mới xét nghiệm để chẩn đoán Tuy nhiên có nghiên cứu cho rằng dù hoạt

độ G6PD tăng song cũng không đạt được tới mức bình thường

Ngoài ra có thể sử dụng kỹ thuật phân tích gen để phát hiện nguyên nhân, dạng đột biến gen từ đó có hướng tiên lượng và dự phòng

+ Với bệnh nhân đang có biểu hiện tan máu cần theo dõi chặt chẽ tránh các biến chứng có thể xảy ra: vàng da, suy thận và vàng da nhân não

Điều trị: Thiếu hụt G6PD là bệnh di truyền nên không thể điều trị khỏi

được nguyên nhân do đó điều trị triệu chứng là chủ yếu:

+ Ngừng thuốc, thức ăn có tính oxy hoá

+ Truyền dịch, truyền máu, lợi tiểu, thận nhân tạo Chú ý không được truyền cho bệnh nhân loại máu thiếu G6PD

1.2.3 Cơ sở gen học của thiếu G6PD, mối liên quan của nó với đặc tính hoá sinh và các thể lâm sàng:

1.2.3.1 Gen m∙ hóa cho G6PD:

Gen mã hóa cho G6PD nằm ở nhánh dài, vùng 2, băng 8, NST X (Xq28) Vùng này gần với rất nhiều gen khác như: gen mã mã hoá hội chứng nhiễm sắc thể X gãy, hemophilia A, nhìn màu [56,66,66b]

Năm 1986, cADN (complementary DNA) G6PD người được Persico

và cs tách dòng (clon) và phân tích trình tự (sequence), cấu trúc gen đầy đủ

được phân tích bởi Martini và cs cũng trong thời gian đó [66b,80]

Gen G6PD dài trên 20 kb, chứa 13 exon và 12 intron, gồm 25.861 nucleotid [52,56,66], khung đọc mở (open reading frame) dài 1545 nucleotid [80] Kích thước của các exon có mã hóa thay đổi rất nhiều từ 38

đến 236 bp Hầu như các intron đều khoảng dưới 1kb, ngoại trừ intron số 2 dài khoảng 11kb Exon 1 và một đầu 5’ của exon 2 không mã hóa Bộ ba mã hóa đầu tiên nằm trên exon 2 [56,66] Chức năng của từng exon có sự khác nhau Gen cấu trúc của G6PD gồm 20014bp, trong đó 1548bp được mã hóa mRNA G6PD gồm 2269 nucleotide Cũng như các gen khác, mRNA của G6PD có 1 đoạn đầu 3’ không mã hoá dài 655bp, và đoạn đầu 5’ không mã hoá dài 69bp [66] cADN dài khoảng 2170bp [56] Khoảng

300 base được phân tích ngược lên từ vị trí bắt đầu dịch mã và vùng này

được coi là promotor của G6PD, kéo dài từ khoảng - 1200bp đến intron 1 Vùng này giàu GC (hơn 70%), và nhiều GC không bị methyl hoá [66,68]

G6PD được coi là gen có sự điều hoà và kiểm soát chặt chẽ [80] Cùng một lúc G6PD được biểu lộ với mức độ rất khác nhau ở những loại tế bào khác nhau, sự biểu lộ đó được điều hoà bởi nhiều yếu tố và được cho là

do sự bất hoạt của nhiễm sắc thể X

1.2.3.2 Đột biến gen G6PD và biểu hiện bệnh thiếu hụt G6PD:

Thiếu G6PD là bệnh di truyền gen lặn liên kết giới tính, nằm trên nhiễm sắc thể X, không có alen tương ứng trên nhiễm sắc thể Y Nữ là người mang gen bệnh, và truyền cho con trai Người nữ, mỗi tế bào có hai alen G6PD, một được truyền từ bố và một từ mẹ Người nữ dị hợp tử mang gen đột biến sẽ có các kiểu hình: bình thường hoặc là thiếu hụt G6PD từ nhẹ đến trung bình, hiếm khi thiếu hụt enzym nặng (trừ khi họ mang alen bị

đột biến ở vùng có chức năng quan trọng) Nguyên nhân là do sự bất hoạt

nhiễm sắc thể X ở tế bào nữ từ giai đoạn sớm trong quá trình phát triển của phôi, nên sau này đã hình thành nên thể khảm giữa dòng tế bào có nhiễm sắc thể X lành và dòng tế bào có nhiễm sắc thể X mang gen đột biến với tỉ

lệ khác nhau Khi tỉ lệ tế bào mang gen đột biến nhiều hơn thì cơ thể nữ thể hiện thiếu hụt G6PD càng nhiều [3,18,52] Người nữ đồng hợp tử gen đột biến hiếm gặp Người nam chỉ mang một nhiễm sắc thể X của mẹ, như vậy nếu thừa hưởng gen đột biến, con trai của họ sẽ có kiểu gen bán hợp tử (hemizygote), và thể hiện sự thiếu hụt G6PD

Khi gen cấu trúc bị đột biến thì sẽ gây nên thiếu G6PD về mặt chất lượng Khi gen điều hòa hoặc gen khởi động bị đột biến thì sẽ gây nên thiếu G6PD về mặt số lượng Sự biến đổi về số lượng hoặc chất lượng của phân tử enzym đều dẫn đến thay đổi hoạt độ của enzym G6PD [4,18] Tuy nhiên hầu hết những enzym G6PD bị đột biến luôn có những thay đổi bất thường

về các thuộc tính hoá sinh, điều này có nghĩa những đột biến này thường xảy ra tại gen cấu trúc-vùng mã hoá (coding region); còn những đột biến gen điều hoà thì chưa được khẳng định [51]

Đến nay với sự phát triển của sinh học phân tử, cơ sở gen học của thiếu hụt G6PD ngày càng sáng tỏ Các dạng đột biến khác nhau có thể gây nên các mức độ thiếu hụt G6PD khác nhau, từ đó dẫn đến những hình thái lâm sàng khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ quan trọng về chức năng của vùng bị đột biến [45,52] Những đột biến xảy ra ở những vùng mã hoá các acid amin có tính đồng nhất cao, những vị trí gắn NADP, gắn G6P hay ở gần vị trí này, cũng như vậy, những đột biến tập trung vào vùng 3’ thường gây thiếu G6PD nặng [30,36,48,52] Đó là các đột biến Birmingham nucleotid 563 CặT, Santiago 593 GặC, Marion 637 GặT, Cleveland 820 GặA là những vị trí mã cho vùng có tính đồng nhất cao của enzym Đột biến Vancouver thay 3 nucleotid 317 CặG, 544 CặT và 592 CặT hay đột biến Toman 1153 TặC, Iowa 1156 AặG mã cho các acid amin của enzym

ở những vị trí gắn NADP [dẫn 32,52]; đột biến Tsukui mất nucleotid 561 -

563 vị trí gắn G6P [33] hay đột biến Varnsdorf mất đầu 3’ hoặc mất những nucleotid từ 105 đến 107 và 1178 GặA là những vị trí gần vùng gắn NADP Theo E Beutler và T.J Vulliamy có gần 30 đột biến rơi vào những vùng chức năng như vậy [52,57] Ngược lại, những đột biến xảy ra ở nucleotid 172 G6PD Metaponto; 242 GặA G6PD Lagosanto; 337 GặA

của G6PD Sao Borga hay G6PD Mexico city 680 GặA; hoặc mất đoạn nucleotid 953 - 976 của G6PD Nara đều là đột biến nhẹ bởi chúng xảy ra ở những vị trí xa vùng có chức năng [32,33,52,57]

Vào năm 1993 người ta đã tìm thấy 58 dạng đột biến, tương ứng khoảng 97 biến thể [80], đến năm 2002, con số này lên đến 140 đột biến hay phức hợp đột biến gen G6PD tương ứng 442 biến thể [52,57] Điều này chứng tỏ rằng tốc độ phát triển những ứng dụng sinh học phân tử trong lĩnh vực y học hiện nay rất nhanh chóng Trong thực tế còn gặp một số đột biến khác nhau có thể tạo ra enzym biến dị giống nhau [38], ví dụ G6PD Aachen

đột biến nucleotid 1089CặG, và Loma Linda 1089CặA, hai đột biến này

đều làm thay đổi acid amin 363AsnặLys [76] Cũng có khi có những đột biến giống nhau nhưng lại tạo ra enzym có những đặc tính sinh hoá không hoàn toàn giống nhau [38,45] Ví dụ như G6PD Morioka và G6PD Santiago

de Cuba có đột biến 1339GặA, dẫn đến thay 447GlyặArg [38,57], nhưng G6PD Morika thì có tốc độ điện di bình thường, trong khi G6PD Santiago

de Cuba thì tốc độ điện di lại chậm [38] Hay cùng là đột biến G6PD Beverly Hill ở vị trí 1160G ặ A làm acid amin 367 Arg ặ His nhưng cho

4 biến thể khác nhau về đặc tính hoá sinh Chính vì thế 140 dạng đột biến nhưng có tới 442 biến thể G6PD Nếu những đột biến xảy ra ở vùng không mã hoá (intron), hoặc là đột biến không làm thay đổi ý nghĩa của bộ ba mã hoá thì sẽ không có biểu hiện bất thường về enzym [66,80] Như G6PD Silent đột biến xảy ra ở exon 11, nucleotid 1311-chuyển C ặ T, tạo thành

bộ ba mã hoá TAT thay cho TAC, cùng mã hoá cho Tyr

Năm 1967 một hiệp hội của WHO [82] đề nghị một qui trình chuẩn

để mô tả đặc điểm các biến thể sử dụng các chỉ số như: hoạt độ enzym, di chuyển điện di, hằng số Km cho G6P và NADP, sự sử dụng thay thế cơ chất, ổn định với nhiệt và pH tối ưu Dựa vào các đặc tính hoá sinh của enzym trong hồng cầu và những biểu hiện lâm sàng của chúng, WHO đã chia các biến thể của thiếu hụt G6PD ra làm 4 lớp Cho đến nay các nghiên cứu của các tác giả trên thế giới cũng áp dụng cách chia này [33,40,47,48, 64]:

• Lớp 1: Thiếu enzym nặng với biểu hiện thiếu máu tan máu hồng cầu hình không tròn mạn tính;

• Lớp 2: Thiếu G6PD nặng (hoạt độ enzym <10% so với bình thường)

• Lớp 3: Thiếu G6PD vừa đến nhẹ (hoạt độ enzym từ 10-60% so với bình thường)

• Lớp 4: Thiếu rất nhẹ hoặc không thiếu G6PD (hoạt độ enzym từ 100% so với bình thường)

60-Tuy nhiên sự phân biệt giữa các lớp này không phải luôn luôn rõ ràng Ví dụ: G6PD Med được chia vào lớp 2, nhưng cũng đã được mô tả là

có liên quan với thiếu máu tan máu bẩm sinh hồng cầu không tròn Vài biến thể được liệt kê trong lớp 1 do chúng gây những rối loạn chức năng nghiêm trọng, nhưng thật ra xét về mặt hoạt độ enzym in vitro thì thậm chí lại cao hơn một số biến thể được xếp vào lớp 3 [40]

Mỗi dạng đột biến gặp ở những vùng dân cư nhất định Chẳng hạn như trong ba dạng đột biến cổ điển nhất là G6PD A(+), G6PD A(-), G6PD Med thì G6PD A(-) và G6PD A(+) thường gặp ở Tây Phi, những người Mỹ

da đen [29] G6PD A(-) là loại thiếu enzym vừa, hoạt độ enzym khoảng 15% bình thường, và tốc độ điện di nhanh và được xếp vào lớp 3 Tất cả các loại G6PD A(-) có đột biến chuyển nucleotid 376AặG, và có thêm một đột biến thứ hai ở nucleotid 202 GặA, hoặc ở nucleotid 680 GặT, hoặc ở nucleotid 968 TặC [52] Đột biến G6PD A(+) xảy ra ở nucleotid 376AặG G6PD A(+) có tốc độ điện di nhanh tương tự loại G6PD A(-), nhưng hoạt độ enzym bình thường Loại đột biến này thường gặp ở Châu Phi với tần xuất khoảng 20-30%, được xếp vào lớp 3 Đột biến G6PD A(-) không chỉ phân bố rộng khắp ở Châu Phi mà còn thấy ở Nam Âu G6PD Med là đột biến gặp với tần xuất rất cao ở những nước Địa Trung Hải, Trung Đông và Tiểu lục địa ấn Độ Trong khi đó rất ít biến thể được biết ở Trung và Bắc Âu [29,40,52,77]

10-ở Phương Đông [53,54,65] người ta đã tìm thấy các loại đột biến như: G6PD Gaohe và Chinese-4 ở Trung Quốc, G6PD Ube và Konan ở Nhật, G6PD Chinese-3 ở Philipin, G6PD Mahidol ở Đông Nam á, Trung Quốc và Đài Loan, G6PD Viangchan ở những dân tộc di cư từ ấn Độ, Lào

và Philipin, G6PD Chatham ở Philipin, G6PD Caton ở Trung Quốc, Kaiping

ở Lào, Trung Quốc ; G6PD Union ở Philipin, Lào, Trung Quốc và Nhật Bản

Hình 1.4 Các dạng đột biến G6PD ở vùng Đông Nam á

Cho đến nay, ở Việt Nam đã bước đầu có những nghiên cứu về các dạng đột biến gen G6PD ở một số dân tộc và ở những vùng địa lý khác nhau của nhóm nghiên cứu chúng tôi [1,7,9,10,11]

1.3 Kỹ thuật phát hiện thiếu hụt G6PD

Hiện nay có rất nhiều các phương pháp phát hiện thiếu G6PD từ phương pháp định tính, định lượng đến phân tích gen để phát hiện nguyên nhân của bệnh [41,43,46,61,62] Từng phương pháp có ưu nhược điểm riêng

và tuỳ theo mức độ thiếu hụt cũng như yêu cầu cần phát hiện mà áp dụng các phương pháp khác nhau

1.3.1 Kỹ thuật định tính:

Phương pháp phát quang (Beutler và Mitchelt-1968), phương pháp

được tiến hành bằng cách lấy máu sau đó trộn đều với dung dịch đã chuẩn

bị sẵn gồm NADP và G6P, sau đó nhỏ vào giấy Whatman -1 Để khô giấy

đã thấm máu và đọc kết quả dưới ánh sáng đèn cực tím Nếu hàm lượng G6PD đủ thì mẫu máu này sẽ phát quang và không phát quang khi không

đủ lượng G6PD Tuy vậy phương pháp này có giá thành cao do cần phải có

các thiết bị chuyên dụng như đèn chiếu tia tử ngoại, ngoài ra phương pháp này khó phát hiện trường hợp thiếu G6PD ở nữ dị hợp tử

Phương pháp nhanh của AkiraHirono-1998: là phương pháp tiến

hành dựa trên nguyên lý G6P (Glucose-6-Phosphat) được chuyển thành 6PG (6-Phosphogluconat) thông qua sự xúc tác của enzym G6PD, từ đó tạo

ra NADPH là một chất khử tham gia phản ứng chuyển MTT Dimethylthiazol-2-yl])-2,5 diphenyl tetrazolium Bromid, Thiazolylblue)

(3-[4,5-thành Formazan, từ mầu vàng sang mầu xanh tím Đây là một phương pháp

đọc kết quả ngay sau 30 phút bằng mắt thường, dễ nhận biết và không đòi hỏi thiết bị tốn kém Phương pháp này đã được các tác giả như Akira Hirono, Kuni Iwai áp dụng ở một số nước Đông Nam á để điều tra hàng loạt Theo nghiên cứu của tác giả Tạ Thị Tĩnh phương pháp này có độ nhạy

và độ đặc hiệu tương ứng là 91,2% và 97,2% [20,26] Mặc dù vậy, kỹ thuật này không cho phép tiến hành cùng lúc hàng trăm mẫu bởi qui trình thao tác và thời điểm đọc kết quả

1.3.2 Kỹ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng

Kỹ thuật bán định lượng tạo vòng Formazan trước đây được giới thiệu bởi Fairbanks và Ernest Beutler 1962 sau này kỹ thuật đã được cải tiến và áp dụng tại Nhật Bản qua tác giả Hisaichi Fuijii và cộng sự [39,61]

MTT (màu vàng)

Formazan (màu xanh)

6-GP (sản phẩm)

G6P-Na (cơ chất)

PMS

G6PD

NADPH2 (dạng khử)

NADP+

(dạng oxy hoá)

Hình 1.5 Nguyên lý của kỹ thuật Formazan bán định lượng

Nguyên tắc của phản ứng: thông qua xúc tác của G6PD, NADP bị khử thành NADPH NADPH tạo thành sẽ khử MTT với sự có mặt của Phenazine methosulfate (PMS) tạo nên vòng Formazan có màu xanh [39,61] Diện tích và độ đậm của vòng màu sản phẩm của phản ứng sau một thời gian nhất định tỷ lệ thuận với hoạt tính của enzym G6PD trong mẫu thử

Hiện nay kỹ thuật này đã và đang được nghiên cứu và áp dụng ở nước

ta, vì nó đơn giản dễ thực hiện, giá thành rẻ [25b] Tuy nhiên để có thể sử dụng như một test sàng lọc trong cộng đồng, thực hiện được trong các hoàn cảnh và điều kiện khác nhau cần có thêm những nghiên cứu điều chỉnh bổ sung

1.3.3 Phương pháp định lượng:

Phương pháp này được tiến hành dựa trên nguyên tắc xác định hoạt

độ G6PD do sự thay đổi phổ hấp thụ tại bước sóng 340 nm của coenzym NAPDH sinh ra trong quá trình phản ứng Hoạt độ G6PD tỷ lệ thuận với

độ hấp thụ của NADPH

G6PD

G6P +NADP Glucorate-6-P + NADPH + H+

Kết quả: Hoạt tính enzym bình thường 100 UI/10≥ 12 HC,

Thiếu G6PD nhẹ và trung bình: 40 - 100 UI/1012HC, Thiếu G6PD nặng: ≤ 40 UI/1012 HC

Hoạt tính của enzym được tính theo nhiều đơn vị Hoạt tính enzym xác

định theo WHO thì trên 100UI/ml máu là bình thường Hoạt độ xúc tác

được coi là chuẩn dùng để đối chiếu đánh giá các trạng thái thiếu hụt G6PD hồng cầu người Việt Nam [4] là: vào khoảng 4,0±0,91 UI/gHb ở nam và 3,81±0,52 UI/gHb ở nữ, hiện nay các phòng xét nghiệm lấy theo chuẩn của thế giới (kít của hãng Roche), hoạt độ G6PD ở người lớn là: 131±13 UI/1012

HC, ở trẻ em: 136±12 UI/1012 HC [20]

1.3.4 Phân tích gen - Kỹ thuật PCR-MPTP: (Polymerase Chain Reaction;

Multiplex PCR using Tandem forward Primer )

Năm 1983 Mullis K.B phát minh ra kỹ thuật PCR với khả năng khuếch đại trong phòng thí nghiệm một đoạn ADN (<2000bp) đã biết trình

tự nucleotid, từ đó bất cứ đoạn ADN nào trong toàn bộ bộ gen gồm hàng tỉ

bp đều có thể được phân tích Kỹ thuật PCR đã trở thành một trong những

kỹ thuật đầu tiên và được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực sinh học phân

tử

Kỹ thuật PCR thực hiện dựa trên nguyên lý sao chép ADN trong tế bào đó là: ADN được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn Từ một phân tử ADN chuỗi kép ban đầu được tách làm hai chuỗi đơn, mỗi chuỗi này lại làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp ADN trong chu kỳ tiếp theo, do đó các bản sao của ADN đích sẽ gấp đôi sau mỗi chu kỳ Như vậy sau một số chu

kỳ nhất định, số lượng bản sao có thể tăng lên gấp hàng tỉ lần so với ban

đầu

Phản ứng PCR có độ nhạy cao, vì thế có thể chỉ cần dùng một phân

tử ADN làm khuôn cũng thu được sản phẩm Phản ứng này được sử dụng rộng rãi và có những biến đổi phù hợp với từng mục đích riêng Đến nay có nhiều loại kỹ thuật PCR khác nhau như là: Nested- PCR, PCR-SSO, PCR-SSP, MPTP-PCR tất cả đều dựa trên nguyên tắc của phản ứng PCR và lấy sản phẩm của PCR ban đầu để làm nguyên liệu

* Kỹ thuật Multiplex PCR using Tandem forward Primer (MPTP)[78] Năm 1997, một nhóm tác giả Nhật Bản và Singapore đã triển khai một phương pháp phát hiện những đột biến của gen G6PD đó là MPTP Nguyên tắc của MPTP dựa trên nguyên lý của PCR

Trước hết một vùng đích trên gen của G6PD được khuếch đại, sau đó sản phẩm này được sử dụng làm khuôn mẫu để chạy MPTP MPTP dựa trên cơ sở một primer rất ngắn có khả năng nhận ra một nucleotid khác biệt trong vùng trình tự đích, và như vậy việc lai sẽ không thực hiện được Phản ứng MPTP được tiến hành với nhiều primer xuôi chiều, những primer xuôi chiều nối đuôi nhau phủ toàn bộ vùng đích và một primer ngược thông thường làm khuếch đại từng đoạn “theo hình bậc thang” Sự thay đổi nucleotid trong vùng “rà soát” của primer đưa đến việc thiếu một hay hai sản phẩm khuếch đại Lợi ích của kỹ thuật này là hầu hết trình tự đột biến

trong vùng đích của gen trên nhiễm sắc thể có thể được khu trú lại một vùng nhỏ và được phát hiện sau hai bước PCR

Chương 2:

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Nghiên cứu được tiến hành trên 6 nhóm dân tộc Kinh, Mường, Katu, Raglai, Tày, Rục ở 6 địa điểm khác nhau Việc xác định dân tộc dựa trên kết quả của Phiếu điều tra nguồn gốc dân tộc (Phụ lục 1)

- Dân tộc Kinh: 3835 người tại Hà Nội

- Dân tộc Mường: 626 người tại Hoà Bình

- Dân tộc Katu: 356 người tại Huế

- Người Raglai: 828 người tại Khánh Hoà

- Người Tày: 212 người tại Khánh Hoà và Cao Bằng

- Người Rục: 222 người tại Quảng Trị

Cỡ mẫu được tính theo công thức sau:

Cỡ mẫu ước lượng đối với từng dân tộc là:

- Người Kinh: p = 0,03, ε = 0,2 ặ Cỡ mẫu n = 3105 người

- Người Mường: p = 0,2, ε = 0,2 ặ Cỡ mẫu n = 384 người

- Người Katu: p = 0,2, ε = 0,2 ặ Cỡ mẫu n = 384 người

- Người Raglai: p = 0,1, ε = 0,2 ặ Cỡ mẫu n = 864 người

- Người Tày: p = 0,2, ε = 0,3 ặ Cỡ mẫu n = 171 người

- Người Rục: p = 0,2, ε = 0,3 ặ Cỡ mẫu n = 171 người

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang, chọn mẫu có

chủ đích.

2.2.2 Nội dung nghiên cứu:

- Xác định những điều kiện thích hợp ứng dụng kỹ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng phát hiện thiếu G6PD

- Tìm tỷ lệ thiếu G6PD ở một số dân tộc người Việt Nam trong nhóm nghiên cứu

- áp dụng kỹ thuật PCR-MPTP tìm dạng đột biến gen G6PD

2.2.3 Các bước nghiên cứu:

- Bước 1: Xác định các điều kiện thích hợp của kỹ thuật Formazan

- Bước 2: Thu thập, sàng lọc phát hiện thiếu hụt G6PD trên đối tượng N/C

- Bước 3: Chiết tách ADN từ giấy thấm hoặc máu tĩnh mạch (trẻ sơ sinh) của các trường hợp thiếu hụt G6PD

- Bước 4: Phân tích các dạng đột biến gen của một số trường hợp thiếu hụt G6PD bằng kỹ thuật PCR-MPTP

- Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, trường Đại học Y Hà Nội

- Phòng Miễn dịch - Khoa Nghiên cứu và điều trị sốt rét - Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương

- Phòng Enzym - Viện Công nghệ sinh học - Trung tâm Khoa học tự nhiên

và Công nghệ Quốc gia

- Khoa Sinh hoá - Viện Nhi trung ương

- Trung tâm Quốc tế về Y học phân tử - Trường Đại học Kobe - Nhật Bản

2.2.4 Các qui trình kỹ thuật:

2.2.4.1 Thiết bị:

- Máy khuấy từ HB 502 (UK)

- Máy ly tâm siêu tốc (UNIEQUIQ)

- Máy ly tâm lạnh (Beckmanm)

- Tủ lạnh âm sâu (Sanyo)

- Máy khuấy trộn Vortex (Rotolab, OSI)

- Cân phân tích (Mettler Toledo)

- Pipettman các loại

- Nồi khử trùng ướt (Nhật Bản)

- Máy đo pH (Mettler Toledo)

- Bể ổn nhiệt có lắc (Haake SWB 20)

- Máy quang phổ bán tự động Master 3000 (Hewler Packard, Mỹ)

- Bộ nguồn và khay điện di (Bio lab)

- Máy soi và chụp ảnh gel (UV transillumination)

2.2.4.2 Kỹ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng:

* Chuẩn bị dụng cụ và hoá chất:

- Cho lấy mẫu: Giấy Whatman-3, có đánh dấu các vòng tròn đường kính 1 cm; Kim lấy máu; Bông cồn vô trùng

- Cho xét nghiệm:

+ Dụng cụ: Lọ, cốc, đũa thuỷ tinh, bình định mức, khuôn nhựa đổ gel + Hoá chất: Tris HCl 1M; MgCl2; G6PNa2; NADP+; MTT; PMS; agarose; nước cất

* Nồng độ hoá chất tham gia: Theo kỹ thuật của tác giả Hisaichi Fuiji

- Nồng độ A: (hoá chất của hãng Roche)

• G6P (Glucose -6- Phosphate): 0,625 mg/ml

• NADP+(Nicotinamid adenin dinucleotid dạng oxy hoá): 0,125 mg/ml

• MTT (3-([4,5-Dimethylthiazol-2-yl])-2,5 diphenyl tetrazolium Bromid, Thiazolylblue): 0.125 mg/ml

• PMS (Phenazin Methosulfat) : 0,125 mg/ml

- Nồng độ B: Gấp 2 lần so với nồng độ A

* Tiến hành xét nghiệm:

- Đổ gel:

+ Cho 10 ml dung dịch đệm Tris HCl vào cốc I

+ Cho 30 ml dung đệm Tris HCl vào cốc II

+ Lần lượt cân các hoá chất trên vào cốc I khuấy cho tan và đun nóng

đến 550C

+ Cho 400 mg agar vào cốc II, đun cho tan; để nguội đến 550C

+ Trộn 2 dung dịch trên vào nhau, khuấy đều được hỗn hợp gel

+ Đặt khuôn nhựa trên một mặt phẳng, nhẹ nhàng đổ hỗn hợp trên vào đĩa (tránh tạo bọt khí)

+ Để nguội gel ở nhiệt độ phòng, khoảng 30 phút gel sẽ đông

Một bản gel đạt yêu cầu khi: Bản gel dày 3 mm, trong suốt, màu vàng nhạt, đồng đều, mặt gel phẳng, không có các bọt khí

- Tra mẫu:

+ Đặt đĩa gel chồng lên thước đo định vị

+ Dùng kìm bấm các mẫu giấy thấm máu thành những vòng tròn có

đường kính 3 mm

+ Đặt từng mẫu tại các vị trí đã định sẵn, ấn nhẹ cho mẫu dính chặt vào gel Lưu ý: Đặt mặt trên của mẫu giấy thấm máu tiếp xúc với gel,

ấn nhẹ tay tránh làm vỡ gel, khi đọc kết quả sẽ khó chính xác

+ Bọc bản gel bằng giấy nhôm, ủ ở tủ 370C trong 8 giờ

Tốc độ NADPH tạo thành được đo dựa theo sự thay đổi mật độ quang học ở bước sóng 340 nm (∆A)

- Làm vỡ thành tế bào, thành nhân để giải phóng ADN

- Loại bỏ các thành phần không mong muốn: protein và ARN

- Tạo tủa acid nucleic - ADN

* Hoá chất (hãng Sigma):

+RCLB: 1mM NH0034NCO3

115 mM NH4Cl +WCLB: 100mM Tris-HCl (pH 7,6)

40mM EDTA (ph8) 50mM NaCl

0,2% SDS 0,05% Sodium azide + Proteinase K nồng độ 10mg/ml

+ NaCl 6M (bão hoà)

- Qui trình tách ADN từ bạch cầu máu ngoại vi:

+ Cho 0,5ml đệm ly giải hồng cầu RCLB vào 0,2ml máu ngoại vi trong eppendorf đã được chống đông bằng EDTA 10mM, lắc 5 phút để phá

vỡ hồng cầu, ly tâm 3.000g x 10 phút

+ Loại nước nổi, làm như bước trên thêm 2 lần

+ Loại bỏ nước nổi, thêm vào 0,1ml đệm ly giải bạch cầu WBLC Dịch lúc này rất nhớt và quánh (ADN dạng này có thể ổn định ở nhiệt độ phòng trong vài tuần.)

+ Thêm 1àl proteinase K vào dịch ly giải bạch cầu, ủ ở 500C x 2 giờ + Thêm vào 30àl NaCl bão hoà (NaCl 6M), lắc 10 phút, ly tâm 7.200g trong 10 phút

+ Tinh khiết ADN bằng 0,25ml phenol/chloroform/isoamyl alchohol (25/24/1), lắc đều, ly tâm 6.000g x 10 phút ở 40C, hút lấy dịch trên cùng Lặp lại lần 2

+ Hút lớp dịch chứa ADN trên cùng, lúc này còn lẫn phenol, loại bỏ phenol bằng 0,2ml chloroform/isoamylalchohol (24/1), lắc đều, ly tâm 6.000g x 10 phút ở 40C, hút lấy dịch trên cùng Lặp lại lần 2

+ Hút nước nổi, dùng ethanol tuyệt đối (lạnh) để tủa ADN(1 thể tích ethanol-2 thể tích nước nổi), lắc đảo ngược, ADN kết tủa sẽ xuất hiện

+ Ly tâm 7.200g x 5 phút, loại bỏ nước nổi

+ Rửa tủa ADN bằng 1ml ethanol 70%

+ ADN thu được làm khô trong không khí, hoà tan trong 20àl nước hay dung dịch TE

- Qui trình tách ADN từ giấy thấm:

+ Cắt nhỏ mảnh giấy thấm ặ eppendorf 1,5ml

+ Cho thêm vào eppendorf: 400 àl BBS, 25 àl SDS 10% và 10 àl Proteinase K 10 mg/ml ặ ủ 700C trong 30 phút, có lắc

+ Thêm vào 0,5 ml Phenol chloroform lắc mạnh trong 15 giây

+ Chuyển phần dịch sang eppendorf khác, ly tâm 9.000g x 10 phút + Chuyển tiếp phần dịch nổi phía trên sang eppendorf khác và thêm vào 40 àl CH3COONa 3M, 0,8 ml Ethanol 100% ặ Lắc ở -200C x 1 giờ + Ly tâm 9.000g x 10 phút