MỘT số đặc điểm của VI KHUẨN cố ĐỊNH NITƠ tự DO CLOTRIDIUM TRONG đất TRỒNG lạc xã NGHI LIÊN NGHI lộc NGHỆ AN

Trờng đại học vinhKhoa Sinh học ………… Phạm Thị Lê bớc đầu nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn cố định nitơ tự do lostridium trong đất trồng lạc tại xã nghi liên - tố và rất nhiều h

Trờng đại học vinh

Khoa Sinh học

…………

Phạm Thị Lê

bớc đầu nghiên cứu một số đặc điểm của

vi khuẩn cố định nitơ tự do lostridium trong đất trồng lạc tại xã nghi liên -

tố và rất nhiều hoạt chất quan trọng khác

Ngời ta nhận thấy rằng muốn có thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta,câytrồng cần lấy đi khỏi đất khoảng 30kg nitơ Số lợng nitơ này nằm trong hạt và

1

trong rơm rạ hoặc trong thân lá Hiệu suất sử dụng phân hóa học là vào khoảng75% Nh vậy có nghĩa là nếu chỉ dựa vào nguồn nitơ của phân hoá học thìmuốn có 5 tấn hạt chúng ta phải bón vào mỗi hecta khoảng 116,6kg nitơ (tơng

đơng với 833kg amôn sunphát) Số lợng nitơ này thật khó có thể thỏa mãn ngaycả ở nớc có công nghiệp phân nitơ hóa học phát triển

Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, trong không khí có đến 78,16% là nitơ.Ngời ta tính rằng bầu không khí xung quanh trái đất chứa 4x1015tấn nitơ,khoảng không khí bên trên mỗi km2 đất đai có khoảng 80.000 tấn nitơ Số lợngnitơ này để thoả mãn nhu cầu về nitơ của cây trồng sống trên mảnh đất đó(vớithu hoạch 20 tạ/ha)trong khoảng 80 triệu năm

Trong thực tế cây trồng( cũng nh ngời và động vật) không có khả năng

đồng hoá trực tiếp nguồn nitơ lớn lao này Sở dĩ nh vậy bởi vì trong không khí,phân tử nitơ tồn tại ở trạng thái liên kết 2 nguyên tử nitơ lại với nhau nhờ 3 dâynối rất bền vững(N=N) [3]

Trên toàn trái đất hằng năm cây trồng sử dụng khoảng 100-110 triệu tấnnitơ, trong khi đó phân đạm hoá học của tất cả các nớc trên thế giới chỉ bổ sung

đợc khoảng 30% số lợng nitơ bị lấy đi

Trong khi con ngời muốn phá vỡ 3 liên kết trong phân tử nitơ (N=N)để

dễ tạo ra các loại phân hoá học, cần phải sử dụng những điều kiện kỹ thuật rấtphức tạp: nhiệt độ cao(6000 C ), áp suất cao(1000atm), chất xúc tác đắttiền(Os,Ru) thì có một số vi sinh vật có khả năng đồng hoá dễ dàng và thờngxuyên nitơ của không khí ở điêù kiện bình thờng , ngời ta gọi chúng là các visinh vật cố định nitơ.[2]

Vi sinh vật cố định nitơ gồm có nhiều loài vi sinh vật sống tự do trong

đất và trong nớc Các loài thuộc các giống Clostridium, Azotobacter,

Pseudomonas ,Bacillus, Azotobacter,vi khuẩn dinh dỡng quang năng, vi khuẩn

sinh mêtan Trong số những vi sinh vật sống t do ở đất thì Azotobacter

,Clostridium là những vi khuẩn có khả năng cố định nitơ cao nhất.Khả năng cố

đinh nitơ tự do còn có ở vi khuẩn nốt sần(Rhizobium) sống cộng sinh trong rễ

các cây họ đậu Tuy nhiên ở loài sống cộng sinh thì chúng có tính chọn lọc mỗiloại vi khuẩn nốt sần chỉ xâm nhiễm lên một loài cây nhất định và chúng chỉ cố

định đợc nitơ khi ở trong nốt sần đối với vi sinh vật sống tự do ngoài khả năng

cố định nitơ tự do trong không khí cho đất cho cây còn có ứng dụng lớn laotrong sản xuất phân bón vi sinh

Ngời ta đã dành những cố gắng rất lớn một mặt đi sâu nghiên cứu về đặc

điểm sinh học của các nhóm vi sinh vật cố định nitơ và tìm cách phát huy caonhất tác dụng lớn lao này của chúng, mặt khác tìm cách khám phá ra các bímật của cơ chế cố định nitơ sinh học với hy vọng sẽ từng bớc dẫn đến nhữngcải tiến quan trọng trong ngành công nghiệp sản xuất các loại phân nitơ hoáhọc.[3]

Trong điều kiện nớc ta hiện nay, việc nghiên cứu các đặc điểm sinh họccủa vi khuẩn cố định nitơ tự do có ý nghĩa rất lớn nhằm để phát huy hết khảnăng cố định nitơ của chúng, từ đó ứng dụng trong công nghiệp sản xuất trongphân bón vi sinh

Trong chiến lợc phát triển kinh tế những năm gần đây, nhà nớc đã chútrọng phát triển những cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao trong

đó có cây lạc.ở Nghệ An, cây lạc là một trong những cây có giá trị kinh tế đã

đợc tỉnh quan tâm đầu t và phát triển

Từ những lý do trên và với khuôn khổ của một đề tài tốt nghiệp cử nhânsinh học mà chúng tôi đi vào tìm hiểu khả năng cố định nitơ tự do của vi khuẩn

kị khí Clostridium trong đất trồng lạc xã Nghi Liên- Nghi Lộc-Nghệ An.

Mục tiêu đề tài

1.Tìm ra các chủng Clostridium có khả năng cố định nitơ tự do

2.Chọn một chủng có khả năng cố định nitơ tự do lớn nhất để nghiên cứu

đặc điểm hình thái và các yếu tố ảnh hởng đến sinh trởng:nhiệt độ, độ ẩm, pH,tìm ra các trị số tối u để chủng đó sinh trởng và phát triển tốt

3.Rèn luyện cho bản thân một số kĩ năng thực hành, thí nghiệm, phơngpháp nghiên cứu khoa học

3

Phần II: Tổng luận

I Sự phân bố của vi sinh vật trong đất:

Khu hệ vi sinh vật đất rất phức tạp, có những đặc điểm sinh lý và sinhthái rất khác nhau Riêng vi khuẩn đã rất phong phú Chúng bao gồm vi khuẩnháo khí, vi khuẩn kị khí, vi khuẩn tự dỡng, vi khuẩn dinh dỡng cacbon, vikhuẩn cố định đạm Vi sinh vật sống thành quần thể, giữa loài này và loài khác

có tác động qua lại lẫn nhau, chúng là tác nhân chủ yếu của quá trình chuyểnhoá vật chất trong đất

Vi sinh vật có mặt trong tất cả các loài vật nhng ở chân đất có đầy đủchất dinh dỡng, kết cấu và thành phần cơ giới tốt, có độ ẩm và phản ứng môi tr-ờng thích hợp thì ở đấy vi sinh vật phát triển nhiều và phong phú về thànhphần Trên những chân đất khô hạn, lầy thụt thì sự phát triển vi sinh vật bị hạnchế rõ rệt và tạo thành một khu hệ vi sinh vật đặc biệt: khu hệ vi sinh vật chịuchua, khu hệ vi sinh vật kị khí và vi hiếu khí, khu hệ vi sinh vật phát triểntrong môi trờng nhiều H2, CH4

Đất trồng lúa nớc vi sinh vật kị khí chiếm u thế Các loài vi khuẩn sống

tự do, có khả năng cố định đạm nh : Azotobacter , Clostridium pasteurianum

có nhiều trong đất lúa Hai loại này có đặc điểm khác nhau :Azotobacter đòi

hỏi có ô xi phân tử, có phản ứng với môi trờng trung tính, có đầy đủ lân, Ca,

Mg và chất hữu cơ Vì vậy trong đất lúa có nhiều vùng không tìm thấy

Azotobacter còn vi khuẩn kị khí Clostridium pasteurianum phân bố nhiều

trong đất lúa, số lợng của chúng có nhiều trong mỗi gam đất, Chúng đã gópphần tích cực làm giàu đạm cho đất lúa

ở đất chuyên trồng màu hoặc luân canh 1 vụ lúa, 1 vụ màu có điều kiệnthông khí tốt, vi sinh vật háo khí phát triển mạnh

Quần thể vi sinh vật đất thờng tập trung nhiều ở đất canh tác, nơi tậptrung nhiều rễ cây đợc bố sung nhờ chất dinh dỡng và có chế độ nhiệt , chế độkhông khí thích hợp cho vi sinh vật phát triển Các loài vi sinh vật háo khí giảmxuống theo chiều sâu tầng đất, còn vi khuẩn kị khí phát triển mạnh ở tầng đấtsâu 40-60cm và trong điều kiện đất thoát nớc mạnh, giàu chất dinh dỡng

Thời tiết khí hậu cũng chi phối mạnh mẽ đến quần thể vi sinh vật đất.Những tháng nóng ẩm có ma rào, ma phùn, cây cối phát triển tốt chính là thờigian vi sinh vật phát triển mạnh mẽ

Vi sinh vật đất đặc biệt là vi sinh vật vùng rễ có mối quan hệ mật thiếtvới cây trồng Thời kì cây ra hoa, bộ rễ hoạt động mạnh tiết ra nhiều chất dinhdỡng có tác dụng kích thích vi sinh vật phát triển Vi khuẩn kị khí có khuynhhớng phân bố xa vùng rễ.

Điều kiện địa hình , khu vực địa lý cũng ảnh hởng không nhỏ đối với visinh vật đất Khi điều kiện sinh thái thích hợp với cây trồng thì cũng thích hợpvới sự phát triển vi sinh vật đất Sự tác động của con ngời thông qua việc khaiphá đất đai, thâm canh tăng năng suất cây trồng làm chi phối rất mạnh mẽ tớikhu hệ vi sinh vật đất Việc cày bừa, xới xáo đất, bón phân làm ải, t ới tiêu hợp

lý đã xúc tiến mạnh mẽ sự phát triển của vi sinh vật đất, làm tăng độ phì nhiêucủa đất và tăng năng suất cây trồng.[2]

II Sơ lợc về vi khuẩn Clostridium

Năm 1893 lần đầu tiên X.N.Vinogradxki phát hiện đợc một loại vi

khuẩn kị khí sống tự do có khả năng cố định nitơ phân tử, đó là Clostridium

pasteurianum.

Tế bào của Clostridium pasteurianum có kích thớc khoảng

2,5-7,5x0,7-1,3 có thể đứng riêng rẽ, xếp thành đôi hay xếp thành chuỗi ngắn Khi cònnon có tế bào chất đồng đều, có khả năng di động Khi già, tế bào chất có cấutạo hạt, tế bào mất khả năng di động Bào tử thờng có hình bầu dục hay hìnhkéo dài nằm ở giữa hay gần một đầu của tế bào Bào tử có kích thớc lớn hơn bềrộng của tế bào dinh dỡng, do đó khi mang bào tử tế bào thờng có hình conthoi Kích thớc của bào tử khoảng 1,3.x1,6.

Hiên nay ngoài loài Clostridium pasteurianum ngời ta còn nhận thấynhiều loài Clostridium khác cũng có khả năng cố định nitơ phân tử đó là các loài:

C.butyricum, C butylicum, C beijerinckia, C aceticum, C multifermentans, C Acetobutylicum, C felsineum, C kluyveri, C lactoacetafilum, C.madisonii Sự

khác nhau về các đặc điểm hình thái và sinh lý giữa các loài này có thể đợc

thấy rõ trong khoá phân loại của Bergey(1965).

Vi khuẩn thuộc loài Clostridium pasteurianum thờng có hoạt tính cố

định cao hơn các loài Clostridium khác Khi đồng hoá hết 1g thức ăn các bon,

chúng thờng tích luỹ đợc khoảng 5-10mg nitơ Khả năng cố định nitơ của các

loài trong chi Clostridium còn phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy.

Clostridium có khả năng đồng hoá các monosaccarit, disaccarit và một số

polisaccarit(nh tinh bột, dextrin) Chúng có thể đồng hoá cả nhiều rợu bậc cao

5

và một số hợp chất chứa các bon khác nữa Khi lên men hidratcacbon,

Clostridium thờng làm tích luỹ axit hữu cơ butanol, etanol, axeton, CO2,

H2 Thành phần và tỷ lệ của các sản phẩm lên men phụ thuộc vào từng loại vikhuẩn cũng nh phụ thuộc vào hai pha khác nhau của quá trình lên men Chẳng

hạn Clostridium axetobutylicum thờng làm tích luỹ trong pha đầu axit axetic,

axitbutiric và trong pha sau butanol, axeton và etanol

Clostridium pasteurianum cũng nh nhiều loài Clostridium có khả năng

cố đinh nitơ khác có thể phát triển đợc trong phạm vi pH khá rộng (pH 8,5) Tuỳ từng nghiên cứu mà pH thích hợp nhất đối với sự phát triển của

=4,7-Clostridium là 5,9-8,3,hay 6,9-7,3 Các nghiên cứu ở Việt Nam cho biết ngay

cả những vùng đất chua, khi không tìm thấy sự phát triển của Azotobacter thì

Clostridium vẫn có mặt với số lợng đáng kể Nói chung trên mỗi gam đất trồng

lúa, trên miền bắc nớc ta, số lợng vi khuẩn nhóm này có từ hàng vạn đến từhàng triệu tế bào Số lợng của chúng trong vùng rễ cây trồng bao giờ cũng

nhiều hơn ngoài vùng rễ Clostridium thờng tập trung nhiều trong lớp đất cày

nhng ngay ở độ sâu 75cm vẫn có thể thấy có hàng ngàn tế bào trong mỗi gam

đất (Nguyễn Lân Dũng, 1960, 1969).

Bào tử của Clostridium có sức đề kháng rất cao đối với nhiệt độ cao và

sự khô hạn Một số nghiên cứu cho biết bào tử của loài vi khuẩn này có thểsống đợc đến 5 giờ ở nhiệt độ 750C và một giờ ở nhiệt độ 800C Bao tử của một

số chủng Clostridium chịu nhiệt ngay ở nhiệt độ 1000 C vẫn có thể sống đợc30phút

Các loài Clostridium hiện diện trong đất ,một số loài trong nhóm này

còn gây bệnh cho ngời và động vật, một số loại khác gây h hỏng thực phẩmkhử sunphur tạo nên màu đen và gây mùi khó chịu Các loài gây ngộ độc thựcphẩmquan trọng là C botulinum và C perfringens.[14]

III Vòng tuần hoàn Nitơ trong tự nhiên

Cây không đồng hoá trực tiếp nitơ hữu cơ Trong thực tế cây trồng có thểnhận đợc một nguồn nitơ lớn nhờ quá trình phân giải của vi sinh vật đối với cácchất hữu cơ có mặt trong đất hoặc đa vào đất (phân rác, phân xanh, phânchuồng) Quá trình này gọi là quá trình a môn hoá hoặc quá trình thối rữa

Nếu đất bị ngập nớc và không đủ ôxi thì muối amôn đợc tạo thành sẽtích luỹ lại trong đất, nhng nếu trong đất có đầy đủ ôxi thì NH3 sẽ đợc oxi hoá

thành nitrit rồi tiếp đó sẽ ôxi hoá thành nitrat (Quá trình nitrat hoá) Nitrat làmột trong những dạng hợp chất nitơ đợc cây trồng hấp thụ một cách dễ dàng

Ngợc lại với quá trình nitrat hoá là quá trình phản nitrat hoá, tức là quátrình khử nitrat thành nitơ phân tử Bên cạnh quá trình phản nitrat hoá do visinh vật còn có một quá trình phản nitrat hoá hoàn toàn hoá học (Phản ứng giữaHNO2với axit amin hoặc amit) Sau quá trình phản nitrat hoá, nitrat sẽ chuyểnthành nitơ phân tử bay vào không khí

Những tổn thất về nitơ do quá trình phản nitrat hoá gây nên đợc bù đắp lạinhờ một quá trình sinh học đặc biệt gọi là quá trình cố định nitơ, tức là quá trìnhchuyển hoá nitơ phân tử thành các hợp chất chứa nitơ Nhóm vi sinh vật có khảnăng thực hiện quá trình này đợc gọi là các vi sinh vật ccố định nitơ, chúng cótác dụng làm giàu thêm nguồn dự trữ thức ăn nitơ trong đất

Hình 1: Chu trình nitơ trong tự nhiên

IV Cơ chế của quá trình cố định Nitơ phân tử

Trong công nghiệp sản xuất phân hoá học việc chuyển hoá N2 thànhcác dạng hợp chất của nitơ (muối amôn, urê, nitrat) cần tiêu tốn nhiều nănglợng Số năng lợng để tổng hợp một tấn NH3 tơng đơng với số năng lợngsinh ra khi đốt cháy 5 tấn than đá Trong khi đó các vi sinh vật cố định nitơbằng một cơ chế nào đó đã thờng xuyên chuyển hoá đợc N2 thành các hợp

7

chất chứa nitơ ngay trong điều kiện bình thờng về áp suất và nhiệt độ Nếukhám phá ra đợc cơ chế quá trình cố định nitơ ở vi sinh vật thì rõ ràng sẽ mở

ra một triển vọng hết sức to lớn đối với việc cải tiến toàn bộ quá trình sảnxuất phân nitơ hoá học

Đa số nghiên cứu đều cho thấy rằng:Quá trình cố định nitơ sinh học làmột quá trình khử N2 thành NH3 dới tác dụng của men nitrogenaza sinh rabởi vi sinh vật

Nitrogenaza có thể thu đợc từ dịch chiết vô bào lấy từ tế bào của các visinh vật cố định nitơ

Nitrogenaza là một hệ phức enzim Chúng cấu tạo bởi 2 thành phần đó

là prôtêin có phân tử nhỏ

Một thành phần gọi là prôtêin sắt còn gọi là nitrogenaza khử hay thànhphần II Một thành phần khác gọi là prôtêin sắt-Molipden hay còn gọi làthành phần I

Thành phần II đợc nghiên cứu ở Clostridium pasteurianum gồm 2 tiểu

phần đồng nhất, mỗi tiểu phần có khối lơng 29.000, ở giữa có một trung tâmchứa 4 nguyên tử Fe và 4 nguyên tử S không ổn định với axit Thành phần

I(Mo-Fe prôtêin ) ở Clostridium pasteurianum phức tạp hơn có khối lợng

phân tử chung là 220.000 gồm 2 nguyên tử Mo, khoảng 30 nguyên tử Fe vànhiều nguyên tử S không ổn định với axit Chúng có cấu tạo bởi 4 tiểu phầngồm 2 loại, mỗi loại có khối lợng phân tử là 50 và một loại có khối lợng phân

tử là 60.000 Dalton Mỗi loại gồm hai tiểu phần

Nitrogenaza không chỉ xúc tác việc khử N2 thành NH3 mà còn có thểxúc tác việc khử CH3 CN, HCN, NH3,N2 O, C2H2 thành các sản phẩm tơngứng

Phản ứng khử N2 dới sự xúc tác của nitrogenaza có thể biểu thị vắn tắt

nh sau:

Nitrogenaza N2 + 6e + 12ATP + 12 H2O 2NH4++ 12ADP + 12Pi + 4H+

Ngời ta cho rằng quá trình khử này bao gồm nhiều phản ứng kế tiếpnhau và sử dụng năng lợng của ATP

2H+ ATP 2H+.ATP +2H ATP

N2 [NH = NH] [NH2 -NH2] 2NH3Sơ đồ giả thuyết về trung tâm hoạt động của nitrogenaza đợc trình bày

nh sau:

Electron của các chất khử (feredoxin, ditionit)đi vào trung tâm có chứa

Fe của thành phần en zim II(prôtêin -Fe)và tiếp tục chuyển cho thành phần

en zim I(prôtêin -Fe-Mo).Electron đã hoạt hoásẽ đi theo mạch nguyên tử Fe

để đến Mo ở bên trong "hạt” Tại đây Mo sẽ bị khử và nhờ đó có khả năngphẳn ứng nhanh chóng với N2 Phân tử N2 đi qua một khe có kích thớckhoảng 4-5 Ao tức là tơng ứng với chiều dài của phân tử N2 vào bên trongmen và đợc hoạt hoá ở đấy

Kết quả của quá trình Nitrogen hoạt hoá và hấp phụ hoá học Nitơ sẽlàm dứt 2 dây nối trong số dây của phân tử N2 Năng lợng tiêu phí là7,8x105J/mol Dây nối thứ 3 sẽ cắt đứt khi tiếp xúc với hidro đã đợc hoạt hoánhờ các men đehirogenaza và hệ thống hidrogenaza

Sau đó NH3 hoặc các sản phẩm khử khác đợc sinh ra sẽ liên kết vớicác ketoaxit để tạo thành axitamin [2]

Hiệu suất của quá trình cố định đạm ở loại kị khí cao hơn so với loại

hiếu khí Khi sử dụng hết 1g thức ăn cacbon Clostridium pasteurianum

th-ờng chuyển hoá đợc một lợng N2 ít hơn Azotobacter khoảng 4- 7 lần Trong khi đó khi phân giải thức ăn cacbon Clostridium pasteurianum nhận đợc số năng lợng ít hơn Azotobacter đến 45 lần Nh vậy nếu tính theo một đơn vị

năng lợng đã nhân đợc thì loại kị khí cố định đạm đợc nhiều hơn loại hiếukhí tới 6-10 lần [6]

V Sử dụng các vi sinh vật có khả năng cố định Nitơ trong nông nghiệp.

Vi sinh vật cố định nitơ đóng vai trò rất quan trọng trong việc thựchiện vòng tuần hoàn nitơ trong nông nghiệp

Các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do(háo khí và kị khí) có khả nănglàm giàu thêm hàng năm khoảng 15-16kg nitơ cho mỗi ha đất đai(tơng đơngvới 75-300kg đạm sun phát) Các loại tảo lam sống trong ruộng lúa cũng cókhả năng đem lại cho mỗi ha đất mỗi năm khoảng 15-80 kg nitơ Một hectatrồng cây bộ đạu mỗi năm có thể cố định từ 50-600kg nitơ Để tăng khả năng

cố định nitơ của vi khuẩn nốt sần ngời ta đã tiến hành nuôi cấy vi khuẩn nốt

9

sần tạo ra chế phẩm Nitragin để bón vào đất hay tẩm hạt giống các cây thuộc

bộ đậu tơng ứng trớc khi gieo trồng, Nitragin có khả năng làm nâng cao năngsuất cây bộ đậu khoảng 10-15% [2]

Chế phẩm Azotobacter còn gọi làAzotobacterin Đối với các loại đất

có chứa nhiều chất hữu cơ, dễ hấp thụ Azotobacterin có thể làm tăng năng

suất khoảng 6-10% sản lợng cây trồng.Là loại phân có chứa vi sinh vật trựctiếp hút nitơ của không khí chuyển hóa vào đất thông qua vi sinh vật tự dỡngháo khí ,nghĩa là làm thức ăn cho chính vi sinh vật đó sau khi chết để lại chấtdinh dỡng hữu cơ ,đạm dễ tiêu cho đất Vì vậy điều kiện để vi sinh vật nàyhoat động là khá nghiêm ngặt :đất phải chua, lợng lân dễ tiêu,chất hữucơ ,một số nguyên tố vi lợng phải khá dồi dào Kĩ thuật phổ biến vẫn thờngngâm với hạt giống trớc khi gieo Tại Việt Nam cũng đã áp dụng thử phân

Azotobacterin nhng cha có hiệu quả rõ rệt.

Đã có rất nhiều thí nghiệm sử dụng chế phẩm Clostridium

pasteurianum (dịch nuôi cấy hoặc dịch nuôi cấy trộn với đất đã khử trùng) để

bón cho cây trồng Trong một số trờng hợp đã thu đợc những hiệu quả dơng

tính khá rõ rệt(nhất là khi phối hợp với Azotobacterin ) Tuy nhiên hiệu quả

nay thờng không ổn định và cho đến nay ngời ta vẫn cha giải thích đợc mộtcách dứt khoát là trong trờng hợp có tác động dơng tính thì chủ yếu là do sự

cố định nitơ hoặc là do tích luỹ những chất có hoạt tính sinh học cao.[3]

Phần III: Địa điểm, thời gian và phơng pháp

nghiên cứu

I Địa điểm nghiên cứu:

Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trờng Đại học Vinh

II Thời gian nghiên cứu:

3.2 Thu mẫu vi sinh vật

Khi phân lập vi sinh vật từ đất hay tính số lợng vi sinh vật của đất thìviệc lấy mẫu đợc tiến hành nh sau:

Dùng dao vô trùng lấy 1 kg đất ở độ sâu 0-30cm thuộc 5 chỗ khácnhau theo phơng pháp đờng chéo rồi trộn lại với nhau, lấy giấy bóng mờ đãkhử trùng để đựng đất, loại bỏ rễ cây và vật lạ Ghi nhãn, bảo quản và phântích tại phòng thí nghiệm.[10]

3.3 Phơng pháp phân lập vi sinh vật

Vi sinh vật đợc nuôi trong môi trờng Vinograxki gồm:

(NH4)2SO4 2gNaCl 2g

FeSO4 0,1gMgSO4 0,5gCaCO3(MgCo3) 1gNớc :1l

Dùng trang thuỷ tinh phân phối đều huyền phù vi sinh vật lên trên bềmặt thạch Sau đó đặt vào tủ ấm nuôi 30oC trong 3- 5 ngày Khuẩn lạc xuấthiện, theo dõi thờng xuyên Chọn các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái khácnhau đứng riêng rẽ Dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật ở khuẩn lạc vi sinhvật đó cấy lên ống thạch nghiêng, đem nuôi ở nhiệt độ 30-350C

Sau thời gian nuôi cấy cần kiểm tra lại độ thuần chủng của giống visinh vật đã mọc trong từng ống nghiệm ,nếu trong từng ống nghiệm mọc chủyếu là giống vi sinh vật cần tìm nhng có lẫn chút ít loại vi sinh vật khác thì

có thể dùng phơng pháp cấy rải nh sau :

Để thu đợc các khuẩn lạc riêng biệt đem que cấy vô trùng chạm nhẹlên môi trờng thạch nghiêng hoăc môi trờng lỏng ,cấy ríc rắc vuông góclên mặt thạch của hộp petri.Sau đó chọn khuẩn lạc mọc tốt của vi sinh vậtcần tìm đem cấy vào ống nghiệm chứa môi trờng lỏng [7]

3.4 Phơng pháp theo dõi (theo dõi các chỉ tiêu sinh trởng và phát triển)

3.4.1.Thời gian mọc của vi khuẩn

Cân chính xác các thành phần

của môi tr ờng

Hoà tan đun sôi

điều chỉnh pH

Cho vào bình tam giácống nghiệm, petri

Khử trùng ở 1atmthời gian 30 phút

Bảo quản tủ lạnh

Sau khi cấy dịch huyền phù vào môi trờng thạch, theo dõi thờng xuyên

sự xuất hiện của khuẩn lạc cho đến khi không xuất hiện các khuẩn lạc mới Vìmỗi loài có có một tốc độ sinh trởng và phát triển không giống nhau

3.4.2.Theo dõi sự sinh trởng:

Nuôi trong đĩa petri, đo kích thớc () của khuẩn lạc bằng thớc đopalmer trong thời gian 24 giờ hoặc 48 giờ hoặc 72 giờ

Từ đó tốc độ sinh trởng theo Blachman(1981)

Wt-Wo

WoTrong đó: Wo là số đo lần đầu

Wt là số đo lần sau tại thời điểm t

3.4.3.Tìm hiểu các đặc điểm của các khuẩn lạc

Vi sinh vật phát triển trên môi trờng đặc sẽ hình thành các khẩn lạc đặc

trng cho loài đó Vì vậy việc miêu tả các khuẩn lạc là một trong các công việcrất cần thiết đối với công tác định tên loài vi sinh vật nghiên cứu

Tìm hiểu các đặc điểm của khuẩn lạc: Màu sắc, hình dáng, bề mặt, cấutrúc, bờ khuẩn lạc

3.4.4 Thử hoạt tính cố định nitơ của các chủng

Từ các chủng có kết quả (+) ở trên Dùng que cấy lấy một ít chủng đemnuôi trong ống nghiệm chứa 5ml môi trờng Vinograxki lỏng Sau khoảng 3-5ngày đem đo trên máy quang phổ CELCIN của Mỹ:

Tìm ra đợc chủng có có hàm lợng NH+

4 lớn nhất-Pha dung dịch chuẩn NH4Cl 0,001 mg/ml

Cân 0,3820g NH4Cl pha trong 1l ta đợc 0,1mgN/ml

Lấy 50 ml dung dịch này pha trong 500ml ta đợc dung dịch 0,01mgN/ml

3.5 Xác định số lợng vi sinh vật theo phơng pháp forming unit)

13

- Từ mẫu ban đầu sau đó pha loãng theo dãy thập phân

- Cấy vào môi trờng thạch đã vô trùng

- Nuôi ở 30Otrong 3- 5 ngày

- Xác định số lợng khuẩn lạc trên đĩa petri

- Tính số lợng tế bào theo công thức

N A(CFU/g hay CFU/ml) =

n1Vf1+ +niVfiTrong đó: A: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong1g hay 1 ml mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm đợc trên các đĩa đã chọn

(25-250 khuẩn lạc) theo FDA(Food and Drug Asministration )

ni: Số đĩa cấy tại độ pha loãng thứ iV: Thể tích dịch mẫu (ml)cấy vào trong mỗi đĩa

4theo Kjendahl Nessler và Sapiro-1972.[12]

Cân 10 g đất tơi +100ml KCl 0,1N cho voà bình tam giác 250ml dịch lọcvào bình định 25 ml, thêm 1ml dung dịch Seignetle (Tactrat kép K-Na)50%+1ml dung dịch Nessle định lợng trên vạch rồi so màu trên máy Xác địnhnồng độ C bằng cách so sánh với đồ thị nồng độ chuẩn

- Tính kết quả:

CxVxV2 x K

WxV1Trong đó:

V: Số ml dung dịch chiết rút(100ml)

V1: Thể tích đem so màu(5ml)

V2: Thể tích hiện màu(25ml)W: Khối lợng đất cân:10gC:Nồng độ so màu(mg/ml)K: Hệ số khô kiệt

- Thang tiêu chuẩn:

Lấy 10 bình định mức 25 ml lần lợt cho vào các thể tích khác nhau dungdịch NH4Cl 0,01mg/ml tiêu chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14,16,ml

Thêm vào mỗi bình 1ml dung dịch Seignetle +1ml Nessle định mức đếnvạch so màu

Tiến hành so màu nh mẫu nghiên cứu

3.6.2 ảnh hởng pH

Cho mỗi công thức thí nghiệm một ít vi sinh vật nh nhau cùng một môitrờng đã vô trùng, điều chỉnh pH ở các công thức khác nhau (pH=5, pH=6,pH=7, pH=8, pH=9) Sau đó nuôi cùng một nhiệt độ là 300C

Từ đó xác định hàm lợng NH+

4 ở các công thức bằng phơng pháp so màuvới thuốc thử Nessle

3.6.4 ảnh hởng thời gian đến khả năng đồng hoá Nitơ

Qua theo dõi pH,nhiệt độ ,độ ẩm ở các thời gian khác nhau Từ đó rút rathời gian tốt nhất cho sự cố định nitơ

3.7 Phơng pháp xử lý số liệu

Số liệu đợc xử theo phơng pháp toán học thống kê

-Xác định trung bình cộng:

n i

n: Sè lÇn xuÊt hiÖn d·y biÕn sè

Rắc tung phân sau đó tiến hành xới xáo để trộn đều phân vào đất

- Kỹ thuật trỉa lạc: Giống lạc L14, lạc Trung Quốc Với kỹ thuật trồnglạc phủ ni lông ,phun thuốc trừ cỏ

Mỗi mét chia 5 hàng, mỗi hàng cách 20 - 25cm, mỗi khóm(cây)cách 10

5 Năng suất: Bình quân 1,5tạ/sào

II Phân lập vi khuẩn Clostridium

1.Đặc điểm Clostridium.

Giống Clostridium là các vi khuẩn gram dơng, hình que, kị khí, sinh bào

tử phần lớn di động, có thể thuỷ giải sacchoride và prôtêin Trong các hoạt

động thu nhận năng lợng, những loài thuỷ giải sacchoride có thể lên men loại

đờng polisacchoride tạo thành axetic acid, butiric và rợu Nhiều loài có thểthuỷ giải prôtêin và chuyển hoá không hoàn toàn các axit amin tạo thành mùi

rất khó chịu trong sản phẩm Hầu hết giống Clostridium thuộc nhóm a nhiệt

vừa, tuy nhiên có một số loài thuộc nhóm a nhiệt và một số loài khác thuộc

nhóm a lạnh [12].Có nhiều loài Clostridium đã đợc chứng minh là có khả

năng cố định nitơ phân tử Trong đó loài có hoạt tính cố định nitơ cao nhất là

Clostridium pasteurianum Tế bào Clostridium pasteurianum có kích thớc

khoảng 0,7-1,3x2,5-7,5 Chúng có thể đứng riêng, xếp thành đôi hay chuỗingắn Khi còn non chúng có chu mao và có khả năng di động, tế bào có cấu tạo

đồng nhất Khi già tế bào có cấu tạo lổn nhổn(chứa các hạt dữ trữ loại tinhbột) Tế bào mất khả năng di động Bào tử có kích thứơc 1,3x1,6, thờng cóhình bầu dục hay hình kéo dài nằm ở giữa hoặc một đầu của tế bào Bào tử có

17