Báo cáo tiểu luận các phương pháp phân tích trong quá trình điều chế Glucosamin từ vỏ tôm

Glucosamine là một aminomonosaccharide, có trọng lượng phân tử 179,17, đó là một thành phần của gần như tất cả các mô của con người, bao gồm cả cartilage. Là thành phần chủ yếu của liên kết O và liên kết N glycosaminoglycans (GAGs), tạo thành mạng lưới của tất cả các mô liên kết. Glucosamine được sản xuất trong cơ thể bằng việc bổ sung các nhóm amin vào glucose; phân tử này sau đó được acetyl hóa tạo acetyl glucosamine. Hyaluronan, keratin sulfate và heparan sulfate được cấu tạo từ một phần của các đơn vị thuộc acetyl glucosamine lặp đi lặp lại. Trong keratan sulfate và heparin sulfate, sulfat được thêm vào ở các vị trí 4 hoặc 6 của glucosamine. Glucosamine là chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi, điểm nóng chảy 88oC, điểm phân hủy 110oC, tan được trong nước và trong methanol sôi, hơi tan trong methanol hoặc ethanol, không tan trong ether và chloroform. Khi thủy phân chitin trong môi trường axit HCl đậm đặc, các mối nối amid và osid đều bị phá hủy do đó thu được glucosamine. Yếu tố nồng độ acid và nhiệt độ thủy phân rất quan trọng, nếu nồng độ của acid không thích hợp thì quá trình deacetyl hóa và deosid chỉ dừng lại giới hạn nhất định, nếu nhiệt độ không thích hợp thì sản phẩm cuối cùng là glucosamine có thể bị giáng hóa thành những phân tử đơn giản hơn. Một số phản ứng của glucosamine: -Phản ứng tráng bạc -Phản ứng với Cu(OH)2: sản phẩm có màu xanh -Phản ứng với C6H5CH=O: Phản ứng nhận biết sự có mặt của NH2. Sản phẩm dạng keo sánh màu nâu.

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA LÝ TRONG

NGHIÊN CỨU THỰC PHẨM ĐIỀU CHẾ GLUCOSAMIN TỪ VỎ TÔM

Giảng viên hướng dẫn : TS Phan Ngọc Hòa

TP HCM, tháng 4 năm 2016

Trước hết nhóm xin cảm ơn giáo viên hướng dẫn TS Phan Ngọc Hòa đã

hỗ trợ cho nhóm trong suốt quá trình học tập và báo cáo

Trong quá trình tìm hiểu để hoàn thành bài tiểu luận, nhóm không tránhkhỏi những sai sót, kính mong cô thông cảm và hướng dẫn, nhóm xin chân thànhcảm ơn

Cuối cùng, nhóm xin kính gởi lời chúc đến Ban giám hiệu, Ban lãnh đạokhoa Kỹ thuật Hóa học cùng quý thầy cô nhiều sức khỏe và luôn thành côngtrong công việc

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 2

1.1 N-acetyl-glucosamine 2

1.2 Nguyên liệu 3

1.2.1 Vỏ tôm 3

1.2.2 Chitin 5

1.3 Nội dung nghiên cứu 6

1.3.1 Quá trình xử lý khoáng 7

1.3.2 Quá trình xử lý protein 7

1.3.3 Tẩy màu 8

1.3.4 Thủy phân 8

1.3.5 Kết tinh 8

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 9

2.1 Xác định ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi (TCVN 3700-90) 9

2.2 Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp nung (TCVN 5105:2009) 11

2.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Microbiuret 14

2.4 Xác định hàm lượng glucosamine (hoạt độ enzyme chitinase) theo phương pháp Elson – Morgan 20

2.5 Xác định độ tinh sạch theo phương pháp sắc ký HPLC 23

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

LỜI MỞ ĐẦU

Là một trong những ngành thủy sản đã đóng góp một phần không nhỏ vào nềnkinh tế quốc dân của nước ta Tôm là mặt hàng có giá trị quan trọng, trong quá trìnhgia công chế biến thì lượng phế liệu trong tôm thải ra tương đối lớn chiếm khoảng 34– 45% tổng khối lượng tôm nguyên liệu và lượng phế liệu của tôm không được thugom xử lý sẽ ảnh hưởng đến môi trường và gây lãng phí

Khi tiến hành thủy phân chitin đến monomer sẽ thu, được D-glucosamine.Glucosamine là chất có nhiều ứng dụng tron gy học Nó dống vai trò sinh lý, sinh hóatrong cơ thể người, tham gia vào chức năng giải dộc của gan và thận, chống viêm gan,chống dị ứng và chống thiếu oxy trong máu Glucosamine là nguyên liệu chủ yếu dểtổng hợp chất nhờn và sụn các khớp của cơ thể khi các khớp bị tổn thương, nó lànguyên liệu để cơ thể sản xuất các chất cần thiết như collagen, proteoglycan vàglucosaminoglycan để hồi phụ sụn khớp và tái cung cấp chất nhờn giúp các khớp linhđộng trở lại Ngoài ra, glucosamine còn có tác dụng chống ung thư, chữa tổn thươngđường ruột và dạ dày

Ở người già, chức năng cũng như cấu tạo của khớp có nhiều thay đổi, các tế bàocủa khớp thoái hóa, trở nên kém ling động Gân và dây chằng phận đoạn, đóng vôi,khô cằn, trở nên kém bền bỉ, kém co dãn, không chịu được căng lực và dễ bị tổngthương Sụn trở nên đục màu, xơ hóa, gai xương, hô nước, rạn nứt với nhiều tính thểcanxi làm khớp đau Khớp co duỗi khó khăn vì màng hoạt dịch mỏng và khô dần,nhứng nghiên cứu với nhiều thử ghiệm lâm sàng đã chứng minh tác dụng điều trị bệnhthoái hóa khớp của glucosamine, nhất là dạng phối hợp với dược liệu thiên nhiên

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

1.1 N-acetyl-glucosamine

Tên gọi khoa học: 2-Acetoamido-2-deoxy-D-glucopyranose; glucosamine; N-acetyl-β-D-glucosamineide; N-acetylchitosamine

N-acetyl-D-(+)-Công thức phân tử: C8H15O6N

Công thức cấu tạo:

Phân tử lượng: Macetylglucosamine = 221.21

Điểm nóng chảy: 201 – 210oC

Tan được trong nước: 0.1g/ml

Glucosamine là một aminomonosaccharide, có trọng lượng phân tử 179,17, đó làmột thành phần của gần như tất cả các mô của con người, bao gồm cả cartilage Làthành phần chủ yếu của liên kết O và liên kết N glycosaminoglycans (GAGs), tạothành mạng lưới của tất cả các mô liên kết Glucosamine được sản xuất trong cơ thểbằng việc bổ sung các nhóm amin vào glucose; phân tử này sau đó được acetyl hóatạo acetyl glucosamine Hyaluronan, keratin sulfate và heparan sulfate được cấu tạo từmột phần của các đơn vị thuộc acetyl glucosamine lặp đi lặp lại Trong keratan sulfate

và heparin sulfate, sulfat được thêm vào ở các vị trí 4 hoặc 6 của glucosamine

Glucosamine là chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi, điểm nóng chảy

88oC, điểm phân hủy 110oC, tan được trong nước và trong methanol sôi, hơi tan trongmethanol hoặc ethanol, không tan trong ether và chloroform

Khi thủy phân chitin trong môi trường axit HCl đậm đặc, các mối nối amid vàosid đều bị phá hủy do đó thu được glucosamine Yếu tố nồng độ acid và nhiệt độ

thủy phân rất quan trọng, nếu nồng độ của acid không thích hợp thì quá trình deacetylhóa và deosid chỉ dừng lại giới hạn nhất định, nếu nhiệt độ không thích hợp thì sảnphẩm cuối cùng là glucosamine có thể bị giáng hóa thành những phân tử đơn giảnhơn.

Một số phản ứng của glucosamine:

- Phản ứng tráng bạc

- Phản ứng với Cu(OH)2: sản phẩm có màu xanh

- Phản ứng với C6H5CH=O: Phản ứng nhận biết sự có mặt của NH2 Sản phẩmdạng keo sánh màu nâu

Lớp màu: tính chất của lớp này do sự có mặt của những thể hình hạt của vật chấtmang màu giống dạng melanin Chúng gồm những túi khí hoặc không bào Một vàivùng xuất hiện những rãnh thẳng đứng có phân nhánh, là con đường cho canxi thẩmthấu vào

Lớp canxi hóa: lớp này chiếm phần lớn vỏ, thường có màu xanh trải đều khắp,chitin ở trạng thái tạo phức với canxi

Lớp không bị canxi hóa: vùng trong cùng của lớp vỏ được tạo thành bởi mộtphần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin-protein bền vữngkhông có canxi và quinine

Bảng 1 Thành phần hoá học của vỏ tôm thẻ chân trắng (theo Phạm Thị Đan Phượng

và Trang Sĩ Trung, năm 2012)

*Tính trên khối lượng khô tuyệt đối, độ ẩm vỏ tôm là 76 ± 1.8%

Về thành phần hóa học của vỏ tôm:

- Protein trong phế liệu tôm thường tồn tại ở 2 dạng Dạng tự do tồn tại ở phầnthịt tôm từ một số tôm bị biến đổi và vứt lẫn vào phế liệu hoặc phần đầu và thịt cònsót lại trong đầu và nội tạng của tôm Dạng phức tạp: ở dạng này protein không hòatan và thường liên kết với chitin, canxi cacbonat, với lipid tạo thành lipoprotein, vớisắc tố tạo thành proteincarotenoit… như một phần thống nhất quyết định tính bềnvững của vỏ tôm

- Chitin: tồn tại dưới dạng liên kết với những liên kết đồng hóa trị với các proteindưới dạng phức hợp chitin-protein, liên kết với các hợp chất khoáng và các hợp chấthữu cơ khác gây khó khăn trong việc tách chiết chúng

- Khoáng: chủ yếu là muối canxi cacbonat, hàm lượng canxi phosphat khôngnhiều nhưng trong quá trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tantrong HCl gây khó khăn cho quá trình khử khoáng

- Sắc tố trong vỏ tôm chủ yếu là astaxanthin Astaxanthin liên kết với các phân

tử protein tạo thành phức carotenoprotein hấp thụ ánh sáng λmax = 628nm, tạo nênmax = 628nm, tạo nênmàu xanh đặc trưng Dưới tác dụng của nhiệt, liên kết này bị phá hủy và giải phóngastaxanthin trở lại dạng tự do hấp thu mạnh bức xạ trong vùng λmax = 628nm, tạo nên = 470÷510nm cómàu đỏ cam

- Enzyme nội tạng trong đầu tôm, mai ghẹ và của các vi sinh vật thường trú trên

vỏ tôm nguyên liệu

Ngoài ra, trong phế liệu còn có các thành phần khác như: nước, lipid

1.2.2 Chitin

Chitin là polime hữu cơ phổ biến trong tự nhiên sau cellulose, được tách chiếtlần đầu tiên vào năm 1811 bởi nhà dược hóa học người Pháp Henri Braconnot từ nấm(Braconnot, 1811)

Trong tự nhiên chitin được tồn tại trong nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau baogồm vỏ các loài giáp xác, côn trùng và vi sinh vật Trong các loài giáp xác như tôm,cua, ghẹ,… loài chân đầu như mực,… và vỏ tôm hùm có hàm lượng chitin cao chiếm60-75% Từ côn trùng thì có ở vỏ các loài như muỗi, gián, ong mật, nhộng tằm,…Chitin cũng tồn tại phổ biến trong giới vi sinh vật như: vi nấm, nấm mốc, nấm men,một số loài tảo và một số loài xạ khuẩn Streptomyces Nhưng nguồn khai thác chính

là từ phế liệu thủy sản, vỏ của các loài giáp xác đặc biệt là từ tôm và cua

Công thức phân tử là (C8H13O5N)n Trong đó: n thay đổi tùy thuộc vào loạinguyên liệu (ntôm thẻ = 400÷500, ntôm hùm = 700÷800, ncua = 500÷600)

Chitin là poly (β-(1→4)- N-acetyl-D-glucosamin), một polisaccarit mạch thẳngkhông phân nhánh, được cấu tạo bởi các monosaccharit N-acetyl-β-D-glucosamin liênkết với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside, tạo nên một mạng lưới các sợi có tổ chức,

có cấu trúc tương tự như cellulose, ở carbon C-2 cellulose chứa nhóm hydroxyl(–OH) còn chitin thì chứa nhóm acetyl (–COCH3)

Hình 1 Cấu trúc hóa học của chitin

Trong các loài giáp xác, chitin là thành phần cấu tạo chính tạo nên độ cứng chắccủa vỏ tôm, chitin ít khi ở dạng tự do mà luôn kết hợp với protein dưới dạng phứchợp, cacbonat canxi và nhiều hợp chất hữu cơ khác

Dựa vào nguồn tách chiết chitin người ta chia thành 3 dạng: α-chitin, β-chitin vàγ-chitin

- α-chitin là phổ biến nhất, được tìm thấy trong nấm và thành tế bào nấm men,nhuyễn thể, gân và vỏ tôm hùm, cua, trong vỏ tôm và trong lớp biểu bì của côn trùng,

có độ rắn phân tử cao nhất và ở dạng rắn chắc và các mạch chitin sắp xếp song songnhưng ngược chiều nhau

- β-chitin hiếm gặp hơn, thường có trong mực, bao gồm các mạch chitin songsong cùng chiều nhau, có độ rắn thấp, tính hydrat hóa cao

- γ-chitin là biến thể của α-chitin, sắp xếp cứ 2 mạch song song cùng chiều thì

có một mạch ngược chiều

1.3 Nội dung nghiên cứu

Hình 2: Quy trình sản xuất glucosamin

Quá trình sản xuất glucosamine gồm các công đoạn chính: xử lý khoáng, xử lýprotein và tẩy màu, sau đó thủy phân chitin, kết tinh tạo thành glucosamine Do vậy,nguyên tắc chung của quá trình sản xuất glucosamine là phải sử dụng các biện phápcông nghệ để khử bỏ các tạp chất phi chitin (protein, khoáng, lipit) và thủy phân chitinthu glucosamine

Kết tinh

1.3.1 Quá trình xử lý khoáng

Đối với phế liệu vỏ tôm, hàm lượng khoáng tương đối cao (chủ yếu là muối calcicacbonate và một ít calci phosphate) nên thực hiện công đoạn xử lý khoáng đầu tiên,công đoạn này cũng góp phần loại bỏ 1 phần protetin bám dính trên vỏ giáp xác giúpgiảm bớt gánh nặng cho công đoạn xử lý protein

Có thể xử lý khoáng bằng các hóa chất sau: acid vô cơ (HCl, HNO3, H2SO4,…)hay acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic,…) Hiện nay thường sử dụng dung dịch HClloãng ở nhiệt độ phòng để xử lý khoáng Phản ứng hóa học của quá trình xử lý khoángnhư sau:

2 H+ + CaCO3 → Ca2+ + CO2 ↑ + H2O

Hàm lượng khoáng giảm đến 90% ở thời gian đầu của quá trình xử lý khoáng(trong vòng 30 phút), sau đó quá trình diễn ra rất chậm Các yếu tố ảnh hưởng đến quátrình xử lý khoáng là nhiệt độ, nồng độ, thời gian và tỷ lệ nguyên liệu/acid

Sản phẩm chitin đạt chất lượng cao khi hàm lượng khoáng còn lại dưới 1%

1.3.2 Quá trình xử lý protein

Protein liên kết với chitin trong vỏ tôm thành từng lớp xen kẽ, ngoài ra proteincòn liên kết với CaCO3 tạo nên tính bền vững của vỏ Các hóa chất có thể được sửdụng để xử lý protein từ nguyên liệu như: NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3,Ca(OH)2,… Ngoài ra có thể sử dụng chế phẩm enzyme protease hay enzyme: từ visinh vật sinh (Bacillus subtilis, Flavourzyme (Novozymes, Đan Mạch) chiết xuất từAspergillus oryzae, Lactobacillus plantarum), bromelin trong dịch ép vỏ dứa, papaintrong quả đu đủ,

Hiện nay NaOH được sử dụng phổ biến nhất Trong môi trường kiềm, protein bịthủy phân tạo ra acid amin và peptide hòa tan, theo phương trình phản ứng sau:

Yêu cầu chất lượng của chitin công nghiệp thì hàm lượng protein còn lại trong sảnphẩm chitin phải nhỏ hơn 1%.

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

- Xác định ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi

- Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp nung

- Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Microbiuret

- Xác định hàm lượng glucosamine (/hoạt độ enzyme chitinase) theo phương

pháp Elson – Morgan

- Xác định độ tinh sạch theo phương pháp sắc ký HPLC

2.1 Xác định ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi (TCVN 90)

3700- Nguyên lí

Dùng nhiệt để loại bỏ nước khỏi mẫu thử Hiệu số khối lượng của mẫu thử trước

và sau khi sấy khô là lượng nước có trong mẫu thử

 Đối tượng áp dụng của phương pháp

Xác định hàm lượng nước đối với các nguyên liệu, bán thành phẩm và sản phẩmthủy sản

ở 60-80oC (60oC) trong 2 giờ, sau đó nâng nhiệt độ lên 100-150oC (105oC) và giữ ởnhiệt độ đó trong 3 giờ

Sau khi sấy 5 giờ, cho vào bình hút ẩm, để nguội 30 phút, đem cân Lại sấy tiếp

30 phút nữa, để nguội và đem cân như trên Tiến hành sấy và cân cho đến khi khốilượng giữa hai lần cân liên tiếp chênh lệch nhau không quá 0.001g (G1)

 Thiết bị

+ Cấu tạo:

Hình 3: Cấu tạo của tủ sấy

1, 2 Lọc khí sơ, thứ cấp 6 Bộ phận điều khiển

3 Lọc khí chịu nhiệt 7 Lọc khí cao cấp

4 Lọc khí trung cao cấp 8 Khay chứa

+ Nguyên lý hoạt động

Khí sạch đi qua các bộ phận lọc khí vào buồng sấy, trước khi qua bộ phận lọccuối cùng khí được gia nhiệt qua bộ phận trao đổi nhiệt đạt nhiệt độ sấy và vào buồngsấy có khay dạng lưới mịn chiều từ dưới lên tách đi hàm ẩm Khí nóng mang hàm ẩm

ra ngoài nhờ quạt hút và qua bộ lọc chịu nhiệt tránh gây ô nhiễm môi trường Mộtphần khí nóng tuần hoàn lại để tiết kiệm năng lượng

Khi đạt nhiệt độ sấy, role ngắt điện, giảm – 2oC role lại cấp điện cho bộ phậntrao đổi nhiệt Thời gian và nhiệt độ sấy được cài đặt bằng bộ phận điều khiển

+ Ứng dụng

Thích hợp cho việc gia nhiệt cứng hoá, sấy, tách nước Sử dụng cho các sảnphẩm trong các ngành sản xuất: Dược phẩm, thực phẩm, nông phụ phẩm, thuỷ sản,công nghiệp nhẹ, công nghiệp nặng Đặc biệt ứng dụng rất rộng rãi cho các loạinguyên liệu dược, dược liệu chưa bào chế, đông dược cắt lát, cao, thuốc bột, thuốcdạng hạt, viên sủi, chai đóng gói, phẩm màu thuốc nhuộm, rau xanh cần tách nước,hoa quả khô, lạp xưởng

+ Ưu nhược điểm

Đại bộ phận gió nóng tuần hoàn trong tủ, hiệu xuất nhiệt cao, tiết kiệm nănglượng Lợi dụng tác dụng thông gió cưỡng chế, trong tủ có bộ phận bản chia gió có thểđiều chỉnh, vật liệu sấy khô đều, nguồn nhiệt có thể sử dụng hơi, nước nóng, điện, tiahồng ngoại, phạm vi lựa chọn rộng Hoạt động ổn định, tự điều khiển nhiệt độ, thờigian, lắp đặt và bảo dưỡng thuận tiện Phạm vi sử dụng rộng rãi, có thể sấy khô nhiềuloại vật liệu, là thiết bị sấy thông dụng

Máy có tiếng ồn thấp, hiệu quả truyền nhiệt khoảng 50 – 70% với thể tích nhỏ,thời gian sấy chậm

 Tính kết quả

% Hàm lượng ẩm (ω) tính bằng phần trăm theo công thức:) tính bằng phần trăm theo công thức:

ω) tính bằng phần trăm theo công thức: = 100 -

 Đối tượng áp dụng của phương pháp

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng tro tổng số và trokhông tan trong nước trong nguyên liệu, bán thành phẩm và sản phẩm thuỷ sản Xácđịnh hàm lượng tro với các nguyên liệu, bán thành phẩm và sản phẩm thủy sản

Chén nung được nung ở nhiệt độ 550oC trong (đến khối lượng không đổi), sau

đó để trong bình hút ẩm để làm nguội Cân xác định khối lượng của chén nung là G Cân 10-15g mẫu thử (10g), chính xác đến 0.001g, cho vào chén nung đãbiết trước khối lượng Mẫu thử được đốt từ từ trên bếp điện có lót lưới amiăng chođến khi cháy hoàn toàn thành than đen (khi đốt không được để mẫu thử cháy thànhngọn lửa) Cho chén chứa mẫu thử vào lò nung, nâng nhiệt độ từ từ đến khoảng

từ 500-550oC (550oC) và giữ ở nhiệt độ đó trong khoảng 6-7 giờ đến khi mẫu thửthành tro trắng Nếu sau thời gian trên, tro vẫn còn đen thì lấy chén nung ra, để nguộirồi cho thêm vài giọt hydro peroxit 10 thể tích hoặc axit nitric đậm đặc rồi tiếp tụcnung mẫu đến khi thành tro trắng

Tắt điện lò nung, chờ cho nhiệt độ hạ bớt thì lấy chén tro ra, cho vào bình hút ẩm

30 phút rồi cân, chính xác đến 0.001g Tiếp tục nung ở nhiệt độ như trên trong 30phút, để nguội và cân Tiến hành nung và cân cho đến khi thu được khối lượng khôngđổi (G1)

 Thiết bị

+ Cấu tạo

Hình 4: Cấu tạo lò nung

Dây đốt (dây điện trở) Bộ điều khiển

Vỏ lò: Các tấm thép được cắt theo hình thích hợp, dạng chữ nhật hoặc tròn

Lớp lót có tác dụng chịu và cách nhiệt:

 Phần vật liệu chịu lửa: Gạch tiêu chuẩn/hình

 Phần cách nhiệt: Giữa vỏ lò và vật liệu chịu lửa, gạch cách nhiệt/bột cách nhiệt (xi bông, amiăng)

Dây đốt: Dạng zíc zắc, xoắn , có thể bố trí ở phía đáy hoặc đỉnh

+ Nguyên lý hoạt động

Đổi điện năng thành nhiệt năng thông qua dây đốt/vật dẫn

Khi dây đốt được nung nóng, nó sẽ truyền nhiệt cho vật nung bằng bức xạ, đốilưu, dẫn nhiệt hoặc phức hợp

+ Ứng dụng

Dùng để nấu luyện các hợp kim, kim loại; sấy và chuẩn bị vật phẩm…

+ Ưu nhược điểm

Tạo nhiệt độ cao, kín

Dễ điều chỉnh thời gian, nhiệt độ

G: khối lượng của chén nung, tính bằng gam (g)

G1: khối lượng của chén nung và tro tổng số, tính bằng gam (g)

m: khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g)

2.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Microbiuret

Dung dịch 1: Hòa tan 173 g natri citrat và 100 g natri carbonat trong 500 mlnước cất nóng

Dung dịch 2: Hòa tan 17.3 g đồng sunfat trong 100 ml nước cất

Trộn dung dịch 1 và dung dịch 2 sau đó làm đầy đến 1000 ml bằng nước cất.Dung dịch thuốc thử được giữ trong chai màu

 Xây dựng đường chuẩn

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

Lắc, ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút sau đó đo OD ở bước sóng 330nm

Từ các số liệu thu được, lập phương trình đường chuẩn để từ đó tích toán hàmlượng protein trong mẫu

 Phương pháp chiết mẫu

Cân 1g mẫu, thêm 10ml NaOH 3%, sau đó ủ ở 80oC trong 8 giờ Sau khi ủ, tiếnhành lọc khối ủ (sử dụng 10-15ml NaOH 3% để rữa mẫu); định mức dịch lọc đến mộtthể tích nhất định (V)

Dịch lọc được mang đi ly tâm với tốc độ 5.000 vòng trong 15 phút

Sử dụng 4ml dịch sau ly tâm sau đó thêm 200µl dung dịch thuốc thửmicrobiuret, ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng và do màu ở bước sóng 330nm

Từ giá trị OD thu được, thay vào phương trình đường chuẩn để suy ra hàm lượngprotein trong mẫu.

 Thiết bị

Máy ly tâm

+ Cấu tạo

Hình 5: Cấu tạo máy ly tâm

Động cơ (màu nâu) Ống lồng (chứa ống ly tâm)

Dùng trong phòng thí nghiệm nuôi cấy mô; li tâm mẫu máu, mẫu thực phẩm; phân tầng các lớp chất lỏng…

+ Ưu nhược điểm