Xác định đồng thời một số kháng sinh quinolon trong tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở các nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước đã được công bố, với mục đích gia tăng số lượng chất xác định, sử dụng thiết bị sắc ký lỏng hiệu nă

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐÀO THỊ VÂN KHÁNH

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON

TRONG TÔM VÀ NƯỚC NUÔI TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC

KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH

MÃ SỐ: 60440118

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS LÊ THỊ HỒNG HẢO

HÀ NỘI, 2015

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian nghiên cứu và học tập tôi đã hoàn thành luận văn cao học

của mình với đề tài: “Xác định đồng thời một số kháng sinh quinolone trong tôm và

nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” dưới sự

hướng dẫn chỉ bảo của PGS TS Lê Thị Hồng Hảo và các thầy cô, anh chị, các bạn

trong bộ môn Hóa phân tích

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS

Lê Thị Hồng Hảo người đã giao đề tài và tận tình chỉ dẫn tôi trong quá trình hoàn

thành luận văn Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Kazuo

HARADA khoa Dược Trường ĐH OSAKA Nhật Bản

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Bộ môn hóa phân

tích, các ban học viên lớp cao học K24 đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong thời gian

thực hiện đề tài

Đồng thời tôi cũng xin được cảm ơn tới Ban Giám đốc Viện Pasteur Nha

Trang, Giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm khu vực

miền Trung cùng các bạn đồng nghiệp Xin được cám ơn lãnh đạo và nhân viên chi

Cục Nuôi trồng và Bảo vệ nguồn lợi thủy sản Khánh Hòa đã giúp tôi thực hiện việc

thu thập mẫu thực hiện đề tài

Trong quá trình thực hiện khóa luận, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết sức nhưng

không tránh khỏi những thiếu sót kính mong ý kiến chỉ bảo, phê bình của quí thầy cô

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2015

Học viên

Đào Thị Vân Khánh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU - 1

Chương I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU - 3

1 1 Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon - 3

1.1.1 Cấu tạo của kháng sinh nhóm quinolon - 3

1.1.2 Cơ chế tác dụng và độc tính - 5

1.2 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon - 6

1.2.1 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước - 6

1.2.2 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trên thế giới - 8

1.3 Các phương pháp xác định hàm lượng các chất nhóm quinolon - 10

1.3.1 Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) - 10

1.3.2 Phương pháp vi sinh vật - 11

1.3.3 Phương pháp hóa lý - 13

2.1 Mục tiêu nghiên cứu - 21

2.2 Đối tượng và nội dung nghiên cứu - 22

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu - 22

2.2.2 Nội dung nghiên cứu - 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu - 21

2.3.1 Khảo sát quy trình tối ưu phân tích đồng thời 7 quinolon - 21

2.3.2 Phương pháp lấy mẫu - 23

2.3.3 Xử lý số liệu - 23

2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu - 23

2.4.1 Thiết bị và dụng cụ - 23

2.4.2 Hóa chất, chất chuẩn - 24

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 25

3.1 Tối ưu các điều kiện trên thiết bị HPLC - 25

3.1.1 Khảo sát bước sóng kích thích và phát xạ của các chất - 27

3.1.2 Khảo sát pha động - 29

3.1.3 Khảo sát khoảng tuyến tính của các chất chuẩn - 36

3.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu phân tích - 36

3.2.1 Giai đoạn làm sạch mẫu sử dụng cột chiết pha rắn (SPE) - 36

3.2.2 Khảo sát giai đoạn chiết mẫu - 42

3.3 Thẩm định phương pháp - 45

3.3.1 Độ đặc hiệu - 46

3.3.2 Giới hạn phát hiện(LOD), giới hạn định lượng (LOQ) - 48

3.3.3 Độ lặp lại, độ thu hồi - 50

3.4 Kết quả phân tích đánh giá dư lượng kháng sinh - 52

3.4.1 Thu thập mẫu tôm nuôi và nước nuôi tôm - 52

3.4.2 Kết quả phân tích mẫu - 53

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN - 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO - 57

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo và pKa của các chất 4

Bảng 1.2: Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon theo EEC No.2377/1990 6

Bảng 1.3: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Thông tư 08/VBHN-BNNPTNT 6

Bảng 1.4: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT 6

Bảng 1.5: Lượng kháng sinh tiêu thụ và sản phẩm thịt phát hiện có chứa kháng sinh quinolon 9

Bảng 3.6: Bước sóng kích thích và phát xạ 07 chất phân tích 29

Bảng 3.7: Chương trình gradient dung môi pha động tối ưu 36

Bảng 3.8: Phương trình hồi qui và hệ số tương quan của các chất phân tích 37

Bảng 3.9 : So sánh diện tích píc dung dịch chuẩn bay hơi và không bay hơi 39

Bảng 3.10: So sánh độ thu hồi giữa cột SPE C18 và cột HLB 40

Bảng 3.11: Độ thu hồi theo thể tích mẫu nước ban đầu 43

Bảng 3.12: Kết quả xác định giới hạn phát hiện đối với nền mẫu nước 51

Hình 3.13: Sơ đồ chiết mẫu dự kiến 52

Bảng 3.14 : Độ thu hồi, độ lặp lại của mẫu nước thêm chuẩn 53

Bảng 3.15: Độ thu hồi, độ lặp lại của mẫu tôm thêm chuẩn 54

Bảng 3.16: Danh sách mẫu nước phát hiện chứa tồn dư kháng sinh 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của quinolon 3

Hình 1.2: Cân bằng acid - base của nhóm acidic quinolon 3

Hình 1.3: Cân bằng acid base của nhóm piperazinyl quinolon 4

Hình 2.4: Sơ đồ quy trình xác định quinolon trong nước và trong tôm 23

Hình 3.5: Phổ hấp thu và phát xạ của 07 chất phân tích 28

Hình 3.6: Kết quả khảo sát với 3 hệ dung môi 30

Hình 3.7: Sắc ký đồ OA và FMQ tại tốc độ dòng: 1,0; 1,5; 2,0mL/phút 32

Hình 3.8: Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký theo pH của dung dịch đệm pha động 33

Hình 3.9: Sắc ký đồ 07 chất phân tích ở 3 nồng độ đệm 34

Hình 3.10: Sắc ký đồ tách 07 chất nhóm quinolon 35

Hình 3.11: So sánh diện tích pic các chất khi dùng các dung dịch rửa cột SPE 41

Hình 3.12: Độ thu hồi theo thể tích rửa giải 42

Hình 3.13: Sơ đồ chiết mẫu dự kiến 44

Hình 3.14: Sắc ký đồ nền mẫu trắng chiết bằng 3 loại dung môi 45

Hình 3.15: Biểu đồ so sánh 3 dung dịch chiết 45

Hình 3.16: Khảo sát pH của dung dịch chiết 46

Hình 3.17: Mẫu trắng nước nuôi tôm và nước nuôi tôm thêm chuẩn 49

Hình 3.18: Nền mẫu tôm thêm chuẩn và mẫu tôm 49

Hình 3.19: Sắc ký đồ mẫu nước xác định LOD 51

Hình 3.20: Sắc ký đồ mẫu tôm xác định LOD 52

Hình 3.21: Sắc ký đồ mẫu tôm có phát hiện nhiễm ERFX 56

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội các nhà phân tích hóa học (Association of Official

Analytical Chemists) ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm

CPFX Ciprofloxacin

DFLX Difloxacin

DNFX Danofloxacin

DAD Diot Array Detector

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA Phương pháp miễn dịch enzym (enzyme-linked immunosorbent

assay) ERFX Enrofloxacin

HLB Hydrophilic Lipophilic Balanced (cột cân bằng ưa nước ưa dầu) FMQ Flumequine

FDA Hiệp hội thuốc và thực phẩm (Food and Drug Administration)

FLD Deetecor huỳnh quang (Fluorescence detector)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-pressure liquid chromatography) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitaion)

MPC Chiết cation hỗn hợp (Mixed-phase cation)

NRFX Norfloxacin

MRL Mức dư lượng tối đa (Maximum Residue Levels)

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SPE Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)

QuEChERS Đơn giản, Dễ dàng, Rẻ, Hiệu quả, Ổn định, An toàn (Quick, Easy,

Cheap, Effective, Rugged and Safe)

RT Thời gian lưu (Retention Time)

UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

(Ultra performance liquid chromatography) WHO Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organisation)

Ex Bước sóng kích thích (ExcitationWavelenght)

Em Bước sóng phát xạ (EmissionWavelenght)

MỞ ĐẦU

Vệ sinh an toàn thực phẩm luôn là vấn đề được quan tâm của toàn xã hội, của mọi quốc gia trên toàn thế giới Thực phẩm không đảm bảo vệ sinh không những ảnh hưởng đến sức khỏe con người mà còn liên quan chặt chẽ đến năng suất lao động, hiệu quả phát triển kinh tế, thương mại, du lịch và an sinh xã hội

Trong những năm gần đây sự xuất hiện dư lượng kháng sinh trong thủy hải sản và thịt gia súc, gia cầm đã ít nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân Tác hại của thực phẩm có tồn dư kháng sinh đối với sức khỏe con người đã được nhiều nghiên cứu chỉ ra như: tạo ra vi khuẩn kháng kháng sinh, gây dị ứng, gây quái thai, gây rối loạn nội tiết và gây ung thư ở người Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam nằm trong danh sách các nước có có tỷ lệ sử dụng kháng sinh cao nhất thế giới hiện nay, không chỉ sử dụng cho con người, các chất kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong ngành chăn nuôi Quinolon (hay còn được gọi

là fluoroquinolone) là một họ kháng sinh có phổ tác dụng diệt khuẩn rộng, hiệu quả cao nên chúng được sử dụng rộng rãi không chỉ để chữa bệnh cho người mà còn được dùng để chữa bệnh cho gia cầm và thủy sản trong công nghiệp Hậu quả là giảm hiệu quả của các kháng sinh quinolon đối với các chủng vi khuẩn gây khó khăn và tốn kém trong điều trị cho người bệnh Theo thông báo của WHO năm

1999 có tới 11.000 người bị nhiễm khuẩn Campylobacter đã kháng quinolon do ăn

thịt gà có chứa quinolon (năm 1998 là 8.000 người)

Có nhiều phương pháp để xác định tồn dư kháng sinh nhóm quinolon như: phương pháp miễn dịch enzym (ELISA); phương pháp vi sinh vật (test vi sinh vật), phương pháp lý hóa Phương pháp lý hóa sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau như sắc

ký lỏng, điện hóa hòa tan, điện di mao quản, các phương pháp đều có độ chính xác,

độ chọn lọc cao, phát hiện được một lượng nhỏ kháng sinh tồn dư trong thực phẩm Phương pháp được sử dụng nhiều nhất là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng các loại detector như detector UV, detector huỳnh quang (FLD) và detector khối phổ (MS)

Việc ứng dụng phương pháp HPLC phân tích nhóm quinlon trong các mẫu

môi trường và thực phẩm đã được làm nhiều trên thế giới nhưng ở Việt Nam sử dụng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang vẫn còn hạn chế đặc biệt là tách đồng thời nhiều chất với Việt Nam hiện nay chưa có quy trình chính thống nào.

Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở các nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước đã được công bố, với mục đích gia tăng số lượng chất xác định, sử dụng thiết

bị sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Xác định đồng thời một số kháng sinh nhóm quinolon trong tôm và nước

nuôi tôm bằng phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao”

Chương I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1 1 Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon

1.1.1 Cấu tạo của kháng sinh nhóm quinolon

Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolon là hợp chất vòng thơm có chứa nitơ, vị trí thứ 4 có gắn nhóm keton, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic Các dẫn xuất của quinolon gồm những hợp chất ở các vị trí 1, 2, 6, 8 được gắn thêm các nhóm thế Vị trí 1: có thể gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị trí 6: có thể gắn thêm

F; Vị trí 2, 6, 8 có thể gắn thêm một nguyên tử N [38, 39, 47, 52, 54]

Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của quinolon

Do có nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên các chất nhóm quinolon mang tính acid Một số quinolon có thêm nhóm amin khác nên có thêm tính base Chúng tan trong lipid và thấm được qua màng tế bào Có thể chia nhóm quinolon thành hai loại dựa trên pKa: acidic quinolon (AQ) và piperazinyl quinolon (PQ)

- Acidic quinolon: chỉ có một giá trị pKa trong khoảng 6,0 đến 6,9 Trong nước chúng tồn tại ở dạng trung hòa hoặc dạng anion Thường AQ gồm những quinolon thuộc thế hệ thứ nhất

- Piperazinyl quinolon: có hai giá trị pKa, pKa1 khoảng 5,5–6,6 và pKa2khoảng 7,2–8,9 Trong nước chúng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng cation, dạng trung hòa và dạng anion; một số PQ là danofloxacin, difloxacin, norfloxacin, ofloxacin, benofloxacin, marbofloxacin, acid pipemidic

Hình 1.2: Cân bằng acid - base của nhóm acidic quinolon

Hình 1.3: Cân bằng acid base của nhóm piperazinyl quinolon

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo và pK a của các chất

1.1.2 Cơ chế tác dụng và độc tính

Kháng sinh nhóm này phân bố đồng đều cả trong dịch nội và ngoại bào, phân

bố hầu hết các cơ quan: phổi, gan, mật, xương, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch não tủy và qua được hàng rào nhau thai Fluoroquinolon đào thải chủ yếu qua đường tiết niệu ở dạng còn nguyên hoạt chất và tái hấp thu thụ động ở thận [16, 52]

Cơ chế tác động của fluoroquinolon lên vi khuẩn là ức chế tổng hợp acid nucleic Sự nhân đôi DNA bắt đầu bằng phản ứng tách chuỗi DNA ra làm hai, mỗi bên là một khuôn để gắn nucleotid thích hợp theo nguyên tắc bổ sung Enzym DNA polymeras xúc tác sự tổng hợp các liên kết giữa các nucleotid; enzym DNA gyrase nối các DNA trong quá trình tổng hợp và tạo thành các vòng xoắn Các quinolon (nalidixic acid và các fluoroquinolon) ức chế mạnh sự tổng hợp DNA trong giai đoạn nhân đôi do ức chế enzym DNA gyrase Cơ chế tác động này hiệu quả trên cả vi khuẩn gram dương và gram âm Nhưng cũng có thể do cơ chế ức chế tổng hợp acid nucleic này mà kháng sinh nhóm fluoroquinolon được cho là có nguy cơ gây đột biến gen, gây sẩy thai khi sử dụng cho động vật mang thai do đó khuyến cáo là không nên sử dụng kháng sinh nhóm fluoroquinolon cho động vật mang thai, động vật sinh sản và làm giống Ngoài ra các nghiên cứu trên động vật còn non cho thấy các kháng sinh thuộc nhóm này gây hủy hoại các khớp sụn [34, 54] do đó các kháng sinh nhóm quinolon không được sử dụng trong điều trị bệnh cho trẻ em

1.1.3 Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon

Ngày 26/6/1990 Uỷ ban An toàn thực phẩm Châu Âu chính thức ban hành Quyết định 2377/1990[26] trong đó qui định mức giới hạn tối đa các chất kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật trong đó giới hạn nhóm quinolon trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật bao gồm:

Bảng 1.2: Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon theo EEC No.2377/1990

Tên kháng sinh Lợn (ppb) Bò, dê, cừu(ppb) Gà(ppb)

(*) Giới hạn cho phép trong cá 100ppb

Tại Việt Nam, Thông tư số 08/VBHN-BNNPTNT ngày 25 tháng 02năm 2014

quy định Danh mục các loại kháng sinh cấm sử dụng và hạn chế sử dụng [1], theo

đó các kháng sinh fluoroquinolon bị cấm sử trong sản xuất, kinh doanh thuỷ sản xuất khẩu vào thị trường Mỹ và Bắc Mỹ, ciproxacin và ofloxacin bị cấm sử dụng trong chăn nuôi thú y, các chất nằm trong danh mục hạn chế sử dụng bao gồm:

Bảng 1.3: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Thông tư 08/VBHN-BNNPTNT

Tên kháng sinh MRL (ppb) Tên kháng sinh MRL (ppb)

Danofloxacin 100 Ciprofloxacin 100

Difloxacin 300 Oxolinic Acid 100

Flumequin 600 Sarafloxacin 30

Hiện nay, theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007

về quy định mức giới hạn ô nhiễm hóa học và vi sinh vật trong thực phẩm, Bộ Y tế cũng đã đưa ra mức giới hạn của 4 kháng sinh nhóm quinolon là danofloxacin, enrofloxacin, flumequine, sarafloxacin

Bảng 1.4: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT

Tên kháng sinh ADI (μg/kg thể trọng/ngày) MRL (μg/kg)

Danofloxacin 0 - 20 50 (gan lợn); 100 (thịt) Enrofloxacin 0 - 3 100

Flumequine 0 - 30 500 (thịt, gan, cá) Sarafloxacin 0 - 0,3 10 (thịt); 80 (gan, thận)

1.2 Tình hình sử dụng và tồn dƣ kháng sinh nhóm quinolon

1.2.1 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước

Mặc dù các kháng sinh nhóm quinolon đã được các cơ quan chức năng quản

lý chặt nhưng nhiều nghiên cứu đã chỉ ra thực phẩm trong nước và ngay cả thực

phẩm xuất khẩu vẫn bị phát hiện có chứa tồn dư loại kháng sinh này Việc tồn dư kháng sinh ở hàm lượng cao cho thấy thực trạng sử dụng kháng sinh trong thời gian dài với hàm lượng lớn đồng thời người chăn nuôi không đảm bảo thời gian cách ly hợp lý đối với vật nuôi trước khi thu hoạch

Nhiều nghiên cứu trong nước đã khảo sát tình hình sử dụng các loại kháng sinh trong chăn nuôi, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy sự lạm dụng kháng sinh

là rất phổ biến và tồn dư trong thực phẩm (kể cả đối với những chất đã bị cấm sử dụng) vẫn chiếm tỷ lệ đáng kể [4, 5, 6, 8, 9] Người chăn nuôi sử dụng nó dưới nhiều hình thức khác nhau hoặc phối trộn trực tiếp vào trong thành phần của thức ăn hoặc đưa vào môi trường nuôi như một hình thức phòng bệnh Theo nghiên cứu của Takahiro Yamaguchi đối với các mẫu lợn, bò, gà, tôm và cá nuôi thu thập tại các tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Khánh Hòa, TP HCM năm 2012-2013 của cho thấy có tới 7,7% số mẫu được kiểm nghiệm phát hiện nhiễm enrofloxacin (ERFX) với hàm lượng từ 12–77ppb điều này cho thấy mặc dù đã bị cấm nhưng bằng con đường nào

đó các kháng sinh này vẫn đi vào mẫu thực phẩm để đến với người tiêu dùng [57]

Theo báo cáo của chính phủ Úc năm 2008, thủy sản nhập khẩu của Việt Nam vào thị trường nước này được giám sát rất chặt chẽ và đã phát hiện những lô hàng nhiễm kháng sinh quinolon bao gồm ERFX và ciprofloxacin (CPFX) với mức nhiễm lần lượt là 8,5 – 35 và 2,0 – 33ppb [12]

Các nghiên cứu trên cho thấy thực trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi

và tồn dư các chất này trong sản phẩm thực phẩm không có dấu hiệu cải thiện, theo báo cáo kết quả công tác quản lý chất lượng an toàn thực phẩm 9 tháng đầu năm

2015 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn có tới 1,01% mẫu thủy sản nhiễm

dư lượng hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng vượt ngưỡng cho phép và 7,6% mẫu thịt có dư lượng hóa chất, kháng sinh vượt ngưỡng

Đối với các mẫu môi trường, tại Việt Nam có rất ít nghiên cứu đánh giá thực trạng tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong môi trường Theo nghiên cứu năm

2006 của TS Dương Thị Hồng Anh về phân tích đánh giá sự có mặt của các kháng sinh họ fluoroquionolon trong nước thải bệnh viện, đã phát hiện thấy hàm lượng kháng sinh ciproxacin và norfloxacin trong nước thải chưa xử lí và đã xử lí tại bệnh

viện Hữu Nghị với nồng độ từ 3,5 tới 50,3 µg/L trong đó nồng độ ciproxacin cao hơn norfloxacin từ 3-5 lần [2]

Năm 2014, cũng theo nghiên cứu của TS Dương Thị Hồng Anh và cộng sự, đối với các mẫu nước, bùn, tôm được lấy tại các điểm trong ao nuôi, dọc kênh và rừng ngập mặn tiếp giáp ở khu vực nuôi tôm quảng canh thuộc xã Giao An, Giao Thủy, Nam Định vào hai thời điểm thả tôm giống và thu hoạch Dư lượng kháng sinh CPFX và norfloxacin (NRFX) được phân tích trong các mẫu sử dụng phương pháp chiết pha rắn, chiết lỏng áp suất cao và xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang Chỉ có dư lượng ciprofloxacin được tìm thấy trong nước và bùn ở các khoảng nồng độ lần lượt là 0,06 – 0,35 µg/L và 0,22 – 0,40 µg/g Kết quả phân tích tại thời điểm đầu vụ nuôi tôm cho thấy người nuôi trồng đã sử dụng CPFX để khử trùng nước và môi trường Trong mẫu tôm sản phẩm thu tại khu vực này không phát hiện thấy CPFX và NRFX [3]

1.2.2 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trên thế giới

Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấy tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon ở mức độ báo động Theo báo cáo năm 2006 của Tổ chức đánh giá dược phẩm Châu Âu (European Medicines Evaluation Agency), tổng lượng kháng sinh quinolon tiêu thụ và khối lượng sản phẩm thịt có chứa kháng sinh nhóm quinolon tại một số quốc gia được thống kê như sau [27]:

Bảng 1.5: Lượng kháng sinh tiêu thụ và sản phẩm thịt phát hiện có chứa kháng sinh quinolon

Tên nước Tổng lượng kháng sinh

tiêu thụ (tấn)

Tổng lượng sản phẩm thịt (tấn)

Fluoro -quinolon

Nhóm quinolon

Bò Lợn Gia cầm Tổng

cộng

Cộng hòa Séc 0,8 1 103775 409102 215802 728679 Đan Mạch 0,1 0,1 147600 1762000 199994 2109595 Phần Lan <0,1 <0,1 95830 193222 83730 372782

Khảo sát của tác giả Pavlína Navrátilová năm 2011 tại Cộng hòa Séc trong

sữa bò nguyên liệu cho thấy có tới 87,3% số mẫu (n=150) được nghiên cứu phát hiện nhiễm kháng sinh nhóm này [46] Hoặc tại vùng Ankara Thổ Nhĩ Kỳ năm

2013 cũng phát hiện tới 118 mẫu/231 mẫu phát hiện dương tính với kháng sinh nhóm quinolon trong đó thịt gà là 58 mẫu chiếm 45,7% và thịt gà là 60 mẫu chiếm 57,7% [15] Tại Hàn Quốc khảo sát với 388 mẫu thực phẩm cho thấy có 3,1% số mẫu phát hiện tồn dư ERFX, CPFX và NRFX với hàm lượng cao: đối với ERFX từ 0,01 đến 0,73 mg/kg, đối với CPFX từ 0,01 đến 0,03 mg/kg; NRFX phát hiện trong một mẫu ở mức 0,12 mg/kg [19]

Cũng theo nghiên cứu năm 2013 của Silfrany và cộng sự tại Santiago đối với

135 mẫu thịt gà thu thập tại 9 thành phố đã phát hiện tỷ lệ mẫu nhiễm kháng sinh nhóm quinolon từ 6,25 đên 50% đối với 4/9 địa điểm thu thập mẫu Nghiên cứu sử

dụng phương pháp ức chế sự phát triển của vi khuẩn E.Coli để phát hiện sự có mặt

của kháng sinh nhóm quinolon trong mẫu [48]

Theo nghiên cứu mới nhất của Omotoso Adekunbi năm 2015 tại Nigeria, đối với 320 mẫu thịt xác định các chất CPFX, NRFX, ofloxacin (OFLX) cho thấy có tới 50% mẫu thịt bò, 55% mẫu thịt gà, 40% thịt lợn và 40% mẫu thịt dê phát hiện có chứa kháng sinh nhóm quinolon [45]

Như vậy có thể thấy rõ tình hình sử dụng kháng sinh quinolon trong chăn nuôi rất phổ biến và tồn dư của nó trong thực phẩm là điều đáng lo ngại ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người tiêu dùng

Các nghiên cứu về kháng sinh trong môi trường cho thấy sự có mặt của các chất này ở rất nhiều các khu vực khác nhau, nhiều quốc gia trên thế giới Ở Trung Quốc nguồn nước cấp cho sinh hoạt [56], nước vùng cảng, nước sông [53], nước thải bệnh viện đã qua xử lý [55] đều thấy có sự hiện hiện ở hàm lượng cao kháng sinh nhóm quinolon

Ngay tại Mỹ, một quốc gia phát triển có sự quản lý chặt chẽ về nguy cơ ô nhiễm môi trường, nghiên cứu của H Nakata và cộng sự năm 2004 cũng phát hiện

có ofloxacin trong mẫu với hàm lượng cao nhất là 204ppb Trong nghiên cứu của mình, tác giả cũng đã so sánh kết quả phát hiện với một số quốc gia Châu Âu trong

các nghiên cứu tương tự Theo đó mức phát hiện OFLX và lomefloxacin (LMFX) ở các quốc gia như Pháp (330–510ppb; 180–290ppb), ở Ý (290–580ppb; 180–320ppb), ở Hy Lạp (460ppb; 290ppb) [33]

Tại Canada, kết quả khảo sát tại 8 hồ xử lý nước thải cho thấy chỉ có 40% lượng kháng sinh nhóm quinolon giảm xuống sau khi xử lý Mẫu sau xử lý được thải trực tiếp ra môi trường vẫn chứa hàm lượng trung bình của CPFX và OFLX lần lượt là 146 và 179ng/L [32]

1.3 Các phương pháp xác định hàm lượng các chất nhóm quinolon

Nhiều phương pháp được sử dụng để xác định các chất nhóm quinolon như:

phương pháp miễn dịch enzym (ELISA); phương pháp vi sinh vật (test vi sinh vật học), phương pháp lý hóa Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng

1.3.1 Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA)

Với ưu thế thời gian phân tích ngắn, các thao tác thí nghiệm đơn giản, có thể thực hiện tại hiện trường, phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên-kháng thể đã trở thành một công cụ khá hiệu quả và được các cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với lục đích sàng lọc Liên minh Châu Âu (tại Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích sàng lọc dư lượng các hóa chất kháng sinh cấm

Với mục đích đưa việc xác hàm lượng sparfloxacin vào xét nghiệm cận lâm sàng, nghiên cứu của Hua-Jin Zeng và cộng sự năm 2011 đã sử dụng kháng thể thu được từ việc tạo miễn dịch với sparfloxacin trên thỏ kết hợp với huyết tương bò Sau khi tối ưu hóa, phương pháp xác định hàm lượng sparfloxacin từ 5ng/mL đến 2mg/mL với độ thu hồi từ 87,7 đến 106,2% [31]

Các nghiên cứu của Jiang Jinqing năm 2011, sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp để xác định SRFX, difloxacin (DFLX), NRFX và pefloxacin trên nền mẫu

cá dựa vào phản ứng của kháng thể SRFX Khoảng xác định đối với SRFX trong dịch chiết từ 0,004 đến 18 ng/mL giới hạn phát hiện 0,002 ng/mL [35] Đối với nền mẫu gan gà tác giả cũng đã xác định được hàm lượng NRFX với khoảng xác định từ 0,006 đến 38 ng/mL giới hạn phát hiện 0,04 ng/mL độ thu hồi đạt 90-117,8% [35]

pháp cho việc xác định CPFX trong mẫu sữa bò với khoảng xác định từ 0,036 đến 92,5 ng/mL với giới hạn phát hiện là 0,019 ng/mL, hệ số tương quan đạt 0,9844 [36]

Tại Việt Nam, Phạm Kim Đăng và cộng sự đã sử dụng kít ELISA do CER Vương Quốc Bỉ sản xuất để phân tích tồn dư kháng sinh quinolon trong tôm tại một

số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc Phương pháp được khẳng định lại bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS/MS) Kết quả cho thấy, bộ kít rất ổn định để phân tích các quinolon được thử và trong tôm với giới hạn nồng độ phát hiện là 0,07ppb Tác giả cũng cho rằng khả năng phát hiện, hiệu lực của kít trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp bán định lượng qui định trong Quyết định số 2002/657/CE Uỷ ban Châu Âu (CE, 2002) Tuy nhiên, muốn định danh loại kháng sinh quinolon và xác định nồng độ chính xác cần phải khẳng định lại bằng các phương pháp lý hoá khác [4]

1.3.2 Phương pháp vi sinh vật

Phương pháp dựa vào sự biến đổi màu sắc của chất chỉ thị được bổ sung vào môi trường trước và sau khi thêm mẫu phân tích Những mẫu có chứa kháng sinh sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn và không làm đổi màu chất chỉ thị Ngược lại đối với mẫu không chứa kháng sinh hoặc chứa với lượng nhỏ hơn giới hạn phát hiện, sau thời gian ủ vi khuẩn phát triển làm thay đổi điều kiện môi trường khi đó màu của chất chỉ thị sẽ khác so với màu sắc ban đầu Tùy thuộc vào loại vi khuẩn sử dụng mà thời gian phát hiện nhanh hay chậm

Nghiên cứu của David Sanz [23] sử dụng test Explorer (ZEULAB, Zaragoza,

Spain) ức chế vi khuẩn G stearothermophilus để định tính các kháng sinh có mặt

trong các mẫu thịt Trong test này, mỗi giếng sẽ chứa môi trường thạch aga và vi khuẩn đích trong sự có mặt của chất chỉ thị pH Khi test được ủ trong điều kiện

650C các bào tử sẽ phát triển sinh ra môi trường axit và làm đổi màu chất chỉ thị từ xanh sang vàng Khi mẫu có chứa các chất ức chế vi khuẩn (các kháng sinh chẳng hạn) vi khuẩn sẽ không phát triển được do đó môi trường pH không thay đổi Nghiên cứu cũng sử dụng test Equinox (ZEULAB, Zaragoza, Spain) đặc hiệu đối với kháng sinh nhóm quinolon trong nền mẫu thực phẩm Khác với test Explorer,

test Equinox dựa vào sự ức chế phát triển của vi khuẩn E.Coli ATCC 11303 Chất

chỉ thị được sử dụng cho test này là chỉ thị oxy hóa khử Nguyên tắc hoạt động của test là khi ủ ở nhiệt độ 37°C các tế bào vi khuẩn sẽ tăng sinh làm thay đổi điện thế khử của môi trường, nhờ đó chất chỉ thị sẽ chuyển màu (từ xanh sang nâu hoặc vàng cam) Với những mẫu có chứa tồn dư kháng sinh nhóm quinolon lớn hơn giới hạn phát hiện sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn E.Coli do đó màu của môi trường sẽ không thay đổi

Phương pháp này đã được tác giả Godelieve Okerman và cộng sự sử dụng để phân tích tồn dư của 10 quinolon trong các mẫu thịt gia cầm và cá: ERFX, DNFX, marbofloxacin (MBFX), SRRFX, NRFX, flumequine (FMQ), oxolinic acid (OA), nalidixic acid (NA), difloxacin (DFLX), ciprofloxacin (CPFX) Ba loại vi khuẩn

Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus ở hai điều kiện pH=6 và pH=8 đã

được khảo sát để lựa chọn điều kiện tối ưu cho từng quinolon Kết quả cho thấy FMQ và OA được phát hiện ở điều kiện pH=6 và CPFX, ERFX, DNFX, MBFX, SRFX, NRFX cho kết quả tốt hơn ở pH=8 Ngoại trừ DFLX cho kết quả giới hạn

phát hiện tốt với vi khuẩn B subtilis, 9 quinolon còn lại cho kết quả tốt với E.coli

[29]

Phương pháp vi sinh vật có ưu điểm đơn giản, rẻ, trang thiết bị đơn giản Tuy nhiên, thời gian kiểm tra thường kéo dài để vi khuẩn phát triển, dễ cho kết quả dương tính giả, độ nhạy phụ thuộc vào điều kiện của chủng vi sinh vật sử dụng Phương pháp này có thể dùng để sàng lọc trước khi sử dụng các phương pháp khác

1.3.3 Phương pháp hóa lý

1.3.3.1 Phương pháp điện hóa

Nhiều phương pháp điện hóa đã được sử dụng để xác định hàm lượng nhóm quinolon trong các nền mẫu khác nhau đặc biệt trong các mẫu dược phẩm Từ năm

1994, nghiên cứu của Corti và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật xung vi phân để xác định NRFX, cinoxacin(CNFX), pipemidic acid, OA và piromidic acid trong huyết tương, nước tiểu và dược phẩm Phương pháp sử dụng kỹ thuật chiết quinolon từ

nền mẫu bằng acetonitrile (MeCN) và dung dịch natri hydroxyt 2M, đối với mẫu nước tiểu cần quá trình làm sạch bằng kỹ thuật chiết pha rắn Kết quả cho píc hấp thụ rõ ràng, độ lặp lại, độ chính xác tốt [21]

Nghiên cứu của tác giả Ali A sử dụng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ trên catốt sử dụng đồng (II) như một chất trung gian để xác định hàm lượng ERFX cho thấy vị trí píc ở -0,3V trên điện cực giọt thủy treo, phương pháp không chỉ cho phép xác định ERFX trong mẫu huyết tương mà còn trong cả các mẫu mô sinh học, Cu (II) được sử dụng như là một chất trung gian để tạo phức trong đệm amoni với loại thuốc này trước khi bị khử trên điện cực bằng kĩ thuật quét sóng vuông [13]

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Thủy sử dụng phương pháp vol–ampe hòa tan hấp phụ trên điện cực giọt thủy ngân treo, kĩ thuật quét sóng vuông để xác định CPFX trong các mẫu dược phẩm Các điều kiện tối ưu đã được xác định trên nền hệ đệm acetat 0,075M pH=3,8 Đường chuẩn xác định CPFX trong khoảng nồng độ từ 0,01-0,22ppm với giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng cỡ ppb (LOD = 2,6ppb; LOQ=8,6ppb) [7]

1.3.3.2 Phương pháp trắc quang

Các quinolon xác định bằng phương pháp trắc quang cho khoảng tuyến tính tuân theo định luật Lambert – Beer trong khoảng nồng độ khác nhau tùy thuộc chất nghiên cứu Do cấu trúc có chứa vòng quinolon nên các kháng sinh nhóm quinolon

có khả năng hấp thu trực tiếp tia sáng tại vùng bước sóng tử ngoại hoặc có thể tạo phức màu với các tác nhân phù hợp

Với ưu thế nhanh, đơn giản và sử dụng các trang thiết bị rẻ tiền phương pháp trắc quang được sử dụng chủ yếu trong lĩnh vực dược phẩm để xác định các quinolon ở hàm lượng lớn Nghiên cứu mới đây của tác giả Edith Critina sử dụng phương pháp đo trực tiếp độ hấp thu quang tại bước sóng 275nm để xác định hàm lượng ciproxacin trong dung dịch thuốc nhỏ mắt Khoảng tuyến tính của đường chuẩn được xác định từ 2,0–7, µg/mL với độ lệch chuẩn tương đối trong khoảng từ 1,55 đến 2,47% (n=6) [25] Cũng tương tự như nghiên cứu trên, tác giả Affo lại sử dụng bước sóng hấp thu ở 326nm để xác định trực tiếp hàm lượng ciproxacin trong

dịch truyền cho độ tuyến tính tốt với khoảng xác định từ 0,002 – 0,012 mg/mL [14] Với levofloxacin tác giả Mahfuza tiến hành đo ở bước sóng 292nm trên nền dung dịch nước:methanol(MeOH):MeCN (9:0.5:0.5) với khoảng tuyến tính từ 1,0–12,0 μg/mL [43]

Ngoài phương pháp đo trực tiếp các nghiên cứu cũng sử dụng các chất tham gia phản ứng tạo phức với các quinolon Trong nghiên cứu của Samia Mostafa đã sử

dụng 3 tác nhân tạo phức khác nhau để xác định CPFX, ERFX và pefloxacin trong

các mẫu dược phẩm dạn tiêm và dạng uống bán trên thị trường Với tác nhân tạo phức chloranilic acid tạo phức với các quinolon xác định có bước sóng hấp thu cực đại ở 520nm Với tác nhân thứ hai là tetracyanoethylene, phức của ba quinolon trên với tác nhân này tạo phức cho độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng =335nm đối với CIP và =290nm đối với cả ERFX và pefloxacin Tác nhân thứ ba là 2,3-

dichloro-5,6-dicyano-p-benzoquinon (DDQ), phức này cho độ hấp thụ quang cực

đại ở bước sóng  = 460nm Với cả ba tác nhân trên, phương pháp đều cho độ chính xác cao đạt trên 99% [44]

Nói chung các phương pháp trắc quang xác định hàm lượng quinolon chỉ được sử dụng trong lĩnh vực dược phẩm để xác định hàm lượng lớn, nền mẫu đơn giản Đối với các nền mẫu phức tạp như nền mẫu sinh học, thực phẩm với hàm lượng chất xác định rất thấp phương pháp không đảm bảo độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện

1.3.3.3 Phương pháp điện di mao quản

Phương pháp này được D Barrón áp dụng trong nghiên cứu với detector DAD để phân tích FMQ và OA trong thịt gà trong đó NRFX được sử dụng làm chất nội chuẩn cho quá trình xác định Các điều kiện điện di gồm: dung dịch điện di là dung dịch phosphoric acid 40mM điều chỉnh pH 8,02 bằng NaOH, thế điện di 18kV, nhiệt độ mao quản duy trì ở 250C, bước sóng phát hiện là 250nm Phương pháp có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng cho OA và FMQ tương ứng là 15

và 48ppb và 10 và 30ppb [17]

Thay detector PAD bằng detector MS, Francisco J Lara sử dụng phương pháp này để phân tích nhiều quinolon hơn: DNFX, SRFX, CPFX, MBFX, ERFX, DFLX, OA và FMQ Cột mao quản được sử dụng trong nghiên cứu có chiều dài 96cm, đường kính trong 50µm Dung dịch điện di là dung dịch CH3COONH470mM điều chỉnh pH 9,1 bằng dung dịch NH4OH 5N Nhiệt độ mao quản duy trì ở

250C và thế điện di là 25kV Bước sóng phát hiện 275nm Dòng mang là hỗn hợp của 2-propanol : nước : formic acid (50:49:1,v/v) Các điều kiện khối phổ được tối

ưu hóa như sau: điện thế mao quản -4kV, áp lực khí phun 10psi, tốc độ khí làm khô 6L/phút, nhiệt độ khí làm khô 1500C [28]

1.3.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng

Phương pháp phổ biến nhất được sử dụng trong việc xác định các kháng sinh nói chung và kháng sinh nhóm quinolon nói riêng là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Phương pháp dựa trên quá trình quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng-rắn, lỏng-lỏng) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích do cấu trúc phân tử của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau chúng

di chuyển với tốc độ khác nhau nhờ đó tách ra khỏi nhau [11] Các chất sau khi được tách ra khỏi cột sắc ký tùy thuộc vào tính chất của chúng sẽ được phát hiện trên các detector phù hợp

Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC: đại lượng đặc trưng cho quá trình tách sắc ký là thời gian lưu của các chất do vậy dựa vào thời gian lưu của chất phân tích so sánh với thời gian lưu của chất chuẩn ta có thể xác định sự có mặt của chất trong mẫu phân tích (định tính) Ngoài ra do sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích peak chất và nồng độ ta có thể so sánh với diện tích của dãy chất chuẩn để từ đó xác định được hàm lượng chất phân tích có trong mẫu (định lượng)

Đối với các chất phân tích nhóm quinolon trong cấu trúc phân tử chứa vòng thơm (vòng quinolon) với các liên kết bội do đó nó có khả năng hấp thụ tia UV (có

thể xác định bằng detector UV hoặc DAD, PAD), cũng nhờ vòng thơm này mà các chất kháng sinh nhóm quinolon có khả năng phát huỳnh quang khi được kích thích bằng tia sáng có bước sóng phù hợp (có thể xác định bằng detector huỳnh quang)

 Phương pháp HPLC sử dụng detector UV và DAD

Tương tự với phương pháp trắc quang, phương pháp HPLC với detector UV hoặc DAD cũng lựa chọn bước sóng hấp thu cực đại của chất phân tích để đo trực tiếp độ hấp thu quang Tuy nhiên nhờ quá trình tách trên cột sắc ký nên tín hiệu chất phân tích không bị ảnh hưởng tạp chất do đó độ nhạy và độ đặc hiệu đảm bảo cho việc phân tích lượng vết các chất

Nghiên cứu của Cliniqua khi tiến hành tối ưu hóa quá trình xác định hàm lượng SPFX và ERFX trong sữa dê sử dụng detector DAD ở bước sóng 277nm Theo đó mẫu sữa được chiết bằng dung dịch đệm phosphate sau đó làm sạch bằng cột chiết pha rắn C18 (SPE), CPFX và ERFX sẽ được tách trên cột sắc ký C14 với hệ dung môi 0,05 M orthophosphoric acid (pH 3,4)–MeCN (87:13 v/v) Phương pháp cho độ thu hồi đối với ERFX là 84% và CPFX là 88% Giới hạn phát hiện đối với

cả 2 chất đạt 100ppb [18]

Đối với nền mẫu cá hồi Evaggelia đã chiết 7 kháng sinh nhóm quinolon bằng dung dịch đệm citrate pH=4,7 kết hợp với rung siêu âm, dịch chiết sau đó được làm sạch qua cột SPE Quá trình xác định thực hiện trên HPLC DAD tại bước sóng 275 nm đối với CPFX, DNFX, ERFX, SRFX và ở bước sóng 255nm đối với

OA, NA và FMQ Thời gian tách tối ưu cho 7 chất là 25 phút cho hệ số phân giải đối với các chất lớn hơn 1,5 khi sử dụng chương trình gradient cho hệ dung môi pha động Phương pháp cho độ thu hồi rất tốt đối với tất cả các chất trong khoảng từ 95–101% [24]

Đối với nền mẫu thịt, các tác giả Hu Yu [30] (xác định 3 nhóm kháng sinh quinolon, tetracyclin, sulfonamid) và ShutingWang [49] (xác định fluoroquinolon,

organophosphorus và N-methyl carbamates) đã thực hiện quá trình chiết sử dụng

chất hấp phụ C18 trộn với mẫu phân tích trong sự có mặt của sodium sulfat Dung môi n-hexan với thể tích phù hợp được sử dụng để loại chất béo ra khỏi nền mẫu

Quá trình tách sắc ký trên cột C18 với chương trình gradient sử dụng hệ dung môi pha động MeOH và dung dịch acetic acid hoặc phosphoric acid Các phương pháp đều cho giới hạn phát hiện đối với kháng sinh nhóm quinolon là dưới 20ppb

Với nền mẫu cá, thịt lợn, thịt gà tác giả Shu-chu Su đã sử dụng dung dịch 0,3% metaphosphoric acid: MeCN (1:10, v/v) để chiết các kháng sinh nhóm quinolon bao gồm NA, FMQ, OA, piromidic acid, DNFX, ERFX và SRFX Dịch chiết được làm sạch bằng cột C18 và xác định trên HPLC ở bước sóng 286 nm đối với piromidic acid và trong khoảng 241 đến 267 nm các quinolon thế hệ 1, trong khoảng 284 đến 287 nm cho các quinolon thế hệ thứ 2 Giới hạn phát hiện đối với các chất trong khoảng từ 0,01ppm đến 0,02ppm tùy thuộc vào chất phân tích [51]

Đối với mẫu nước môi trường Danijela đã cho hấp phụ ERFX, oxytetracyclin và trimethoprim lên đĩa chiết pha rắn với thành phần chất nhồi polystyrene divinylbenzen (SDB) và C18 Các chất được rửa giải ra khỏi đĩa bằng 20mL ethanol Quá trình tách sắc ký trên HPLC sử dụng cột C18, chạy đẳng dòng với hệ dung môi pha động chứa 0,5% formic acid và 1% trifluoroacetic acid trong dung dịch 0,05M CH3COONH4:MeOH (70:30 v/v) Bước sóng xác định cho tất cả các chất là 254nm Phương pháp cho giới hạn phát hiện 0,1ppb đối với ERFX [22]

Có thể nhận thấy trong hầu hết các nghiên cứu bước sóng xác định đối với các chất thuộc nhóm fluoroquinolon đều nằm trong khoảng từ 270–285nm, với nhóm quinolon bước sóng xác định nhỏ hơn trong khoảng 250–265nm Giới hạn phát hiện của các phương pháp đều đáp ứng yêu cầu khi so sánh với giới hạn tối đa cho phép (MRL)

 Phương pháp HPLC sử dụng detector MS

Phần lớn các nghiên cứu trong và ngoài nước hiện nay đều sử dụng phương pháp HPLC kết nối với detector MS Với ưu điểm xác định được tất cả các chất khó bay hơi đảm bảo độ đặc hiệu, độ lặp lại và giới hạn phát hiện tốt, phương pháp này

có số lượng nghiên cứu rất lớn Phương pháp này có độ chọn lọc và độ nhạy rất cao được Ủy ban Châu Âu khuyến cáo sử dụng để phân tích dư lượng kháng sinh trong thực phẩm Trong detector MS chất phân tích bị ion hóa, phân mảnh và được phát

hiện dựa vào cường độ tỉ lệ m/z Trên cở sở đó, detector MS cho phép định tính và định lượng một cách rõ ràng về một hợp chất cụ thể

Với 18 chất kháng sinh nhóm quinolon được xác định trên nền mẫu thủy sản và mẫu thịt, Chui-shiang chang đã chiết các chất bằng dung dịch MeCN chứa 0,1% formic acid, dịch chiết được loại nước bằng sodium sulphat và loại béo bằng n-hexan, bay hơi đến cạn khô ở 400C rồi hòa tan lại trong dung dịch MeCN chứa 0,1% formic acid rồi bơm lên LC/MS Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự ảnh hưởng đáng kể của đường nền lên độ thu hồi của các chất phân tích trong đó cinoxacin và piromidic acid có độ thu hồi dưới 60%.Tác giả cũng cho thấy để tăng hiệu suất thu hồi và giới hạn phát hiện, cần phải tăng cường hiệu quả của quá trình làm sạch để loại các tạp chất như muối, protein, chất béo và các loại carbohydrat [20]

Tác giả Nguyễn Thị Thanh Nga trong nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh CPFX và ERFX trong thực phẩm lựa chọn phương pháp LC/MS/MS sử dụng cột XDB-C18 (50mm x 4,6mm; 3,5μm;) với pha động gồm MeCN và formic acid 0,1% Giới hạn phát hiện của CPFX và ERFX tương ứng là 0,426ppb và 0,391ppb [6]

Để đánh giá tồn dư ERFX trên cá tra, tác giả Trần Minh Phú đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp kết hợp với đầu dò khối phổ Phương pháp có giới hạn định lượng 2ppb Các điều kiện sắc ký đã được tối ưu hóa: sử dụng cột C18 (150mmx 3mm; 3,0μm), pha động chạy sắc ký là MeCN và nước được điều chỉnh đến pH đạt 2,5 bằng formic acid Thể tích tiêm mẫu 20μL, tốc độ dòng 500μL/phút, nhiệt độ cột: 250C, nhiệt độ nguồn 4500C [10]

Đối với mẫu môi trường Manuel Lombardo đã thực hiện xác định 19 kháng sinh quinolon trong nước thải theo đó 100mL mẫu nước được điều chỉnh đến pH=7 sau

đó chỉ 5mL mẫu được lấy vào ống ly tâm và chiết với 10mL dung dịch MeCN có chứa 1% formic acid Dịch chiết tiếp tục được làm sạch bằng kit Agilent SampliQ

EN QuEChERSt chứa 1 g NaCl và 4 g MgSO4 Dịch chiết sẽ được bay hơi và xác

định trên sắc ký lỏng Phương pháp cho giới hạn phát hiện rất thấp từ 0,02ppb đến 0,09ppb tùy thuộc chất phân tích [41]

Đều sử dụng kỹ thuật làm sạch SPE nhưng với các dạng chất nhồi cột khác nhau các nghiên cứu [32] sử dụng cột WCX, nghiên cứu [33] sử dụng pha rắn chiết cation hỗn hợp (MPC) dạng đĩa, nghiên cứu [53] sử dụng cột HLB để xác định các kháng sinh quinolon trong mẫu nước Detector MS được sử dụng để xác định hàng loạt các chất cho thấy độ thu hồi đều đạt trên 80%

 Phương pháp HPLC sử dụng detector huỳnh quang

Do cấu trúc hóa học có chứa vòng quinolon, các chất kháng sinh nhóm quinolon có khả năng phát huỳnh quang khi được kích thích bằng tia sáng có bước sóng phù hợp Chính vì lí do đó, kĩ thuật HPLC với detector huỳnh quang với độ nhạy và độ chọn lọc cao ngày càng được sử dụng rộng rãi trong phân tích lượng vết, nhất là trong phân tích các mẫu sinh học

Nghiên cứu trên nền mẫu cá, Marilyn J Schneider đã chiết các kháng sinh CPFX, SRFX, DNFX, ERFX, DFLX, oxytetracyclin, tetracyclin và chlortetracyclin bằng dung dịch MeCN và dung dịch đệm citrat có 50mM magnesium chloride Quá trình tách sắc ký sử dụng cột ZORBAX Eclipse XDB-phenyl các chất được tách hoàn toàn trong thời gian 25 phút Bước sóng kích thích và phát xạ cho các chất nhóm quinolon là 275 nm và 425 nm Độ thu hồi của các chất đạt trên 80% với giới hạn phát hiện của DNFX là 0,15 ng/g các chất còn lại trong nhóm quinolon là 0,5ng/g [40]

Tương tự nghiên cứu của Stoilova [50], nghiên cứu của Macarena Ramos [42] đều sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để làm sạch dịch chiết kháng sinh từ nền mẫu Với kỹ thuật này phần lớn tạp chất được loại bỏ, các phương pháp đều sử dụng chương trình gradient để tách các chất trong thời gian ngắn nhất nhưng đảm bảo độ phân giải, sử dụng chương trình cho bước sóng kích thích/ phát xạ đặc hiệu đối với từng nhóm chất nhờ đó giới hạn phát hiện của phương pháp đều rất thấp và

độ thu hồi đạt trên 80% cho tất cả các chất xác định

Bên cạnh kỹ thuật làm sạch bằng chiết pha rắn, kỹ thuật chiết lỏng-lỏng cũng được sử dụng đối với nền mẫu đơn giản hơn như nền mẫu sữa chẳng hạn Nghiên

cứu của Pavlína Navrátilová đã chiết kháng sinh trong sữa bằng dung môi MeCN dịch chiết này sau đó được bay hơi đến cạn và hòa tan lại trong pha động để tiến hành tách sắc ký Bước sóng kích thích/phát xạ được lựa chọn để xác định là 280/450 nm cho các chất MBFX, CPFX, DNFX, ERFX; đối với FMQ là 312/336nm [46]

Đối với mẫu nước môi trường Haruhiko Nakata [33], Yiruhan [56], Dương Thị Hồng Anh [3] đều sử dụng kỹ thuật SPE để làm sạch và làm giàu mẫu Chất phân tích sau đó được rửa giải và xác định trên máy HPLC sử dụng detector huỳnh quang với bước sóng khác nhau

Như vậy để sử dụng detector huỳnh quang xác định nhiều chất kháng sinh quinolone, các phương pháp đều sử dụng chương trình với bước sóng đo phù hợp cho từng chất hoặc từng nhóm Bước sóng kích thích thường được chọn trong khoảng 280nm, 297nm, 320nm và bước sóng phát xạ tương ứng thường là 450nm, 515nm và 366nm Giới hạn phát hiện của các quinolon trong các nghiên cứu khác nhau tùy thuộc vào chất phân tích và phương pháp chiết, làm sạch mẫu

Nhận xét: Qua các tài liệu nghiên cứu cho thấy, kháng sinh nhóm quinolon

có thể được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau mỗi phương pháp có những ưu, nhược điểm nhất định:

- Phương pháp trắc quang phù hợp cho nền mẫu dược phẩm với hàm lượng chất phân tích lớn

- Phương pháp ELISA và phương pháp test vi sinh vật được sử dụng cho sàng lọc mẫu ban đầu phải khẳng định lại kết quả bằng phương pháp khác

- Phương pháp điện hóa, điện di, HPLC có giới hạn phát hiện, độ lặp lại và độ đặc hiệu tốt tuy nhiên cần phải thực hiện quá trình chiết mẫu và làm sạch mẫu

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình xác định đồng thời 07 kháng sinh nhóm quinolon bao gồm: CPFX, DNFX, ERFX, SRFX, DFLX, OA, FMQ trong 2 nền mẫu tôm và nước nuôi tôm đạt yêu cầu của phương pháp phân tích định lượng

2.2 Đối tượng và nội dung nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài này là:

 02 phương pháp xác định đồng thời lượng tồn dư của 07 kháng sinh trong nhóm quinolon, đó là: CPFX, DNFX, ERFX, SRFX, DFLX, OA, FMQ trong thịt tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc ký hiệu năng cao sử dụng detector huỳnh quang

 Mẫu tôm và nước nuôi tôm thu thập tại địa phương đánh giá hàm lượng tồn dư 07 chất này

2.2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu bao gồm:

 Tối ưu hóa điều kiện xác định 07 kháng sinh trong họ quinolon bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao detector huỳnh quang

 Xây dựng quy trình tách chiết chất phân tích

 Thẩm định phương pháp:

 Ứng dụng phương pháp: Áp dụng phương pháp mới xây dựng để xác định tồn

dư các kháng sinh trong môi trường nước nuôi tôm và tôm nuôi trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa trong giai đoạn từ tháng 5 đến tháng 9/2015

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát quy trình tối ưu phân tích đồng thời 7 quinolon

Khảo sát các các thông số cho quy trình phân tích các quinolon sử dụng phương pháp khảo sát đơn biến, trên cơ sở quy trình phân tích dự kiến gồm các giai đoạn tại hình 2.4

Hình 2.4: Sơ đồ quy trình xác định quinolon trong nước và trong tôm

- Khảo sát quy trình phân tích: + Khảo sát các thông số cho thiết bị HPLC

+ Khảo sát điều kiện chiết, làm sạch mẫu

- Thẩm định phương pháp đã được tối ưu các điều kiện:

 Độ đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp

 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

 Khoảng tuyến tính

 Lập đường chuẩn và phương trình hồi quy của đường chuẩn

 Độ chính xác của phương pháp (độ đúng và độ chụm)

- Khảo sát tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong mẫu: sử dụng quy trình đã

xây dựng được để phân tích các mẫu tôm và nước nuôi tôm đã thu thập

2.3.2 Phương pháp lấy mẫu

- Phương pháp lấy mẫu: Lấy mẫu ngẫu nhiên

- Cách thực hiện: chọn ngẫu nhiên 20 hồ nuôi tôm tại các khu vực nuôi tôm xung quanh thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa Mẫu nước nuôi tôm và tôm nuôi được lấy đồng thời, khoảng cách giữa 2 lần lấy mẫu là từ 20 – 28 ngày trong khoảng thời gian từ tháng 5 đến tháng 9/2015

2.3.3 Xử lý số liệu

- Sử dụng phần mềm ChemStation Rev B.04.03(16) của máy HPLC, phần mềm Exel

- Đánh giá số liệu theo phương pháp của FDA (Guidelines for the Validation

of Chemical Methods for the FDA Foods Program)

2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu

2.4.1 Thiết bị và dụng cụ

 Thiết bị:

- Máy sắc ký hiệu năng cao (HPLC Agilent Technologies) bao gồm:

+ Bơm 2 kênh 1260 Infinity và bộ phận khử bọt khí -Agilent

+ Detector huỳnh quang G1321B

+ Cột: ZORBAX Esclipse XDB C18 5µm, 150x4,6mm

Tiền cột: C18 (12,5mm × 4,6 mm, 5 μm) Agilent + Điều nhiệt cột G1316A Agilent

+ Tiêm mẫu tự động Agilent

+ Phần mềm điều khiển ChemStation Rev B.04.03(16)

- Bộ bay hơi ly tâm Labconco bao gồm: bơm chân không, buồng ly tâm, bẫy dung môi

- Máy ly tâm thường: Hermle Z323

- Máy đo pH để bàn Cyberscan 1100

- Cân phân tích Satorius CPA224S (Max=210g ; d=0,1mg)

- Cân kỹ thuật Satorius TE412 (max=410g ; d=0,01g)

-Thiết bị deion trong nước milipore cho nước lọc đầu ra có độ dẫn <10µS

- Cột tách sắc ký ZORBAX Esclipse XDB-C18, 150mmx4,6mm, 5µm

- Sodium hydroxide (NaOH), sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4), metaphosphoric acid (MPA), sodium dodecyl sulfate (SDS), ammonium acetate, citric acid, hydrochloric acid của hãng Merck

- Các dung môi hữu cơ: acetonitril (MeCN), methanol (MeOH) dùng cho sắc

ký lỏng của hãng Fisher

Chuẩn bị hóa chất, chất chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc (chuẩn đơn) lưu trữ trong MeOH nồng độ 200ppm (DNFX: 50ppm) (dung dịch này được bảo quản ở -280C)

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp (A) có nồng độ: OA 1,01ppm; FMQ 1,0ppm; SRFX 1,21ppm; CPFX 1,02ppm; DNFX 0,26ppm; ERFX 1,12ppm; DFLX 1,04ppm pha trong nước

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp (B) trong dung môi MeCN: đệm acetat 50mM pH=4 (bảo quản ở 40C) có nồng độ: OA 10,1ppm; FMQ 60ppm; SRFX 3ppm; CPFX 10,2ppm; DNFX 2,5ppm; ERFX 10,2ppm; DFLX 30ppm

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ưu các điều kiện trên thiết bị HPLC

3.1.1 Khảo sát bước sóng kích thích và phát xạ của các chất

Để đảm bảo độ nhạy và chọn lọc cho phương pháp cần phải xác định điều kiện đo thích hợp cho detector bao gồm bước sóng kích thích và phát xạ phù hợp đối với từng chất phân tích

Quá trình khảo sát gồm các bước sau:

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn đơn từng chất các dung dịch có nồng độ 1ppm Tiến hành quét độ hấp thu từ bước sóng 220–700nm đối với từng dung dịch chuẩn đơn (7 đơn chất) riêng biệt sử dụng các điều kiện sau:

Hình 3.5: Phổ hấp thu và phát xạ của 07 chất phân tích

Nhận xét:

- Khoảng bước sóng hấp thu cực đại cho 5 chất: CPFX, DNFX, ERFX, SRFX, DFLX trong khoảng từ 260 – 320nm; đối với OA từ 240 – 285nm; đối với FMQ từ 220 – 270nm và từ 285 – 320nm

- Thời gian lưu của các chất: CPFX: 0,8 phút; DNFX: 1,1 phút; ERFX: 1,3 phút; SRFX: 1,4 phút; DFLX: 1,5 phút; OA: 2,5 phút; FMQ: 5,4 phút

Từ thời gian lưu và tín hiệu hấp thu cực đại của các chất chọn nhóm 1 gồm 5 chất fluoroquinolone (CPFX, DNFX, ERFX, SRFX, DFLX) với bước sóng hấp thu cực đại 295nm; nhóm 2 gồm 2 chất (OA, FMQ) tại bước sóng 260nm

Bảng 3.6: Bước sóng kích thích và phát xạ 07 chất phân tích

Tên chất Thời gian

lưu (phút)

Khoảng bước sóng hấp thu cực đại (nm)

Bước sóng kích thích (nm)

Bước sóng phát xạ (nm)

Ciproxacin 0,8 280 – 300 295 440 - 460 Danofloxacin 1,1 280 – 300 440 - 470 Enrofloxacin 1,3 280 – 300 440 - 470 Sarafloxacin 1,4 280 – 300 440 - 470 Difloxacin 1,5 280 – 300 440 -470 Oxolinic acid 2,5 250 – 280 260 365 - 400 Flumequin 5,4 250 – 280 và 290

Sau pha tĩnh, pha động là yếu tố quyết định đến quá trình tách Trong

phương pháp nghiên cứu, pha tĩnh sử dụng là cột C18, ít phân cực nên pha động phải

là hệ dung môi phân cực Chất tan ít phân cực sẽ bị lưu giữ trong cột lâu hơn chất

tan phân cực Do tính chất phân cực trung bình của các quinolon nghiên cứu nên

chúng tôi chọn pha động trên 2 kênh:

Kênh A: Dung dịch đệm Kênh B: MeCN

Tiến hành thực nghiệm khảo sát quá trình tách đối với 3 hệ dung môi được

sử dụng phổ biến với điều kiện đo như sau:

- Hệ 3: MeCN:dung dịch formic acid 1% (20:80)

Đo các dung dịch chuẩn đơn nồng độ 1ppm của 7 chất ta thu được sắc ký đồ

như hình 3.6

Hình 3.6: Kết quả khảo sát với 3 hệ dung môi: a) Hệ dung môi 1; b) Hệ dung môi 2; c)

hệ dung môi 3 (Nồng độ dung dịch chất khảo sát 1ppm(DNFX là 250ppb)

Nhận xét: cả 3 hệ dung môi đều có khả năng tách được hỗn hợp 7 chất phân

tích, tuy nhiên:

- Hệ 1 do sự có mặt của SDS đóng vai trò chất tạo cặp ion (ion pair reagent) với 1 đầu ưa nước (mạch 12 C) liên kết với mạch C18 của pha tĩnh, đầu kị nước (gốc SO42-) liên kết với các chất phân tích nhờ đó các chất bị lưu giữ trên cột với các lực liên kết có độ mạnh yếu khác nhau tùy thuộc vào giá trị pKa của nó Tuy nhiên hệ có thành phần phức tạp, không thể thực hiện quá trình lọc dung môi trước khi đưa vào chạy HPLC (do sự tạo bọt mạnh của chất hoạt động bề mặt SDS) vì vậy

độ lặp lại thời gian lưu của các píc chất chuẩn sau mỗi lần pha dung môi rất kém, quá trình rửa cột, rửa bơm sau mỗi lần phân tích rất khó khăn không thuận lợi khi phân tích số lượng mẫu lớn

- Hệ 2 và 3: thành phần đơn giản, dễ chuẩn bị, độ lặp lại của thời gian lưu tốt Tuy nhiên với hệ dung môi 3 píc các chất có hiện tượng doãng đuôi (tailing) do

đó chúng tôi lựa chọn hệ dung môi 2 cho quá trình thực nghiệm

3.1.2.2 Khảo sát tốc độ dòng pha động

Tốc độ pha động ảnh hưởng đến thời gian rửa giải và lượng dung môi tiêu tốn Nếu tốc độ quá nhỏ quá trình tách, thời gian lưu của các chất sẽ kém ổn định Tốc độ dòng cao, ảnh hưởng đến áp suất của toàn hệ thống.Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng dung môi: 1,0; 1,5; 2mL/phút lên quá trình tách các chất chọn tốc độ dòng tối ưu để có được píc sắc ký cân đối và thời gian phân tích phù hợp

Thực hiện khảo sát các dung dịch chuẩn đơn nồng độ 200ppb (DNFX là 50ppb), dung môi pha động MeCN: đệm acetat 50mM pH=4 (20:80) so sánh sắc ký

đồ của các chất tại các tốc độ dòng khác nhau

Hình 3.7: Sắc ký đồ OA và FMQ tại tốc độ dòng: 1,0; 1,5; 2,0mL/phút

Sắc ký đồ của các chất CPFX, DNFX, ERFX, SRFX, DFLX tại Phụ lục số 2

Nhận xét:

- Quan sát các sắc ký đồ tại Hình 3.6 nhận thấy không có sự khác biệt đáng kể

về độ cân đối của peak sắc ký khi xác định các chất với các tốc độ dòng khác nhau Tuy nhiên với tốc độ dòng là 1,0mL/phút thì sau 40 phút FMQ mới bị rửa giải; 1,5mL/phút là sau 27 phút; 2,0mL/phút là sau 20 phút Do đó để giảm thời gian phân tích mẫu chúng tôi chọn tốc độ dòng pha động là 2mL/phút áp suất hệ thống lúc này đạt 167bar (áp suất tối đa 400bar) hoàn toàn phù hợp cho hệ thống hoạt động ổn định

3.1.2.3 Khảo sát pH của pha động

Hầu hết các nghiên cứu khi tách hỗn hợp chất kháng sinh nhóm quinolone đều sử dụng hệ dung môi pha động trong khoảng pH từ 2,5-5 Chúng tôi thực hiện khảo sát pH của pha động tại các giá trị: 2,5; 3;3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6 trong khi cố định nồng độ dung dịch đệm là 50mM với tốc độ dòng 2mL/phút

Hình 3.8: Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký theo pH của dung dịch đệm pha động

Nhận xét: Với giá trị pH của pha động từ 2,5 đến 4,0 diện tích píc hầu như

không thay đổi khi giá trị pH thay đổi, trong khoảng pH từ 4,5 diện tích píc thay đổi

rõ rệt đặc biệt là đối với DFLX, OA và FMQ Nguyên nhân do ở pH cao trên 4,5 các chất phân tích tồn tại ở dạng ion (do giá trị pKa nằm trong khoảng từ 6,0 – 6,9)

có độ phân cực lớn do đó khả năng lưu giữ trên cột sắc ký giảm Từ nhận xét trên chúng tôi chọn pH=4 cho nghiên cứu tiếp theo nhằm thu được tín hiệu tốt nhất đồng thời kéo dài tuổi thọ của cột sắc ký

3.1.2.4 Khảo sát nồng độ đệm của pha động ở pH=4

Tiếp tục khảo sát các nồng độ khác nhau của các dung dịch đệm acetat có cùng pH=4 Sau khi chuẩn bị các dung dịch đệm acetat ở 20mM, 50mM và 100mM tại pH=4 đo các dung dịch chuẩn đơn các chất tại nồng độ 1ppm với tốc độ dòng 2mL/phút

Kết quả tách các chất trong hỗn hợp ở sắc ký đồ hình 3.9