NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH VÀ ỨNG DỤNG CỦA AMYLASE TỪ VI SINH VẬT DẠNG HÒA TAN, DẠNG CỐ ĐỊNH

Amylase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, tuy nhiên chúng không phải là sản phẩm sinh học vô tận sẵn có, vả lại việc tách chiết, tinh chế enzym rất tốn kém, nên việc sử dụng

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, các kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong

bất kỳ công trình nào

3

 Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu - Cán bộ giảng dạy bộ môn Sinh hóa -

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM, Cô đã tận tình hướng dẫn, luôn động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này

 Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:

- Quý Th ầy, Cô trực tiếp giảng dạy

- Phòng Khoa h ọc Công nghệ Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm

TP.HCM

- Ban Giám hi ệu - Trường phổ thông trung học chuyên Bến Tre

- TS Dương Thị Bạch Tuyết - Trưởng khoa Sinh trường Đại học Sư

phạm TP.HCM

- TS Tr ần Thanh Thủy và các Cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh - Sinh

- hóa - Trường Đại học Sư phạm TP HCM

- Các Cán b ộ phòng thí nghiệm Sinh hóa - Trường Đại học Khoa học Tự

LÊ THỊ HOÀNG HẠNH

2.3.1 Phương pháp thu nhận dịch chiết enzym amylase từ canh

trường Bacillus subtilis và Aspergillus oryzae [20], [23]45T 56

3.2.Hiệu suất thu nhận CPE amylase từ canh trường B.subtilis và A.oryzae

bởi các tác nhân tủa khác nhau45T 74

45T

3.3 Hoạt độ chung của CPE amylase thu được từ canh trường B.subtilis và A.oryzae bởi các tác nhân tủa khác nhau45T 75

45T

3.4 Hàm lượng protein trong CPE amylase thu được từ canh trường

B.subtilis và A.oryzae bởi các tác nhân tủa khác nhau45T 76

45T

3.4.1 Dựng đường chuẩn albumin45T 76

7

45T

3.4.2 Hàm lượng protein trong CPE amylase thu được từ canh trường

B.subtilis và A.oryzae bởi các tác nhân tủa khác nhau45T 77

45T

3.5 Hoạt độ riêng của CPE amylase thu được từ canh trường B.subtilis và A.oryzae bởi các tác nhân tủa khác nhau45T 78

45T

3.6 So sánh CPE amylase thu được từ canh trường B.subtilis và A.oryzae

với sản phẩm Termamyl 120L của hãng Novo45T 80

3.6.4 So sánh hoạt độ riêng của CPE amylase thu được từ canh

trường B.subtilis và A.oryzae với sản phẩm Termamyl 120L của hãng

3.9.2 Khảo sát quá trình thủy phân các loại tinh bột bởi CPE amylase

hòa tan thu được từ canh trường B.subtilis và A.oryzae theo thời gian45T

86

8

45T

3.10 Cố định enzym amylase của CPE B.subtilis và A.oryzae bằng phương

pháp hấp phụ lên oxyt nhôm, diatomite và màng chitosan45T 89

45T

3.10.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian gắn đến lượng protein cố

định của CPE B.subtilis và A.oryzae lên oxyt nhôm, diatomite và

màng chitosan45T 89

45T

3.10.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian gắn đến hoạt độ amylase

cố định của CPE B.subtilis và A.oryzae lên oxyt nhôm, diatomite và

màng chitosan45T 90

45T

3.10.3 Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzym amylase B.subtilis

cố định trên oxyt nhôm, diatomite và màng chitosan45T 91

45T

3.10.4 Khảo sát khả năng tái sử dụng của amylase A.oryzae cố định

của trên oxyt nhôm, diatomite và màng chỉtosan45T 92

3.11.6 So sánh hiệu quả sử dụng amylase cố định trên màng chitosan

hoạt hóa với amylase cố định trên màng chitosan chưa hoạt hóa45T 100

3.12.2 Khảo sát khả năng cố định protein của CPE amylase B.subtilis

và A.oryzae lên màng chitosan xốp theo thời gian gắn45T 103

45T

3.12.3 So sánh hiệu suất cố định protein lên màng chitosan và chitosan xốp của các CPE B.subtilis và A.oryzae theo thời gian45T 104

45T

3.12.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian gắn đến hoạt độ amylase

cố định của CPE amylase B.subtilis và A.oryzae lên màng chitosan

3.13.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của khối lượng màng chitosan xốp đến

lượng protein cố định của CPE amylase B.subtilis và A.oryzae45T 107

45T

3.13.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của khối lượng màng chitosan xốp đến

hoạt độ amylase cố định của CPE amylase B.subtilis và A.oryzae45T 109

45T

3.14 Khảo sát ảnh hưởng của kích thước màng chitosan xốp đến khả năng

cố định enzym45T 110

45T

3.14.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của kích thước màng chitosan xốp đến

lượng protein cố định của CPE amylase B.subtilis và A.oryzae45T 110

45T

3.14.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của kích thước màng chitosan xốp đến

hoạt độ amylase cố định của CPE amylase B.subtilis và A.oryzae45T 111

45T

3.15 So sánh khả năng phân giải tinh bột của enzym hòa tan và enzym cố định45T 113

4.1.1 Xác định các tác nhân tủa tối ưu để thu nhận CPE amylase từ

canh trường B.subtilis và canh trường A.oryzae45T 117

4.1.7 So sánh khả năng phân giải tinh bột và khả năng tái sử dụng

của amylase cố định lên màng chitosan chưa hoạt hóa và màng chitosan hoạt hóa45T 119

4.1.10 Ứng dụng CPE amylase dạng hòa tan và dạng cố định vào

việc thủy phân các loại tinh bột khác nhau45T 120

12

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

A.oryzae : Aspergillus oryzae B.subtilis : Bacillus subtilis

CPE : Chế phẩm enzym

CT : Canh trường ĐVHĐ : Đơn vị hoạt độ HđR : Hoạt độ riêng HLpr : Hàm lượng protein

HS : Hiệu suất HSPL : Hệ số pha loãng

13

LỜI NÓI ĐẦU

Enzym là protein nhưng kỳ diệu hơn mọi protein, bởi nó có đầy đủ mọi tính chất của chất xúc tác hóa học nhưng siêu việt hơn hẳn Mặc dù tồn tại trong

tế bào với số lượng không đáng kể nhưng chúng thực hiện những chuyển hóa

hết sức đa dạng, với tốc độ cực kỳ nhanh chóng và dễ dàng ngay ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường, đảm bảo cho các "nhà máy" tế bào "vận hành"

và "sản xuất" một cách nhịp nhàng, chính xác Có thể khẳng định rằng không

thể hiểu biết sự sống nếu không hiểu biết về enzym

Trong thế giới sống có hàng ngàn loại enzym khác nhau, mỗi enzym đều là

"tác phẩm" kỳ diệu của tự nhiên Amylase, loại enzym phân giải tinh bột mang

lại vị ngọt cho thiên nhiên và con người, cũng không nằm ngoài các "tác phẩm"

đó Đã có rất nhiều công trình khoa học nghiên cứu về enzym nói chung cũng như amylase nói riêng Từ những năm đầu của thế kỷ 18, các nhà khoa học đã

bắt đầu nghiên cứu về amylase và đến nay đã biết khá rõ về nó Hiện nay amylase là một trong những hệ enzym quan trọng nhất của ngành công nghệ sinh học bởi vì chúng có những ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp lên men, công nghiệp dệt Tiếp tục tìm hiểu, khám phá những bí ẩn về cấu trúc và đặc tính

của amylase để nâng cao hiệu suất xúc tác của chúng là đề tài hấp dẫn đối với nhiều người

Amylase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, tuy nhiên chúng không phải là sản phẩm sinh học vô tận sẵn có, vả lại việc tách chiết, tinh chế enzym rất tốn kém, nên việc sử dụng tiết kiệm enzym, cụ thể là tái sử dụng lại chúng là điều hết sức cần thiết, cố định enzym lên những chất mang trơ đã góp

phần giải quyết được vấn đề này

Kỹ thuật cố định enzym bắt đầu được nghiên cứu vào những năm 50 của

thế kỷ 20 và sau 20 năm đã được ứng dụng vào công nghệ với qui mô lớn ở các

14

nước phát triển, ở Việt Nam, việc nghiên cứu cố định enzym chỉ bắt đầu vài năm gần đây và còn rất hạn chế, ứng dụng amylase cũng như enzym cố định nói chung vào các qui trình công nghệ lại càng hạn chế hơn

Xuất phát từ cơ sở trên chúng tôi đã chọn đề tài cho luận văn là "Nghiên cứu các đặc tính và ứng dụng của amylase từ vi sinh vật dạng hòa tan, dạng

c ố định"

 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Amylase được tổng hợp bởi nhiều chủng vi sinh vật khác nhau, tuy nhiên

vi khuẩn B.subtilis và nấm mốc A.oryzae được coi là những chủng "sung mãn"

trong sản xuất loại enzym này Vì vậy, trong luận văn này, chúng tôi chọn amylase của hai chủng B.subtilis và A.oryzae để nghiên cứu

• Do trong hệ enzym amylase của B.subtilis chỉ có 𝛼-amylase và hệ enzym

amylase của A.oryzae chứa phần lớn là 𝛼-amylase còn các amylase khác như

𝛾-amylase (gluco𝛾-amylase) chỉ chiếm một lượng rất ít nên khi xác định hoạt độ amylase chúng tôi chọn phương pháp xác định hoạt độ 𝛼-amylase theo Smith và Roe

 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

• Từ các canh trường vi khuẩn B.subtilis và nấm mốc A.oryzae, chúng tôi

tiến hành tách chiết enzym amylase, khảo sát các tác nhân tủa khác nhau (etanol 96°C, aceton, muối sunfate amon và PEG 4000) nhằm thu nhận CPE amylase

với hiệu suất và hoạt độ cao nhất

• Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH lên hoạt độ của amylase từ đó rút

ra nhiệt độ, pH tối ưu cho hoạt động của amylase

• Khảo sát khả năng cố định amylase lên các chất mang: oxyt nhôm, diatomite, chitosan theo thời gian So sánh và lựa chọn chất mang và thời gian thích hợp nhất để cố định amylase

15

• Khảo sát khả năng cố định amylase lên chitosan đã được hoạt hóa bằng glutaraldehyde ở các nồng độ khác nhau, từ đó tìm ra nồng độ glutaraldehyde thích hợp nhất để hoạt hóa chitosan cho hoạt độ của amylase cố định cao nhất

• Cải biến chitosan để khắc phục một trong những nhược điểm vốn có của

nó như độ trương và diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ từ đó nâng cao hiệu suất cố định amylase lên chất mang này

• Khảo sát hiệu quả sử dụng lặp lại nhiều lần của amylase cố định

• Khảo sát khả năng ứng dụng của amylase dạng hòa tan và dạng cố định vào việc thủy phân các loại cơ chất khác nhau: bột gạo, bột mì, bột bắp

 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

• Sử dụng amylase dạng hòa tan từ canh trường vi khuẩn B.subtilis và nấm

mốc A.oryzae phân giải các loại tinh bột ở điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu, thời gian thích hợp để đạt hiệu suất thủy phân cao nhất

• Sử đụng chitosan - sản phẩm deacetyl của chitin, nguồn nguyên liệu phổ

biến trong tự nhiên, nguồn phế thải từ các nhà máy chế biến thủy hải sản - cải

biến chúng thành vật liệu có khả năng cố định enzym cao, hoạt độ enzym cố định ổn định và đồng thời góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường

16

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYM [5], [23]

Sự sống là quá trình trao đổi chất liên tục, sự trao đổi chất ngừng thì sự

sống không còn tồn tại Để thực hiện sự trao đổi chất, trong cơ thể diễn ra một cách liên tục, nhịp nhàng hàng ngàn, hàng vạn những quá trình hóa học phức

tạp có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau Trong những quá trình hóa học ấy hầu như tất cả đều có sự tham gia của chất xúc tác tự nhiên hay còn gọi là chất xúc tác sinh học

Chất xúc tác này có trong mọi tế bào của cơ thể sống Nhờ chất xúc tác sinh học mà các quá trình sinh học trong cơ thể có thể xảy ra rất nhạy với tốc độ

rất nhanh trong những điều kiện sinh lý bình thường của cơ thể sống Những

chất xúc tác này được gọi là enzym Điều kỳ diệu nữa là enzym không chỉ xúc tác cho các phản ứng hóa học nhất định trong các tế bào cơ thể sống (invivo) mà

nó còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (invitro)

1.1.1 C ấu tạo hóa học và cơ chế tác dụng của enzym

1.1.1.1 C ấu tạo hóa học của enzym [4], [7], [25]

* B ản chất protein của enzym

Năm 1930, Northrop và Kunitz đã thu nhận tinh thể protein của pepsin và trypsin và họ cũng chứng minh rằng các tinh thể protein này là enzym Sau đó nhiều nhà nghiên cứu cũng thu nhận được nhiều enzym khác nhau ở dạng tinh

thể và xác định rằng chúng đều là protein, do đó đã đi đến định nghĩa enzym là protein có hoạt tính xúc tác

Enzym được cấu tạo từ các L-𝛼- acid amin liên kết với nhau bởi các liên

kết peptide tạo thành chuỗi polypeptide Có loại enzym do một chuỗi polypeptide tạo nên nhưng cũng có nhiều enzym được cấu tạo từ nhiều đơn vị

nhỏ, mỗi đơn vị là một chuỗi polypeptide Về hình dạng, phần lớn enzym thuộc

tố này để kìm hãm hoạt tính enzym khi cần thiết

* C ấu trúc phân tử enzym

Dựa vào thành phần hóa học, người ta chia enzym thành hai loại: enzym

một cấu tử và enzym hai cấu tử

Enzym một cấu tử: là enzym trong thành phần cấu tạo chỉ có protein, các

enzym hydrolase thuộc loại này

Enzym hai cấu tử: là enzym trong thành phần cấu tạo ngoài protein

(apoenzym) còn có phần không phải protein gọi là nhóm ngoại (coenzym) Nhóm ngoại thường là các dẫn xuất của vitamin, nucleotide, các kim loại

Apoenzym quyết định tính đặc hiệu cao và làm tăng hoạt độ xúc tác của enzym Coenzym quyết định kiểu phản ứng mà enzym xúc tác, trực tiếp tham gia phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzym đối với các yếu tố gây biến tính

18

Trong quá trình xúc tác, chỉ một phần rất nhỏ của phân tử enzym tham gia

kết hợp đặc hiệu với cơ chất và quyết định hoạt độ xúc tác của enzym Phần đó được gọi là trung tâm hoạt động của enzym Có enzym chỉ có một trung tâm

hoạt động nhưng cũng có enzym có hai hay nhiều trung tâm hoạt động

1.1.1.2 Cơ chế tác dụng của enzym [25], [35]

Theo quan điểm hiện nay trong phản ứng có xúc tác enzym, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzym-cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa, bởi lẽ khi

cơ chất kết hợp vào enzym do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới

sự thay đổi động năng cũng như thế năng, kết quả làm cho phân tử cơ chất trở nên linh động hơn nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng

Năng lượng hoạt hóa khi có enzym xúc tác không những nhỏ hơn rất nhiều

so với trường hợp không có xúc tác mà còn nhỏ hơn so với cả trường hợp có

chất xúc tác thông thường

Bằng thực nghiệm cho thấy rằng quá trình tạo thành phức enzym-cơ chất (ES) và biến đổi phức hợp này thành sản phẩm (P) và giải phóng enzym tự do (E) thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ: E + S → ES → P + E

Giai đoạn 1: Enzym kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức enzym-cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra rất nhanh, đòi hỏi năng lượng

hoạt hóa thấp

Giai đoạn 2: Xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng

Giai đoạn 3: Tạo thành sản phẩm, còn enzym được giải phóng dưới dạng

tự do như ban đầu

Ở giai đoạn kế tiếp, nếu V xấp xỉ giá trị cực đại thì nó hoàn toàn không

phụ thuộc vào cơ chất

Giai đoạn tiếp theo, nếu nồng độ cơ chất tiếp tục tăng cao thì hầu như V không tăng nữa mà chỉ lân cận giá trị VR max R bởi vì các enzym đã bão hòa cơ chất

 N ồng độ enzym

Trong trường hợp thừa cơ chất, nồng độ enzym tăng sẽ làm V tăng Sự tăng V trong tế bào sinh vật lại phụ thuộc rất nhiều vào khả năng điều hòa của gen Nhìn chung V phụ thuộc tuyến tính với lượng enzym

V= K [E]

Trong đó: V: tốc độ phản ứng

[E]: nồng độ enzym K: hằng số vận tốc phản ứng

 Nhi ệt độ

Bản chất enzym là protein, do đó nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc

của chúng Tốc độ phản ứng enzym chỉ có thể tăng ở giới hạn nhiệt độ nào đó khi mà protein chưa bị phá vỡ cấu trúc Đại lượng biểu thị cho ảnh hưởng của nhiệt độ đến V của enzym là hệ số nhiệt Q10, hệ số này càng lớn, phản ứng càng khó xảy ra ở nhiệt độ thường Hệ số Q10 của phản ứng enzym là 1-2, của

phản ứng hóa học là 2-3

Ứng với nhiệt độ mà tại đó V đạt giá trị cực đại gọi là nhiệt độ tối ưu của enzym (t°R opt R) Đa số các enzym có t°R opt R nằm trong khoảng 45-55°C

20

 pH môi trường

pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzym và ảnh hưởng đến độ

bền của protein enzym Do đó V enzym sẽ tăng dần đến giá trị cực đại và sau đó

sẽ giảm dần Đa số enzym bền ở pH 5-9, độ bền của enzym tăng nếu có mặt cơ

chất và coenzym hoặc CaP

2+

P

Mỗi enzym có một giá trị pH tối ưu (pHR opt R), tại đó V đạt VR max R Mọi giá trị

pH khác pHR opt R, V phản ứng đều giảm so với VR max R

 Các ch ất kìm hãm

• Các chất kìm hãm cạnh tranh

Các chất này có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất Vì thế chúng

có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzym Kết quả là một số trung tâm hoạt động của enzym bị chất kìm hãm chiếm mất, do đó cơ chất mất

một phần khả năng tương tác, làm cho tốc độ phản ứng giảm

• Các ch ất kìm hãm không cạnh tranh

Khác với kiểu cạnh tranh trên, chất kìm hãm không cạnh tranh sẽ kết hợp

với enzym ở một vị trí không phải là trung tâm hoạt động của enzym, kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzym Như vậy phức hợp

EI (enzym và chất kìm hãm) này sẽ làm thay đổi theo hướng không có lợi cho xúc tác enzym Sau khi tạo thành phức hợp EI, chất kìm hãm vẫn có khả năng

kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS như các phản ứng sau:

E + I = EI

EI + S = EIS Hay E + S = ES

ES + I = ESI

• Kìm hãm b ởi sản phẩm của phản ứng

Các sản phẩm tạo thành do các phản ứng enzym có thể trở thành chất kìm hãm tốc độ của chính phản ứng đó Giả sử nếu có một phản ứng kiểu:

SR 1 R+SR 2 R=PR 1 R+PR 2

21

Do tính thuận nghịch của phản ứng trên, các enzym có ái lực với PR 1 R và PR 2 R

tương đương với SR 1 R và SR 2 R, trong trường hợp như thế PR 1 R và PR 2 Rđược coi như chất kìm hãm cạnh tranh với SR 1 R và SR 2 R

1.1.2 Ngu ồn thu nhận enzym [21], [23]

Enzym là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và được tổng hợp ở

mọi cơ thể sống vì thế enzym có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, động vật, VSV Tuy nhiên việc khai thác enzym từ thực vật và động vật thường gặp khó khăn vì nguồn nguyên liệu thu nhận hạn chế, hiệu suất

thấp nên giá thành cao Hiện nay phần lớn enzym được thu nhận từ VSV vì so

với việc thu nhận enzym từ động vật và thực vật, việc sản xuất enzym từ VSV

có những ưu điểm nổi bật sau:

- Vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng, phát triển và sinh sản cực kỳ nhanh,

tổng hợp enzym với cường độ rất mạnh, vì thế trong một thời gian ngắn có thể thu được một lượng enzym rất lớn

- Hệ enzym của vi sinh vật rất phong phú Từ các chủng VSV khác nhau ta

có thể thu nhận được nhiều loại enzym khác nhau trong đó có những enzym chuyên biệt chỉ có ở VSV mà hầu như không thấy ở các động vật, thực vật

- Môi trường nuôi cấy VSV đơn giản, rẻ tiền, thường là những phế phụ liệu

của ngành công nghiệp nên giá thành thu nhận sản phẩm enzym rẻ hơn và dễ áp

dụng cho các cơ sở sản xuất

- VSV chịu ảnh hưởng rất lớn bởi thành phần dinh dưỡng hoặc các tác động của môi trường do đó người ta có thể thay đổi thành phần dinh dưỡng

- Sản xuất enzym từ VSV có thể thực hiện trên qui mô công nghiệp, tự động hóa và cơ giới hóa

- Việc sử dụng enzym VSV rất tiện lợi, với nhiều hình thức như bổ sung

chế phẩm enzym VSV vào cơ chất hoặc nuôi VSV tổng hợp enzym ngay trên cơ

chất, VSV sẽ tổng hợp enzym phân giải cơ chất trong quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng

1.1.3 Tách chi ết enzym từ các nguồn nguyên liệu [4], [18], [20]

Hiện nay, về cơ bản người ta thường dùng các phương pháp sau đây để thu

nhận enzym:

 Đối với enzym ngoại bào: để thu dịch enzym, người ta tách sinh khối và

các chất cặn bã khỏi canh trường bằng phương pháp ép lọc hoặc ly tâm Với

việc sử dụng thêm các chất trợ lọc (diatomite, than hoạt tính ) hoặc các chất

tạo kết tủa nếu cần thiết để các chất này dễ dàng bị lắng cặn kéo theo sinh khối giúp quá trình lọc sẽ dễ dàng hơn

 Đối với enzym nội bào: cần phải phá vỡ tế bào để giải phóng enzym bằng

thủy phân, như vậy thành tế bào sẽ bị phá vỡ

Sau khi phá vỡ tế bào, các enzym được tách chiết bằng các dung môi khác nhau như nước, dung dịch đệm, muối trung tính Đa phần các enzym thủy phân tan tốt trong nước, do đó nước là dung môi tốt nhất để chiết rút enzym, có thể thêm một ít focmalin để sát trùng Nhiệt độ nước để chiết thường từ 25-28°C là thích hợp Cần làm lạnh nhanh dịch chiết xuống 10-12°C để ngăn cản VSV lạ phá hỏng dịch enzym

1.1.4 Tinh s ạch enzym [24]

Phần dịch chiết enzym thu được bằng các phương pháp trên gọi là dung

dịch enzym thô vì ngoài enzym cần tách chiết, trong dung dịch còn nhiều tạp

chất khác như muối, đường, các protein Để thu được CPE có độ tinh khiết hơn

ta cần phải tiến hành tinh sạch enzym Việc tinh sạch enzym có thể được thực

hiện theo nhiều phương pháp và qua nhiều giai đoạn khác nhau

1.1.4.1 Phương pháp tủa enzym bằng các tác nhân tủa [6], [11], [17], [20]

* K ết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ

Dung môi hữu cơ dùng để tủa enzym bao gồm etanol, aceton, izopropanol Các loại dung môi này làm giảm hằng số điện môi của môi trường nghĩa là làm

giảm khả năng hòa tan của những phân tử nước bao quanh phân tử protein Do

24

đó, các phân tử protein enzym, các protein khác cũng như các tạp chất phân tử

lớn có thể tương tác với nhau tạo thành một tập hợp và sẽ lắng xuống

Kết tủa enzym bằng aceton, etanol 96° có nhiều thuận lợi vì nó tương đối

rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzym Do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi CPE bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió

Tuy nhiên khi sử dụng dung môi hữu cơ làm tác nhân tủa enzym có một

vấn đề cần quan tâm là khả năng biến tính không thuận nghịch của protein và

muốn đạt hiệu quả kết tủa cao, dung môi phải được trộn đều hoàn toàn với nước, có tính ưa nước và quá trình phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp để tránh

biến tính enzym

Khi cần tách riêng biệt một enzym nào đó ra khỏi hỗn hợp enzym, người ta

dựa trên độ hòa tan khác nhau của các enzym ở các nồng độ dung môi khác nhau bằng phương pháp kết tủa phân đoạn

* K ết tủa enzym bằng muối trung tính

Muối trung tính dùng để kết tủa enzym là sunfate amon ((NHR 4 R)R 2 RSOR 4 R), Sunfate magie (MgSOR 4 R), Clorua natri (NaCl)

Các phân tử protein trong dung dịch được một lớp vỏ nước (hydrat) che

chắn, bao bọc các phần kị nước trên bề mặt Ở nồng độ muối thấp, đa phần protein và enzym có độ hòa tan lớn, chỉ có một số tạp chất kết tủa Khi tặng

nồng độ muối đến một lúc nào đó, có hiện tượng tranh giành lớp vỏ hydrat của các phân tử protein nên các phân tử protein sẽ gắn kết lại với nhau tạo sự lắng

tủa Ở nồng độ muối bão hòa thì toàn bộ các protein hay enzym đều tủa hết

Mỗi protein hay enzym sẽ kết tủa ở những nồng độ muối khác nhau vì vậy

có thể dùng nồng độ muối để tách riêng các enzym ra khỏi hỗn hợp của chúng Trong các loại muối trung tính dùng tủa enzym, sunfate amon được dùng

phổ biến nhất vì độ hòa tan của chúng cao, phản ứng kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ và chúng không làm biến tính các enzym Tuy nhiên, nhược điểm

25

lớn nhất của phương pháp này là lượng muối trung tính dùng quá nhiều, thường 50-60% so với dịch chiết enzym và lượng muối này không thể thu hồi lại được, đồng thời sản phẩm còn lẫn nhiều muối nên phải dialise để tách muối

* K ết tủa enzym bằng polymer không phân cực

Polymer không phân cực được sử dụng nhiều nhất hiện nay là polyethylenglycol (PEG) có trọng lượng phân tử từ 400-7500 Cơ chế này gần

giống với cơ chế kết tủa protein bằng dung môi, nghĩa là quá trình này sẽ tạo ra

một quần hợp protein do sự giảm mức độ hydrat hóa của nó

Ưu điểm của phương pháp này là có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng và chỉ

cần một lượng polymer nhỏ nồng độ khoảng 10-20% (trọng lượng/ thể tích)

Nếu nồng độ cao hơn sẽ làm dung dịch trở nên quá nhớt và gây ra hàng loạt khó khăn sau này

* K ết tủa enzym ở điểm đẳng điện

Protein có một tính chất đặc biệt là chúng có độ hòa tan rất thấp ở điểm đẳng điện Trong cấu trúc protein tồn tại nhóm acid và nhóm kiềm nên chúng có tính chất lưỡng tính Tùy theo pH môi trường mà protein di chuyển về cực âm hay dương

Giá trị pH mà tại đó điện tích toàn phần của protein bằng không cho nên protein hay enzym không di chuyển về cực nào gọi là pH đẳng điện (pI) Ở điểm này, độ hydrat hóa của protein là cực tiểu, điều đó sẽ làm gia tăng tương tác giữa các protein với nhau dẫn tới hiện tượng lắng tủa

Mỗi enzym có một giá trị pI riêng, nếu thay đổi pH của dung dịch có thể

kết tủa các loại enzym khác nhau ở pI tương ứng của chúng

1.1.4.2 Phương pháp sắc ký rây phân tử (lọc gel) [11], [14]

Phương pháp này có khả năng tách, phân tích, xác định kích thước và trọng lượng phân tử của các hợp chất cao phân tử, các protein

Để tách phân đoạn enzym dựa trên trọng lượng phân tử người ta sử dụng các gel có kích thước lỗ khác nhau như sephadex, biogel, sepharose Gel chính

26

là các mạng lưới phân tử có cấu trúc không gian ba chiều ghép hở ở dạng hạt Gel được sử dụng chủ yếu hiện nay là sephadex Do có nhiều liên kết tạo thành

một mạng lưới nên sephadex có khả năng hút nước và trương nở Khi ngâm các

hạt gel trong nước vài giờ sẽ tạo thành hai pha:

- Pha mạng: gồm các mạng lưới liên kết trong hạt gel

- Pha kẽ: nằm giữa các hạt gel và được phủ đầy dung môi hoặc nước

Nguyên tắc của phương pháp này là khi cho một dung dịch chứa các phân

tử có trọng lượng khác nhau đi qua cột chứa các hạt gel đã trương nở thì những phân tử có kích thước nhỏ sẽ lọt vào bên trong lỗ gel (pha mạng) và do dó sẽ di chuyển chậm qua cột, còn những phân tử có kích thước lớn hơn lỗ gel sẽ di chuyển bên ngoài các hạt gel (pha kẽ) nên sẽ di chuyển nhanh và được súc giải

ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ Kết quả là tách được các chất có trọng lượng phân tử khác nhau thành các phân đoạn theo trình tự: các phân đoạn có

trọng lượng phân tử lớn sẽ ra trước, các phân đoạn có trọng lượng phân tử nhỏ

sẽ ra sau và cuối cùng là muối khoáng, ion

ổn định Ngoài ra, hình dáng, trọng lượng phân tử protein, cường độ điện trường, nhiệt độ, tính chất của giá mang cũng ảnh hưởng ít nhiều lên sự di chuyển của protein

Quá trình phân tách enzym bằng phương pháp điện di dựa trên sự khác nhau về tốc độ di chuyển của các phân tử protein mang điện tích khác nhau trong điện trường Phương pháp này được sử dụng để phân tách hỗn hợp các

27

chất, đánh giá độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử protein dựa trên sự

so sánh với một thang phân tử lượng của một sốprotein chuẩn có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết

1.2 ENZYM AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG

1.2.1 Lược sử nghiên cứu enzym amylase [2], [12], [26]

Những nghiên cứu đầu tiên về enzym amylase được bắt đầu vào những năm đầu thế kỷ 19 Năm 1814 , Kirchoff đã phát hiện ra khả năng thủy phân tinh bột của dịch chiết lúa đại mạch nẩy mầm Đến năm 1833, Payen và Persor

lần đầu tiên tách được ở dạng kết tủa chất phân giải tinh bột bằng cách thêm etanol vào dịch chiết của mầm đại mạch Chất kết tủa này được đặt tên là diastase (xuất phát từ chữ Hy Lạp có nghĩa là phân giải) Sau này theo đề nghị

của Duclo, enzym phân giải tinh bột được gọi là amylase

Có rất nhiều công trình nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng các enzym amylase Vào năm 1862, Danilevxki đã tách được amylase của tuyến tụy

bằng phương pháp hấp phụ chọn lọc Đến năm 1894, lần đầu tiên amylase được

sản xuất ở qui mô công nghiệp, nó có nguồn gốc từ nấm mốc và được sử dụng như một loại dược phẩm để chữa bệnh về tiêu hóa

Việc khám phá ra glucoamylase và xác định vai trò chủ chốt của nó trong quá trình thủy phân tinh bột có mối quan hệ chặt chẽ với việc nghiên cứu các enzym dùng trong công nghiệp rượu Năm 1947, Le Mense và cộng sự có nhận xét là một số loài nấm mốc thủy phân tinh bột tạo ra một lượng lớn glucose Năm 1948, Corman và Langlykke khi nghiên cứu các enzym của nấm mốc

Rhizopus và Aspergillus cũng thấy rằng cùng với 𝛼-amylase trong canh trường

lỏng còn có một enzym khác có khả năng thủy phân tinh bột, 𝛼-dextrin maltose đến glucose, đó chính là glucoamylase Glucoamylase được tách ra đầu tiên từ

A.awamori và được gọi là 𝛾-amylase Các nghiên cứu về tinh chế glucoamylase,

cơ chế và tính chất của nó được tiến hành mạnh mẽ vào những năm 60

-Các loại amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về tính

chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân

1.2.2.1 𝜶-amylase: (𝜶-1,4 glucan-4-glucanhydrolase, EC.3.2.1.1)

[2], [27]

* C ấu tạo

𝛼-amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng 50.000→60.000 (phân tử lượng của 𝛼-amylase B.subtilis là 47.000 và của 𝛼- amylase A.oryzae là 52.600)

Cấu trúc cơ bản của 𝛼-amylase gồm ba tiểu đơn vị A là tiểu đơn vị lõi có

cấu trúc đặc trưng helix (𝛼 /𝛽)8- barel, được nối với tiểu đơn vị C (C-terminal)

có cấu trúc 8 đoạn 𝛽-sheet song song Tiểu đơn vị B gồm hai đoạn 𝛽-sheet được

lồng vào giữa đoạn 𝛽-sheet thứ 3 và 𝛼-helix thứ 3 của tiểu đơn vị A Tiểu đơn

vị B quyết định độ bền hoạt độ enzym và liên kết enzym-cơ chất, nó cũng ảnh hưởng số lượng các isoform và các tính chất đặc biệt của các isoform này Có

một ion canxi nối giữa tiểu đơn vị A và B, tuy nhiên ở 𝛼-amylase của nấm mốc

29

liên kết này yếu và có thể bị hạn chế Tuy thuộc vào dạng enzym, có thể có một

số tiểu đơn vị khác được gắn với đầu C-terminal hoặc đầu N-terminal của phân

tử protein

Hình 1.1: c ấu trúc phân tử 𝛂-amylase [41]

𝛼-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần acid amin khác nhau,

mỗi loại 𝛼-amylase được cấu tạo từ một tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng, song chúng đều có khá nhiều tyrosin và tryptophan Các acid glutamic và acid aspartic chiếm khoảng 1/4 tổng lượng acid amin cấu thành phân tử enzym Trong α-amylase có rất ít methionin và chỉ có khoảng 7-10 gốc cystein, trừ α-amylase của B.subtilis không có các liên kết disunfit và disunithidrin

Trung tâm hoạt động của α-amylase có chứa nhiều nhóm -COOH, -NHR 2 R

* Tính ch ất

pH tối ưu của 𝛼-amylase phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc enzym Nhìn chung pH tối ưu nằm trong khoảng acid yếu 4,8 - 6,9 Tuy nhiên có một số amylase chịu acid cao như 𝛼-amylase từ B.acidocaldarious (pH R opt R 3,5) và chịu

kiềm mạnh như 𝛼-amylase từ B.licheniformis (pH R opt R 9,0)

Điểm đẳng điện của 𝛼-amylase nằm trong vùng pH 4,2-5,7, 𝛼-amylase của

nấm mốc hoạt động mạnh ở pH 4,5-4,9; vi khuẩn 5,9-6,1, nếu pH < 3 đa số

𝛼-30

amylase bị vô hoạt hoàn toàn trừ 𝛼-amylase của A.niger có thể chịu được pH

2,5-2,8

Nhiệt độ hoạt động tối ưu của 𝛼-amylase cũng phụ thuộc vào nguồn gốc

của enzym Nhìn chung 𝛼-amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác và nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 40-50°C nhưng có thể đạt tới giá trị gần 70 -80°C đối với 𝛼 -amylase của vi khuẩn chịu nhiệt B.licheniformis, B.sterothermophilus

Sự có mặt của ion canxi (CaP

2+

P

) trong cấu trúc 𝛼-amylase cho phép cải thiện

độ ổn định của 𝛼-amylase đối với sự thay đổi của pH, nhiệt độ cũng như các tác nhân gây biến tính khác Tất cả các 𝛼-amylase đều bị kìm hãm bởi kim loại

𝛼-1,4-bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp (không cho màu với iod), ngoài ta còn

số các enzym này là 𝛽-amylase của B.polymyxa và mầm đỗ xanh (Mikami và

Morita, 1988) Nghiên cứu các chuỗi acid amin này thấy một tỉ lệ giống nhau khoảng 32%, đặc biệt với hai vùng tham gia vào quá trình thủy phân Có hai nhóm tiol, trong đó có một nhóm hoạt động hơn tham gia trực tiếp hay gián tiếp vào quá trình thủy phân

𝛽-amylase chịu nhiệt kém hơn 𝛼-amylase nhưng bền với acid hơn, ngay ở

pH 3-4 chúng vẫn hoạt động nhưng ở nhiệt độ 70°C lại bị bất hoạt Nhiệt độ

hoạt động tối thích của 𝛽-amylase là 50°C, pH 5,0 - 6,0 và chúng cũng bị kìm hãm bởi CuP

𝛼-1,4-tuần tự từng gốc maltose từ đầu không khử của mạch Do enzym này không

thủy phân được liên kết 𝛼-l,6-glucoside ở amylopectin nên kết quả thủy phân

cuối cùng thường gồm 54-58% maltose và 42-46% dextrin phân tử lớn

1.2.2.3 𝜸-amylase (glucoamyla.se, EC.3.2.I.3) [20], [27]

* C ấu tạo

𝛾-amylase được tạo ra chủ yếu từ nấm mốc, chiếm tỉ lệ nhỏ trong hệ amylase của A.oryzae và không có trong hệ amylase của B.subtilis

32

𝛾-amylase là các protein có khối lượng phân tử dao động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 tuy thuộc vào nguồn gốc của enzym

Nhìn chung các 𝛾-amylase đều có chứa các gốc methionin, tryptophan và

nửa gốc cystein Tất cả các 𝛾-amylase từ nấm mốc đều là glucoprotein, chứa 20% glucid trong đó chủ yếu là các monosaccharide glucose, manose, galactose

5-và glucosamin

Hình 1.3: C ấu trúc phân tử 𝛄-amylase [45]

* Tính ch ất

Đa số 𝛾-amylase đều thuộc loại enzym "acid tính", pH tối ưu 4,5-5,0 So

với 𝛼-amylase, chúng bền với acid hơn nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng

của aceton, etanol Nhiệt độ hoạt động tối thích của 𝛾-amylase 40-60°C và mất

33

Ngoài các liên kết 𝛼-l,4-glucoside và 𝛼-l,6-glucoside, 𝛾-amylase còn có

khả năng thủy phân cả các liên kết 𝛼-1,2 và 𝛼-l,3-glucoside nữa (Sawasaki, 1960; Ucyama et ai., 1965; Watanabe, Fukimbara,1965,1966).Vì thế, 𝛾-amylase

có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, dextrin cuối, panose và maltose thành glucose mà không cần có sự tham gia của các amylase khác

1.2.3 Ứng dụng của amylase [13], [23]

Amylase là hệ enzym thủy phân có ứng dụng rộng rãi nhất CPE amylase được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, lên men, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy Hàng năm trên thế giới, khối lượng chế

phẩm các enzym amylase được sản xuất đến hàng chục vạn tấn và ngày càng tăng, trong đó chủ yếu là amylase của VSV

Ở nước ta amylase VSV cũng được sử dụng để sản xuất rượu, sản xuất mật tinh bột và đang có những nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm amylase để sản

xuất glucose, các loại đường mật tinh bột khác để áp dụng trong sản xuất bia thay thế malt, trong rũ hồ vải, trong y học, nông nghiệp

1.2.3.1 Ứng dụng amylase trong sản xuất rượu [ 13], [ 16], [26]

Việc dùng chế phẩm amylase của VSV ở giai đoạn đường hóa trong sản

xuất rượu, cồn đã rút ngắn quá trình sản xuất, tăng hiệu suất rượu do khả năng

thủy phân sâu sắc của phức hệ enzym VSV

Người ta thường dùng hỗn hợp canh trường bề mặt hay bề sâu của

A.usamii, A.awamori, A.oryzae, Rhizopus để đường hóa So sánh quá trình thủy phân tinh bột bằng malt và bằng chế phẩm amylase nấm mốc thì thấy rằng khi đường hóa bằng malt tạo ra 71% maltose, 24-28% glucose, còn bằng amylase

nấm mốc sẽ có 14-21% maltose, 80-85% glucose Sản phẩm cuối cùng của sự

thủy phân tinh bột bởi amylase nấm mốc chủ yếu là glucose, đường dễ lên men,

do đó sự lên men rượu xảy ra nhanh hơn Còn chế phẩm amylase từ vi khuẩn

B.subtilis, B.diastaticus chịu nhiệt độ cao dùng trong giai đoạn dịch hóa tinh bột lúc đầu trước khi đường hóa thì rất thích hợp

34

1.2.3.2 Ứng dụng amylase trong sản xuất bia [23], [26]

Hiện nay người ta đã sử dụng rộng rãi chế phẩm amylase của nấm mốc

A.oryzae, A.niger, A.awamori và c ủa vi khuẩn B.subtilis, B.diastaticus để

đường hóa thay malt Dùng chế phẩm amylase VSV có thể thay thế từ 50-100% malt bằng nguyên liệu khác như bột gạo, bột bắp, bột sắn nhưng thông thường thay thế từ 50-60% malt thì chất lượng bia tốt hơn, thơm ngon hơn

Việc sử dụng chế phẩm amylase thay thế malt đã tiết kiệm được hàng vạn

tấn malt đại mạch loại tốt, giảm giá thành sản phẩm, rút ngắn được qui trình sản

xuất Đối với Việt Nam và một số nước phải nhập malt với giá thành cao từ nước ngoài thì biện pháp trên càng có ý nghĩa to lớn và cần thiết trong công nghiệp sản xuất bia

1.2.3.3 Ứng dụng amylase trong trong sản xuất bánh mì [10],

[23]

Trong sản xuất bánh mì người ta thường sử dụng chế phẩm amylase của

nấm mốc A.oryzae, A.awamori hay của vi khuẩn, nhưng chế phẩm amylase từ

nấm mốc áp dụng có hiệu quả và rộng rãi hơn

Khi thêm 0,002-0,05% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ tăng cường quá trình lên men bột, tăng thể tích bánh lên 15-25%, màu sắc vỏ bánh đẹp hơn, ruột bánh xốp và sáng màu hơn, tăng hương vị thơm ngon của bánh Khi làm bánh

mì ngọt, nếu thêm chế phẩm amylase vào bột sẽ xảy ra quá trình thủy phân tinh

bột thành đường, do đó giảm lượng đường tiêu tốn cho quá trình sản xuất

1.2.3.4 Ứng dụng amylase trong sản xuất mật tinh bột, maltose, glucose [2]

Trước đây các sản phẩm mật tinh bột (mật glucose, mật maltose) được sản

xuất bằng phương pháp thủy phân tinh bột bằng acid hay bằng malt Ngày nay người ta sử dụng rộng rãi chế phẩm amylase VSV trong sản xuất các sản phẩm này từ nguồn nguyên liệu là tinh bột

35

Khi thủy phân tinh bột bằng enzym VSV do không xảy ra phân hủy đường

bởi acid, bởi nhiệt và không xảy ra sự phân hủy các tạp chất có lẫn trong tinh

bột nên chất lượng của dịch thủy phân tốt hơn, dễ dàng tinh chế hơn Hai loại enzym được sử dụng chủ yếu là 𝛼-amylase và glucoamylase từ nấm mốc và vi khuẩn, 𝛼-amylase dùng để dịch hóa tinh bột và tạo maltose, còn glucoamylase dùng để đường hóa tạo glucose

1.2.3.5 Ứng dụng amylase trong công nghiệp dệt [23]

Chế phẩm amylase được dùng để rũ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm Trong vải mộc thường chứa 5% tinh bột và nhiều tạp chất khác Để làm vải

mềm, có khả năng nhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tốt khi nhuộm thì phải tách

bỏ tinh bột, người ta thường dùng chế phẩm amylase của B.subtilis, B.mesentericus hay t ừ nấm mốc A.oryzae Khi rũ hồ vải, lượng chế phẩm

enzym tính cho mỗi lít dung dịch là 0,3-0,6g, nhiệt độ xử lý là 90°C, thời gian

từ 5-15 phút Phương pháp này không làm hại vải, tạo độ mao dẫn tốt đồng thời đảm bảo vệ sinh

1.2.3.6 Ứng dụng amylase trong chăn nuôi [23]

Chế phẩm amylase được sử dụng riêng rẽ hay phối hợp với các enzym khác như protease, cellulase, pectinase để sản xuất các loại thức ăn dễ tiêu hóa, dễ hấp thu cho gia súc, gia cầm đặc biệt là động vật còn non, giúp vật nuôi tăng trọng nhanh, sinh sản tốt, sức đề kháng cao

1.2.3.7 Ứng dụng amylase trong y học và nghiên cứu khoa học

[20], [26]

Amylase cùng các enzym khác được dùng trong chữa bệnh do thiếu enzym, khả năng chuyển hóa các chất kém, các bệnh về tiêu hóa, tim mạch, thần kinh

Ngoài ra chế phẩm amylase còn dùng để điều chế môi trường nuôi VSV

phục vụ cho công tác khoa học, chẩn trị bệnh Một dung dịch bền vững chứa

𝛼-36

amylase cho phép phát hiện các oligosacchride phân tử lượng lớn với độ nhạy

rất cao 𝛼-amylase được sử dụng trong phân tích cyclodextrin

1.3 TINH B ỘT VÀ SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT

1.3.1 Khái quát v ề tinh bột [2], [27], [28], [29], [34], [36]

Tinh bột là nguồn cung cấp năng lượng chính cho con người hay gia súc thuộc loại động vật không nhai lại Lượng tinh bột từ lúa mì, gạo, bắp (ngô), khoai tây vượt quá con số một tỷ tấn một năm, trong đó khoảng 10% được khai thác ở dạng tinh bột Ở Mỹ, khoảng 20 triệu tấn tinh bột, chủ yếu làm từ bắp, được sử dụng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp Tại Châu Âu, một lượng đáng kể tinh bột thu được từ khoai tây Phần nhỏ hơn nhưng đang ngày một tăng trên thị trường toàn cầu là tinh bột từ gạo, lúa mì và sắn

 Thành phần cấu tạo của tinh bột

Sau hơn 100 năm nghiên cứu, các nhà khoa học đã đi đến thống nhất rằng tinh bột được cấu tạo từ hai polymer khác nhau của đường 𝛼-glucose là amylose

và amylopectin

* Amylose:

Amylose là một polymer mạch thẳng được cấu tạo từ 𝛼-glucose nhờ các liên kết 𝛼-l,4-glucoside, tuy nhiên amylose cũng chứa khoảng 0,1% các liên kết phân nhánh 𝛼-l,6-glucoside Mạch amylose có một đầu khử và một đầu không

khử và mạch này ở dạng cuộn xoắn, mỗi vòng xoắn là 6 đơn vị glucose

Amylose dễ tan trong nước ấm tạo dung dịch có độ nhớt không cao

* Amylopectin:

Amylopectin chứa chủ yếu liên kết 𝛼-l,4-glucoside nhưng tỉ lệ liên kết phân nhánh 𝛼-l,6-glucoside chiếm tới 4% làm cho nó cồng kềnh hơn amylose Tuy amylopectin phân nhiều nhánh nhưng chúng cũng chỉ có một đầu khử duy

nhất

Amylopectin tan trong nước nóng (60-80%) và cho dung dịch có độ nhớt cao

37

Trong tinh bột, tỉ lệ giữa amylose và amylopectin khoảng 1/4 Trong một

số trường hợp tỉ lệ này có thể thay đổi ít nhiều phụ thuộc vào nguồn gốc các loại tinh bột Chẳng hạn tinh bột bắp, lúa mì chứa 25-28% amylose phần còn lại là amylopectin Tinh bột ngô nếp hầu như toàn bộ là amylopectin, cũng có loại ngô giàu amylose chứa tới 80% amylose

 Cấu trúc tinh thể của tinh bột

Tinh bột có bản chất bán tinh thể với nhiều mức độ tinh thể hóa khác nhau, thường từ 15-45% ở dạng hạt Khả năng tạo tinh thể của tinh bột gắn liền với thành phần amylopectin, tinh bột không chứa amylose có một mức độ tinh thể hóa không thay đổi

Tinh bột bền dưới tác dụng của enzym thường chứa các hạt hình cầu có kích thước lớn hơn so với loại tinh bột kém bền Tuy nhiên khả năng bền với tác

dụng của enzym một phần cũng do hàm lượng amylose cao trong các loại tinh

bột này

1.3.2 S ự thủy phân tinh bột

1.3.2.1 Các phương pháp thủy phân tinh bột [2], [18], [27]

* Th ủy phân tinh bột bằng acid

Trước đây trong công nghiệp sản xuất dextrin, maltodextrin và một vài loại siro có giá trị DE khoảng 40, người ta thường sử dụng các acid HR 2 RSOR 4 R, HCl

để thủy phân tinh bột rồi sau đó trung hòa lượng acid dư bằng NaR 2 RCOR 3 R

Sử dụng acid để thủy phân tinh bột có những hạn chế như hiệu suất thủy phân thấp, dung dịch sau thủy phân bị nâu hóa mạnh và có nhiều sản phẩm phụ không mong muốn dẫn đến chi phí để tinh sạch cao Ngoài ra việc sử dụng các

chất hóa học như acid mạnh còn gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái, gây nguy hiểm cho người sản xuất…

* Th ủy phân tinh bột bằng enzym

Thủy phân tinh bột bằng hệ enzym amylase được ứng dụng mạnh mẽ trong

những năm gần đây do tính ưu việt của chúng so với việc sử dụng acid như

38

phân cắt đặc hiệu tạo ra các sản phẩm rất đặc thù, phản ứng nhanh, công nghệ đơn giản hơn, không gây hại sức khỏe người lao động và hạn chế ô nhiễm môi trường

Thủy phân tinh bột bằng enzym gồm hai giai đoạn sau:

 Dịch hóa: mục đích của giai đoạn này là chuyển hệ huyền phù các hạt

tinh bột thành dạng dung dịch hòa tan chứa các dextrin có chiều dài mạch ngắn hơn

Quá trình dịch hóa đầu tiên trong công nghiệp sử dụng 𝛼-amylase từ

B.subtilis Hiện nay, quá trình thủy phân ở nhiệt độ cao bằng enzym chịu nhiệt

của B.licheniformis, B.stearothermophilus được sử dụng rộng rãi trong công

nghiệp sản xuất các sản phẩm tinh bột thủy phân và được coi là phương pháp

hữu hiệu để sản xuất đường glucose Sản phẩm của quá trình dịch hóa là các maltodextrin được lọc, tẩy màu, sau đó cô đặc hoặc sấy phun Dung dịch dextrin cũng có thể tiếp tục được đường hóa để thu các sản phẩm khác

 Đường hóa: dịch thu được sau quá trình dịch hóa được tiếp tục thủy phân

thành đường glucose, maltose hay các oligosaccharide

Việc tách riêng hai quá trình dịch hóa và đường hóa cho phép sử dụng

những điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu để tăng hoạt độ của enzym cũng như để

cơ chất có trạng thái hòa tan tốt Nói chung đường hóa được tiến hành ở nhiệt

độ khoảng 50°C, tương ứng với nhiệt độ tối ưu của đa số enzym được sử dụng trong công nghiệp và pH hơi acid (5-6)

1.3.3.2 Các s ản phẩm thủy phân tinh bột [2], [20], [23]

* Maltodextrin

Theo định nghĩa của cơ quan Thực phẩm và Thuốc của Hoa Kỳ (FDA) thì maltodextrin là các loại polysaccharide không ngọt, có công thức (CR 6 RHR 10 ROR 5 R)n.HR 2 RO, là sản phẩm thủy phân tinh bột không hoàn toàn, có đương lượng dextrose (DE) từ 4-20 Đặc tính của maltodextrin phụ thuộc vào chỉ số

DE nhận được Sản phẩm có thể ở dạng bột màu trắng hoặc dạng dung dịch đậm

39

đặc Maltodextrin được thừa nhận là phụ gia cho thực phẩm và dược phẩm an toàn cho người dùng trực tiếp

Maltodextrin được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực chế biến thực

phẩm và dược phẩm Sản phẩm có DE 4-7 được sử dụng để tạo màng mỏng dễ tan và tự hủy được dùng để bọc kẹo, bọc trái cây khi bảo quản, làm chất độn tạo viên trong công nghiệp dược Sản phẩm có DE 9-12 được dùng trong công nghiệp sản xuất đồ uống, đặc biệt là đồ uống cho trẻ em, làm kẹo gum mềm,

yếu tố tạo hình Sản phẩm có DE 15-18 được sử dụng làm chất kết dính, chất tăng vị ngọt cho đồ uống, đưa vào thành phần sữa bột, cà phê hòa tan

* Maltose

Maltose (đường mạch nha) là sản phẩm thủy phân tinh bột, có công thức phân tử là CR 12 RHR 22 ROR 11 R Phân tử maltose do hai gốc 𝛼-glucose liên kết với nhau

bằng liên kết 1,4 glucoside Khác với saccharose, maltose có tính khử, có vị

ngọt dịu hơn, dễ tiêu hóa, dùng cho trẻ em rất tốt Maltose được dùng trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, nước giải khát, đồ hộp

* Glucose

Glucose là monosaccharide tiêu biểu, có công thức phân tử CR 6 RHR 12 ROR 6 R

Tinh bột sau khi dịch hóa, đường hóa thành 𝛼-glucose và được làm sạch thông thường bằng bằng sắc kí trao đổi ion, sau đó cô đặc và kết tinh Các sản

phẩm glucose thương phẩm thường ở hai dạng dung dịch và tinh thể Glucose dùng trong dược phẩm được sản xuất từ glucose tinh thể tẩy màu bằng than hoạt tính và loại bỏ tạp chất bằng siêu lọc

Glucose là loại đường khử có nhiều tính chất quan trọng bao gồm độ ngọt,

khả năng lên men, áp suất thẩm thấu, khả năng tăng vị, dễ tiêu hóa, dễ hấp thu

nên chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp sản

xuất bánh kẹo, nước giải khát, đồ hộp, thức ăn nhanh, công nghiệp rượu, bia, làm dịch truyền trong y học, sản xuất vitamin C, kháng sinh, pha chế thuốc

40

* Cyclodextrin

Cyclodextrin (CD) là những phân tử oligosaccharide mạch vòng với những nhóm ưa nước bên ngoài và nhóm kỵ nước bên trong Cyclodextrin có khả năng

giữ phân tử mùi bên trong vòng CD nên nó được coi là "cái lồng của hương",

tức là chất cố định mùi và có nhiều ứng dụng hết sức rộng rãi Trong công nghiệp thực phẩm, CD được sử dụng để che bớt mùi, như giảm mùi hôi của thịt,

giữ hương thơm ở bánh trái Trong công nghiệp chất dẻo, mỹ phẩm, CD được

sử dụng để bảo vệ các phân tử dễ bị oxy hóa hay hư hỏng do ánh sáng, nhiệt độ Trong dược phẩm, CD được dùng để tăng độ hòa tan của thuốc và cho phép sử

dụng thuốc với liều thấp hơn cũng như kiểm soát việc giải phóng thuốc một cách từ từ trong thời gian dài hơn

1.4 S Ự CỐ ĐỊNH ENZYM

1.4.1 Khái ni ệm về enzym cố định (enzym không tan) [9], [33]

Theo Trevan, thuật ngữ enzym cố định (immobilized, insoluble enzym) được hiểu là đưa những phân tử enzym vào những pha riêng rẽ, pha này được tách riêng với pha dung dịch tự do Pha enzym thường không tan trong nước và được gắn với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn

Theo Mosbach thì định nghĩa có phần mở rộng và thực tế hơn: Các chất xúc tác sinh học cố định là các enzym, tế bào, cơ thể sống hoặc tổ hợp giữa chúng trong một trạng thái mà cho phép sử dụng lại và liên tục Các chất xúc tác sinh học có thể được liên kết với các vật liệu khác gọi là chất mang bằng liên

kết hóa học hoặc vật lý hoặc được giới hạn trong một không gian cố định

* Cơ sở khoa học của việc cố định enzym

Khi nghiên cứu sự tồn tại của enzym trong cơ thể sống thì thấy phần lớn enzym được nhốt trong các bào quan như ty thể, lạp thể, bộ máy Golgi, nhân,

một số enzym được gắn trên các màng như màng tế bào, mạng lưới nội chất thành một hệ enzym xúc tác cho một quá trình chuyển hóa nào đó Rất ít enzym

hoạt động ở trạng thái tự do