Nghiên cứu tính đa hình và mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 nhằm đánh giá mối liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa

Các phản ứng này có thể giúp cây thích ứng với stress mặn theo một số cách khác nhau, bao gồm giảm sự thoát hơi nước ở các lá bị cháy xém, chuyển hướng các nguồn năng lượng và dinh dưỡng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đặng Ngọc Hoa

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN

CỦA GEN OsHKT1;4 NHẰM ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở LÚA (Oryza sativa)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đặng Ngọc Hoa

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN

CỦA GEN OsHKT1;4 NHẰM ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở LÚA (Oryza sativa)

Chuyên ngành: Di truyền học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đỗ Thị Phúc

XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG

Giáo viên hướng dẫn Chủ tịch hội đồng chấm luận văn

thạc sĩ khoa học

TS Đỗ Thị Phúc PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Thị Phúc, Bộ môn Di truyền

học, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

đã thu nhận, hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn thạc sỹ khoa học

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô công tác tại bộ môn

Di truyền học và Khoa Sinh học đã chỉ bảo và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Trong quá trình học tập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chia sẻ tận tình về chuyên môn của tập thể anh chị và các bạn trong phòng thí nghiệm Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp

đỡ quý báu đó !

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và tất cả các bạn đã động viên và chia sẻ khó khăn cùng tôi trong thời gian qua !

Đặng Ngọc Hoa

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 7

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

1.1 Cây lúa và khả năng chịu mặn 9

1.1.1 Giới thiệu về cây lúa (Oryza sativa) 9

1.1.2 Đáp ứng với stress mặn ở thực vật và cây lúa 11

1.2 Protein High-Affinity K+ Transporter (HKT) ở thực vật 16

1.2.1 Họ protein HKT ở thực vật 16

1.2.2 Họ protein HKT ở lúa 17

1.2.3 Gen OsHKT1;4 18

1.3 Một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu đa hình 20

1.3.1 Phương pháp PCR và PCR-RFLP 20

1.3.2 Phương pháp giải trình tự 21

1.4 Một số phương pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen 24

1.4.1 Lai northern blot và Lai huỳnh quang tại chỗ 24

1.4.2 RT-PCR và Real time PCR 24

1.4.3 Microarray 25

1.5 Tình hình nghiên cứu liên quan đến họ gen HKT ở lúa 26

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 27

2.1.1 Vật liệu 27

2.1.2 Hóa chất 27

2.1.3 Thiết bị 29

2.2 Nhóm phương pháp sử dụng trong phân tích đa hình gen 29

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 29

2.2.2 PCR khuếch đại vùng gen 29

2.2.3 Điện di trên gel agarose 30

2.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự DNA 30

2.2.5 Phân tích số liệu 31

2.3 Nhóm phương pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen 31

2.3.1 Trồng lúa trong dung dịch thủy canh và xử lý mặn 31

2.3.2 Tách chiết RNA tổng số 31

2.3.3 Xử lý với DNase I 32

2.3.4 Tổng hợp cDNA 32

2.3.5 RT-PCR 32

2.3.6 Phân tích số liệu 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Phân tích đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;4 ở lúa 34

3.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá lúa 34

3.1.2 Khuếch đại vùng promoter của gen OsHKT1;4 34

3.1.3 Phân tích đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;4 ở lúa 35

3.1.4 Phân tích các yếu tố cis thuộc vùng promoter của gen OsHKT1;4

bằng công cụ tin sinh 38

3.2 Phân tích đa hình vùng mã hóa của gen OsHKT1;4 ở lúa 42

3.2.1 Khuếch đại vùng exon 2 và exon 3 của gen OsHKT1;4 42

3.2.2 Phân tích đa hình vùng exon 2 và exon 3 của gen OsHKT1;4 43

3.3 Phân tích mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 ở lá lúa 44

3.3.1 Trồng lúa thủy canh và xử lý mặn 45

3.3.2 Tách chiết RNA tổng số từ mô lá 45

3.3.3 Phân tích mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 bằng phương pháp

RT-PCR 46

3.3.3.1 Tổng hợp cDNA 46

3.3.3.2 Phân tích mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 bằng phương pháp RT-PCR 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các bậc phân loại và phân bố của cây lúa [8] 11

Bảng 1.2 Danh pháp, vị trí các locus của các gen thuộc họ HKT ở lúa [37] 18

Bảng 2.1 Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu 27

Bảng 2.2 Trình tự mồi cho phản ứng PCR 28

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen 30

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen 30

Bảng 2.5 Thành phần và quy trình tổng hợp cDNA 32

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng RT-PCR 33

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 33

Bảng 3.1 Các vị trí đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;4 ở 9 giống lúa

thuộc nhóm II so với cơ sở dữ liệu 38

Bảng 3.2 Kết quả dự đoán các yếu tố cis vùng promoter của gen OsHKT1;4

ở 12 giống lúa nghiên cứu 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây lúa và các bộ phận của cây 9

Hình 1.2 Sơ đồ tiến hóa của cây lúa [13] 10

Hình 1.3 Mô hình hóa hệ thống một số kênh vận chuyển Na+ ở thân bẹ và rễ [65] 12

Hình 1.4 Tổng quan về cơ chế vận chuyển Na+ và các thành phần quan trọng trong

hệ thống đáp ứng stress mặn ở các tế bào rễ thực vật 14

Hình 1.5 Sự khác nhau về kích thước intron ở 2 phân họ HKT [37] 16

Hình 1.6 Vị trí phân bố và kích thước của gen OsHKT1;4 trên NST số 4 ở lúa 18

Hình 1.7 Mô hình vận chuyển Na+ của gen OsHKT1;4 ở thân bẹ [61] 19

Hình 1.8 Mô hình phân tử dạng toàn vẹn (A) và dạng sai khác do cắt nối luân phiên (B) của protein OsHKT1;4 [61] 20

Hình 1.9 Giải trình tự theo phương pháp Sanger 22

Hình 3.1 DNA tổng số tách từ mẫu lá của 12 giống lúa 34

Hình 3.2 Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng promoter của gen OsHKT1;4

ở 12 giống lúa 35

Hình 3.3 Kết quả phân tích đa hình trình tự nucleotide vùng promoter của gen OsHKT1;4 ở 12 giống lúa nghiên cứu so với cơ sở dữ liệu bằng phần mềm MUTALIN 37

Hình 3.4 Trình tự vùng promoter của gen OsHKT1;4 và vị trí của các yếu tố cis

của 9 giống lúa thuộc nhóm II 41

Hình 3.5 Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng exon 2 của gen OsHKT1;4 sử dụng mồi OsHKT1;4-2 của 12 giống lúa 42

Hình 3.6 Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng exon 3 của gen OsHKT1;4 sử dụng mồi OsHKT1;4-3 của 12 giống lúa 43

Hình 3.7 Kết quả phân tích đa hình trình tự nucleotide exon 2 (A) và exon 3 (B)

của gen OsHKT1;4 ở 12 giống lúa và cơ sở dữ liệu 44

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết RNA tổng số của giống Pokkali 46

Hình 3.9 Kết quả phản ứng RT-PCR ở 2 giống lúa Nipponbare (A) và Pokkali (B)

tại các mức độ điều kiện stress mặn khác nhau 47

Hình 3.10 Kết quả phân tích bán định lượng sự biểu hiện của gen OsHKT1;4 ở mức độ phiên mã của 2 giống lúa Nipponbare (A) và Pokkali (B) 48

BẢNG CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

cDNA Complementary DNA

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

dS/m deci Siemens per meter

EC Electric Conductivity

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

HKT High-Affinity K+ Transporter

Os Oryza sativa

PCR Polymerase Chain Reaction

ppm part per million

QLT quantitative trait loci

RFLP Restriction fragment length polymorphism

MỞ ĐẦU

Hiện nay, nền nông nghiệp thế giới đang phải đối mặt với thử thách là cung cấp khoảng 70% nguồn thức ăn cho thêm 2,3 tỷ người đến năm 2050 [27] Năng suất cây trồng nông nghiệp thấp hơn chủ yếu là do các stress phi sinh học khác nhau như độ mặn cao, hạn hán, nhiệt độ đang là mối đe dọa đến an ninh lương thực trên toàn thế giới [82;53] Đáng chú ý, diện tích đất nhiễm mặn ngày càng tăng do nhiều yếu tố bao gồm biến đổi khí hậu, mực nước biển dâng cao, sự tồn tại của mỏ đá muối… có thể dẫn đến mất 50% diện tích đất canh tác nông nghiệp hiện nay vào năm 2050 [85]

Việt Nam có đường bờ biển dài 3.260 km, hệ thống sông chằng chịt đổ ra biển qua rất nhiều cửa sông Hai khu vực trồng cây nông nghiệp chính của cả nước

là đồng bằng sông Hồng và sông Cửu Long hàng năm bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi sự xâm lấn của nước biển, là một trong những nguyên nhân chính gây ra nhiễm mặn đất trồng trọt Stress mặn dẫn đến ức chế nghiêm trọng sự tăng trưởng và phát triển của thực vật, gây mất cân bằng ion do tích lũy Na+ và Cl-, tăng cường peroxide lipid, tăng sản phẩm của các dạng phản ứng oxy như các gốc superoxide và hydroxyl

Hiện nay có 2 phương pháp khắc phục sự nhiễm mặn Một là cải tạo môi trường, tạo điều kiện thuận lợi cho cây trồng phát triển, phương pháp này đòi hỏi phải thực hiện ở quy mô lớn, kinh phí tốn kém nên khó áp dụng trong viêc canh tác trồng trọt của người dân Phương pháp thứ 2 là lựa chọn và tạo ra các giống cây trồng có thể đáp ứng được với các điều kiện stress: dễ tiếp cận, ứng dụng rộng rãi hơn, hạn chế kinh phí, hiệu quả cao và lâu dài [91] Để cải thiện năng suất cây trồng trong điều kiện stress mặn thì việc cần thiết là hiểu các cơ chế phân tử cơ bản đằng sau các đáp ứng stress mặn ở thực vật Khả năng chịu mặn là một tính trạng số lượng được kiểm soát bởi nhiều gen [15]

Lúa là một trong những cây lương thực quan trọng đối với con người Hơn 90% lúa gạo trên thế giới được trồng và tiêu thụ ở Châu Á (nơi chiếm 60% dân số thế giới) Ở Việt Nam, việc lai tạo và sử dụng các giống lúa có khả năng chịu mặn ngày càng được áp dụng rộng rãi tại nhiều địa phương trên cả nước, đặc biệt là các vùng lân cận biển Tuy nhiên, các nghiên cứu phân tử về các gen liên quan đến khả

năng đáp ứng stress mặn vẫn còn rất hạn chế Vì vậy, chúng tôi tiến hành “Nghiên

cứu tính đa hình và mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 nhằm đánh giá mối liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa (Oryza sativa)”

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Di truyền học, Bộ môn Di truyền học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây lúa và khả năng chịu mặn

1.1.1 Giới thiệu về cây lúa (Oryza sativa)

Lúa là cây nông nghiệp được

trồng rộng rãi trên toàn thế giới, cung

cấp nguồn thực phẩm thiết yếu cho

khoảng một nửa dân số thế giới [52]

Đây là loài cây trồng ngũ cốc dinh

dưỡng, chứa carbohydrate, protein,

lipid, khoáng sản, …vv Ngoài ra, rơm

rạ cũng là nguồn thức ăn gia súc quan

trọng ở nhiều nước Hình 1.1 Cây lúa và các bộ phận của cây

Với khả năng thích nghi tốt ở các điều kiện phát triển đa dạng, lúa được canh tác từ phía bắc bờ sông Amur (53º N) trên biên giới giữa Nga và Trung Quốc đến phía nam Argentina (40º S) (IRRI, 1985) Cây lúa có thể được trồng ở vùng khí hậu mát mẻ hay trong hệ thống tưới tiêu ở những sa mạc nóng Nó cũng có thể phát triển tốt ở những vùng sông nước như vùng đồng bằng sông Mekong ở Việt Nam, sông Hằng-Brahmaputra ở Bangladesh và miền đông Ấn Độ, đặc biệt là các khu

vực nước lợ có nồng độ muối cao như nơi cửa sông

Cây lúa (Oryza sativa L.) thuộc chi Oryza, phân họ Poaceae, bộ Poales [92]

Có hai loài lúa trồng là O sativa được trồng - phát triển trên toàn thế giới, và

O glaberrima được trồng ở Tây và Trung Phi Trong đó, O sativa có rất nhiều các

kiểu sinh thái (giống) thích nghi với nhiều điều kiện môi trường Lúa hoang châu Á,

tổ tiên của O sativa đã trải qua một loạt các biến đổi sau hàng ngàn năm và được

cho là đã hình thành trong khoảng 15.000 đến 10.000 BC Sau đó dần dần phát triển

ở đông bắc và miền đông Ấn Độ, Bắc Đông Nam Á và miền nam Trung Quốc [13]

Lúa hoang được phân biệt với lúa trồng (O sativa) bởi các đặc điểm về hình thái,

sinh lý và đặc điểm sinh thái như môi trường sống, chiều cao cây, hình dáng, kích thước và mầu sắc, thời gian sinh trưởng, khả năng kháng hoặc chống chịu với bệnh, côn trùng, nhiệt độ Ngoài ra các phân tích isozyme cho thấy lúa hoang sở hữu

nhiều alen ở locus isozyme khác nhau và có mức độ đa hình cao hơn O sativa [60]

O sativa được nhân rộng và phân hóa thành hai nhóm sinh thái là Indica và Japonica [60] Japonica được trồng ở nơi khô ráo, mát mẻ của vùng cận nhiệt đới

và ôn đới trong khi Indica được tìm thấy ở vùng nhiệt đới Châu Á Indica có lá bản rộng và sáng hơn, cây cao và đẻ nhánh tốt, hạt dài - mảnh còn Japonica có lá hẹp và

xanh đậm hơn, chiều cao cây thấp hơn và đẻ nhánh trung bình, hạt tròn -ngắn

Hình 1.2 Sơ đồ tiến hóa của cây lúa [13]

Về cơ bản O sativa là cây tự thụ phấn, tuy nhiên thụ phấn chéo tự nhiên có

thể xảy ra giữa các giống khác nhau ở các khu vực kề cận với một tỷ lệ lên đến 0,5% Thế hệ F1 có khả năng sinh sản kém [60]

Bảng 1.1 Các bậc phân loại và phân bố của cây lúa [8]

1.1.2 Đáp ứng stress mặn ở thực vật và cây lúa

Độ mặn là một trong những stress phi sinh học chính ở thực vật, gây ảnh hưởng lớn đến năng suất cây trồng [7] Độ mặn có nghĩa là sự xuất hiện của muối (chủ yếu là NaCl, ion Na+) trong nước ngầm hoặc dung dịch đất ở mức độ ức chế sự tăng trưởng của thực vật [69] Đất được coi là nhiễm mặn khi độ dẫn diện của dung dịch đất (Ece) vượt quá 4 dS/m (40 mM NaCl) [56; 69] Nồng độ muối thực tế có

ảnh hưởng tiêu cực đến tăng trưởng của các loại thực vật khác nhau phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm loài thực vật, loại đất và nước [56] Độ mặn trung bình vượt quá 1,9 dS/m (decisiemens/m) có thể làm giảm sản lượng hạt, ở độ mặn vượt quá 3.0 dS/m mật độ cây lúa có thể giảm 30 - 40 % [77]

Hình 1.3 Mô hình hóa hệ thống một số kênh vận chuyển Na+ ở thân bẹ và rễ [65]

Kênh vận chuyển chịu trách nhiệm thu hồi Na+ từ xylem rễ gồm AtHKT1;1 và OsHKT1;5) và Na+ / H+ antiporter (SOS1) Kênh vận chuyển chịu trách nhiệm thu hồi Na+

từ mô xylem thân bẹ gồm (AtHKT1;1 và OsHKT1;4) và Na+ / H+ antiporter (SOS1) Loại

tế bào miêu tả gồm: biểu bì (EP), nhu mô vỏ (CO), trung bì (EN), trụ bì (PR), nhu mô xylem (XP) và metaxylem (MX)

Chống chịu mặn ở thực vật là một đặc tính được điều khiển bởi nhiều yếu tố

Đối với những loài nhạy cảm với độ mặn như Arabidopsis thaliana và Oryza sativa thì bị ức chế sinh trưởng tại 100 mM NaCl, trong khi, loài Atriplex amnicola có thể

phát triển ở 600 mM NaCl [69] Khi thực vật tiếp xúc với điều kiện môi trường bất lợi, nó thường biểu hiện kiểu hình già yếu như cháy xém lá [67] Các phản ứng này

có thể giúp cây thích ứng với stress mặn theo một số cách khác nhau, bao gồm giảm

sự thoát hơi nước ở các lá bị cháy xém, chuyển hướng các nguồn năng lượng và dinh dưỡng đến cho lá non, đỉnh sinh trưởng và bảo vệ các cơ quan quan trọng bởi

sự tích lũy các ion gây độc trong các lá già yếu [16]

Khả năng chịu mặn trong nhiều thực vật tỷ lệ nghịch với mức độ tích lũy Na+trong thân bẹ, đặc biệt là ở các cây lương thực chính như lúa mì và gạo [79] Có rất nhiều cơ chế dẫn đến khả năng chịu mặn khác nhau giữa các loài, trong đó các protein vận chuyển chất tan thường rất quan trọng, đặc biệt là các protein vận chuyển Na+ [56; 65] Na+ được tìm thấy là có sự tích lũy khác nhau giữa các loại tế bào của lá [44] Sự tích lũy Na+ ở các tế bào biểu bì lá, tránh gây độc cho các mô quang hợp, có thể do hoạt động của các kênh cation không chọn lọc [44]

Một số kênh vận chuyển như NHX, SOS1 và HKT thể hiện vai trò trung tâm trong vận chuyển Na+ ở điều kiện mặn NHX và SOS tham gia vào việc duy trì hàm lượng ion Na+ thấp trong tế bào chất [6] Hai yếu tố chính duy trì lượng Na+ thấp trong tế bào chất ở tế bào thực vật là các kênh trao đổi (exchanger) Na+/H+ hiện diện trên màng không bào (tonoplast) NHX1 và kênh đối chuyển (antiporter)

Na+/H+ trên màng sinh chất (plasma membrane) SOS1 Hầu hết các kênh NHX cần thiết cho quá trình khử độc Na+ thông qua sự cô lập Na+ vào trong không bào thực vật, trong khi SOS thực hiện xuất Na+ ra khỏi tế bào [3] Ví dụ, việc chuyển gen và

sự biểu hiện vượt mức của gen AtNHX1 trên cà chua làm tăng nồng độ ion K+ trong không bào cũng như sự vận chuyển K+

từ rễ lên chồi, quá trình này giúp gia tăng tỷ

lệ K+/Na+ nội bào (giảm Na+) dẫn đến giảm hiệu ứng của stress mặn do Na+ gây ra

[48] Bất hoạt đồng thời gen NHX 5 và NHX 6 có mặt trên bộ máy Golgi và mạng lưới trans-Golgi dẫn đến cây mẫn cảm với stress mặn và giảm tính chống chịu [4]

HKT là nhân tố chính trong sự chống chịu mặn ở thực vật Các thành viên

trong họ gen HKT ở lúa có mặt trong tế bào nhu mô xylem và bảo vệ lá khỏi stress

mặn bằng cách loại bỏ Na+ khỏi xylem, giảm sự thẩm thấu của các ion theo gradien

nồng độ [68] Ví dụ gen OsHKT1;5 tham gia vào vận chuyển Na+, có chức năng quan trọng trong mô xylem, nhằm giúp thu hồi Na+ từ mạch gỗ, do đó làm giảm tích lũy Na+

trong thân bẹ của cây [68]

Hình 1.4 Tổng quan về cơ chế vận chuyển Na+ và các thành phần quan trọng trong

hệ thống đáp ứng stress mặn ở các tế bào rễ thực vật

Na+ (mầu đỏ) đi vào tế bào thông qua các kênh không chọn lọc cation như NSCCs

và một số kênh khác (màu cam) và hình thành con đường truyền tín hiệu làm biểu hiện

vượt mức các gen như họ HKT và kích hoạt các cơ chế giải độc tế bào (như hoạt động của

các kênh vận chuyển HKT1, NHX, SOS1) [31]

Các yếu tố phiên mã (transcription factor) có mối liên hệ chặt chẽ với các cơ chế cảm ứng mặn, đóng góp vào tính đề kháng của cây [31] Các yếu tố phiên mã chính liên quan trong các đáp ứng với stress mặn như bZIP [59] (basic leucine zipper), WRKY [40], AP2/ERF [45] (APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR), MYB [12], bHLH [41] và NAC [83] Các yếu tố phiên mã này chịu trách nhiệm điều hòa sự biểu hiện của các gen ảnh hưởng đến các mức độ chống

chịu stress mặn ở thực vật (Hình 1.4) Các gen liên quan đến các quá trình đáp ứng

này được kích hoạt biểu hiện ở mức cao như các gen liên quan đến hấp thu các ion

vô cơ, sự tổng hợp các osmolyte (các phân tử điều hòa tính thẩm thấu của tế bào) [30] và quá trình sinh tổng hợp các hormone thực vật (phytohormone) [24]

Trong quá trình cảm ứng stress mặn, các yếu tố phiên mã có thể được kích hoạt trực tiếp bởi kênh Ca2+/calmodulin và bao gồm cả các yếu tố kích hoạt phiên

mã gắn kết với calmodulin CAMTA (calmodulin-biding transcription activator) [63], GTL (GT element-biding like protein) [87] và MYB [90]

Sự thay đổi lượng hormone ABA (abscisic acid), jasmonate (JA), GA và BR (brassinosteroid) xảy ra ở hai giai đoạn ức chế tăng trưởng và phục hồi sau cảm ứng stress [24; 30] Hormone ABA ngăn cản sự kéo dài của hệ thống rễ trong môi trường có nồng độ muối cao [20] Hormone auxin giúp thực vật tránh né môi trường

có độ muối cao bằng cách thay đổi hướng tăng trưởng của rễ (sự hướng động liên quan đến hiện tượng mặn - halotropism) [28] Ngoài ra, hormone ethylene cũng cho thấy vai trò quan trọng trong sự chống chịu mặn ở cây Arabidopsis thông qua sự thay đổi tỉ lệ Na+/K+ ở chồi Bất hoạt gene ETO1 (ETHYLENE

OVERPRODUCER1) gây ra các thay đổi hàm lượng ethylene và qua đó kích thích

quá trình sản xuất ROS ở vùng trụ rễ bởi yếu tố RBOHF (respiratory burst oxidase homolog F) Sự gia tăng ROS ở trụ giữa dẫn đến giảm dòng ion Na+ vào rễ, giảm thu nhận Na+ ở mạch gỗ (xylem) và duy trì ion K+ ở rễ giúp tăng cường khả năng chống chịu mặn [39]

1.2 Protein High-Affinity K+ Transporter (HKT) ở thực vật

1.2.1 Họ protein HKT ở thực vật

Schachtman và Schroeder là người đầu tiên đã phát hiện ra các protein HKT (High-affinity Potassium Transporters) [76] chỉ có ở thực vật nhưng có trình tự và chức năng tương tự với lớp protein vận chuyển cation TrkH / TrkB ở vi khuẩn và nấm [10; 11; 22] HKTs thuộc lớp các protein màng quan trọng (IMP), tham gia vào quá trình vận chuyển cation qua màng tế bào, đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia vào khả năng chống chịu mặn ở thực vật [56; 69]

Hình 1.5 Sự khác nhau về kích thước intron ở 2 phân họ HKT [37]

(a) Cấu trúc gen từ mã mở đầu đến mã kết thúc Exon: mầu trắng, intron: mầu xanh

Tất cả các gen HKT đều chứa 2 intron

(b) So sánh kích thước exon và intron tương ứng ở 2 phân họ Kích thước exon ở 2

phân họ là tương đương nhau, trong khi kích thước intron ở phân họ 1 dài hơn phân họ 2

Dựa vào sự chọn lọc vận chuyển, HKTs được phân thành hai phân họ Phân

họ 1 chỉ vận chuyển Na+; trong khi phân họ 2 vận chuyển cả Na+ và K+ (có vận chuyển đồng thời những ion này ở điều kiện cụ thể) hoặc chỉ vận chuyển Na+ tại nồng độ Na+ cao Gen HKT được xác định nằm trong locus tính trạng số lượng

(quantitative trait loci - QLT), biểu hiện khác nhau về khả năng chịu mặn ở lúa mì [21; 23] Tất cả các gen HKT đều chứa 2 intron Tuy nhiên, các gen thuộc phân họ 1

có tỷ lệ độ dài intron lớn hơn phân họ 2 (Hình 1.5)

Ở điều kiện phát triển bình thường, một số gen như TaHKT2;1, OsHKT2;1,

OsHKT2;4 biểu hiện ở phần phụ của rễ (bao gồm lông rễ) và có thể thu thập Na+ từ dung dịch đất vào trong rễ [46; 47; 75] Tuy nhiên, chức năng quan trọng của HKTs còn được xác định trong việc hỗ trợ thực vật sống sót ở đất nhiễm mặn cao qua nhiều thí nghiệm bất hoạt gen này dẫn đến sự mẫn cảm của cây với điều kiện mặn

[5; 17; 54] và thông qua sự chuyển gen HKT biểu hiện ở nhiều loài thực vật khác, ví

dụ sự biểu hiện của AtHKT1;1 trong lúa cho phép cây phát triển tốt hơn trong điều

kiện mặn [64] Thí nghiệm này còn có ý nghĩa trong việc chuyển gen để nâng cao khả năng chịu mặn của cây trồng

1.2.2 Họ protein HKT ở lúa

Ở lúa có 9 gen thuộc họ HKT, được phân thành hai phân họ (Bảng 1.2) Phân

họ I gồm OsHKT1;1 - OsHKT1;5, phân họ II gồm OsHKT2;1 - OsHKT2;4 Phân họ

1 có ái lực với Na+ OsHKT1;5 được xác định nằm trên locus tính trạng số lượng

SKC1 mã hóa cho một protein vận chuyển Na+ ở mô xylem rễ [49] OsHKT1;1 có thể được biểu hiện ở chồi và rễ OsHKT1;2 là một gen giả, sản phẩm phiên mã của gen cũng được phân lập từ rễ cây lúa OsHKT1;3 chủ yếu biểu hiện ở thân lá, ít biểu hiện ở rễ OsHKT1;4 được biểu hiện chính ở thân lá [28] Các gen thuộc phân họ 2

đồng vận chuyển Na+

và K+ hoặc vận chuyển chọn lọc Na+ hoặc K+ Một số gen biểu hiện ở cả trong vỏ rễ, và có khả năng thu thập Na+ trong điều kiện thiếu K+, cung cấp ion nội mô Dưới điều kiện stress mặn sự biểu hiện của những gen này sẽ được điều hòa giảm hoạt động Ví dụ như ở protein OsHKT2;1 vận chuyển Na+

vào trong rễ, nhưng hoạt động của nó bị giảm xuống ở những cây xử lý mặn 30 mM NaCl, do đó làm giảm tích lũy Na+

gây độc cho cây [33] Ngoài ra, OsHKT2;1 cũng được biểu hiện trong lá [43] OsHKT2;2 có thể hoạt động đồng vận chuyển Na+ và

K+ Cây lúa xử lý mặn ở 150 mM NaCl làm tăng cường biểu hiện của gen này ở lá,

đặc biệt là ở các tế bào diệp lục [43] Các gen OsHKT2;3 / 4 Biểu hiện chủ yếu

trong mô thân bẹ, ít biểu hiện ở rễ [29]

Bảng 1.2 Danh pháp, vị trí các locus của các gen thuộc họ HKT ở lúa [37]

1.2.3 Gen OsHKT1;4

Gen OsHKT1;4 nằm trên NST số 4, dài 5252 bp (Hình 1.6), với kích thước

khung đọc mở dài 1503 bp Gen được biểu hiện chính ở thân lá [29], có vai trò loại ion Na+ ra khỏi mô quang hợp, một cơ chế quan trọng cho khả năng chịu mặn của

cây trồng (Hình 1.7)

Hình 1.6 Vị trí phân bố và kích thước của gen OsHKT1;4 trên NST số 4 ở lúa

(loci LOC_Os04g51830) http://rice.plantbiology.msu.edu/

Hình 1.7 Mô hình vận chuyển Na+ của gen OsHKT1;4 ở thân bẹ [61]

Gen OsHKT1;4 mã hóa cho một protein dài 500 axit amin, và có sự tương

đồng 99,8% giữa 2 giống lúa Pokkali và Nipponbare Sự khác biệt duy nhất nằm trong một vị trí thay thế Arginine (R) thành Glutamine (Q) ở vị trí 110 đối với Pokkali Mô hình cấu trúc protein OsHKT1;4 dự đoán rằng sự thay thế này nằm trong vòng loop ở mặt trong của màng tế bào, kết nối 2 chuỗi α-helices xuyên màng

và không ảnh hưởng đến tốc độ vận chuyển Na+ của protein OsHKT1;4 [61] Một dạng biến đổi sai khác cũng có thể tạo ra một protein có trình tự ngắn hơn 47 axit

amin, trong đó khác nhau 19 axit amin ở vùng đầu C tận cùng (Hình 1.8) Một axit

amin Valine bảo tồn được tìm thấy ở vị trí 344 [61]

Hình 1.8 Mô hình phân tử dạng toàn vẹn (A) và dạng sai khác do cắt nối

luân phiên (B) của protein OsHKT1;4 [61]

Vùng đầu C tận cùng có sai khác của dạng B được chỉ ra bằng mũi tên nhỏ Các vị trí ion Na+ được biểu thị mầu tím, và gần trung tâm hoạt động Vùng mầu đen là trình tự Ser-Gly-Gly-Gly Mũi tên đen đậm chỉ lỗ kênh

1.3 Một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu đa hình

Cây lúa là cây lương thực mẫn cảm với stress mặn Các giống lúa sinh trưởng trong các điều kiện khác nhau sẽ có các cơ chế chống chịu mặn khác nhau Quá trình phức tạp này liên quan chặt chẽ tới mức độ biểu hiện của gen nhằm đáp ứng với các tín hiệu kích thích từ môi trường Sự đa hình trình tự mã hóa của gen và vùng trình tự promoter có thể dẫn đến mức độ biểu hiện gen khác nhau ở các giống lúa khác nhau Việc phân tích đa hình di truyền các gen là một trong những bước

đầu tiên để đánh giá mối liên quan đến khả năng chịu mặn ở các giống lúa

1.3.1 Phương pháp PCR và PCR-RFLP

PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp được xây dựng bởi Kary Mullis vào những năm 1980 Phản ứng được thực hiện dựa trên khả năng của DNA polymerase (DNA pol) để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với trình tự khuôn DNA ban đầu Enzym này chỉ có khả năng kéo dài mạch nhờ việc gắn thêm một

nucleotide vào nhóm chức 3’ - OH tự do của nucleotide trước đó, do đó nó cần có trình tự mồi chứa đầu 3’ - OH tự do để thực hiện kéo dài chuỗi Yêu cầu này dẫn đến có thể khuếch đại một vùng gen mong muốn bằng cách thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR Các enzym này có thể sử dụng để sao chép bất kỳ phân đoạn axit nucleic quan tâm bằng phản ứng PCR Sự kết hợp của phương pháp PCR và giải trình tự sản phẩm PCR sẽ giúp xác định được chính xác trình tự và các vị trí đa hình trên vùng gen quan tâm Phương pháp này rất hiệu quả, chính xác, tiết kiệm thời gian, ít chi phí

Phương pháp PCR-RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuếch đại có chọn lọc một đoạn trình tự DNA, sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA bằng enzym cắt giới hạn Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di sẽ cho ta biết được

sự đa hình đoạn DNA phân tích Ưu điểm của phương pháp này là không tốn kém, thao tác đơn giản, dễ thực hiện, có thể ứng dụng trong phân tích đa hình đơn nucleotide Tuy nhiên, nhược điểm là không xác định được chính xác trình tự gen

và vị trí đa hình Do mỗi enzym giới hạn chỉ nhận biết và cắt tại một trình tự đặc hiệu nên sẽ không phân tích được các gen đa hình cao, không thích hợp cho phân tích các gen có mức độ đa hình cao, đòi hỏi sử dụng nhiều enzym cắt

1.3.2 Phương pháp giải trình tự

Kỹ thuật giải trình tự đã trở thành công cụ quan trọng trong rất nhiều lĩnh vực khoa học như khảo cổ học, nhân chủng học, di truyền, công nghệ sinh học, khoa học pháp y, sinh học phân tử… Theo thời gian, các kỹ thuật ngày càng được phát triển để đáp ứng với các yêu cầu chính xác, nhanh nhạy, hiệu suất cao, giá rẻ,…

Phương pháp Sanger và các phương pháp enzym khác

Phương pháp giải trình tự DNA đầu tiên được mô tả bởi Sanger và Coulson được gọi là phương pháp “cộng và trừ” [73] Phương pháp này sử dụng

DNA pol từ vi khuẩn Escherichia coli và bacteriophage T4 [25; 26] với các

nucleoside triphosphate khác nhau Sản phẩm tạo ra bởi các polymerase được điện

di trên gel acrylamide Do sự không hiệu quả của phương pháp này, nên 2 năm sau

đó ông và cộng sự đã mô tả một phương pháp mới mang tính đột phá, giải trình tự các oligonucleotide thông qua chuỗi trùng hợp bằng enzym [74] Phương pháp này

đã mở ra cuộc cách mạng trong lĩnh vực gen và được biết đến như phương pháp Sanger hay phương pháp dideoxynucleotide Bao gồm một enzym xúc tác phản ứng trùng hợp các triphosphate deoxynucleotide (dNTP) bổ sung với các mẫu DNA quan tâm Phản ứng sẽ được kéo dài cho đên khi các enzym kết hợp một dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) được đánh dấu vào chuỗi đang tổng hợp

Do các ddNTP không chứa nhóm 3’ - OH nên enzym sẽ không thể xúc tác gắn thêm

nucleotide tiếp theo, dẫn đến phản ứng kéo dài bị kết thúc (Hình 1.9) Các phương

pháp giải trình tự bằng enzym khác cũng được sử dụng để xác định trình tự các đoạn nucleotide trong nghiên cứu di truyền Trong đó 2 hướng tiếp cận được sử dụng nhiều nhất là shotgun sequencing và walking primer sequencing [32]

Hình 1.9 Giải trình tự theo phương pháp Sanger

Phương pháp Maxam - Gibert và các phương pháp hóa học khác

Phương pháp giải trình tự bằng phương pháp hóa học được mô tả đầu tiên bởi Maxam và Gilbert (1977) [55] Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau DNA được đánh dấu đồng vị phóng

xạ 32P ở đầu 5’ của mạch đơn, tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hiện hình phóng xạ Xử lí hóa học đặc hiệu giúp phân hủy một loại nucleotide của mạch

DNA đã đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotide, sản phẩm được điện di trên gel polyacriamide để xác định trình

tự mạch đơn Tuy nhiên, việc sử dụng các nhãn phóng xạ là gây nguy hiểm nên sau

đó được thay thế bằng một số phương pháp khác như đánh dấu nhãn huỳnh quang [2], phân tử chỉ thị hóa học biotin hoặc bằng enzym phản ứng mầu [71]

Pyrosequencing

Đây là phương pháp giải trình tự dựa trên sự phát hiện các pyrophosphat (PPi) được giải phóng trong phản ứng chuỗi trùng hợp DNA [72] PPi được giải phóng khi một trong những deoxynucleotide được DNA pol xúc tác gắn vào chuỗi trùng hợp, sau đó tham gia chuyển đổi APS thành ATP bởi enzym ATP sulphurylase Ánh sáng được phát ra nhờ enzym luciferase chuyển hóa luciferin thành oxyluciferin Số lượng trung bình của các photon phát ra tương ứng với số deoxynucleotide được hợp nhất, do đó trình tự có thể được xác định bằng cách đo cường độ ánh sáng phát ra [58]

Sơ đồ phản ứng của các enzym

(DNA)n + dNTP (DNA)n+1 + PPi

PPi + APS ATP +

ATP + luciferin + O2 AMP + PPi + oxyluciferin + CO2 + hv

Giải trình tự Single-molecule sử dụng exonuclease

Kỹ thuật dựa trên cơ sở laser cho phép xác định trình tự một cách nhanh chóng các đoạn DNA khoảng 40 kb với tốc độ 100 - 1000 bazơ mỗi giây [38] Phương pháp này được chia thành các bước: gắn nhãn huỳnh quang vào bazơ trong đoạn trình tự DNA; gắn DNA đã đánh dấu vào một microphere sau đó chuyển vào một dòng chảy đệm Sử dụng exonuclease để phân cắt tuần tự nucleotid được đánh dấu huỳnh quang theo chiều 3’-5’ của đoạn DNA Các nucleotide này sẽ được phát hiện khi đi qua một tia laze hội tụ [18] Trong đó mỗi loại nucleotide được dán nhãn với một loại thuốc nhuộm đặc trưng, có huỳnh quang lượng tử lớn và tính chất quang phổ phân biệt [19]

DNA polymerase

DNA sulphurylase Luciferase

1.4 Một số phương pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen

Sự biểu hiện của gen có thể được đánh giá ở mức độ RNA Nồng độ mRNA của một gen ở các giống lúa khác nhau có thể khác nhau trong cùng một điều kiện sinh trưởng Từ đó góp phần đánh giá được mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình ở các giống lúa khác nhau

1.4.1 Lai northern blot và lai huỳnh quang tại chỗ

Northern blot là một phương pháp thí nghiệm được sử dụng để phát hiện và định lượng các phân tử RNA cụ thể trong một hỗn hợp các RNA Phương pháp này

có thể sử dụng để phân tích một mẫu RNA từ một mô hoặc loại tế bào cụ thể để đo lường sự biểu hiện của các gen đặc hiệu

Bước đầu tiên trong một phản ứng northern blot là làm biến tính RNA trong mẫu thành các sợi đơn Các phân tử RNA này sau đó được phân tách theo kích thước của chúng bằng cách sử dụng phương pháp điện di Sau đó, tất cả các băng RNA ban đầu trên gel được chuyển vào một màng thấm Tiếp theo, các màng được lai với các mẫu đầu dò đã được thiết kế sẵn, có trình tự bổ sung với một chuỗi RNA đặc biệt trong mẫu (đầu dò có thể là DNA hoặc RNA) Bước lai này cho phép thăm

dò / gắn kết, với một đoạn RNA cụ thể trên màng Các đầu dò đã được gắn nhãn phóng xạ hoặc chất nhuộm huỳnh quang sẽ cho phép xác định kích thước dựa vào

vị trí của phân tử RNA quan tâm gắn trên màng và ước tính nồng độ dựa vào cường

độ tín hiệu của mẫu dò Tuy nhiên, phương pháp này tồn tại một số nhược điểm: kỹ thuật thực hiện trong thời gian dài, yêu cầu lượng RNA lớn để phân tích nên không chính xác khi phân tích lượng RNA nhỏ [1; 42]

1.4.2 RT-PCR và Real time PCR

RT-PCR và Real time PCR là hai phương pháp chuẩn được sử dụng cho việc phân tích định lượng RNA Ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, đặc hiệu và độ nhạy cao (thời gian thực hiện ngắn, có thể phân tích với lượng mẫu nhỏ) cung cấp thông tin tin cậy về định tính và định lượng [9]

RT-PCR được sử dụng để phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua quá trình tổng hợp cDNA từ RNA sử dụng enzym phiên mã ngược Các cDNA sau

đó được sử dụng như là khuôn mẫu cho phản ứng PCR Định lượng bằng kỹ thuật RT-PCR có thể được thực hiện theo 2 cách gồm phản ứng một bước hay phản ứng hai bước [88] Ở phản ứng một bước, quá trình tổng hợp cDNA và PCR được thực hiện chỉ trong 1 ống phản ứng Trong khi phản ứng hai bước đòi hỏi hai quá trình này được thực hiện trong hai ống phản ứng riêng biệt Phản ứng một bước được cho là môi trường thực nghiệm đồng nhất hơn và giảm thiểu được sự nhiễm mẫu Tuy nhiên mẫu mRNA ban đầu rất dễ bị suy thoái trong quá trình lặp lại thí nghiệm, dẫn đến kết quả ít chính xác hơn phản ứng hai bước Định lượng sản phẩm RT-PCR có thể được phát hiện bằng cách phân tích điểm cuối PCR (end - poin) (bằng cách chạy điện di DNA trên gel agarose sau khi phản ứng kết thúc) hoặc phương pháp real-time PCR (cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại ngay khi phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở đánh dấu huỳnh quang, hàm lượng DNA tổng hợp được sẽ tương ứng với tín hiệu huỳnh quang) Real-time PCR có ưu điểm so với RT-PCR là cho phép định lượng số bản copy với độ chính xác và độ nhạy cao Thời gian thí nghiệm được rút ngắn, ít thao tác thí nghiệm hơn nên tránh được nhiễm mẫu Đây có thể coi là tiêu chuẩn vàng trong các phân tích định lượng

1.4.3 Microarray

Microarray (gene chip, genome chip hay DNA chip) là một phương pháp dựa trên nguyên tắc lai giữa DNA - DNA hay DNA - RNA Trong đó các đoạn đầu dò DNA đã đánh dấu được gắn trên bề mặt rắn bằng các liên kết hóa học Các trình tự DNA và RNA được cho chạy qua giá thể rắn sẽ bắt cặp bổ xung với các đầu dò Từ

đó, vị trí chính xác và trình tự của gen được xác định và được ghi lại trên một cơ sở

dữ liệu Phương pháp này có thể được sử dụng để đánh giá định tính và định lượng

sự biểu hiện của hàng ngàn gen, trong một thí nghiệm đơn giản và rất hiệu quả Tuy nhiên, phương p háp này đòi hỏi giá thành cao, quy mô phân tích lớn

1.5 Tình hình nghiên cứu họ gen HKT ở lúa

Hiện nay, hướng nghiên cứu về các họ gen chịu mặn, đặc biệt là họ HKT

đang rất được quan tâm Ví dụ, trên thế giới, các nghiên cứu về gen OsHKT1;5 của

các tác giả Lin [49], Olivier Cotsaftis [61] đã cho thấy vai trò trung tâm trong việc thu thập các ion Na+ từ dòng xylem vào các mô bao quanh bó mạch ở rễ Nghiên

cứu của Kader ở các gen OsHKT2;1; OsHKT2;2 cho thấy mức độ biểu hiện khác

nhau ở các điều kiện stress mặn giữa 2 giống lúa nhiễm mặn và kháng mặn [43]…

Ở Việt Nam, đã có nghiên cứu về một số gen như phân tích đa hình trình tự gen

OsHKT1;1 [94]…; phân tích biểu hiện của gen OsHKT2;1 ở các điều kiện xử lý

mặn khác nhau [95]

Gen OsHKT1;4 cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình đáp ứng stress

mặn ở lúa Nghiên cứu phân tích đa hình một vùng trình tự 522 bp của sản phẩm phiên mã từ gen này ở hai giống Pokkali và Nipponbare (vùng này chứa 2 vị trí nối giữa exon 1 - exon 2 và exon 2 - exon 3) cho thấy xuất hiện hai dạng biến đổi có kích thước dài hơn 104 bp và 186 bp so với dạng cơ sở Nguyên nhân là do sai khác trong quá trình cắt nối luân phiên giữa exon 2 và exon 3, dẫn đến xuất hiện bộ ba kết thúc sớm (nằm trong vùng intron 2) ở 2 dạng biến đổi này, và không có chức

năng (Hình 1.8) [61] Ngoài ra, nghiên cứu cũng phát hiện được một vị trí đa hình

axit amin giữa 2 giống Nipponbare và Pokkali, và không ảnh hưởng đến chức năng

của gen OsHKT1;4 [61] Phân tích biểu hiện của gen OsHKT1;4 được thực hiện

giữa rễ - thân bẹ cho thấy gen biểu hiện mạnh hơn ở thân bẹ, và biểu hiện mạnh hơn

ở lá non khi phân tích biểu hiện ở lá non- lá già [61] Tuy nhiên, hiện vẫn chưa có

phân tích nào về trình tự promoter của gen OsHKT1;4 Cũng như chưa có nghiên cứu nào về gen OsHKT1;4 ở nước ta Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi thực

hiện phân tích đa hình trình tự vùng promoter, đa hình vùng mã hóa của gen

OsHKT1;4 ở 12 giống lúa (trong đó có 10 giống lúa địa phương) Đồng thời bước

đầu đánh giá mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 ở 2 giống lúa Nipponbare và

Pokkali trong các điều kiện xử lý mặn khác nhau

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Vật liệu

Vật liệu thí nghiệm gồm hạt giống của 12 giống lúa được cung cấp bởi Viện

Di truyền Nông nghiệp và Học viện Nông nghiệp Việt nam Trong đó 12 giống lúa

sử dụng trong phân tích đa hình và 2 giống lúa được sử dụng trong phân tích biểu

hiện (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên giống lúa

- Các hóa chất được cung cấp bởi hãng Thermo Scientific:

 Kit tách chiết ARN tổng số (GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit); kit tổng hợp cDNA (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit); kit tinh sạch (GeneJET PCR Purification Kit)

 Dream Taq polymerase, Dream Taq buffer 10X, dNTPs

 Enzym DNAse I

 Thang chuẩn 1kb, 100bp

 Mồi sử dụng cho phản ứng PCR

- Dung dịch thủy canh của Yoshida (phụ lục 1)

- Ngoài ra còn có một số hóa chất khác đƣợc sử dụng trong tách chiết DNA, điện di nhƣ: đệm CTAB, Tris-HCL, EDTA, Chloroform, isomylalcohol, NaCl, đệm

TE agarose, ethidium bromide… đều đạt tiêu chuẩn của phòng thí nghiệm sinh học phân tử

Bảng 2.2 Trình tự mồi cho phản ứng PCR

STT Tên mồi

Trình tự mồi

Mồi xuôi (5’→3’) Mồi ngƣợc (5’→3’)

Mồi sử dụng trong phân tích đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;4

1 Pro-HKT1;4 CAGCTGATCGGATGG

TTGAG

GAGCAACAAAATAGGCCACGC

Mồi sử dụng trong phân tích đa hình vùng mã hóa của gen OsHKT1;4

2

HKT1;4-2

(exon 2)

CCCAAGGGTGACTTTCTGATCG

GTATCAGTTTGCCAGAGTCGC

3

HKT1;4-3

(exon 3)

TCACAACTCTCCTACCTGACC

GAGCTTTGTGCAAGGATGACAG

Mồi sử dụng trong phân tích RT-PCR

4 ACT [93] CTGATGGACAGGTTAT

CACC

CAGGTAGCAATAGGTATTACAG

5 RT-HKT1;4 CGACGTGGTTCCCATT

TGAAG

ATATGCACTGACAACTTCGACA

Cân 50mg mẫu lá đã nghiền trong ống eppendorf (epp) và bổ sung thêm 500

µl đệm CTAB, votex đều hỗn hợp Sau đó ủ mẫu ở 65oC trong khoảng 15 phút Ống mẫu được lấy ra để nguội về nhiệt độ phòng, rồi bổ sung 500 µl Chloroform / isoamylacohol (tỷ lệ 24 : 1), votex Ly tâm ống ở 10 000 vòng / phút, 10 phút, 4oC Thu dung dịch bên trên (pha trong) và chuyển sang ống epp mới Bổ sung 300 µl isopropanol vào mỗi ống và để ở nhiệt độ lạnh khoảng 10 phút Ly tâm ống 14 000 vòng / phút, 5 phút, 4oC Đổ bỏ pha trên, thu DNA tủa trắng dưới đáy ống và rửa tủa bằng 500 µl EtOH 70 % Ly tâm thu lại tủa ở 14 000 vòng / phút, 5 phút, 4oC Để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ hút trong khoảng 60 phút, sau đó hòa tan tủa DNA trong đệm TE và bảo quản ở - 20oC

DNA sau khi tách chiết được kiểm tra nồng độ và chất lượng bằng cách điện

di trên gel agarose 1 % và đo tỷ lệ OD bằng máy Nanodrop Spectrophotometer (Nanodrop Technologies, Mỹ)

2.2.2 PCR khuếch đại vùng gen

Thành phần phản ứng và quy trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày ở

bảng 2.3 và bảng 2.4