Nghiên cứu sản xuất HTKNRCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa; đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm

Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu và huyết tương phải sử dụng trong điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế đã quan tâm chỉ đạo việc nghiêncứu, ứng dụng sản xuất huyết thanh kháng n

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo WHO ước tính, mỗi năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vịmáu phục vụ cấp cứu điều trị (≈ 2% dân số) [40]; ngoài máu và các chế phẩmmáu, chế phẩm huyết tương, còn phải kể đến các chế phẩm huyết thanh như:gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-T lymphocyte globulin, anti-Dglobulin, antivenom [141],[147],[152] trong đó, huyết thanh kháng nọc rắn

(antivenom) là loại chế phẩm rất quan trọng, đặc biệt trong điều trị rối loạn đông cầm máu do nhiễm độc nọc rắn họ Vipridae.

Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi và đất nông nghiệp, bờ biểndài hơn 3000 km, Việt Nam có môi trường rất thuận lợi cho rắn độc pháttriển Phần lớn cư dân sinh sống, làm việc trong môi trường nông nghiệp,rừng núi, hải đảo nguy cơ bị rắn độc cắn rất cao (> 30.000 người /năm [21]);ngoài tổn thất nhân mạng, chi phí điều trị rất tốn kém: nhiều nạn nhân phảithở máy hàng tháng hoặc phải truyền hàng chục lít máu và huyết tương đểcứu tính mạng; kỷ lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai đã phải truyền

≈ 46 lít máu và chế phẩm để cứu một người bệnh [174]

Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu và huyết tương phải

sử dụng trong điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế đã quan tâm chỉ đạo việc nghiêncứu, ứng dụng sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) [6],[8] Đếnnay, đã có một số nghiên cứu rất thành công, góp phần cứu sống hàng ngànbệnh nhân, giảm mạnh lượng máu và chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23]

Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến nay chúng ta vẫn đang thiếu trầmtrọng nhiều loại HTKNR; hầu như ta chỉ có duy nhất hai loại HTKNR cho rắn

hổ đất và rắn lục tre [8],[165],[166],[171] Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọcrắn theo vùng địa lý, mỗi quốc gia phải tự chế tạo HTKNR cho chính quốcgia mình (khuyến cáo của WHO) [141],[20],[6] Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu,

điều trị rắn độc cắn, chúng ta rất cần đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR;

đặc biệt là các HTKNR cho các loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; trong

các loài đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% các loài rắn độc

họ rắn hổ (Elapidae) tại Việt Nam, là loài rắn độc có độc tính cực mạnh, gây

tử vong rất cao (> 80% nếu không được cấp cứu điều trị kịp thời) [14]

Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam từ trước đến nay cho thấy:nước ta có hai loài rắn cạp nia thường gặp chủ yếu là rắn cạp nia nam

(Bungrarus candidus) và rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) Đây là hai

loài rắn có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” rất giống nhau, thoáng nhìn rấtkhó phân biệt Hai loài rắn này khác nhau cả về độc tính nọc và biểu hiện lâmsàng, chẩn đoán rất dễ nhầm lẫn, HTKNR đơn đặc hiệu không có tác dụngchéo và cũng chưa có VDK để chẩn đoán xác định [15]

Nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá cho cả hai loài rắn độc nguy hiểmnói trên là giải pháp đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cạpnia cắn trong cả nước Để tăng tính an toàn của chế phẩm, dạng F(ab’)2 là tối

ưu, đồng thời phải áp dụng các giải pháp kỹ thuật và kiểm soát chất lượngtoàn diện để chế phẩm có thể đạt Tiêu chuẩn Quốc gia về HTKNR dùng chongười, theo Dược điển Việt Nam [9]

Với các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’) 2 từ huyết tương ngựa; đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng

thí nghiệm” được thực hiện, nhằm các mục tiêu sau:

đạt Tiêu chuẩn Quốc gia.

2 Đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. MỘT SỐ ĐIỂM CẦN CHÚ Ý VỀ MÁU VÀ HUYẾT TƯƠNG

Protein huyết tương gồm: globulin miễn dịch, bổ thể, các yếu tố đôngmáu, các yếu tố enzyme, các protein liên kết với lipid, các protein vậnchuyển các thành phần này thay đổi trong bệnh lý

Điện di protein, điện di miễn dịch sẽ tách được các thành phần protein.Mỗi protein huyết tương đều có điểm đẳng điện tương ứng với pH

Tính hòa tan của protein chịu ảnh hưởng của nhiệt độ và tính tan trongdung dịch muối

Khi cấu trúc protein thay đổi, độ hòa tan cũng thay đổi, tính chất sinh học

có thể mất đi; các yếu tố gây biến tính protein là: nhiệt độ, acid, base, tia cực

tím (làm đứt gãy liên kết peptid), sóng siêu âm (gây oxy hóa) [31],[163].

1.2 CÁC LOẠI CHẾ PHẨM MÁU VÀ CHẾ PHẨM HUYẾT TƯƠNG 1.2.1 Máu toàn phần:

Máu toàn phần là máu lấy từ mạch máu người cho (hoặc động vật chomáu), bảo quản trong túi (hoặc chai, bình chuyên dụng) có chất chống đông

và bảo quản máu (thông thường là CPDA gồm citrate, phosphat, đườngdextrose, adenin) Mỗi đơn vị máu người cho khỏe mạnh (250 ml) có 30 - 40gam hemoglobin [31],[170] Bảo quản máu toàn phần ở nhiệt độ 2 - 6oC, thờigian bảo quản tối đa 42 ngày với dung dịch CPDA Máu toàn phần lưu trữchứa thành phần chính là hồng cầu, máu mới thu nhận còn có tiểu cầu và một

số yếu tố đông máu; bạch cầu đoạn nhanh chóng bị huỷ và giải phóng ra cácchất trung gian; ngoài ra máu toàn phần còn chứa các bạch cầu lympho và cácyếu tố huyết tương

1.2.2 Khối hồng cầu [31],[170]:

Khối hồng cầu là máu toàn phần đã được ly tâm và tách phần huyết tương

ở trên; tuỳ cách sản xuất mà có 5 loại khối hồng cầu sau:

+ Khối hồng cầu đậm đặc: là khối hồng cầu có hematocrit (Hct) khoảng 75%,

gồm có: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một ít huyết tương; bảo quản ở nhiệt độ

2 - 6°C; là chế phẩm có tính đậm đặc nên phải truyền chậm

+ Khối hồng cầu có dung dịch bảo quản: là khối hồng cầu sau khi tách huyết

tương được trả lại dung dịch bảo quản; thành phần gồm có hồng cầu và dungdịch bảo quản, một ít bạch cầu, lượng huyết sắc tố tương tự máu toàn phần;bảo quản ở nhiệt độ 2 - 6°C, thời gian tối đa 42 ngày

+ Khối hồng cầu nghèo bạch cầu: là chế phẩm máu được sản xuất từ máu

toàn phần tách huyết tương và phần buffy coast; thành phần gồm có hồng cầu

và khoảng 10% bạch cầu so với khối hồng cầu thông thường; có ưu điểm làmgiảm các phản ứng do bạch cầu, giảm các nguy cơ lây bệnh do tác nhân cư trútrong bạch cầu

+ Khối hồng cầu rửa: là máu toàn phần hoặc khối hồng cầu được ly tâm bỏ

hết huyết tương, sau đó thay thế bằng nước muối sinh lý NaCl 0,9% trộn đều,

ly tâm tiếp để rửa ba lần; thành phần gồm có: hồng cầu + nước muối sinh lý;bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 6°C dưới 24 giờ, ở nhiệt độ 22°C dưới 6 giờ

+ Khối hồng cầu lọc bạch cầu và khối hồng cầu chiếu xạ: là khối hồng cầu đã

được dùng màng lọc bạch cầu hay tia xạ hoặc cả hai, bảo quản ở 2 - 6°C dướihai tuần từ khi chiếu xạ Nếu dùng màng lọc rời thì sau lọc không để quá 24giờ Thành phần chủ yếu là hồng cầu, còn rất ít bạch cầu, bạch cầu bị bấthoạt

Như vậy: sau khi tách huyết tương, tùy điều kiện và nhu cầu truyền trảkhối hồng cầu cho ngựa sớm hay muộn để quyết định sử dụng chống đông,dung dịch nuôi dưỡng hồng cầu và phương pháp bảo quản, vận chuyển trênđường đến nơi truyền trả khối hồng cầu ngựa Nếu lấy máu ngựa vào các túiđôi, túi ba, dung tích 450ml, việc tách huyết tương và truyền trả khối hồngcầu ngựa sẽ đơn giản hơn lấy vào bình nhựa số lượng lớn (10 lít)

1.2.3 Khối tiểu cầu:

Tuỳ cách sản xuất, có hai loại khối tiểu cầu sau:

+ Khối tiểu cầu pool: là khối tiểu cầu được sản xuất bằng cách ly tâm các túi

máu toàn phần, gạn lấy lớp buffy coast rồi ly tâm tách lấy tiểu cầu; thôngthường từ 3 - 4 đơn vị máu toàn phần cùng nhóm ABO có thể sản xuất đượcmột đơn vị pool tiểu cầu; khối tiểu cầu nếu chưa pool, được bảo quản ở 22°C,lắc liên tục, thời gian từ 3 - 5 ngày; nếu đã pool qua hệ thống hở: để ≤ 24 giờ;

số lượng tiểu cầu/pool khoảng 1,5 x 1011

+ Khối tiểu cầu máy: là khối tiểu cầu được sản xuất bằng máy tách tế bào lấy

tiểu cầu từ một người cho, thành phần có ≥ 3,0 x 1011 tiểu cầu/đơn vị, có ítbạch cầu; bảo quản ở 22°C trong máy lắc liên tục, tối đa được 5 ngày

1.2.4 Huyết tương tươi đông lạnh:

Huyết tương tươi đông lạnh là huyết tương tách từ máu toàn phần trong

6 giờ kể từ lúc lấy máu, bảo quản đông lạnh; thành phần có albumin, globulinmiễn dịch, các yếu tố đông máu bền vững và yếu tố VIII còn khoảng 70%;lượng huyết tương tách từ một đơn vị máu (250 ml) thường ≈ 125 - 150 ml.Thường pool lượng huyết tương tươi của hai đơn vị máu toàn phần cùngnhóm, dung tích khoảng 250 - 300ml Bảo quản ở nhiệt độ - 25°C/năm, bảoquản ở nhiệt độ thấp hơn - 25°C trong hai năm [31],[170]

Khi sản xuất HTKNR, phải bảo quản huyết tương của nhiều đợt, đượclấy trong nhiều thời điểm khác nhau, bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 25°C để tránhcác biến tính của protein theo thời gian do nhiều yếu tố tác động bất lợi

1.2.5 Tủa VIII (cryo):

Để huyết tương tươi đông lạnh ở 4°C, huyết tương tan ra có một phầntủa, ly tâm thu nhận các tủa này đó là tủa lạnh yếu tố VIII (cryo); thành phần:cryo có khoảng 2 - 3 đơn vị yếu tố VIII /ml và yếu tố V, fibrinogen; trọnglượng phân tử yếu tố VIII khoảng 300 kD [164], lớn hơn trọng lượng phân tửIgG (150 kD) [16] và được tách ta trong phương pháp tủa Cohn ở Fraction I,loại bỏ phần này khi tách γ-globulin vì không cần thiết sử dụng

1.2.6 Huyết tương tươi đã tách tủa:

Huyết tương tươi đã tách tủa là phần huyết tương tách ra sau khi lấy tủa

ở huyết tương tươi đông lạnh, bảo quản ở - 25°C; thành phần gồm có:albumin, globulin, một số yếu tố đông máu Nếu sản xuất HTKNR theo

phương pháp Cohn, đây là phần cần thiết giữ lại để sản xuất do có γ -globulin.Sản phẩm này cần bảo quản như huyết tương tươi đông lạnh: ở nhiệt độ -25°C / năm, bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn - 25°C trong hai năm [31],[170].

1.2.7 Huyết tương đông lạnh:

Huyết tương đông lạnh là huyết tương tách từ máu toàn phần sau 6 giờ

kể từ khi lấy máu; thành phần gồm các yếu tố huyết tương, các yếu tố đôngmáu không bền vững còn lại ít; bảo quản ở nhiệt độ - 25°C, như huyết tươngtươi đông lạnh Huyết tương để sản xuất HTKNR được sản xuất, tách chiếttheo dạng chế phẩm này

1.2.8 Khối bạch cầu hạt:

Là chế phẩm huyết tương tách từ phần buffy-coast và pool của nhiềungười cho máu; thành phần chứa nhiều bạch cầu hạt, hồng cầu và một số tếbào lympho và các chất do bạch cầu giải phóng; do sản xuất theo phươngpháp pool từ nhiều người cho nên nguy cơ nhiễm virus rất cao Bảo quản: ởnhiệt độ 22°C ≤ 24 giờ Trong sản xuất HTKNR, chỉ cần tách huyết tương, vìvậy cần để lại phần bạch cầu và tiểu cầu cùng với khối hồng cầu; cần truyềnlại máu ngựa sớm để ngựa đảm bảo sức khỏe, nhanh hồi phục

1.2.9 Albumin:

Albumin là protein hình cầu, tính hòa tan cao, trọng lượng phân tử66.500 Da, chiếm nhiều nhất trong huyết thanh; chức năng chính là duy trì 70– 80% áp lực keo trong huyết tương và liên kết vận chuyển các chất có phân

tử nhỏ như bilirubin, hormon, steroid, acid béo, các phân tử thuốc

Dung dịch albumin được điều chế từ huyết tương đậm đặc chứa 15 20% protein toàn phần, lượng Na+ ≤160 mmol/lít, albumin đẳng trương chứa5% protein [163]; do trọng lượng phân tử albumin thấp, sản xuất chế phẩmnày theo phương pháp tủa Cohn sẽ thu được albumin ở Fraction V, phần tủa

-Cohn cuối cùng; khi sản xuất HTKNR, cần tách chiết albumin để loại bỏ; theotiêu chuẩn tinh sạch protein của dược điển Việt Nam III-2002, albumin chỉđược phép còn dạng vết, phát hiện được bằng điện di miễn dịch [7]

1.2.10 Gamma globulin:

Hình 1.1 Các thành phần protein khi điện di protein huyết thanh [176].

Gamma globulin (-globulin) là các lớp globulin xác định được khi điện

di protein huyết thanh; với 5 lớp -globulin là IgG, IgM, IgD, IgA, IgE; trong

đó chiếm tỷ lệ nhiều nhất là IgG, sau đó là IgM; IgD, IgA, IgE chiếm rất ít Năm 1940, -globulin đã được tách chiết lần đầu tiên trên thế giới.Không lâu sau đó, globulin miễn dịch tiêm bắp (IGIM) được đưa vào sử dụng,tạo miễn dịch thụ động dự phòng điều trị bệnh viêm gan A, bệnh vô -globulin huyết (1950) Globulin miễn dịch tiêm tĩnh mạch (tức IGIV) đượcsản xuất và đưa vào sử dụng năm 1970, ít đau, tác dụng nhanh hơn IGIM Năm 1981, Gamimune do Mile phân lập, là IGIV đầu tiên được đăng

ký ở Mỹ Sandoglobulin của hãng Sandoz có ở thị trường năm 1984.Gamimune được chuyển thành dạng không biến đổi năm 1986; sản phẩm nàyđược đổi tên thành Gamimuner N Sau đó, một số IGIV khác được đăng ký ở

Mỹ như: Gammagard do Hyland, Polygam bởi hội chữ thập đỏ Mỹ, Iveegam

bởi Immuno, Venoglobulin - I bởi Alpha Therapeutic, Gammar-IV bởi Armor

và GammaRaas của tập đoàn RAAS (Mỹ) [167]

Năm 1991, IGIV sản phẩm dạng bột hoà tan lần đầu tiên được chấpnhận (Venoglobulin-S) Năm 1994, sau một vụ dịch viêm gan C liên quan đếnGammagard, sản phẩm điều chế dạng bột không hoà tan Gammagard vàPolygam bị đình chỉ

Năm 1980, bệnh nhân dùng IGIV điều trị giảm -globulin huyết, xuấthuyết giảm tiểu cầu tự phát (ITP) thấy đa số gây tăng số lượng tiểu cầu Tiếptheo phát hiện ngẫu nhiên này, việc sử dụng IGIV cho ITP được nghiên cứu

và hiện nay nó chính thức được dùng cho chỉ định này Kể từ khi IGIV cóhiệu quả đối với ITP, chúng tiếp tục được đánh giá trong điều trị những bệnhkhác với giả định cơ chế tự miễn Hầu hết sử dụng IGIV đối với bệnh tự miễnđều có hiệu quả; ví dụ bệnh Kawasaki, nhược cơ, bệnh đa thần kinh huỷmyelin viêm mạn tính, hội chứng Guillain-Barre

Các chỉ định -globulin được thừa nhận hiện nay gồm: suy giảm miễndịch tiên phát, xuất huyết do giảm tiểu cầu tự phát, bệnh Kawasaki, ngănngừa nhiễm khuẩn thụ động, AIDS, bệnh nhân thực hiện ghép tuỷ xương

Gamma globulin tiêm tĩnh mạch (IGIV) là chế phẩm có trên 95% IgG từ

huyết tương người hiến máu được tinh chế IGIM chứa 15 - 18% protein,trong đó IgG chiếm trên 90% IGIM là dung dịch trong suốt hoặc hơi đục, cóthể có màu vàng nhạt hoặc nâu nhạt Cả hai loại đều là dung dịch vô khuẩn,không chứa chất gây sốt, gồm các -globulin chứa nhiều loại kháng thể cómặt trong máu người bình thường

Sau khi tiêm bắp IGIM, nồng độ IgG huyết thanh đạt đỉnh trong haingày, được phân bổ nhanh và ngang nhau giữa các khu vực trong và ngoàimạch máu Ở những người có hàm lượng IgG bình thường, thời gian bán hủycủa IgG khoảng 23 ngày Khi liều tiêm IGIM lớn hơn 10 ml thì phải chia ra

thành nhiều liều nhỏ để tiêm vào nhiều vị trí bắp thịt khác nhau nhằm làmgiảm đau tại chỗ và bớt khó chịu Tổng liều một lần tiêm bắp thịt không đượcvượt quá 20 ml - ngay cả đối với người lớn Bảo quản ở nhiệt độ từ 2 - 8oC vàkhông được để đông băng Thời hạn dùng của IGIM không được quá 3 năm

kể từ ngày xuất khỏi kho lạnh (5oC) của nhà sản xuất [31],[123]

Bảng 1.1 Các thành phần của protein huyết tương [31],[167],[176]

Globulins

α-globulins

α1-antitrypsinantitrypsin, α2-α2-antitrypsinantiplasmin, α2-antithrombin α2-α1-antitrypsin α2-transcortin, α2-α2-antitrypsinceruloplasmin, α2-retinol α2-binding α2-protein, α2- orosomucoid, α2-α2-antitrypsinmacroglobulin, α2-haptoglobin

β-globulins hormone, α2-binding α2-globulin, α2-transferrin α2-angiostatin, α2-hemopexin, α2-β-antitrypsin2

α2-microglobulin, α2-factor α2-H, α2-plasminogen, α2-properdin

-globulin Immunoglobulins α2-(IgG, α2-IgM, α2-IgA, α2-IgD, α2-IgE)

Loại khác Fibronectin, α2-macroglobulin/microglobulin, α2-Transcobalamin

Albumins

Lòng trắng trứng Conalbumin, α2-ovalbumin, α2-avidinSerum

albumin Human α2-serum α2-albumin, α2-bovine α2-serum α2-albumin, α2-prealbumin

Loại khác C-antitrypsinreactive α2-protein, α2-α-antitrypsinlactalbumin, α2-parvalbumin, α2-ricin

1.2.11 Kháng huyết thanh:

Kháng huyết thanh (KHT) là sinh phẩm chứa -globulin miễn dịch có

khả năng trung hòa kháng nguyên đặc hiệu, thu được từ huyết tương động vậthoặc huyết tương người đã được mẫn cảm với kháng nguyên trước đó, đượctinh chế để lượng globulin đạt mức cần thiết theo quy định và loại bỏ cácprotein không cần thiết [7],[9] Một số KHT đã được nghiên cứu, sử dụngtrong chuyên ngành Huyết học và Truyền máu:

- Anti-HBs globulin: dùng cho con của những bà mẹ có HBV (+), sản xuất từhuyết tương người cho máu giàu anti-HBs globulin [30],[41],[173]

- Anti-T lymphocyte globulin: điều trị suy tủy xương, điều trị bệnh tự miễn(sản xuất từ huyết tương thỏ gây miễn dịch) [75],[86],[97],[109]

- Anti-hairy cell serum: điều trị leucemie tế bào tóc (sản xuất từ huyết tươngthỏ gây mẫn cảm) [132].

- Anti-D globulin: điều trị huyết tán do bất đồng nhóm máu mẹ con hệ Rh,dùng cho người mẹ Rh (-) sau khi sinh con Rh (+) [57],[74],[138],[139] vàđiều trị xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (ITP) [119]

- Anti-γG globulin: điều trị đái huyết sắc tố kịch phát lạnh PNH (Paroxysmalnocturnal hemoglobinuria) [99]

- Anti-neutrophil serum (ANS): gây giảm bạch cầu đoạn trung tính (sản xuất

từ huyết tương thỏ) [127]

- Anti-thymocyte globulin: sản xuất từ huyết thanh thỏ [111]

- Antivenom (SAV): điều trị các rối loạn đông máu, DIC, tan máu, do rắn

độc họ Viperidae cắn [33] (sản xuất từ huyết tương ngựa, dê, bò, cừu, ).

- Antiglobulin người sử dụng trong chẩn đoán (Coombs test), sản xuất từhuyết tương thỏ, ngựa [22]

Hiện nay lượng KHT rất thiếu hụt ở các nước nghèo do các nhà sản xuất

chỉ sản xuất KHT từ huyết tương người hoặc từ động vật tinh chế haibước, giá thành tăng lên gấp nhiều lần, kèm theo là nguy cơ phải đóng cửacác trang trại nuôi ngựa sản xuất KHT vì không đem lại lợi nhuận, do giá đắt,

do thị trường eo hẹp, do những đạo luật bảo vệ động vật không cho lấy máu,

đã khiến việc sản xuất KHT càng trở lên kém hấp dẫn; kết quả là sự khanhiếm về số lượng và chủng loại trên thị trường, hậu quả tất cả đổ lên ngườibệnh Để duy trì sản xuất KHT phục vụ đa số như hiện nay, chính phủ một sốnước miễn thuế cho sản xuất KHT [77], tăng cường hỗ trợ sản xuất KHTmiễn phí cho người nghèo (Thái Lan) [96],[104],[119],[160],[148], tăngcường hỗ trợ ngân sách từ các tổ chức quốc tế, các tổ chức từ thiện để duy trì

số lượng, chất lượng các sản phẩm [153],[67],[63],[68],[149]

1.3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẾ PHẨM HUYẾT TƯƠNG:

1.3.1 Phương pháp tủa lạnh bằng Ethanol:

+ Phương pháp tủa Cohn:

Là phương pháp tách các thành phần máu và huyết tương bằng thay đổinồng độ ethanol, pH, nhiệt độ, lực ion quy trình này còn được gọi là: quytrình tách "tủa protein" đã biết ra khỏi các protein chưa biết trong huyếttương; được phát minh lần đầu tiên bởi Edwin Joseph Cohn (1892-1953),người Mỹ [169]; phát minh lúc đó đã góp phần cứu sống hàng vạn ngườitrong Chiến tranh thế giới thứ II; đến nay vẫn là phương pháp cơ bản trongtách chiết các chế phẩm máu và huyết tương tại các Trung tâm Huyết học -Truyền máu trên thế giới [31]

Phân đoạn huyết tương theo phương pháp Cohn thu được albuminhuyết thanh, -globulin, fibrinogen, thrombin và một số yếu tố đông máu.Fibrinogen và các phần phân đoạn của thrombin được nghiên cứu sâu hơn,chế tạo thành các sản phẩm fibrin keo lỏng, fibrin bọt và màng fibrin

Các -globulin tìm thấy trong Fraction Cohn II, III được chứng minh cótác dụng rất tốt trong điều trị bệnh sởi, bệnh bại liệt, điều chỉnh và ngăn ngừabệnh viêm gan truyền nhiễm cho những người lính trong chiến tranh thế giớithứ hai Fibrin keo lỏng, fibrin bọt và màng fibrin đã được sử dụng điều trịnạn nhân bỏng, trong đó có một số nạn nhân từ cuộc tấn công tại Trân ChâuCảng, giúp tỷ lệ ghép da thành công tăng cao Fibrinogen keo lỏng rất hữu íchtrong kết nối dây thần kinh bị cắt đứt Fibrin bọt và thrombin được sử dụng đểkiểm soát chảy máu, đặc biệt là trong tổn thương gan và khối u, giảm thiểuchảy máu từ tĩnh mạch lớn cũng như đối phó với dị tật mạch máu trong não.Màng fibrin được sử dụng để cầm máu trong các ứng dụng phẫu thuật khácnhau, bao gồm cả phẫu thuật thần kinh, tuy nhiên, không hữu ích trong việckiểm soát chảy máu động mạch

Sau này Martin MacPhee (Hội chữ thập đỏ Mỹ) trong đầu những năm

90, đã thử nghiệm thành công sản phẩm "Băng keo fibrin” trong quân y Mỹ;đây là loại fibrinogen có khả năng ngăn chặn xuất huyết động mạch

+ Phương pháp Cohn cải tiến [31]:

Để sản xuất một lượng lớn albumin, -globulin miễn dịch; nhiều nơi sửdụng phương pháp Cohn có bổ xung điều kiện pH, nhiệt độ, lực ion, nồng độethanol của môi trường tủa cho phù hợp với từng thành phần của huyết tương,như: các cải tiến của tác giả Gerlough (1955), Hink (1957), Van Aken (1996),

Mulford , Kistler và Nitschmann, William N Drohan

- Phương pháp Van Aken (1996):

Fraction I (F1): sử dụng ethanol 8%, pH 7,2, - 3oC, lực ion 0,14

Thu được F-VIII, Von - Willebrand, fibrinogen (5,1% protein).Fraction II (F2): xử lý nước mặt bước 1, ethanol 25%,- 5oC, pH 6,9 Thu được F-II, V, VII, IX, X và IgG, IgA, ít IgM (3% protein)Fraction III (F3): xử lý nước mặt bước 2 bằng ethanol 18%, pH 5,2

Thu được AT-III, bổ thể, IgM, protease inhibitor

Fraction IV (F4): xử lý nước mặt bước 3 (IV- 1) bằng ethanol 40%, pH 5,8 Thu được tủa IV- 2 có haptoglobin transferrin, -globulin

Fraction V (F5): xử lý nước mặt bước 4 (IV- 2) bằng ethanol 40%, pH 5,8 Thu được tủa V chứa albumin và -globulin (1% protein)

Nước mặt V được tủa ethanol 40%, - 3oC, pH 5,2 thu được albumin sạch Quy trình này cho 5 sản phẩm (Fraction I, II + III, IV- 1; IV- 2, V) trong

đó, mỗi bước lại chiết tách các sản phẩm tinh khiết hơn

Như vậy, Gamma globulin miễn dịch có mặt trong F-II

Sản phẩm này có thể sử dụng với dung dịch lỏng tiêm bắp cơ IGIM; đểđảm bảo an toàn và hiệu quả cao, cần sản xuất dạng tiêm tĩnh mạch IGIV Cónhiều phương pháp sản xuất IGIV, nhưng phương pháp sử dụng F-II Cohn

loại bỏ Fc của IgG được nhiều nước sử dụng có kết quả Có thể tóm tắtphương pháp này như sau: F-II thu được bằng phương pháp Cohn cho tácdụng với pepsin ở pH 5; sản phẩm thu được đem thẩm tích loại bỏ Fc vàpepsin, cho sản phẩm an toàn hơn, giảm phản ứng phụ, có thể tiêm tĩnh mạch.

- Phương pháp Gerlough (1955): sử dụng ethanol 20% thay vì 40%

trong Fraction II và III, làm giảm tiêu thụ ethanol; ngoài ra, tác giả kết hợphai Fraction IV vào một bước, giảm số fraction yêu cầu

- Phương pháp Hink (1957): phương pháp này năng suất cao hơn do tái sử

dụng một số các protein huyết tương bị loại bỏ trong các Fraction IV

- Phương pháp kết hợp tủa lạnh và tủa ethanol của William N Drohan:

Phương pháp này kết hợp tủa lạnh và tủa ethanol, tách được ba thành phầnhuyết tương có giá trị: tủa lạnh yếu tố VIII, fibrinogen, yếu tố Von-Willebrand; IgG (F-II); albumin Phương pháp này được Mỹ, Đức, Pháp, Italy

và nhiều nước đang phát triển sử dụng có hiệu quả, trang bị đơn giản, các sảnphẩm đạt độ tinh khiết tốt, nhất là albumin đạt trên 85%, giảm được dịch tủaethanol

- Phương pháp Mulford: sử dụng Fraction II và III là bước cuối trước khi

xử lý nhiệt, kết hợp Fraction IV và V (hạn chế là albumin không tinh khiết)

- Phương pháp Kistler và Nitschmann: cung cấp albumin tinh khiết hơn,

tương tự như phương pháp Gerlough, Fraction II, III thực hiện ở nồng độethanol thấp hơn 19%, pH 5,8 Fraction IV được kết tủa ở điều kiện ethanol40%, pH 5.8 và nhiệt độ - 8oC; albumin, bị thu hồi trong Fraction V, đượctinh chế bằng cách chiết xuất ở ethanol 10%, pH 4,6 và nhiệt độ - 3oC

Sau phát minh của Cohn, việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm máu,chế phẩm huyết tương và truyền máu từng phần đã phát triển nhanh ở cácnước tiên tiến Tới nay, một số nước đã tách được trên 20 sản phẩm, tập trung

vào các nhóm sản phẩm có hiệu quả cao trong điều trị như albumin, globulinmiễn dịch, các yếu tố đông máu.

1.3.2 Phương pháp tủa bằng muối:

Phương pháp này dùng trong tinh chế IgG, mảnh kháng thể Fab, F(ab’)2

Để thu được một thành phần protein, cần phá vỡ lớp nước liên kết xung quanhphân tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein các dung môi hoặc cáchoá chất có ái lực với nước mạnh hơn để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein

đó, giúp cho protein kết tủa Thường sử dụng dung môi (acetone, ethanol)hoặc muối trung tính để kết tủa protein Sự kết tủa có tính chọn lọc: cácprotein khác nhau kết tủa ở nồng độ dung môi và muối khác nhau

Để kết tủa protein huyết tương, thường dùng nhất là ammoniumsulphate (NH4)2SO4, do muối này có mức độ hoà tan rất cao trong nước, ítlàm mất hoạt tính enzyme, thậm chí còn có tác dụng làm bền enzyme; ưuđiểm nữa là khả năng kết tủa chọn lọc protein, loại bỏ được nhiều proteinkhông mong muốn trong huyết tương Lưu ý, khi sử dụng, phải bổ sung vàohuyết tương một cách từ từ, kết hợp khuấy đều để tránh khả năng tăng quánhanh cục bộ của nồng độ muối, làm mất tính kết tủa chọn lọc của nó, thậmchí có thể làm biến tính một số protein kém bền Hạn chế của phương pháp làmất nhiều thời gian, do nồng độ ammonium sulphate cao, tỷ trọng của dungmôi lớn, để kết tủa được các protein, phải ly tâm tốc độ cao và nhiệt độ thấp,sau đó cần loại muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước tinh sạch tiếp theo

Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp, thường dùng biệnpháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng hoặc bằngcách lọc qua gel sephadex

Muối (NH4)2SO4 rẻ và phổ biến, độ hòa tan lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở

25oC); thường được sử dụng ở dạng bột rắn, cho vào huyết tương tới nồng độbão hoà 40-50%, ủ ở nhiệt độ, pH nhất định, trong thời gian thích hợp tùy loại

huyết tương của người hay động vật để đạt kết quả cao nhất Thu IgG qua lytâm hoặc lọc thu tủa, hòa lại kết tủa bằng một lượng đệm tối thiểu; thẩm tíchđối với đệm trước khi dùng

Để loại bỏ những thành phần protein không cần thiết, có thể gây biếntính chọn lọc bằng nhiệt độ, pH Phương pháp này thích hợp với protein chịuacid và bền nhiệt: đưa nhiệt độ của dung dịch protein lên 50 - 70oC và pH ≤ 5;những protein không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến tính, đượcloại bỏ bằng ly tâm hoặc lọc

Khi thu hoạch các mảnh kháng thể F(ab), F(ab’)2, phải cắt Fc bằng cácenzyme pepsin hoặc papain Đây là các protease thủy phân protein, xúc táccho quá trình thủy phân liên kết peptid của phân tử protein Nhiệt độ có tácdụng làm tăng tốc độ của phản ứng enzyme đến tốc độ cực đại chừng nàoenzyme chưa bị biến tính; khi nhiệt độ tăng đến 60 - 70oC, enzyme mất hẳnhoạt tính Các bước tinh sạch protein thường được tiến hành ở nhiệt độ thấpdưới 40oC, để hạn chế sự biến tính enzyme Để loại bỏ các protein tạp và cáctạp chất có phân tử lượng cao khác, thường kết hợp nhiều biện pháp khácnhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH củamôi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc cácdung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổiion), điện di, phương pháp lọc gel

1.3.3 Phương pháp sắc ký (chromatography):

Dựa trên nguyên lý trao đổi ion dùng DEAE (Diethyl amino ethyl), CM(Carboxyl methyl), hoặc lọc qua gel sử dụng Sephacryl S - 200, bằngphương pháp này, độ tinh khiết của sản phẩm đạt 99% Tuy nhiên giá rất cao,

sử dụng một khối lượng lớn dung dịch đệm (buffer), trong khi so với phươngpháp Cohn chất lượng cũng không tốt hơn là bao Mất mát trong quá trình sắc

ký nhiều hơn, hiệu suất thấp, làm số lượng lớn sẽ khó khăn, cho nên nhiều

nước kết hợp các phương pháp tủa lạnh ethanol với sắc ký Theo phươngpháp này, sau ly tâm huyết tương tươi đông lạnh có ba nhóm nguyên liệu cầntinh khiết và chiết tách bằng phương pháp sắc ký.

+ Nhóm 1 (tủa lạnh sau ly tâm): nếu sắc ký ta thu được bốn thành phần: VIII, fibrinnogen, F.Von Willebrand, fibronectin

+ Nhóm 2 (nước mặt sau ly tâm): Nếu sắc ký sẽ thu được sáu thành phần: VII, IX, XI, AT III, pascal, protease inhibitor, IgG

F-+ Nhóm 3: nhóm này có hàm lượng lớn nhất được tủa bằng ethanol 40%, pH5,8 nhiệt độ 5oC sẽ thu được albumin và -globulin, có thể tủa thêm lần hai,với ethanol 40%, pH 4,8 Phương pháp sắc ký tuy thu được các sản phẩm khátinh khiết, nhưng mất mát qua các bước của quy trình cũng khá nhiều

1.3.4 Phương pháp miễn dịch hấp thụ:

Sử dụng kháng thể đơn dòng, đặc hiệu kéo các sản phẩm cần thu hoạch

ra khỏi hỗn hợp chung Tuy nhiên chi phí cho phương pháp này quá cao nênchỉ dùng trong phòng thí nghiệm

1.3.5 Phương pháp lọc qua màng ma trận với các vật rắn:

Gần tương tự như phương pháp sắc ký trao đổi ion Phương pháp nàysản xuất được lượng nhưng giá trị lọc không cao, nên vấn đề chất lượng, giáthành đầu ra là một vấn đề cần bàn tới

Tóm lại: sản xuất  - globulin miễn dịch đặc hiệu chống nọc rắn từ huyết tương người không khó đối với các cơ sở sản xuất chế phẩm máu của ngành Huyết học - Truyền máu, vấn đề là người cho huyết tương chứa

KT chống nọc rắn không đủ số lượng máu để cung cấp cho sản xuất với số lượng lớn, hiệu giá KT thấp và nhiều phiền phức khác Vậy nên, chỉ có thể tạo nguồn huyết tương từ ngựa theo phương pháp miễn dịch chủ động.

1.4 HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN:

1.4.1 Khái niệm:

HTKNR là sinh phẩm chứa các γ-globulin miễn dịch kháng nọc rắn cókhả năng trung hòa đặc hiệu nọc rắn tương ứng, thu được từ động vật hoặc từngười đã được miễn dịch, được tinh chế để lượng globulin đạt mức cần thiếttheo quy định và để loại bỏ các protein không cần thiết [7],[9]

Thuật ngữ “antivenin” xuất phát từ tiếng Pháp “venin”, nghĩa là nọc, từgốc chữ Latinh “venenum”, nghĩa là chất độc “poison” Năm 1895, thuật ngữantivenin bắt đầu được sử dụng, đến nay đã phổ biến khắp toàn cầu Từ 2003,thuật ngữ “antivenin” tiếng Pháp đã được WHO chuyển thành tiếng Anh:

“antivenom”, cả hai danh pháp đều được công nhận và sử dụng như nhau

1.4.2 Lịch sử phát minh:

Năm 1894, Calmette, Phisalix và Bertrand báo cáo tại hội nghị khoa

học tại Paris về kết quả xác định đặc tính kháng nọc rắn hổ của huyết thanh

thỏ Năm 1895, Albert Calmette và Le’Pinay đã chế tạo thành công HTKNR

rắn hổ đất Việt Nam từ huyết tương ngựa và sử dụng HTKNR chế tạo điều trịcứu sống nạn nhân, lần đầu tiên trên thế giới, HTKNR được sử dụng hiệu quả

trên người (Barbara J Hawgood, 1999)[43] Việc gây miễn dịch cho động vật, lấy huyết thanh trị bệnh cứu người - kiểu miễn dịch thụ động (passive immunity), do Emil Adolf Von Behring và Shibasaburo Kitasato phát minh

năm 1890 đã được A Calmette ứng dụng trong thực tiễn, sản xuất thành côngHTKNR [64] Nghiên cứu, chế tạo thành công HTKNR đã mở ra một thời kỳmới trong điều trị tai nạn rắn độc trên trái đất Từ đó, các nghiên cứu vềHTKNR ngày càng phát triển, ứng dụng điều trị ngày càng hiệu quả, an toàn

HTKNR có thể ngăn chặn hoặc đảo ngược hầu hết các triệu chứng nhiễm độc

nọc rắn và đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm thiểu tử vong và tàn

phế (Chippaux J.P., Goiffon M., 1992 [54], Isbister G.K., 2010) [79] Hàng

nhiều thập kỷ trôi qua, qua tác dụng thực tiễn của HTKNR, WHO đã khẳngđịnh: “HTKNR là thuốc đặc trị rắn độc cắn duy nhất phổ biến khắp toàn cầu,giải quyết một trong những vấn đề y tế còn tồn tại của thế giới”[6]

1.4.3 Cơ sở miễn dịch học:

1.4.3.1 Kháng nguyên nọc rắn:

Các độc tố nọc rắn sau khi đã được khử độc tính, bảo đảm an toàn chođộng vật gây mẫn cảm mà vẫn giữ được tính sinh miễn dịch, tính khángnguyên gọi là KN nọc rắn Nọc rắn trở thành kháng nguyên do có đủ các đặc

điểm của chất sinh miễn dịch đó là tính lạ, kích thước phân tử đủ lớn, có thành phần và tính không thuần nhất về phương diện hoá học, có khả năng giáng hoá Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể thì mức độ sinh miễn dịch

phụ thuộc vào mức độ lạ Khác biệt về di truyền càng lớn, khác biệt về khángnguyên giữa hai cơ thể càng nhiều Do đó, các độc tố nọc rắn có đặc điểm thứnhất là hoàn toàn “lạ” với cơ thể động vật gây mẫn cảm Các kháng nguyên

có tính sinh miễn dịch tốt thường có trọng lượng phân tử trên 100 kDa.Những phân tử có trọng lượng phân tử thấp từ 0,5-10 kDa, có tính sinh miễndịch yếu Một số trường hợp có trọng lượng phân tử < 1 kDa có tính sinh

miễn dịch rất yếu [16],[34] Độc tố nọc rắn họ Elapidae chủ yếu là dạng neurotoxins, là các polypeptide có kích thước nhỏ, lan truyền, hấp thụ trong

cơ thể nạn nhân rất nhanh, nhưng khi chế tạo kháng nguyên lại khó khăn do

có tính sinh miễn dịch yếu Các phân tử không hoà tan có tính sinh miễn dịchlớn hơn các phân tử nhỏ và hoà tan do dễ bị đại thực bào nuốt và xử lý Vìvậy, có thể gây ngưng tập các toxins dạng polypeptid trọng lượng phân tử nhỏbằng nhiệt, làm tăng tính không hoà tan của các đại phân tử, tạo thuận lợi chođại thực bào nuốt chúng và làm tăng tính sinh miễn dịch

Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên mạnh hay yếu còn phụ thuộc tínhchất của hệ thống sinh học mà nó xâm nhập, kiểu hình di truyền của túc chủ

và cách gây mẫn cảm (liều lượng, đường vào của kháng nguyên, sử dụng các

tá chất miễn dịch hay không) [16],[19],[28] Cấu trúc di truyền của túc chủảnh hưởng lớn đến khả năng sinh miễn dịch cũng như cường độ của đáp ứng.Việc sử dụng động vật gây mẫn cảm cho hiệu quả cao cần phải lựa chọn.Ngay cả chế độ ăn cũng cần phải đảm bảo, giúp cho sinh kháng thể tốt nhất.Ngoài ra, bất kỳ kháng nguyên nào cũng cần sự kết hợp giữa liều lượng tối

ưu, đường vào của kháng nguyên và qui trình gây mẫn cảm, nhằm đạt đápứng miễn dịch với cường độ cao nhất Liều kháng nguyên quá thấp và liềuquá lớn kháng nguyên cũng không kích thích được đáp ứng miễn dịch vìchúng làm cho các tế bào lympho rơi vào trạng thái không đáp ứng Đưakháng nguyên vào cơ thể một lần, chỉ kích thích sinh miễn dịch với cường độthấp Nếu kháng nguyên vào cơ thể lặp lại nhiều lần trong vòng thời gian vàituần sẽ gây đáp ứng miễn dịch với cường độ cao [16],[25]

Tá dược (adjuvant): là những chất khi được trộn với kháng nguyên, tiêm

gây mẫn cảm sẽ làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên Sử dụng tádược làm tăng đáp ứng miễn dịch khi kháng nguyên có tính sinh miễn dịchthấp hoặc khi chỉ có được một lượng nhỏ kháng nguyên Tá dược kéo dài sựtồn tại của kháng nguyên trong cơ thể túc chủ gây mẫn cảm Khi tiêm khángnguyên + tá dược, kháng nguyên được giải phóng chậm hơn từ nơi tiêm vào

cơ thể túc chủ, thời gian tiếp xúc với kháng nguyên sẽ tăng lên [1],[2],[16]

Sự tăng kích thước của tá chất + kháng nguyên làm tăng hiệu quả đáp ứngmiễn dịch vì các đại phân tử dễ được đại thực bào nuốt hơn Tá dược Freund

là một tá dược hay được sử dụng Tá dược Freund hoàn toàn (Freund’s complete adjuvant) có thêm Mycobarterium chết, hoà trong nhũ tương dầu, có hiệu lực cao hơn tá dược Freund không hoàn toàn (Freund’s incomplete

adjuvant) Các dipeptide của Mycobarterium sẽ hoạt hoá đại thực bào, làm

tăng hoạt động thực bào, tăng biểu lộ các phân tử MHC lớp II trên màng tếbào, đồng thời tăng tiết các cytokine như IL-1, cytokine do đại thực bào tiết

ra, là đồng kích thích tố hoạt hoá các tế bào lympho TH Cả hoạt động trìnhdiện kháng nguyên và các tín hiệu đồng kích thích tế bào lympho TH đều tănglên khi có tá chất Một số tá dược kích thích phản ứng viêm tại chỗ và mạntính, thu hút các tế bào làm nhiệm vụ thực bào và lympho đến nơi có khángnguyên Sự thâm nhiễm các tế bào này tại nơi tiêm tá chất dẫn đến hình thànhcác u hạt Đại thực bào tại u hạt là đại thực bào hoạt hoá, làm tăng hoạt hoálympho TH Tùy từng trường hợp, khi gây mẫn cảm cho túc chủ, khángnguyên nọc rắn được phối hợp với các tá dược khác nhau, theo nhiều phươngpháp khác nhau, theo từng tác giả, miễn sao hiệu quả nhất [16],[25]

1.4.3.2 Kháng thể chống nọc rắn:

Bản chất kháng thể chống nọc rắn là gamma globulin miễn dịch IgG,

đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn, lưu hành trong máu và bạch huyết, hoạtđộng đáp ứng miễn dịch bằng cách trung hoà, loại bỏ các kháng nguyên nọc,được tạo ra sau khi gây mẫn cảm cho động vật với kháng nguyên nọc rắntương ứng, đặc hiệu

Kháng thể chống nọc rắn nhận diện và gắn một cách đặc hiệu với một

kháng nguyên tương ứng nhờ các domain biến thiên Trong phản ứng chống

độc tố nọc rắn (toxins), kháng thể chống nọc rắn gắn với độc tố, trung hòa,làm giảm mất độc tính của độc tố, ngăn ngừa sự bám dính của các độc tố trênlên các thụ thể tế bào, giúp các tế bào của cơ thể tránh được các rối loạn docác độc tố đó gây ra Một cơ chế khác là hoạt hóa bổ thể Khi hệ thống bổ thểđược hoạt hóa bởi kháng thể chống nọc rắn IgG, hiện tượng thực bào, thanhlọc phức hợp miễn dịch và phóng thích các phân tử hóa hướng động đượcdiễn ra Sau khi gắn vào kháng nguyên ở đầu biến thiên (Fab), kháng thể có

thể liên kết với các tế bào miễn dịch ở đầu hằng định (Fc) Các tế bào NK cóthể thực hiện chức năng độc tế bào và ly giải các độc tố bị opsonine hóa bởicác kháng thể Tiếp xúc lặp đi lặp lại với cùng một kháng nguyên, sẽ dẫn đếnviệc tạo ra kháng thể có ái lực cao hơn với kháng nguyên (thuần thục ái lực),tạo ra các kháng thể có khả năng bám và trung hoà độc tố hiệu quả hơn [16],[25] Khi lượng IgG được tạo ra đã đạt số lượng cần thiết, các tế bàolymphocyte B sử dụng một cơ chế đặc biệt gọi là phản hồi kháng thể

(antibody feedback), dập tắt các đáp ứng miễn dịch dịch thể Tế bào plasma

chế tiết kháng thể sẽ di chuyển đến tuỷ xương, tại đây chúng tiếp tục sản sinh

ra các kháng thể ngay cả khi kháng nguyên đã được loại bỏ Các tế bàolymphocyte B mang trí nhớ miễn dịch không chế tiết kháng thể nhưng lưuhành trong máu, tồn tại hàng tháng hoặc hàng năm, khi kháng nguyên tái xuấthiện thì chúng sẽ nhanh chóng đáp ứng Kháng thể chống nọc rắn cạp nia đagiá là tập hợp nhiều kháng thể đặc hiệu chống rất nhiều thành phần độc tốkhác nhau; hiện nay không thể sản xuất HTKNR theo dạng sản xuất kháng

thể đơn dòng (Jose’ Maria Gutierrez, Guillermo Leon, 2003) [82],[125],[32].

1.4.4 Các giai đoạn của quy trình sản xuất HTKNR:

1.4.4.1 Chế tạo kháng nguyên nọc rắn:

Mục đích nhằm khử độc tính nọc, đảm bảo an toàn cho ngựa gây mẫncảm, kháng nguyên có tính sinh miễn dịch mạnh Để chế tạo được khángnguyên, phải có nọc rắn chuẩn, chất lượng tốt, đại diện cho quần thể rắn độccần sản xuất HTKNR Phải tuyển chọn chính xác, nhận diện đúng, phân loạiđúng loài rắn cần nghiên cứu Tuyển chọn rắn không đại diện, HTKNR sẽkhông có tác dụng Nọc để tạo HTKNR phụ thuộc theo mùa, vùng địa lý, đặctính di truyền từng loài rắn Một số cơ sở sản xuất HTKNR dùng nọc rắn thuđược từ các quốc gia khác nhau để sản xuất HTKNR, kết quả không cao Thí

dụ, Viện Nghiên cứu y học Nam Phi dùng nọc rắn Đông Phi chế tạo HTKNR

cho Tây Phi, kết quả hiệu lực kháng nọc rất hạn chế (Daltry J.C, Wuster W., Thorpe R.S, 1996) [20],[60] Tuyển chọn rắn khỏe, tiến hành nuôi dưỡng cẩn

thận, giúp cho việc lấy nọc nhiều lần Nọc rắn thu được phải sạch, không lẫnmáu, làm khô tự nhiên sau đó đông khô và bảo quản ở - 20oC Chế tạo khángnguyên có nhiều phương pháp, hiện nay nhiều cơ sở thường dùng phương

pháp của Theakston RDG, sử dụng glutaraldehyde để bất hoạt độc tính nọc.

Khử độc bằng chiếu xạ hoặc nhiệt độ có thể gây hủy hoại hoàn toàn nhữngkháng nguyên quan trọng, thậm chí phá vỡ cả cấu trúc protein nọc, tạo ranhững kháng thể không cần thiết, làm ra các HTKNR hiệu lực thấp

Sau khi chế tạo được kháng nguyên, phải kiểm tra tính an toàn cho động

vật trước khi sử dụng)[13]: kiểm tra tính an toàn trên chuột lang (Safety test), kiểm tra chí nhiệt tố trên thỏ (Pyrogen test), cấy khuẩn để xác định kháng nguyên vô khuẩn (Sterility test) Để đánh giá được tính sinh miễn dịch,

thường phải sau hai, ba lần gây mẫn cảm Có thể kiểm tra bằng gây mẫn cảmtrên thỏ trước khi làm chính thức

Theo dõi đáp ứng miễn dịch sau mẫn cảm bằng thử nghiệm Ouchterlony,ELISA, điện di miễn dịch huyết thanh đã có kháng thể và hiệu giá kháng thể[12],[15],[22],[26][73]

1.4.4.2 Gây mẫn cảm, tạo nguồn huyết tương giàu kháng thể:

- Lựa chọn động vật: có thể chọn ngựa, lừa, dê, thỏ, chó, phôi trứng gà [126],[129] Dùng ngựa gây mẫn cảm, cung cấp huyết thanh đã có từ thế kỷ trước,nhưng đến nay, nhiều trung tâm sản xuất HTKNR vẫn chọn ngựa, do ngựacho số lượng lớn huyết tương với giá rẻ và dễ làm, máu được lấy đều đặn mộtkhối lượng lớn mà không ảnh hưởng đến sức khỏe của ngựa, mang đến hiệuquả kinh doanh cho nhà sản xuất, nhất là đối với các nước đang phát triển,nạn nhân rắn độc nhiều, khả năng chi trả của bệnh nhân thấp Thường dùng

ngựa đực trưởng thành, từ 3 - 4 tuổi, khỏe mạnh, trọng lượng 300 - 350 kg.

Cứ một lít máu ngựa có thể cho 100 ml HTKNR, một con ngựa cho khai thác

huyết tương khoảng sáu năm (Lê Văn Hiệp, 2010) [159] Cừu có đáp ứng

miễn dịch khác với ngựa, không gây phản ứng tại chỗ như ở ngựa khi dùng tá

dược Freund’s (Karlson-Stiber C., Persson H., Heath A et al., 1997) [84].

Tuy gây mẫn cảm chỉ cần một lượng nhỏ nọc đã đạt mức kháng thể đặc hiệutối đa, nhưng số máu lấy chỉ được 500ml/lần với cừu lớn trưởng thành

- Gây mẫn cảm: hiệu lực của HTKNR phụ thuộc vào hiệu giá kháng thể, tínhđặc hiệu và mức cô đặc Vì vậy, huyết tương sản xuất cần có hiệu giá khángthể cao, đây là một yêu cầu quan trọng và là một vấn đề thường xuyên đặt racho tất cả các nhà sản xuất Thông thường, phải miễn dịch ngựa theo lịchtrình tăng dần lượng nọc tiêm vào cơ thể ngựa, hiệu giá kháng thể sẽ tăngtheo mỗi lần miễn dịch Liều kháng nguyên và khoảng cách thời gian giữa cáclần tiêm kháng nguyên được xác định trước khi gây mẫn cảm, thường từ 2-4tuần Tùy theo mức độ độc của nọc rắn (LD50) và kỹ thuật chế tạo khángnguyên để qui định liều kháng nguyên mỗi lần gây mẫn cảm cho phù hợp Tádược tạo sự thuận lợi cho sự tiếp xúc giữa tế bào macrophages và tế bàolympho, hỗ trợ hiệu quả quá trình sinh kháng thể Huyền dịch kháng nguyênnọc rắn trong tá dược Freund’s cũng làm giảm độc tính nọc vì nọc được giải

phóng từ từ vào cơ thể động vật mẫn cảm (Christensen, Latifi, Sawai, 1972)

[20]

- Theo dõi hình thành kháng thể: trong suốt lịch trình gây mẫn cảm, theo dõi

sự hình thành kháng thể đặc hiệu, sử dụng kỹ thuật Ouchteclony, khuếch tánhai chiều trong gel agarose1%, nếu xuất hiện các đường vòng cung tủa KN -

KT đặc hiệu, cho thấy đã hình thành kháng thể trong máu ngựa Điện di miễndịch huyết thanh ngựa sau khi gây mẫn cảm với kháng nguyên nọc rắn để xácđịnh tính đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên

1.4.4.3 Thu hoạch huyết tương giàu kháng thể:

Sau khi ngựa đã có kháng thể đặc hiệu chống nọc rắn với hiệu giá cao sẽlấy máu, thu huyết tương hoặc huyết thanh để sản xuất HTKNR Theo

Warrell D.A, Theakston R.D.G (1971) tuy một số nhà sản xuất vẫn dùng

huyết thanh để sản xuất, song ngày nay đa số nhà sản xuất dùng huyết tươngthu được từ máu chống đông [20]

Dùng huyết tương có lợi điểm sớm hoàn trả được khối hồng cầu chongựa, đảm bảo sức khỏe ngựa hồi phục sớm, giúp cho đáp ứng sinh kháng thểchống nọc rắn được mạnh hơn Ly tâm hoặc để lắng, tách khối hồng cầu đểtruyền trả cho ngựa càng sớm càng tốt Thường lấy máu vào bình thủy tinhhoặc bình nhựa vô khuẩn chuyên dùng với thể tích lớn trên 10 lít Hệ thốnglấy máu được thiết kế theo vòng kín để đảm bảo vô trùng, dễ khử khuẩn Máulấy không được để vỡ hồng cầu, ảnh hưởng đến chất lượng huyết thanh.Lượng máu lấy cần tính toán cân nhắc trước, tùy theo trọng lượng, sức khỏe

ngựa Theo Lê Văn Hiệp (2010) thường lấy số lượng máu không quá 1,5%

trọng lượng cơ thể ngựa, trung bình một tháng/lần; cứ 1 lít máu ngựa chođược ≈ 100ml HTKNR [159]

Cần chú ý an toàn cho người lấy máu khi làm việc với ngựa Phải có cácdụng cụ chuyên dùng cố định thân mình và cổ ngựa, vừa dễ lấy máu, an toàncho người lấy máu

1.4.4.4 Tinh chế huyết thanh kháng nọc rắn:

Đến nay, việc tinh chế HTKNR có thể thực hiện theo một trong ba kỹthuật chế tạo là IgG, F(ab’)2 và Fab [136] Tùy điều kiện và kinh nghiệm củanhà sản xuất, nhu cầu điều trị của từng quốc gia, từng địa phương và từng loạinọc rắn; có thể sản xuất HTKNR ở một trong ba dạng sản phẩm trên, sau đó

tinh chế loại bỏ các thành phần khác, chỉ để lại phần đặc hiệu tác dụng vớiđộc tố nọc rắn là phần IgG, F(ab’)2 hoặc Fab, với mức độ cô đặc cao nhất Đểgiảm thiểu phản ứng quá mẫn khi sử dụng HTKNR, dùng pepsin cắt bỏ phần

Fc của γ-globulin miễn dịch, tạo ra mảnh F(ab’)2 (Latifi, 1978) [20], sau đó

tinh chế, cô đặc mảnh F(ab’)2 Phần Fc là nơi có nhiều thụ thể kết dính tế bào,

là trung gian của các phản ứng quá mẫn được loại bỏ Mảnh F(ab’)2 vẫn cònkhả năng kết hợp hai kháng nguyên được giữ lại

Một phương pháp khác tinh chế HTKNR là dùng papain cắt Fc của IgG,thu hồi hai mảnh Fab, mỗi mảnh có một vị trí kết hợp kháng nguyên Trọnglượng Fab khoảng 50.000

Hình 1.2 Vị trí tác động của pepsin và papain.

Mảnh Fab có ưu điểm: chỉ có một vị trí kết hợp kháng nguyên, Fabkhông hình thành phức hợp miễn dịch, không gây phản ứng quá mẫn type -III [11]; phần Fc đã mất nên không kết hợp bổ thể, hoặc macrophages, loại bỏ

quá trình giải phóng amin hoạt mạch; mảnh Fab không gây shock phản vệhoặc phản ứng dạng phản vệ; do kích thước nhỏ, Fab thấm vào khoang nộibào nhanh hơn Tuy nhiên, do thời gian bán hủy F(ab’)2 là 36 giờ, dài hơn bán

hủy F(ab) (khoảng 4 giờ), dẫn đến hiệu quả điều trị thấp (Dart R.C, McNally

J., 2001) [61]

Tại Hội nghị độc học thế giới tại Mexico lần thứ 12 (1997), các nhà khoahọc đã thống nhất quan điểm cho rằng hiệu quả điều trị của HTKNR F(ab’)2

phù hợp hơn F(ab) Hàng chục năm nay, ba vấn đề lớn của sản xuất HTKNR

từ ngựa vẫn là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu là: hiệu lực chưa đủmạnh, phản ứng không mong muốn còn cao và giá thành đắt

1.4.4.5 Đánh giá chất lượng sản phẩm:

Bất kỳ nhà sản xuất HTKNR nào cũng đều có hệ thống kiểm tra chấtlượng của mình, bao trùm tất cả quy trình sản xuất, quản lý chất lượng toàn

diện (Total quality management - TQM) [18] Kiểm soát, làm chủ được quy

trình sản xuất thể hiện ở chất lượng sản phẩm có đạt Tiêu chuẩn Quốc gia vàQuốc tế hay không Trong từng giai đoạn sản xuất, công tác kiểm tra, giámsát và đánh giá chất lượng được thực hiện thường xuyên, chặt chẽ Giai đoạnnào cũng hoàn thành mục tiêu, yêu cầu chất lượng của giai đoạn đó, đây lànền tảng thành công của sản phẩm cuối cùng Không hoàn thành tốt kết quảgiai đoạn trước sẽ làm hỏng toàn bộ công việc của giai đoạn sau

Sau khi HTKNR ra đời, sản phẩm sẽ được đánh giá chất lượng với haibước độc lập với nhau là Kiểm định cơ sở và Kiểm định Quốc gia [7],[9] Kiểm định cơ sở thực hiện tại cơ sở sản xuất HTKNR, với những thửnghiệm cơ bản: an toàn chung, vô khuẩn, không có chí nhiệt tố và hiệu lực;nếu đạt, sẽ được tiếp tục kiểm tra tiếp bước sau, đó là kiểm định Quốc gia tạiViện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ y tế Cơ quan này cótrách nhiệm đánh giá, kiểm định chất lượng độc lập, khách quan, khoa học

cho các sinh phẩm y tế đã được nhà sản xuất đánh giá chất lượng Tiêu chuẩn

chất lượng của huyết thanh kháng nọc rắn (antivenom) được quy định thống

nhất trong Dược điển Việt Nam, có tính chất pháp lý và trọng tài, có giá trịtiêu chuẩn hóa chất lượng, giúp quản lý và nâng cao chất lượng dược phẩmsản xuất và lưu hành trong nước

Tóm lại: quy trình sản xuất HTKNR cho thấy, bản chất HTKNR là

các IgG chống nọc rắn đặc hiệu, do đó các cơ sở Huyết học - Truyền máu

có điều kiện tách chiết và tinh chế được gamma globulin, đều có thể sản xuất được chế phẩm HTKNR.

1.5 TAI NẠN DO RẮN CẠP NIA VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HTKN-RCN TẠI VIỆT NAM

1.5.1 Tình hình tai nạn do rắn cạp nia tại Việt Nam:

Việt Nam có địa hình và khí hậu rất thuận lợi cho rắn độc phát triển,trong đó có các loài rắn cạp nia Cho đến nay, Việt Nam được biết là nơi cưngụ của 193 loài rắn thuộc 69 giống, 8 họ; trong đó ghi nhận tổng số 53 loài

rắn độc gồm 35 loài (15 giống) thuộc họ Rắn hổ Elapidae và 18 loài (8 giống) thuộc họ Rắn lục Viperidae Bên cạnh đó, sự phân bố theo vùng địa lý của các

loài rắn độc cũng khác nhau: 12 loài chỉ ghi nhận ở miền Bắc, 19 loài chỉ ghinhận ở miền Nam và 22 loài ghi nhận ở cả hai miền đất nước

Với hệ thống kênh rạch chằng chịt và mùa nước nổi hàng năm, cùngthời tiết ấm áp phù hợp với sự phát triển của rắn, số nạn nhân rắn độc hàngnăm ở miền Nam nhiều hơn miền Bắc

Các loài rắn nguy hiểm nhất ở miền Nam là rắn cạp nia nam (Bungarus candidus), rắn choàm quạp (Agkistrodon rhodostoma), rắn hổ mèo (Naja naja siamensis) Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) gây tử vong tại bệnh viện

tới > 80% (Trịnh Xuân Kiếm, 2010) [6],[89]; trong khi tỷ lệ tử vong do rắn

choàm quạp (Agkistrodon rhodostoma) khoảng 22% (WHO, 1999) [147], tử vong do rắn hổ mèo (Naja naja siamensis) xấp xỉ 40% (Lê Khắc Quyến, 2010) [6],[33]

Ở các tỉnh miền Bắc và miền Trung, thường gặp nhất là rắn cạp nia bắc

(Bungarus multicinctus), rắn hổ mang phì (Naja naja atra), rắn hổ mang chúa (Ophiophagus hannah) và một số loài rắn lục, trong đó nhiều nhất và nguy hiểm hàng đầu là rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) [71],[72]

Như vậy, rắn cạp nia bắc và cạp nia nam là hai loài rắn nguy hiểm nhấtViệt Nam, độc tính nọc rắn ức chế rất mạnh cả màng trước và màng sau sinapthần kinh-cơ, gây liệt cơ vân, trong đó có cơ hô hấp, gây tử vong nhanh nếukhông được cấp cứu kịp thời Khi điều trị không đặc hiệu - không có HTKNR

- bệnh nhân phải thở máy dài ngày, trung bình 4 - 6 tuần, rất vất vả, tốn kém,nhiều biến chứng và vẫn có thể tử vong

Đến nay, chúng ta vẫn chưa có số liệu đầy đủ về tình hình và ước tính

số lượng nạn nhân do rắn cạp nia cắn trong cả nước Theo Trịnh Xuân Kiếm (2001), tại bệnh viện Chợ Rẫy, từ năm 1990 đến tháng 4/1996, có 23 trường

hợp nhập viện, chiếm 2,6% tổng số nạn nhân rắn độc cắn vào viện Chợ Rẫyđiều trị [6], tỷ lệ tử vong của nhóm bệnh nhân này tại viện lên tới trên 80%

Cũng theo tác giả và cộng sự (2010), từ 1998 đến 2007, bệnh viện Chợ Rẫy tiếp nhận 42 trường hợp rắn cạp nia nam cắn, chiếm 2,1% [88] Theo Phạm Ngọc Thảo (2010) [35], trung bình mỗi năm bệnh viện Chợ Rẫy tiếp nhận

2500 trường hợp nhập viện, trong đó do rắn độc chiếm 34,7%, xấp xỉ hàngngàn người mỗi năm Như vậy, số nạn nhân rắn cạp nia ước chừng hơn 20

người/năm, bằng khoảng 1/3 so với bệnh viện Bạch Mai Theo Nguyễn Thị

Dụ, Hà Trần Hưng (2010), tại ICU - Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch

Mai, có 81 bệnh nhân bị rắn cạp nia bắc cắn trong ba năm 2004 - 2006, trong

đó 27 trường hợp nhập viện trong năm 2006 Tỷ lệ tử vong tại viện dù đượccấp cứu với đầy đủ điều kiện tốt nhất vẫn tới ≈ 7%.[72] Trong thực tế, tai nạn

do rắn cạp nia tại Việt Nam hiện chưa được thống kê đầy đủ và có hệ thốngngoài một số nghiên cứu đề cập trên đây Đây là thực tế không chỉ diễn ra tạiViệt Nam và đã được Tổ chức y tế Thế giới khuyến cáo toàn cầu: “Tai nạn dorắn độc là một vấn đề y tế bị lãng quên”[147]

Tuy nhiên, qua báo chí hàng năm, liên tiếp nhiều nơi trong cả nước cóthông tin về việc cấp cứu điều trị bệnh nhân bị rắn cạp nia cắn, đa số là rấtnặng, điều trị vất vả do thở máy dài ngày và biến chứng; điều này cho thấy sựphổ biến của tai nạn do rắn cạp nia trong cộng đồng, mức độ nguy hiểm trongthực tế do loài rắn này gây ra, cũng như tình hình cấp cứu ở các tuyến cơ sở

và tuyến bệnh viện cho loại mặt bệnh này Thí dụ: Ngày 29/7/2007: “Bệnhnhân “ôm” máy thở… bác sĩ đứng canh”, nói về tình trạng vất vả của bệnhnhân, người nhà bệnh nhân và các bác sĩ, nhân viên y tế tại Trung tâm chốngđộc bệnh viện Bạch Mai do không có HTKN-RCN [165]; Ngày 27/6/2008:

“Chữa ngộ độc rắn cắn: vất vả do thiếu huyết thanh” [166], phản ánh tìnhtrạng bức xúc trong cứu chữa rắn độc cắn mà không có HTKNR hiện nay;Ngày 22/5/2013 [172]: “Đi thể dục, thiếu nữ suýt tử vong vì rắn cắn”; Ngày22/5/2013: “Đầu hè, trúng độc do rắn độc tăng đột biến”[176]; Ngày23/8/2013 [171]: “Xin về chờ chết vì không có tiền chữa rắn cắn”,

Như vậy, đây là mặt bệnh có tỷ lệ tử vong cao, gây nhiều khó khăn chocông tác cấp cứu điều trị; bệnh nhân phải thở máy dài ngày, rất vất vả cho giađình và nhân viên y tế, nhiều biến chứng do thở máy và nằm lâu, như viêmphổi, viêm đường tiết niệu, suy kiệt , ngoài ra còn gây tổn thất rất lớn vềkinh tế Các vấn đề này có thể được giải quyết dễ dàng hơn rất nhiều nếu cóHTKN-RCN đa giá đặc hiệu Trong khi, về kỹ thuật, chúng ta có đủ điều kiệnnhân lực và cơ sở vật chất để sản xuất được loại HTKNR này

1.5.2 Chi “rắn cạp nia” Việt Nam:

- Việt Nam có 5 loài rắn độc thuộc chi Rắn cạp nia (chi Bungarus), trong đó

ba loài có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” là dễ nhầm với nhau nhất

+ Rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus):

Tên khác: rắn mai gầm, rắn mai gầm bạc

Phân bố: miền Bắc Việt Nam, Thái Lan; Đài Loan, Trung Quốc, Mianma, bắc

và trung Lào

Hình 1.3 Khu vực cư trú của rắn cạp nia bắc (B multicinctus) [156].

Loài này có thể tìm thấy ở độ cao tới 1.300 m, sinh sống chủ yếu ở cáckhu vực thấp, trong các bụi cây, rừng, bờ ruộng, ao hồ, đầm và rừng ngậpmặn Rắn hoạt động về ban đêm, ban ngày ẩn trong các hang, hốc Xuất hiệnnhiều từ cuối mùa xuân và ngủ đông trong tháng mười một Thức ăn là cácloài rắn khác, lươn, chạch, ếch nhái, chột và thỉnh thoảng ăn cả thằn lằn Rắn

đẻ 3 - 15 trứng, nở thành con sau một tháng rưỡi, thường vào tháng 6,7 trong

năm Loài rắn này nhút nhát dưới ánh sáng ban ngày nhưng rất hoạt động vàoban đêm Dễ bị chúng cắn nếu bị khiêu khích hoặc bị đụng phải Lượng nọcđộc trung bình khoảng 4,6 mg -18,4 mg mỗi vết cắn Nọc rắn cạp nia bắc có

LD50 khoảng 0,15µg/g (Steven D., Aird Glen C., et al., 1999) [131]

+ Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus):

Tên khác: Malayan kraid, Common krait, Blue krait, Javan krait

Phân bố: Việt Nam, Campuchia, Indonexia, Lào, Malaysia [136],Myanmar, Singapore, Thái Lan [157],[24] Đây là loài rắn phổ biến nhất đồngbằng và trung du Việt Nam

Hình 1.4 Khu vực cư trú của rắn cạp nia nam (B.candidus) [155].

Về hình thái, loài này thoáng nhìn giống hệt rắn cạp nia bắc Rắn cạp nianam chỉ có tối đa 32 khoang đen trên toàn bộ cơ thể Khoang trắng rộng hơnkhoang đen, bao toàn bộ mặt bụng liên tiếp đến mặt bên thân rắn

Rắn cạp nia nam sống chủ yếu ở đồng bằng, đồi, rừng, đôi khi gặp ở độcao tới 1600 mét Đặc tính loài giống rắn cạp nia bắc: thích sống gần nước,bên bờ ruộng, ao hồ, đầm; hoạt động về đêm, thích ăn lươn, chạch Rắn cạpnia nam thường gặp nhiều nhất ở miền đông Nam Bộ đến Trung Bộ Đây làloài rắn độc vào loại nhất Việt Nam và là một loài rắn độc nhất thế giới, với

LD50 ≈ 0,1 µg/g (Tan N.H et al., 2004) [135], tỷ lệ gây tử vong rất cao [117].

+ Rắn cạp nong (Bungarus fasciatus) [10],[24]:

Loài rắn này có 24 - 27 khoang đen, khoang vàng xen kẽ nhau, khoangđen bao quanh thân rắn Rắn có ở khắp mọi miền ba nước Đông Dương ỞViệt Nam, loài rắn này thường gặp ở vùng đồng bằng và trung du Rắn hay ở

bờ ruộng, bờ đê, bụi tre, gò đống Hoạt động về đêm Thức ăn là các loại rắnkhác, ếch, rắn mối, chuột, thậm chí cả cá Nọc rắn cạp nong có độc tính mạnh

(Pe T., Myint T., et al., 1997)[113] Loài rắn này chậm chạp, ít cắn người.

+ Rắn cạp nong đầu đỏ (Bungarus flaviceps) [24],[39]:

Đầu và phần chót đuôi rắn có mầu đỏ Loài rắn này hiếm gặp Ở Việt

Nam đến nay mới chỉ phát hiện thấy ở Núi Dinh, tỉnh Đồng Nai, với độ caotrên 914 mét so với mực nước biển Tại các nước như Thái Lan, Malaysiacũng chỉ tìm thầy loài rắn này ở vùng núi cao Rắn cạp nong đầu đỏ là loài rắn

độc họ rắn hổ, cùng chi rắn cạp nia (Bungarus) nhưng khá hiếm gặp Nọc độc

loài này chủ yếu tác động màng trước sinapse và có khả năng gây rối loạn

đông máu (Ang Swe Siang, et al., (2010)[42].

+ Rắn khoang sông Hồng (RKSH) - Bungarus slowinskii:

RKSH (Red River Krait), mang tên nhà sinh học Mỹ chuyên nghiên cứu

về bò sát Joseph Bruno Slowinskii (1965 - 2001), người đã chết do bị rắn cạp

nia bắc cắn, khi đang nghiên cứu về loài rắn này tại Mianma [158] Năm

2005, Kuch, Kizirian, Lawson, Donnelly, Nguyễn Quang Trường và Mebs, đã

phát hiện loài rắn này tại tỉnh Yên Bái, huyện Văn Yên, Na Hầu và lưu vựcsông Hồng Sau đó còn phát hiện thấy loài rắn này tại Quảng Nam, QuảngTrị, Thừa Thiên – Huế và Lào [93] Đây cũng là loài rắn khúc đen, khúc trắngnhư rắn cạp nia bắc, cạp nia nam Loài rắn này có khoang đen rộng, khoanhtrắng rất hẹp Đây là loài rắn độc mới phát hiện trên thế giới, thuộc chi rắn

cạp nia (Bungarus), và là một trong 5 loài rắn đặc hữu có ở Việt Nam [39].

Các hiểu biết về độc tố nọc loài rắn này chưa nhiều

1.5.3 Đặc điểm nọc rắn cạp nia và cơ chế bệnh sinh:

- Thành phần: nọc rắn khô có trên 90% là protein, trong đó 25-70% là enzym,

còn lại là các độc tố polypeptide không enzyme, polypeptide không phải độc

tố và một số chất vô cơ

+ Các enzym: thường gặp nhất là phospholipase A2, hyaluronidase,

phosphoesterases, peptidase [48],[50],[66],[78],[90],[124],[133] tác dụngphá hủy các tế bào máu, các dây thần kinh ngoại vi, cơ vân, nội mạc mạchmáu, tác động vào hoạt động màng trước synapse

Theo Middlebrook J.L., Kaiser II (1989) [102]; Manjunatha Kini (2003)

[98], thành phần nọc của rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus ) và rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) đều chứa hai loại độc tố thần kinh là α-

neurotoxin và β,γ-neurotoxins nhưng số lượng, thành phần khác nhau [59]

Theo Khow O., et al., (2003) [87], Inn-Ho Tsai et al., (2002) [78], trọng

lượng phân tử độc tố nọc hai loài rắn này này từ 25-25,5 kDa, cấu tạo bởi cácpolypeptide 16-16,5 kDa và 7-8,5 kDa, nhỏ hơn nhiều loài rắn khác [44],[50]

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của độc tố nọc rắn cạp nia [6].

- Bệnh cảnh lâm sàng của bệnh nhân rắn cạp nia nam cắn thường nặng nềhơn cạp nia bắc do khác biệt về thành phần nọc và vị trí tác động tại synapsethần kinh-cơ của hai loài rắn độc khác nhau Cũng chính vì vậy, HTKN-RCNđơn đặc hiệu của từng loài rắn cạp nia không có tác dụng trung hòa chéo nhau

hoặc tác dụng rất hạn chế (Warell D.A và cs, 1983) [146]

- Nọc rắn cạp nia là loại độc tố thần kinh có trọng lượng phân tử thấp, hấpthu và lan tỏa rất nhanh trong cơ thể, tác động cả màng trước và sau sinapse,

ức chế rất mạnh dẫn truyền thần kinh-cơ Các dấu hiệu nhiễm độc tại chỗ rắn

Hướng dẫn truyền thần kinh

Màng trước sinapse Màng sau sinapse

cắn thường mờ nhạt, nạn nhân thường không đau, không chảy máu, khiếnphát hiện không kịp thời hoặc chủ quan coi thường Khi triệu chứng yếu, bại,liệt cơ xuất hiện, nạn nhân trở tay không kịp, tử vong

1.5.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất HTKN rắn cạp nia:

1.3.1 Trên thế giới:

- Năm 1983, David Warrell khi thông báo kết quả nghiên cứu về các tai nạn

do Bungarus candidus (Malayan kraid) gây ra tại miền đông Thái Lan và tây bắc Malaysia, tác giả đã dẫn nghiên cứu của Kuo T.P., Wu C.S trên tạp chí The Snake (1972) về 925 trường hợp bị rắn Bungarus multicinctus cắn tại Đài

Loan với tỷ lệ tử vong tới 23% Đây là những cảnh báo đầu tiên về sự nguyhiểm do rắn cạp nia gây ra [146]

- Năm 1995, Chan J.C., Cockram C.S., Buckley T (Hongkong) [47], thông báo về hai trường hợp bị rắn cạp nia bắc cắn (Bungarus multicinctus), với đầy

đủ triệu chứng nhiễm độc nọc rắn cạp nia, có liệt cơ hô hấp, sụp mi, sau khi

được điều trị với HTKNR đơn giá chống nọc Bungarus fasciatus và thở máy

hỗ trợ, đã hồi phục sau tám ngày Thời điểm này chưa có nước nào sản xuất

được HTKN-RCN cho hai loài rắn cạp nia bắc (B.multicinctus) và rắn cạp nia nam (B.candidus).

- Năm 1999, Chanhome L., Wongtongkam et al., 1999 (Thái Lan) dùng HTKN rắn cạp nong (Bungarus fasciatus) trung hòa nọc rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) trong in - vivo, thấy có hiệu quả tương tự như với nọc rắn Bungarus flavicep [51], tuy nhiên nghiên cứu không nói rõ mức độ thành

công đến đâu Như vậy, tới thời gian này Thái Lan chưa sản xuất được

HTKN-RCN, trong khi ở Việt Nam, Trịnh Xuân Kiếm và cộng sự đã chế tạo thành công HTKN rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) tại Đơn vị nghiên cứu huyết thanh kháng nọc, bệnh viện Chợ Rẫy [88]

- Năm 2002, với nghiên cứu dùng nọc rắn cạp nia nam không khử độc để gây

miễn dịch cho thỏ, các tác giả Thái Lan cho biết, thỏ nghiên cứu đã chịu đượcliều tiêm dưới da với nồng độ nọc 150 – 200 µg/kg ở lần gây mẫn cảm thứ 5,trong vòng 6 tháng nghiên cứu Khi tăng liều trên mức này ở các lần miễn

dịch sau, thỏ đều tử vong (Chanhome L et al., 2002) [52] Đây là nghiên cứu

tạo nền tảng cho sản xuất HTKN rắn cạp nia nam ở Thái Lan sau này

- Năm 2004, Trịnh Xuân Kiếm, Nguyễn Thị Dụ, Hà Trần Hưng và cộng sự

sản xuất và thử lâm sàng thành công HTKN-RCN bắc trên 27 bệnh nhân bị

Bungarus multicinctus cắn, hiệu quả rất cao [71].

- Năm 2007, Leeprasert W., Kaojarern S., (Thái Lan) [95] đã sử dụng

HTKNR của Viện QSMI, sản xuất 2004, điều trị cho ba bệnh nhân nhiễm độcnọc rắn cạp nia nam, vào viện và được dùng HTKNR đặc hiệu rất sớm Kếtquả có so sánh với một trường hợp vào viện cùng thời điểm, không được điều

trị bằng B.candidus antivenom Các tác giả cho biết, ở cả ba bệnh nhân,

HTKNR đều có hiệu lực, triệu chứng liệt được cải thiện trong vòng 40 giờ saukhi dùng thuốc Tuy nhiên, lượng antivenom được sử dụng quá nhiều: 80, 88,

87 lọ trong thời gian 90 giờ Điều này cho thấy, công hiệu của HTKNR

Bungarus candidus của họ không cao, nhiều nguy cơ bệnh huyết thanh sau

điều trị Các bệnh nhân này nhiễm độc nặng (khó thở, khó nói, sụp mi mắttrong 30 – 60 phút; được đặt nội khí quản trong 2 - 3 giờ sau khi bị rắn cắn)

Như vậy, sau Việt Nam 5 năm, Thái Lan đã sản xuất thành công B.candidus antivenom [160], nhưng chất lượng còn phải bàn.

- Năm 2009, theo Chieh-Fan C et al., (Đài Loan) [53], Trung tâm Vacxin và

Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Đài Loan - đã sản xuất được nhiều loạiHTKNR phục vụ cho cứu chữa sáu loài rắn độc nguy hiểm thường gặp nhất

Đài Loan, trong đó có loài rắn cạp nia bắc Bungarus multicinctus, loài rắn độc

gây tử vong cao nhất Đài Loan hiện nay: khi các loài rắn độc khác chỉ gây tử

vong 2,4% thì loài rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) vẫn gây tử vong

đến 24% Hiện nay Đài Loan đã sản xuất được bốn loại HTKNR, trong đó có

HTKNR đa giá cho hai loài: rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) và rắn

hổ mang phì (Naja atra) (Chi - Wen Juan, 2012) [56]

- Malaysia là một nước ASEAN hiện đang phát triển rất mạnh các nghiên cứu

về nọc độc của rắn cũng như sản xuất các loại HTKNR ứng dụng điều trị các

loài rắn của Malaysia, trong đó có rắn cạp nia nam Năm 2012, Tan N.H., Leon P.K., Phung S.Y (Malaysia) [137], đã thí nghiệm đánh giá tác dụng trung hòa độc tính nọc của rắn cạp nia nam Bungarus candidus (Malayan kraid) bằng hai loại HTKN rắn hổ đa giá thường dùng nhất ở Ấn Độ là Vins

polyvalent antivenom (VPAV) và Bharat polyvalent antivenom (BPAV), kếtquả: các loại HTKNR này đều không có tác dụng Như vậy, cho đến nay, vớinhiều thành công trong nghiên cứu, Malaysia vẫn chưa sản xuất được loại

HTKN rắn cạp nia nào, đây quả là một vấn đề không đơn giản.

- Trung Quốc cũng là nước đang phát triển mạnh các cơ sở nghiên cứu sảnxuất HTKNR, việc ứng dụng các thành tựu nghiên cứu vào sản xuất HTKNRdiễn ra rất nhanh chóng, làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do tai nạn rắn độc trongnhững năm gần đây Hiện nay, Trung Quốc đã sản xuất được HTKNR đa giá

cho rắn hổ mang (Naja atra) và rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) Tuy

nhiên, ít có thông báo của các tác giả Trung Quốc về vấn đề này

- Theo Warrell D.A (2010), chuyên gia hàng đầu của WHO về rắn độc [147],hiện nay thế giới mới chỉ có hai loại sản phẩm HTKN-RCN trên thị trường là:

“Bungarus candidus antivenom”, “Malayan Krait antivenin” do Viện Queen

Saovabha Memorial Institute, Thái Lan sản xuất, liều dùng 50 ml (10ml/ống),

trung hòa được 0.4 mg/ml nọc rắn cạp nia nam; và “Bungarus multicinctus and Naja atra antivenom”do Chinese Shanghai Vaccine & Serum Institute sản xuất, “Taipei Naja-Bungarus antivenin” do Đài Loan sản xuất [147].

1.3.2 Tại Việt Nam:

- Trước 1990, chúng ta vẫn chưa có một loại HTKNR nào Việc điều trị rắnđộc cắn chỉ duy nhất bằng các phương pháp không đặc hiệu Rất nhiều bệnhnhân tử vong, tàn phế [6]

- Năm 1991, Đơn vị nghiên cứu chế tạo HTKN được thành lập tại bệnh viện Chợ Rẫy, đơn vị đã nghiên cứu chế tạo được HTKNR hổ đất (Naja kaothia antivenom) ứng dụng lâm sàng hiệu quả, làm giảm tỷ lệ tử vong từ 19,5% còn

3,1% [5],[6]

- Từ đó đến nay, việc nghiên cứu về nọc rắn và sản xuất HTKNR ở Việt Nam

đã có nhiều tiến bộ Đã thử nghiệm thành công nhiều loại HTKNR, đáp ứngmột phần nhu cầu của bệnh nhân bị rắn độc cắn, như: HTKN rắn hổ chúa

(King cobra antivenom)[21], HTKNR choàm quoạp (Agkistrodon rhodostoma antivenom), HTKNR lục tre (Trimeresurus albolabris antivenom), HTKNR hổ đất (Naja kaothia antivenom), HTKNR hổ mang (Naja atra) [6],[23]

- Năm 1999, Trịnh Xuân Kiếm đã nghiên cứu, chế tạo thành công HTKN rắn cạp nia nam (Bungarus candidus antivenom), trước Thái Lan 5 năm [88]

- Năm 2004, Trịnh Xuân Kiếm và cộng sự đã nghiên cứu, chế tạo thành công HTKN rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), kết quả đã được Hà Trần Hưng, Höjer J., Nguyễn Thị Dụ, Trịnh Xuân Kiếm đăng trên J Med Toxicol, Dec, 6, pp 393-7 [71],[72].

- Với các thành công trên, Việt Nam là nước nghiên cứu, chế tạo thành côngHTKN rắn cạp nia đơn giá của hai loài rắn cạp nia bắc, rắn cạp nia nam tươngđối sớm hơn so với các nước khác trong khu vực Tuy nhiên, do nhiều nguyên

nhân, cho đến nay, trong khi Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc đã cho ra thịtrường sản phẩm thương mại, chúng ta vẫn chưa có HTKN rắn cạp nia đơn

giá (Monospecific) trên thị trường

- Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý, nhập khẩuantivenom để điều trị, lâu dài không phải là biện pháp tốt, trong khi đất nướccòn ngèo, ta có tiềm lực khoa học công nghệ, đầu tư không cần nhiều Nhucầu HTKNR cho bệnh nhân điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam là đòi hỏi cấpthiết, trước mắt cũng như lâu dài Cần chủ động tìm một giải pháp cho vấn đề

này một cách căn cơ, bài bản: đó là sản xuất HTKNR có chất lượng tốt, an

toàn, hiệu lực cao, giá thành hợp lý, sẵn sàng cứu chữa nạn nhân

- Để cứu chữa nạn nhân rắn cạp nia cắn, cần cả antivenom monospecific và polyspecific Trong nhiều trường hợp không xác định được loài rắn cắn, điều trị với HTKNR polyspecific hay hơn monospecific

- Trên cơ sở những thành công trong nghiên cứu, sản xuất HTKN rắn cạp nianam và HTKN rắn cạp nia bắc, việc nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giáF(ab’)2 cho cả hai loài Bungarus candidus và Bungarus multicinctus là giải

pháp tốt, đáp ứng kịp thời nhu cầu cấp cứu điều trị nạn nhân rắn cạp nia cắn

hiện nay, nhất là khi chưa có VDK (Venom detection kits) đặc hiệu [15],[83]