tieu luan Ứng dụng Công nghệ ADN tái tổ hợp trong Y học

Hơn một thập kỷ qua, phương pháp chẩn đoán và giám định loài sinh vật dựa trên đặc điểm ADN đã được phát triển và đang được sử dụng rộng rãi. Lợi thế của phương pháp sinh học phân tử là cho kết quả có độ tin cậy cao, cần ít mẫu vật và không phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển của các cá thể sinh vật nên rất phù hợp cho việc chẩn đoán và phân loại các bệnh ký sinh trùng. Với kích thước nhỏ lại chứa gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào nên ADN hệ gen ty thể được coi là đối tượng lý tưởng để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen phục vụ nghiên cứu về giám định, phân loại và lập phả hệ quần thể. Các gen của ty thể trong cùng một chủng, cùng loài thậm chí trong các loài có quan hệ gần về sinh học có sự bảo tồn rất cao, do vậy bất cứ sự thay đổi nhỏ nào cũng là dấu hiệu giá trị trong giám định và phân loại (Lê Thanh Hoà, 2002). Một trong những gen quan trọng là nad3gen mã hoá cho enzyme nicotinamide dehydrogenase, có độ bảo tồn cao đã được khai thác phục vụ nghiên cứu, giám định, phân loại và lập di truyền quần thể (Fernadez và cs., 1998). Do tầm quan trọng về dịch tễ học và phòng bệnh sán lá gan nhỏ O. viverrini ở Việt Nam, cũng như ý nghĩa về giám định bệnh bằng chỉ thị di truyền hệ gen, em lựa chọn đề tài tiểu luận: Giám định bệnh sán lá gan nhỏ O. viverrini bằng chỉ thị di truyền gen nad3 của hệ gen ty thể.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

  

-TIỂU LUẬN CUỐI KHÓA

Tên đề tài:

Giám định bệnh sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini bằng

chỉ thị di truyền gen nad3 của hệ gen ty thể

Môn học: Công nghệ ADN tái tổ hợp Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến Lớp: K29.CSH.ĐN

Ngành: Công nghệ sinh học

Đà Nẵng, 3/2015

MỞ ĐẦU

Bệnh sán lá gan nhỏ là một bệnh truyền nhiễm lây qua đường ăn uống, do loài

Clonorchis sp hoặc loài Opisthorchis sp gây nên Trong đó, bệnh sán lá gan nhỏ opisthorchiasis do Opisthorchis viverrini gây nên là bệnh quan trọng đối với sức khỏe

cộng đồng ở các nước Đông Nam Á bao gồm Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam

(IARC, 1994)

Những mẫu ký sinh trùng lần đầu tiên được Lieper mô tả (1911) do Kerr cung cấp, lấy từ tử thi của 2 tù nhân ở nhà tù Chiengmai (phía Bắc Thái Lan) vào năm 1911 Sau này, năm 1955 Sadun đã nghiên cứu hình thái và dịch tễ học của loài sán lá gan này ở Đông Bắc Thái Lan (Sadun và cs., 1955)và kết luận những trường hợp bị nhiễm

sán ở Thái Lan là do O viverrini gây nên và được Wykoff và cộng sự xác nhận lại năm

1965 (Wykoff và cs., 1965)

Ở Việt Nam, sán lá gan nhỏ O viverrini được tìm thấy ở một số tỉnh phía Nam

và đã được giám định phân tử bằng chỉ thị di truyền hệ gen ty thể (Nguyễn văn Chương, 2000; Lê Thanh Hòa và cs., 2003; Ngô Thị Hương và cs., 2006)

Hơn một thập kỷ qua, phương pháp chẩn đoán và giám định loài sinh vật dựa trên đặc điểm ADN đã được phát triển và đang được sử dụng rộng rãi Lợi thế của phương pháp sinh học phân tử là cho kết quả có độ tin cậy cao, cần ít mẫu vật và không phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển của các cá thể sinh vật nên rất phù hợp cho việc chẩn đoán và phân loại các bệnh ký sinh trùng

Với kích thước nhỏ lại chứa gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào nên ADN hệ gen ty thể được coi là đối tượng lý tưởng để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen phục vụ nghiên cứu về giám định, phân loại và lập phả hệ quần thể Các gen của ty thể trong cùng một chủng, cùng loài thậm chí trong các loài có quan hệ gần về sinh học có

sự bảo tồn rất cao, do vậy bất cứ sự thay đổi nhỏ nào cũng là dấu hiệu giá trị trong giám định và phân loại (Lê Thanh Hoà, 2002) Một trong những gen quan trọng là

nad3-gen mã hoá cho enzyme nicotinamide dehydrogenase, có độ bảo tồn cao đã được

khai thác phục vụ nghiên cứu, giám định, phân loại và lập di truyền quần thể (Fernadez

và cs., 1998)

Do tầm quan trọng về dịch tễ học và phòng bệnh sán lá gan nhỏ O viverrini ở

Việt Nam, cũng như ý nghĩa về giám định bệnh bằng chỉ thị di truyền hệ gen, em lựa

chọn đề tài tiểu luận: Giám định bệnh sán lá gan nhỏ O viverrini bằng chỉ thị di

truyền gen nad3 của hệ gen ty thể.

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ SÁN LÁ GAN VÀ HỆ GEN TY THỂ

1.1 Tình hình bệnh sán lá gan nhỏ ở Việt Nam và trên thế giới

1.1.1 Tình hình bệnh sán lá gan nhỏ trên thế giới

Hình 1.1: Sự phân bố địa lý của các loài sán lá gan nhỏ ở châu Á

Bệnh sán lá gan nhỏ gặp nhiều ở các nước Đông Á, Đông Nam Á, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Malaysia, Thái Lan, Lào, Campuchia (WHO, 1995) và tăng lên

ở các nước phát triển do sự di cư của người Châu Á(Woolf, A., và cs., 1984)

Bệnh sán lá gan nhỏ do Opisthorchis viverrini gây nên là một căn bệnh phân bố

theo địa phương ở các nước Campuchia, Lào, Thái Lan, Malaysia, Việt Nam, Trung

Quốc Năm 1929, Bedier và Chesneau đã phát hiện thấy O viverrini bị nhiễm ở những

người Lào ở Vientian (15%) và Takhet (23%) (Bedier, E., Chesneau, P., 1929) Năm

1997, ở Lào có tới 1,7 triệu người nhiễm, có nơi tỷ lệ nhiễm tới 54,4-100%

(Sithithawom và cs., 1997) Thái Lan được coi là trung tâm về dịch tễ của O viverrini,

có khoảng 6 triệu người bị nhiễm sán lá gan (Jongsukusntigul và Imsomboon, 1997)

1.1.2 Tình hình bệnh sán lá gan nhỏ ở Việt Nam

Clonorchis sinensis

Opisthorchis viverrini

Clonorchis sinensis

Opisthorchis viverrini

Cũng như trên thế giới, bệnh sán lá gan nhỏ ở Việt Nam cũng liên quan đến tập quán sinh hoạt, đặc biệt ở những nơi có tập tục ăn gỏi cá.

Bệnh sán lá gan nhỏ đã được xác định phân bố ít nhất ở 18 tỉnh, thành phố: Nam Định, Ninh Bình, Hà Nam, Thái Bình, Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Tây, Hòa Bình, Hà Giang, Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa thiên Huế, Quảng Nam, Bình Định, Phú Yên, Đắc Lắc, Gia Lai, có nơi tỷ lệ nhiễm tới 37% như ở Nam Định, Phú

Yên Riêng nhiễm O viverrini thì được tìm thấy chủ yếu ở một số tỉnh phía Nam Hiện nay đã xác định ít nhất 8 tỉnh lưu hành O viverrini như Phú Yên (tỷ lệ nhiễm 36,9%),

Bình Định (tỷ lệ nhiễm 11,9%), Đắc Lắc (tỷ lệ nhiễm 7,6%), Đà Nẵng (tỷ lệ nhiễm 0,3%), Quảng Nam (tỷ lệ nhiễm 4,6%), Khánh Hoà (tỷ lệ nhiễm 1,4%), Thừa ThiênHuế (phát hiện ca bệnh) (Nguyễn Văn Chương, Nguyễn Văn Đề, 1996, 1997, 2003)

Bằng hình thái học Opisthorchis viverrini đã được Nguyễn Văn Chương,

Nguyễn Văn Đề và cộng sự năm 1997 xác định tại Phú Yên và công bố năm 2000 và

đã được giám định bằng chỉ thị di truyền hệ gen ty thể (Lê Thanh Hoà và cs., 2003; Nguyễn Văn Đề và cs., 2004; Ngô Thị Hương và cs., 2006)

1.2 Giới thiệu sơ lược về hệ gen ty thể

1.2.1 Một số khái niệm cơ bản

Gen là một đơn vị di truyền chứa một đoạn ADN giới hạn giữa bộ mã khởi đầu

và bộ mã kết thúc Gen có thể cho sản phẩm hoặc không cho sản phẩm

Hệ gen là tập hợp các chuỗi nucleotit phân bố trong các phân đoạn dài ngắn khác nhau gọi là nhiễm sắc thể (NST) (đối với hệ gen cá thể bậc cao) hoặc là một vòng acid deoxyribonucleic (ADN) khép kín (đối với hệ gen cá thể bậc thấp)

Plasmid là các yếu tố di truyền nằm ngoài NST, sao chép một cách độc lập bên trong các tế bào sinh vật ADN của chúng là ADN mạch vòng, sợi kép, có mang các gen cần thiết cho việc sao chép plasmid và cần thiết cho các chức năng khác nhau của plasmid

Các plasmid được dùng nhiều nhất trong các thí nghiệm về ADN tái tổ hợp, có mang các gen bền vững với các kháng sinh Nhờ vậy có thể chọn lọc các phân tử ADN tái tổ hợp một cách dễ dàng Chúng lại có trọng lượng nhỏ hơn nhiều so với ADN vật chủ nên có thể dễ dàng tinh sạch

1.2.2 Ty thể và hệ gen ty thể

Ty thể (mitochondrial) là một loại tế bào quan (organelle) đặc biệt của tế bào, nằm trong tế bào chất của các tế bào có nhân thật (Eucaryota) Chức năng chính của ty thể là sử dụng các loại enzyme chuyển hoá do chúng sản xuất, thực hiện quá trình oxy hoá-khử để sản xuất năng lượng dưới dạng ATP cung cấp cho các hoạt động của tế bào Chính vì thế, ty thể được xem như là nhà máy năng lượng của tế bào

ADN của ty thể là một vòng ADN khép kín, có kích thước khoảng 13-40 kb tuỳ loài, có những đặc điểm đặc trưng như tồn tại ở dạng đơn bội, không xảy ra quá trình tái tổ hợp và di truyền theo dòng mẹ Hơn nữa, hệ gen ty thể không lớn lắm, lại không có cấu trúc quá phức tạp và có tỷ lệ biến đổi nucleotide cao hơn hệ gen nhân từ 10-15 lần Với

Hình 1.3: Hệ gen nhân và hệ gen ty thể trong tế bào

Trong một tế bào động vật luôn tồn tại song song hai hệ gen: hệ gen nhân và hệ gen ty thể Hai hệ gen này đều có sản phẩm riêng hoạt động có tính chất vừa độc lập vừa tương tác Dĩ nhiên hệ gen ty thể chịu ảnh hưởng điều hòa của hệ gen nhân

Hệ gen nhân chỉ có một bản sao trong một tế bào động vật, nhiễm sắc thể dạng thẳng, ADN sợi kép, kích thước lớn (vài trăm đến vài nghìn megabase)

Hệ gen ty thể gồm nhiều bản sao trong một tế bào, nằm trong tế bào chất ADN sợi kép, dạng vòng, kích thước 13-25 kb (ở động vật), 40 kb (ở thực vật)

Hình 1.4: Cấu trúc ty thể

Ty thể và hệ gen ty thể là một bộ phận quan trọng của tế bào, nó có hình gậy hoặc hình hạt Dưới kính hiển vi điện tử, người ta thấy ty thể là bộ phận có tổ chức cao Ty thể có hai màng phân biệt rõ rệt: màng ngoài nhẵn, bao quanh ty thể, màng trong có từng đoạn có nếp gấp chạy vào trung tâm làm thành những mào (cristae) Khoang ở trung tâm gọi là chất cơ bản Kích thước thay đổi tùy loại tế bào Trong một

tế bào có 200-300 ty thể hoạt động(Lê Thanh Hoà, 2002)

nad6

A nad1

E K

N P I D

cox1 W nad3

S1 atp6 nad2

M F cob nad4

nad6

A nad1

E K

N P I D

cox1 W nad3

S1 atp6 nad2

M F cob nad4

nad6

A nad1

E K

N P I D

cox1 W nad3

S1 atp6 nad2

M F cob nad4

nad6

A nad1

E K

N P I D

cox1 W nad3

S1 atp6 nad2

M F cob nad4

Hệ gen ty thể động vật bao gồm một vòng ADN khép kín chứa khoảng 13-25 nghìn nucleotit gồm 12-13 gen cho sản phẩm Protein, 2 gen ARN Ribosome (rARN),

22 gen ARN vận chuyển (tARN) và một số tiểu phần khác Các chuỗi giao gen thường ngắn (tuy nhiên cũng có ít nhất một vùng không mã hóa dài), cùng với bộ ba khởi đầu cho việc sao chép ở một số loài có liên quan đến tính ổn định của cấu trúc bậc 2

Cho đến nay có hơn 130 hệ gen ty thể của các động vật từ đơn bào đến đa bào

đã được phân tích đầy đủ hoặc gần đầy đủ Điều này là một thuận lợi to lớn cho việc sử dụng hệ gen ty thể trong nghiên cứu(Lê Thanh Hoà, 2002)

Trật tự của gen ty thể thường ổn định qua một thời gian dài Sự khác biệt giữa các thành viên trong một họ thường là hiếm Trong khi những khác biệt rõ ràng có thể xảy ra ở loài cao hơn, đặc biệt trong các lớp hoặc trong phả hệ Điều này rất thuận lợi cho việc nghiên cứu chẩn đoán, giám định loài bằng sinh học phân tử với chỉ thị di truyền là hệ gen ty thể

Do kích thước gen nhỏ lại chứa gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào,ADN hệ gen ty thể được gọi là đối tượng lý tưởng để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen phục vụ nghiên cứu về chẩn đoán, phân loại sinh vật Các gen trong ty thể lại có sự biến đổi nhanh hơn hệ gen nhân tế bào 10-15 lần nên rất thuận lợi cho việc nghiên cứu

Các gen của ty thể trong cùng chủng, loài thậm chí trong các loài có quan hệ gần về sinh học có sự bảo tồn rất cao, do vậy bất cứ sự thay đổi nhỏ nào cũng là dấu hiệu giá trị trong giám định và phân loại

Nghiên cứu hệ gen ty thể còn có tầm quan trọng trong chẩn đoán, điều trị và phòng chống bệnh, vì có nhiều bệnh ở người và động vật có liên quan tới sự biến đổi ở

ty thể Đối với ký sinh trùng, sự hiểu biết đầy đủ về hệ gen ty thể còn có giá trị định hướng trong phòng chống Đặc biệt là tìm kiếm hóa chất, hóa dược trong điều trị bệnh

ký sinh trùng hoặc thực nghiệm các loài vacxin thế hệ mới

1.2.3 Gen nad3 (nicotinamide dehydrogenase)

Loài sán lá gan nhỏ O viverrini ở Phú Yên (OvPY4) được giám định bằng đoạn gen có chiều dài khoảng 1,3kb, đoạn gen này bao gồm toàn bộ gen nad3 mà chúng tôi

dùng để phân tích, so sánh

Hình 1.6: Sơ đồ minh họa vị trí cặp mồi bám

Chức năng của gen nad3 là tổng hợp NADH cung cấp điện tử cho các chu trình

1.3 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu bệnh sán lá gan nhỏ bằng phương pháp sinh học phân tử

1.3.1 Giới thiệu chung

Sinh học phân tử là một lĩnh vực quan trọng để khám phá hệ gen bên trong, nghiên cứu cấu trúc, mối tương quan và biểu hiện kiểu gen (genotype) của đối tượng Như vậy, nói đến sinh học phân tử nghĩa là nói đến cấu trúc cơ bản về gen và di truyền cũng như các kỹ thuật nhằm phục vụ cho quá trình nghiên cứu và thực nghiệm lĩnh vực này

Phương pháp sinh học phân tử đang được ứng dụng ngày càng rộng rãi và có hiệu quả trong mọi lĩnh vực sinh học Đó là việc sử dụng các kỹ thuật ADN (trước hết

là kỹ thuật PCR) và kỹ thuật protein để xác định chuỗi gen hay chuỗi amino acid của từng gen, cũng như lập bản đồ gen của từng khu vực nhất định trong hệ gen của loài cần chẩn đoán để so sánh đối chiếu với những loài khác, nhằm xác định chính xác loài mong muốn Có rất nhiều phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử, trước hết phải kể đến phương pháp di truyền học tế bào, phương pháp hợp lai ADN-ADN, phương pháp hợp lai ADN phóng xạ, phương pháp phân tích biến thái phân đoạn ADN bằng kỹ thuật enzyme giới hạn (RFLP), cũng như rất nhiều phương pháp sử dụng phản ứngPCR (polymerase chain reaction) hoặc phối hợp PCR với phương pháp ADN

Tính chính xác khi so sánh cấu trúc trật tự nucleotit của hệ gen các cá thể khác nhau cho phép có được sự phân biệt chính xác đặc tính di truyền học của cá thể, kể cả khi sản phẩm gen của chúng có thể bị ảnh hưởng tương tác của môi trường và đồng loại Ngày nay, khảo sát và phân tích cấu trúc ADN của cá thể để so sánh được coi là phương pháp tối ưu trong nghiên cứu sinh vật nói chung và ký sinh trùng nói riêng, đặt

ra một hướng mới: hướng giám định, phân loại và nghiên cứu tiến hoá bằng phương pháp sinh học phân tử, đúng hơn là phương pháp ADN

Phương pháp ADN có độ nhạy và tính chính xác cao, đặc biệt trong chẩn đoán phát hiện biến chủng, thậm chí trong các cá thể đồng chủng, ngay cả khi vùng ADN nghiên cứu không cho sản phẩm gen (non-coding region), hay cả khi một số gen ở trạng thái im lặng (silent genes) Phương pháp ADN còn bao quát cả phương pháp Protein, vì khi cấu trúc gen trong chuỗi nucleotide đã được xác định thì cấu trúc protein cũng dễ dàng xác định để đánh giá và so sánh Sự phát triển của kỹ thuật máy tính điện tử (computational technology), kết hợp với các kỹ thuật ADN (DNA technology) hình thành nên một lĩnh vực khoa học nghiên cứu và ứng dụng mới gọi là Sinh-tin học (Bioinformatics) cho phép ứng dụng phương pháp này một cách hiệu quả

và rộng rãi Tuy nhiên phương pháp sinh học này đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, tốn kém và cần các nhân viên kỹ thuật có trình độ cao

Như vậy, việc chẩn đoán, giám định và phân loại nhiều loại sinh vật, kể cả ký sinh trùng cho đến nay vẫn dựa vào các phương pháp truyền thống là chính, trước hết phương pháp hình thái học chiếm vị trí quan trọng Các phương pháp sinh học phân tử

đã bước đầu được ứng dụng trong chẩn đoán phân loại và lập phả hệ sinh vật Các số liệu chính xác của các phương pháp sinh học phân tử đã cho phép ứng dụng những hướng mới và rất có thể sẽ làm thay đổi một phần hệ thống phân loại hiện có

1.3.2 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu bệnh sán lá gan nhỏ bằng phương pháp sinh học phân tử

Hiện nay, ở Việt Nam cũng như trên thế giới việc phòng chống các bệnh do ký sinh trùng gây ra có vai trò rất quan trọng cho việc chăm sóc sức khỏe người dân

Tổ chức y tế thế giới (WHO, 1995) đã đưa ra các chương trình y tế lớn nhằm chống lại các bệnh lý do ký sinh trùng gây ra: chương trình phòng chống sốt rét, chương trình phòng chống các bệnh về giun, sán Các chương trình đều rất tốn kém nhưng hiệu quả của nó thì chưa được như mong muốn Trong đó có vấn đề kháng thuốc của ký sinh trùng, xác định sự phân bố, vùng dịch tễ, tỷ lệ mắc bệnh… vẫn còn gặp nhiều khó khăn

Việt Nam là một nước nằm ở vùng nhiệt đới, rất thuận lợi cho ký sinh trùng phát triển Hơn nữa do điều kiện kinh tế, y tế còn có nhiều khó khăn, cộng với các tập quán sinh hoạt còn lạc hậu nhất là ở các vùng nông thôn, vùng xa, điều kiện vệ sinh chưa đảm bảo, vì vậy tỷ lệ mắc các bệnh về ký sinh trùng ở Việt Nam còn rất cao trong

đó có bệnh sán lá gan Mặt khác, do nằm ở giữa vùng dịch tễ, bao bọc xung quanh bởi các nước có tỷ lệ nhiễm bệnh sán lá gan nhỏ cao: Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Philippine nên việc phòng chống bệnh sán lá gan nhỏ là quan trọng và cấp thiết

Chúng ta đều biết hậu quả sán lá gan gây cho người bị nhiễm là rất trầm trọng:

xơ gan, ung thư gan, ung thư đường mật Đây là những vấn đề gây nên những tổn thất rất lớn về sức khỏe và kinh tế cho gia đình và xã hội

Việc sử dụng phương pháp sinh học phân tử mà cụ thể là ứng dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán và phân loại bệnh sán lá gan nhỏ nói riêng và bệnh ký sinh trùng nói chung có một ý nghĩa hết sức to lớn Nhờ phương pháp này mà người ta có thể chẩn đoán từ rất sớm, rất chính xác tác nhân gây bệnh Ngay cả khi bệnh nhân chưa

có triệu chứng (người lành mang trùng) Điều này giúp cho các nhà điều trị học lựa chọn phương pháp điều trị hiệu quả ít tốn kém nhất, góp phần ngăn chặn các hậu quả xấu do bệnh gây ra

Việc xác định các cấu trúc một gen hay nhiều gen đặc trưng của sán lá gan nhỏ còn giúp cho các nhà sinh học xác định được sản phẩm cụ thể của gen đó Đây sẽ là cơ

sở cho việc sản xuất các kháng nguyên đặc hiệu, sử dụng cho phương pháp chẩn đoán bằng miễn dịch học

Phương pháp sinh học phân tử còn giúp cho các nhà dịch tễ học xác định được một cách chính xác tỷ lệ mắc bệnh, loại ký sinh trùng gây bệnh, vùng phân bố của các

ký sinh trùng từ đó đề ra các chương trình phòng chống phù hợp và hiệu quả

Trong chẩn đoán bệnh sán lá gan, phương pháp PCR còn là cơ sở, nền tảng cơ bản đầu tiên cho việc tiếp cận với một phương pháp kỹ thuật chẩn đoán mới Từ đây,

sẽ mở rộng việc ứng dụng nó trong việc chẩn đoán các bệnh lý khác nhau như bệnh về

vi khuẩn, virus: lao, viêm gan, HIV và thậm chí cả việc chẩn đoán sớm bệnh ung thư

Chương 2: NGUYÊN, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và phương pháp thu nhận mẫu

Nguyên liệu nghiên cứu là mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành có kích thước 1,2 x

0,1 cm, màu vàng nhạt, thu nhận trên người, được xác định là O viverrini về mặt hình

thái học

Cách thu nhận mẫu được tiến hành như sau: chọn các bệnh nhân có tiền sử có

ăn gỏi cá diếc sống, sau đó cho xét nghiệm phân Những bệnh nhân xét nghiệm có trứng sán lá gan nhỏ được điều trị bằng 1 liều Distocid (6 viên), sau đó đãi phân của bệnh nhân đó để tìm sán trưởng thành Mẫu sán được định loại dựa vào các đặc điểm hình thái học, rửa sạch bằng nước muối sinh lý nhiều lần, trước khi chuyển vào cồn 70% và bảo quản ở -850C

2.2 Vật liệu

2.1.1 Thiết bị dụng cụ

 Máy ly tâm Eppendorf (Centrifuge 5415D)

 Máy PCR (máy PTC-100) của MJ Research Inc

 Máy soi gel Dolphin- Doc (Wealtech, USA), có kèm theo máy vi tính

 Máy tính và các phần mềm tin-sinh học

 Thiết bị dùng để điện di kiểm tra sản phẩm PCR của hãng Bio-Rad

 Máy ổn nhiệt, máy lắc tế bào

 Laminair cấy vô trùng

 Bộ pipetman (10l, 20l, 200l, 1000l) và đầu côn các loại, ống Eppendorf các loại, đĩa Petri, lọ đựng môi trường, ống nuôi vi khuẩn

 Máy Vortex

2.1.2 Hoá chất

 Bộ kit tách chiết ADN tổng số, “QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Inc, USA)” và hoá chất do hãng Qiagen cung cấp

 Bộ kit dùng cho phản ứng PCR do hãng Invitrogen cung cấp

 Dung dịch đệm điện di TAE 1X và bột agarose

 Bộ kit tách dòng “TA-cloning Kit” do hãng Invitrogen cunng cấp

 Môi trường LB lỏng và môi trường LB agar 1,5%

 Môi trường dinh dưỡng SOC được cung cấp cùng với bộ “TA-cloning Kit”

 Kháng sinh kanamycin (50 mg/ml), X-gal, cồn tuyệt đối

 Bộ kit tách plasmid tái tổ hợp, “QIAprep Spin Miniprep Kit” do hãng Qiagen cung cấp

 Bộ kit dùng cho phản ứng PCR giải trình trình tự

 Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR giải trình trình tự

2.1.3 Dung dịch sử dụng trong biến nạp ADN plasmid vào tế bào E.coli và môi

trường nuôi cấy chọn lọc tế bào biến nạp

 Dung dịch: dung dịch giàu dinh dưỡng SOC: - trypton: 20g/l; dịch chiết nấm men: 5g/l; NaCl: 10mM; KCl: 2,5mM; MgCl2: 10mM; MgSO4: 10mM; glucozơ: 20mM.

 Môi trường: Môi trường LB (Luria-Bertani): 1% Trypton; 0,5% cao nấm men; 1% NaCl

Môi trường chọn lọc: môi trường LB đặc: thành phần như môi trường LB và

bổ sung thêm agar 1,5%, Kanamycin (tỉ lệ 1:1 so với thể tích môi trường LB), X-gal (tỉ

lệ 2:1 so với thể tích môi trường LB)

Môi trường nuôi cấy: tương tự môi trường chọn lọc nhưng không bổ sung agar

2.1.4 Các dung dịch dùng trong điện di ADN trên gel agarose

 Dung dịch đệm TAE đặc 50X (100ml):

Tris-kiềm: 24,2%; Axit axetic: 5,71ml; EDTA 0,5M (pH8,0): 10ml

 Đệm tra mẫu (6X) (loading dye):

Bromophenol blue: 0,25%; Xylen cyanol FF: 0,25%; Glycerol: 30%

 Dung dịch nhuộm gel: ethidium bromide (EtBt): 0,5 mg/ml

2.3 Phương pháp nghiên cứu (có phụ lục chi tiết)

 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu vật

 Phương pháp điện di trên gel agarose

 Phương pháp khuyếch đại invitro ADN bằng phản ứng trùng hợp polymerase (PCR)

 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

 Phản ứng nối ADN ngoại lai vào plasmid

 Phương pháp sốc nhiệt biến nạp vectơ vào trong tế bào và nuôi cấy chúng trên môi trường thạch

 Phương pháp chọn lọc khuẩn lạc và nuôi cấy trong môi trường lỏng

 Phương pháp tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp

 Phương pháp xử lý ADN plasmid bằng enzyme cắt hạn chế

 Phương pháp giải trình trình tự

Chương 3: KẾT QUẢ

Mẫu sán lá gan nhỏ thu nhận (Ov1) được tách chiết ADN tổng số bằng QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Inc, USA)

ADN tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra bằng cách điện di trên gel argarose 1% Quá trình điện di được thực hiện với nguồn điện một chiều ở 100V, 400mA trong 25 phút

Phát hiện ADN tổng số bằng cách soi bản gel dưới đèn tử ngoại của máy Dolphin-Doc Kết quả được ghi lại trên máy tính, thể hiện ở hình 10

Hình 3.1: Ảnh điện di ADN tổng số

Ghi chú:

Giếng 1: ADN tổng số của chủng Ov1

Giếng M: Thang ADN chuẩn (Thực khuẩn thể λ cắt bằng HindIII)

Trên hình, mẫu ADN tổng số (gồm ADN nhân và ADN ty thể) là phần hiện thị thành vệt màu sáng trắng ở giếng số 1 Như vậy, chứng tỏ ADN tổng số đã được tách chiết thành công bằng bộ kit “QIAamp Mini DNA kit” Dựa vào độ sáng của vệt trên gel cho thấy ADN tổng số được tách chiết đảm bảo chất lượng làm khuôn cho phản ứng PCR, có thể ước tính được nồng độ ADN tổng số khoảng 1500 ng

Với mục đích giám định bệnh sán lá gan nhỏ O.viverrini (Ov1) với một số bằng chỉ thị di truyền gen nad3 của hệ gen ty thể, sử dụng cặp mồi đặc hiệu để xác định O viverrini và chẩn đoán phân biệt với C sinensis (Lê Thanh Hoà và cs., 2006), cho sản

phẩm PCR có độ dài khoảng 1,3kb Đoạn gen này chứa toàn bộ gen nad3 mã hoá cho enzyme nicotinamide dehydrogenase, có kích thước 357 nucleotit.

Các đoạn mồi có trình tự như trình bày ở bảng 3.1

M 1

Bảng 3.1: Các đoạn mồi dùng trong phản ứng PCR

Hình 3.2: Sơ đồ minh họa ví trí bám của mồi

Đoạn mồi OvF được thiết kế trên gen nad1.

Đoạn mồi OvR được thiết kế trên gen trnS1.

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên agarose 1% Kết quả được chỉ ra ở hình 3.3

Hình 3.3: Ảnh điện di sản phẩm PCR

Ghi chú:

Giếng 1: sản phẩm PCR, kích thước khoảng 1,3kb

Giếng M: chỉ thị phân tử ADN (DNA marker,  cắt bằng HindIII)

Với cặp mồi đặc hiệu cho O viverrini OvF-OvR, phản ứng PCR được thực hiện

với khuôn là ADN tổng số tách chiết từ sán lá gan nhỏ thu nhận trên người bệnh (Ov1)

~1,3k2,0k

3.3 Kết quả tách dòng sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng “QIAquick PCR purification kit”(QIAGEN, USA) và được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pCR®2.1TOPO

(Invitrogen), sau đó được chuyển nạp vào tế bào E.coli chủng DH5-T1 và tiến hành

chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp Chọn lọc các khuẩn lạc trắng (là những khuẩn lạc có khả năng mang vector tái tổ hợp) nuôi cấy vào môi trường LB, lắc 200 vòng/phút ở 370C qua đêm Tế bào tái tổ hợp được thu lại bằng cách ly tâm và tách chiết ADN plasmid bằng “QIAprep Spin Mini prep kit” (hãng QIAGEN), cắt kiểm tra sản phẩm ADN

plasmid bằng enzyme giới hạn EcoRI và điện di kiểm tra trên thạch agarose 1% Kết quả tách dòng đoạn gen của chủng Ov1 và cắt kiểm tra bằng EcoRI được trình bày ở

hình 3.4

Hình 3.4: Ảnh điện di kiểm tra kết quả cắt vector tái tổ hợp bằng EcoRI

Ghi chú: Giếng 1, 2, 3: vector tái tổ hợp cắt bằng EcoRI

Giếng M: chỉ thị phân tử ADN

Kết quả trên hình 3.4 cho thấy: sau khi cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn

EcoRI, thu được hai băng: băng có kích thước khoảng 3,9kb tương ứng với kích thước

của vector pCR®2.1-TOPO, còn băng có kích thước khoảng 1,3kb tương ứng với đoạn ADN cần tách dòng

Như vậy, 3 khuẩn lạc được chọn để tách chiết vector tái tổ hợp đều mang đoạn gen cần nghiên cứu

Sau khi kiểm tra, chọn 1 trong 3 ADN plasmid tái tổ hợp ở các clone đại diện có chứa đoạn gen dài khoảng 1,3kb của chủng Ov1 được giám định để tiến hành giải trình trình tự tự động trên máy ABI-3100 Avant Genetic analyzer (ABI-3100 automated Sequencer) của hãng Perkin-Elmer (Mỹ)

Để tiến hành giải trình trình tự tự động, tiến hành thực hiện phản ứng gắn thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent) vào chuỗi gen cần giải trình tự (PCR sequencing) với đoạn mồi được sử dụng là:

Mồi xuôi (M13F): 5’- GTAAAACGACGGCCAG -3’

M

2,0kb

~1,3kb

~3,9kb4,3kb

của O viverrini đã được công bố trong Ngân hàng gen Quốc tế Kết quả thu được đoạn gen có chiều dài 357bp của gen nad3 chủng Ov1 (Hình 3.5).

Hình 3.5: Trình tự nucleotide và amino acid chuỗi gen nad3 của sán lá gan nhỏ (Opisthorchis

viverrini) chủng Ov1 phân lập trên người bệnh

Ghi chú:

Trình tự nucleotide của gen nad3 biểu thị bằng các bộ mã (dòng trên).

Trình tự amino acid tương ứng ký hiệu bằng một chữ cái (dòng dưới) Gen nad3 của Ov1 bắt đầu bằng bộ mã GTG và kết thúc bằng bộ mã TAG

Kết quả giải trình trình tự gen có kích thước là 357bp của gen nad3 là cở sở để

giám định bệnh sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini

Gen nad3 có kích thước 357bp của loài sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini

Bảng 3.2: Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi nucleotide của gen nad3 chủng O

viverrini trên người bệnh (Ov1)

Số đăng ký

Ngân hàng gen Tên chủng có kết quả tương đồng Hệ số Giá trị

DQ882173.1

DQ119551.1

DQ882175.1

DQ882174.1

DQ882172.1

Opisthorchis viverrini strain PY3 NADH

Opisthorchis viverrini NADH

Opisthorchis viverrini strain OvL NADH

Opisthorchis viverrini strain DL3 NADH

Opisthorchis viverrini strain BD NADH

536 520 512 504 501 1e-74 3e-72 8e-70 8e-70 1e-68 Kết quả truy cập Ngân hàng gen cho thấy chủng được giám định (Ov1) có mức độ tương đồng đạt 99% so với trình tự nucleotide của chủng OvKK (Thái Lan) (chủng đối chứng) đăng ký trong Ngân hàng gen (số DQ119551) (Lê Thanh Hoà và cs., 2006) Hình 3.6: So sánh thành phần nucleotide của gen nad3 ty thể của chủng O Viverrini phân lập ở bệnh nhân với chủng O Viverrini Việt Nam và với các chủng O Viverrini và C sinensis (CsND) khác trên thế giới NUCLEOTIDE (NAD3) * 20 * 40 * 60 * 80 *

Ov1 : GTGCGTGCTTTATTGGTGTGTTTTGTTTTATTTGGGGTCTTGCTTTCTTTGATTTTGGTCTTTCATGGTCTTTTTTGAAATTCCGGTTGT : 90 OvPY3 : : 90

OvBD1 : T A : 90

OvDL3 : : 90

OvKK : T : 90

OvVCL : T : 90

OvMH : : 90

CsND : GC T G CA T T A G.T.GG ATAT CG G G A G : 90 100 * 120 * 140 * 160 * 180

Ov1 : TGACTAGTTAATGGGTTTCGTTCTTGGGTAAGAGGATATGAGTGCGGGTTTTTGTCCCAGGGTGTGGTAGAGAAATATTTTAGTTATACT : 180 OvPY3 : : 180

OvBD1 : G T : 180

OvDL3 : T C : 180

OvKK : T : 180

OvVCL : T : 180

OvMH : T : 180

CsND : G.GT.T GG TC A G G.T T A.A T A G G T C C : 180 * 200 * 220 * 240 * 260 *

Ov1 : TATTTTTTTCTTTTGGTTTTCTTTGTTATTTTCGATCTGGAGATTTCTTTATTGTTGAAAATGCCTTTTGAGGGTCTGCTTTTTAAGAAT : 270 OvPY3 : : 270

OvBD1 : A : 270

OvDL3 : T : 270

OvKK : : 270

OvVCL : T : 270

OvMH : T : 270

CsND : G T T T A G C C AT T.G : 270

280 * 300 * 320 * 340 *

Ov1 : TTACCGTACTATGTGTTTTTCCTTTGTATTCTGGCTGTTGGGTTTGGTATCGAGGTGAGAGGTGGTTATGTAGGTTGGGGTTATTAG : 357 OvPY3 : : 357

OvBD1 : A C : 357

OvDL3 : C C : 357

OvKK : C : 357

OvVCL : T C : 357

OvMH : C : 357

CsND : T A T T.A T T AT G AG.T TC.A TAA G : 357

Ghi chú: Sai khác trình tự của các chủng so với Ov1 biểu thị bằng chính ký hiệu nucleotide; dấu (.) biểu thị giống với nucleotide.

Các chuỗi gen được phân tích và so sánh về thành phần nucleotide được thực hiện bằng chương trình GENEDOC2.5

Các kết quả thu được trong việc ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử và sinh tin học trong giám định chủng Ov1 thu nhận từ người bệnh đã cho kết luận chủng

là loài O viverrini.

KẾT LUẬN

Như vậy, bằng phương pháp sinh học phân tử, ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp, có thể chẩn đoán chính xác các loài ký sinh trùng gây bệnh cho người, từ đó có thể có pháp đồ điều trị hợp lý Đồng thời có thể khu trú được vùng dịch tễ, xác định nguyên nhân gây bệnh để có biện pháp phòng tránh hiệu quả

Từ kết quả phân tích, giải trình trình tự gen, có thể xác định được nguồn gốc của các loài ký sinh trùng, quan hệ phả hệ với các loài tương tự và xác định được các đột biến nếu có để có phương pháp điều trị hợp lý nếu chủng có những đột biến gây bất lợi cho quá trình điều trị thông thường