Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất n hydroxybenzamid mang khung 2 oxoindolin và cầu nối triazol

Trong số các loại chất ức chế HDAC đã được tổng hợp vàcông bố cho đến nay, các dẫn xuất của acid hydroxamic có hoạt tính tốt, đặc biệtmột dẫn xuất acid hydroxamic - acid suberoylanilid h

ĐẶT VẤN ĐỀ

Histon deacetylase (HDAC) và histon acetyltransferase (HAT) là các enzymquan trọng tham gia vào quá trình điều hoà biểu hiện gen Nhiều nghiên cứu chothấy sự huy động quá mức các HDAC có khả năng gây nên các sai lệch trong quátrình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của các tế bào ung thư [23, 53] Do đó,các HDAC là mục tiêu phân tử hấp dẫn cho nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ungthư hiện nay [21, 29, 47] Trong số các loại chất ức chế HDAC đã được tổng hợp vàcông bố cho đến nay, các dẫn xuất của acid hydroxamic có hoạt tính tốt, đặc biệtmột dẫn xuất acid hydroxamic - acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA, Zolinza®),

đã được FDA phê duyệt năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL)

Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào các N-hydroxybenzamid, trong số đó cónhiều hợp chất có tác dụng ức chế HDAC mạnh [9, 20, 21, 32, 53] Các nhà khoahọc cũng nhận ra nhiều hợp chất chứa vòng indolin trong tự nhiên hoặc tổng hợphóa học, mà đặc biệt là các isatin thể hiện tác dụng nổi bật trong điều trị ung thưtrên lâm sàng [29, 32] Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng dị vòng

1,2,3-triazol có tác dụng trên nhiều tế bào ung thư ở mức độ in vitro [6]

Do đó, với mục đích thiết kế các N-hydroxybenzamid có vòng indolin như một

nhóm khóa hoạt động và cầu nối triazol, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất hydroxybenzamid mang khung 2-oxoindolin và cầu nối triazol” với 2

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC)

1.1.1 Khái niệm, phân loại

Histon là các protein cơ bản cấu tạo nên nhiễm sắc thể, trong đó bốn cặp histon(H2A, H2B, H3 và H4) tạo nên lõi protein của nucleosom Các cặp histon lõi có 2phần quan trọng: đuôi C nằm bên trong lõi và đầu N nằm bên ngoài nucleosom Đầuamin này mang nhiều điện tích dương nên tương tác mạnh với phần phosphat mangđiện âm trên phân tử ADN tạo nên cấu trúc nucleosom và các cấu trúc bậc cao hơncủa nhiễm sắc thể

Việc tích điện dương của histon mạnh hay yếu thông qua quá trình acetyl hóađầu amin ở phần đuôi của histon Ở dạng deacetyl hóa, histon tích điện dương lớn,tương tác điện tích với ADN mạnh làm đóng xoắn nhiễm sắc thể gây ức chế quátrình dịch mã và tổng hợp protein, ức chế sự biểu hiện gen Ngược lại, khi bị acetylhóa, điện tích dương bị trung hòa, nhiễm sắc thể được tháo xoắn, quá trình tổng hợpprotein diễn ra và đặc tính của gen được biểu hiện Trong tế bào, quá trình acetylhóa này được điều hòa bởi 2 enzym: histon acetyltranferase (HAT) và histondeacetylase (HDAC) [2, 17, 26, 43]

Hiện nay người ta đã biết đến 18 HDAC, chia làm 4 nhóm (bảng 1.1.).Nhóm I, II và IV gồm 11 thành viên, được coi là những HDAC “kinh điển” lànhững enzym phụ thuộc Zn2+ Vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion

Zn2+ ở đáy nên những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelatevới Zn2+ như các acid hydroxamic Ngược lại nhóm III là những sirtuin không bị

ức chế bởi những hợp chất như vậy vì chúng có cơ chế hoạt động khác là phụthuộc vào NAD+ [34]

Bảng 1.1: Enzym HDAC: phân loại, số lượng acid amin, vị trí, chức năng sinh lý

HDAC10 669 Bào tương Tái tổ hợp tương đồng Không

SIRT3 399 Ty thể Chu trình Ure, quá trình chuyển

hóa năng lượng, điều chỉnhATP, sự trao đổi chất, sự chết vàtruyền tín hiệu tế bào

Có

CóSIRT6 355 Nhân TB Quá trình chuyển hóa năng

SIRT7 400 Nhân TB Sự chết đi của tế bào Không

1.1.2 Cấu trúc của HDAC

Bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X người ta đã xác định

chúng Về cơ bản các HDAC có cấu trúc trung tâm hoạt động khá giống nhau,chúng đều gồm các phần cơ bản sau:

- Ion Zn2+ là coenzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác của chúng Đây làthành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon bằng liên kết phối trí.Thông thường các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ứcchế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [35, 46, 50]

- Kênh enzym là nơi chứa đựng cơ chất và tham gia liên kết Van der Wallsvới cơ chất Kênh này có cấu trúc dạng túi hình ống hẹp, được cấu tạo bởi các acidamin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro, His Nó

có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất và thamgia phản ứng deacetyl Trên miệng túi có một vành nhỏ được tạo nên từ 1 vài vòngxoắn protein (phần vành sẽ tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC) Đốivới các hợp chất acid hydroxamic chiều dài của kênh này là tối ưu với khoảng 5-6liên kết carbon [17, 46, 50]

1.2.3 Mối liên quan giữa ung thư và sự bất thường hoạt động của HDAC

Như đã trình bày trong phần khái niệm, hoạt động của HDAC ảnh hưởng tới

sự tích điện trên phần đầu amin của histon, từ đó gây tác động lên quá trình phiên

mã Các sai lệch của quá trình phiên mã là một trong những nguyên nhân dẫn tới sựhình thành khối u Chẳng hạn, mối tương quan giữa hoạt động của HDAC và sự tạothành khối u được thể hiện rõ nhất trong bệnh ung thư bạch cầu tiền tủy bào cấp

tính (APL) Những nghiên cứu trên phạm vi rộng đã chỉ ra rằng sự ức chế phiên mã

không thích hợp của HDAC là cơ chế phổ biến tạo ra các protein gây ung thư

(oncoprotein) Ngoài ra trong các tế bào ung thư người ta còn thấy sự hoạt động quá

mức của HDAC như ung thư buồng trứng (HDAC1-3), ung thư dạ dày (HDAC2);ung thư phổi (HDAC1) [18, 24]

Các nghiên cứu có ý nghĩa thống kê đã chỉ ra rằng các HDAC liên quan đếnnhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thư như chu

xâm lấn và sự tạo mạch Vai trò chức năng của các HDAC trong quá trình sinh họccủa tế bào ung thư được tóm tắt ở hình 1.1 [10, 18, 24, 45].

Hình 1.1: Vai trò sinh học của các HDAC trong hoạt động tế bào ung thư

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC (HDIs) có thể phục hồi lại sự biểu hiện gen, ức chế

sự phát triển và sống sót của tế bào ung thư Khả năng chống ung thư của các chất

ức chế HDAC bắt nguồn từ khả năng tác động lên nhiều chu trình tế bào đã bị biếnđổi ở các tế bào ung thư Trong hầu hết các trường hợp, sự hoạt hóa các chươngtrình biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình

là chìa khóa cho tác dụng chống ung thư của HDIs Thêm vào đó, sự hoạt hóa củachuỗi phản ứng miễn dịch và sự ức chế tạo mạch cũng đóng vai trò quan trọng trong

tác dụng ức chế khối u in vivo của HDIs [26].

Một số chất ức chế HDAC đã được miêu tả là ức chế sự phát triển khối u

in vitro và in vivo mà có ít hoặc không có độc tính, và một vài chất đã được thử

nghiệm trong lâm sàng Tất cả các HDIs đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàngđều ức chế sự tăng sinh của tế bào bị biến đổi trong nuôi cấy bằng cách làm giảm sựngắt quãng của chu trình tế bào, sự phân hóa và/hoặc sự gây chết tế bào theochương trình, và ức chế sự phát triển của khối u ở các động vật mẫu

Trichostatin A (TSA) là một trong những hợp chất hydroxamate tự nhiên đầutiên được phân lập từ xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus đã được tìm thấy cókhả năng ức chế HDACs tại IC50 dưới 10 nM, có mức chọn lọc hơn 300 lần so vớilớp IIa [34, 39] Bên cạnh đó một chất ức chế tổng hợp là acid suberoylanilidhydroxamic (SAHA) đã được nghiên cứu và báo cáo cho thấy chúng ức chế sự pháttriển của tế bào, dẫn đến kết thúc sự biệt hóa và ngăn ngừa hình thành khối u trênchuột Năm 2006, SAHA (Vorinostat, Zolinza) đã được FDA cấp phép dùng trongđiều trị u lympho tế bào T dưới da Bảng 1.2 đề cập đến những chất ức chế enzymHDAC khác cũng đang được thử nghiệm lâm sàng để sử dụng trong điều trị ungthư, bao gồm 4 nhóm chính: các acid béo chuỗi ngắn, các acid hydroxamic, cáctetrapeptid vòng, các benzamid [33]

Mỗi nhóm có những hạn chế riêng: các acid hydroxamic bị chuyển hóanhanh và ức chế không chọn lọc các HDAC; các benzamid và các acid béo có hiệulực hạn chế; dẫn chất ceton bị khử hóa trong huyết tương; trong khi các peptid vòng

có cấu trúc quá phức tạp [1]

Bảng 1.2: Một số chất ức chế HDAC đang được thử lâm sàng

lâm sàng

Acid

hydroxamic

Vorinostat (SAHA,Zolinza)

Nhóm I, II, IV FDA đã phê

duyệtPanobinostat (LBH589) Nhóm I, II, IV IIIBelinostat (PXD101) Nhóm I, II,IV IIAbexinostat

(PCI24781)

Resminostat (RAS2410)

Givinostat (ITF2357) Nhóm I, II IIDacinostat

LAQ824)

Các peptid vòng

Romidepsin (Depsipeptide,FK228)

HDAC 1, 2 FDA đã phê

Entinostat 275,SNDX-275)

Rocilinostat 1215)

Aciid

carbonxylic

1.2.2 Cơ chế tác dụng

Các chất ức chế HDAC có tác dụng chống ung thư do tác động lên nhiều giaiđoạn quan trọng của chu trình tế bào làm mất sự điều hòa trong tế bào ác tính.Trong đó, yếu tố then chốt quyết định hoạt tính chống ung thư của HDIs là thúc đẩy

sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào

quan trọng của HDIs, gián tiếp ức chế sự phát triển in vivo của khối u (hình 1.2) [3,

26]

Hình 1.2: Điều hòa sự phát triển và sống sót của tế bào bởi các chất ức chế HDAC

1.2.3 Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC

Phần mang dược tính của các chất ức chế HDAC thông thường bao gồm:

- Nhóm gắn với kẽm (ZBG): tương tác với Zn2+ ở vị trí hoạt động của cácenzym HDAC: acid hydroxamic, các thiol, benzamid, mercaptoceton Với các chất

ức chế HDAC có nhóm hydroxamic, ion Zn2+ tạo 2 liên kết phối trí với 2 nguyên tửoxy của nhóm hydroxamic

- Vùng cầu nối sơ nước: là những hydrocacbon thân dầu mạch thẳng hayvòng, có thể no hoặc không no

- Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt: thường làvòng thơm hoặc peptid vòng, sẽ tạo tương tác với 1 vành nhỏ trên miệng túi trong cấutạo của kênh enzyme HDAC được tạo nên từ vài vòng xoắn protein [1, 26, 36, 44]

Khi phân tích cấu trúc tia X của một đồng đẳng của HDAC, protein giốngHDAC (HDLP), kết hợp được với SAHA hay TSA, và gần đây khi nghiên cứuHDAC8 ở người, người ta đã xác định được ZBG tương tác với một ion Zn2+ của vịtrí hoạt động có dạng túi (Zn2+ ở đáy của túi) [36] Dây nối sơ nước đưa ZBG đến vị

hoạt động ở phía bên kia của dây nối liên kết với những đuôi amino acid ở mép túi.ZBG thông thường của những chất ức chế HDAC là một nửa hydroxamat Sự thayđổi cấu trúc của ZBG hydroxamat đạt được một số thành công: sinh ra những đẳng

vị như benzamid, những α-ketoester, những keton ái điện tử, mercaptoamid vànhững phosphonat

Trong một chất ức chế HDAC nguyên mẫu, nhóm khóa hoạt động có thể đượcnối với dây nối sơ nước thông qua những nhóm cho hay những nhóm nhận liên kếthydro khác như những nhóm keto và amid Sự thiếu hụt những nhóm cho hay nhữngnhóm nhận liên kết hydro trong một nửa dây nối đưa đến một cơ hội liên kết với nhữngnhóm khác mà dễ tổng hợp hơn và có dược động học thuận lợi hơn từ đó có thể giúpđơn giản hóa việc thiết kế và tổng hợp những chất ức chế HDAC mới

Các chất ức chế HDAC dựa trên cấu trúc amid-alkyl-acid hydroxamic đãđược biết đến nhiều (ví dụ SAHA) Cấu trúc của chúng bao giờ cũng bao gồm 3phần chính A-B-C [51]

- Phần A liên quan đến hiệu lực và tính đặc hiệu (thường là aryl)

- Phần B là cầu nối như amid-alkyl

- Phần C là nhóm gắn kết với Zn2+: acid hydroxamic

Cho đến nay phần lớn các nghiên cứu liên quan cấu trúc – tác dụng đều tậptrung tìm hiểu vai trò của nhóm gắn kết Zn2+, cố gắng ngiên cứu thay thế acidhydroxamic và một vài cầu nối Sau đây là tổng kết liên quan cấu trúc – tác dụngcủa một dãy các dẫn chất của acid hydroxamic đã được nghiên cứu [51]

Hình 1.3: Liên quan cấu trúc – tác dụng của các chất ức chế HDAC

dẫn chất acid hydroxamic

Khi phân tích cấu tạo trung tấm hoat động của dạng túi của HDAC, nhómnghiên cứu thuộc trung tâm Sigma-Tau (Ý) đặc biệt chú trọng phần miệng túi vớicác vòng aminoacid có thể tham gia tương tác quan trọng với các nhóm nhận diện

bề mặt hoặc các nhóm lân cận Phần nhận diện bề mặt tại trung tâm hoạt động củaHDAC chấp nhận một hệ vòng khá đa dạng, từ indol, bemzofuran, quinolin,benzodioxol… Nhóm nitơ trong cấu trúc của phần nhân thơm R có thể tạo liên kếthydro với các nhóm aminoacid trong cấu trúc túi, tăng tương tác với mép túi tạitrung tâm hoạt động của enzyme HDAC, do đó tăng hoạt tính của các chất ức chếHDAC Vì vậy, các nghiên cứu khảo sát dẫn chất ức chế HDAC bằng cách thay đổinhóm khoá hoạt tính (thay thế vị trí phenyl bằng các nhân thơm như benzothiazol,phenylthiazol, isoxazol ) trong SAHA có tính khả quan cao

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÁC ACID HYDROXAMIC

với HDAC (Ki =3,4nM), có tác dụng rất tốt trong việc làm giảm sự biệt hóa tế bào

trong bệnh bạch cầu Friend, và đóng vai trò như chất ngăn cản sự di căn trong ungthư đại tràng Tuy nhiên việc sản xuất ra TSA rất tốn kém với hiệu suất thấp (trảiqua 20 bước với hiệu suất 2%) nên việc nghiên cứu ra các chất ức chế HDAC thaythế TSA đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Hiện nay, TSA chủ yếu đượcdùng làm chất đối chiếu trong nghiên cứu tìm ra HDIs mới [8]

Một chất ức chế HDAC đã được nghiên cứu tổng hợp thành công là acidsuberoylanilid hydroxamic (SAHA) Chất này đã được FDA phê duyệt sử dụngtrong điều trị u lympho da tế bào T SAHA làm tăng sự acetyl hóa của các histonH2B, H3 và H4, đồng thời thay đổi sự biểu hiện của một số gen dẫn đến sự chết tếbào theo chương trình [11]

Bên cạnh đó, nhiều dẫn chất acid hydroxamic ức chế HDAC đang đượcnghiên cứu rộng rãi và được chia thành nhiều phân nhóm nhỏ (hình 1.4)

Hình 1.4: HDIs có cấu trúc acid hydroxamic

Đặc điểm chung của các chất này là nhóm hydroxamic dễ tạo phức với Zn2+của HDAC nên ức chế không chọn lọc cả HDAC nhóm I, II và bị chuyển hóa nhanh[36, 52]

Chính vì vậy các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang nỗ lực tìm kiếm cácdẫn chất mới dựa trên phiên mẫu TSA, SAHA và các chất đã tìm được Dựa trênđặc điểm cấu trúc của các chất ức chế HDAC dẫn chất hydroxamic (hình 1.3), cácnghiên cứu có thể tiến hành thay đổi một trong 2 phần cấu trúc: nhóm khóa hoạtđộng (C), cầu nối (B) Sau đây là tổng kết một số nghiên cứu trên thế giới về thayđổi nhóm khóa hoạt động của các acid hydroxamic.

Các nhà khoa học thuộc Viện nghiên cứu quân đội Walter Reed (Mỹ) đã thiết

kế và tổng hợp hàng trăm dẫn chất acid hydroxamic mang hợp phần phenylthiazol

thay thế vào vị trí của phenyl trong SAHA (1, hình 1.5) Một dẫn chất oxazol là

S

N

O

NHOH O

S

N

O

NHOH O

S

N

O

NHOH O

Hình 1.5: Các acid phenylthiazol hydroxamic tương tự SAHA

Kết quả đánh giá tác dụng trên HDAC cho thấy dẫn chất WR301801 (1a) với

nhóm khóa hoạt động là 3-aminophenyl-5-thiazolyl có tác dụng ức chế mạnh nhấtvới IC50 = 10,4 nM, mạnh hơn cả SAHA trên cùng thử nghiệm Đồng phân vị trí của

WR301801 là WR301826 (1b) (nhóm thế amino ở vị trí ortho) cũng có tác dụng

mạnh tương đương SAHA [52]

Sử dụng hai chất WR301801 và WR301826 làm những chất dẫn đường mới,nhóm nghiên cứu của Alan P Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) tiếptục thiết kế dãy acid phenylthiazol-hydroxamic dẫn chất hóa dựa trên nhóm aminocủa vòng phenyl (hình 1.6) Kết quả cho thấy, khi nhóm amin thế trên vòng phenyl

Tác dụng mạnh nhất thu được với dẫn chất 1a-5 (hình 1.6) IC50 của dẫn chất này

với HDAC2, HDAC3 thấp dưới mức 0,2 nM Kết quả thử độc tính trên 5 dòng tế

bào ung thư tụy công bố với 1a, 1b, 1a-2 cho thấy các dẫn chất này đều có IC50 nhỏ

1a-5

Hình 1.6: Một số acid phenylthiazol hydroxamic

Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic,nhóm nghiên cứu của Alan P Kozikowski cũng đồng thời tiến hành thiết kế và tổnghợp một dãy các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic tương tự SAHA (hình1.7) [30].Kết quả các dẫn chất biphenyl ức chế HDAC mạnh hơn SAHA trên 6 loại HDAC(HDAC1, 2, 3, 8, 10, 6) Khi gắn thêm nhóm -NH2 vào vị trí ortho trên vòng phenylthứ 2 hoạt tính giảm song khi nhóm -NH2 này được acyl hóa bằng những nhómaminoacyl cồng kềnh, tác dụng ức chế HDAC lại được tăng cường Điều này chứng

tỏ phần nhận diện bề mặt của trung tâm hoạt động của HDAC có thể chấp nhậnnhiều nhóm có kích thước lớn Kết quả này cũng gợi ý các tương tác được tạo lậpthêm từ những nhóm aminoacyl này với các acid amin tại vành của túi hoạt động đãlàm tăng ái lực đối với HDAC của các dẫn chất Một số acid biphenyl-hydroxamiccũng cho độc tính trên 5 dòng tế bào ung thư tụy thử nghiệm nhưng tác dụng khôngtốt bằng các acid phenylthiazol hydroxamic

R

H N O

NHOH O

4

2

Hình 1.7: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic

Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic,nhóm nghiên cứu của Alan P Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) đãtổng hợp dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR301849 (hình 1.8) [30] Dẫnchất isoxazol này có tác dụng ức chế các HDAC1, 3 và 6 rất mạnh với IC50 thấp đến0,002 nM Tiếp tục mạch nghiên cứu này, một số dẫn chất trong đó vòng isoxazolđược đưa vào vị trí ngay sát cạnh nhóm acid hydroxamic đã được thiết kế và tổnghợp (sơ đồ 1.1) [48].

Ar

NH2

Ar

H N

4 O

Ar

H N

a

Ar H

O

NHOH O

4

3

Sơ đồ 1.1: Tổng hợp các acid isoxazol-hydroxamic

* Tác nhân và điều kiện: (a) acid 7-heptynoic, POCl 3 , pyridin, -13 o C, khuấy đều, 30 phút; (b) ethyl clorooxamidoacetat, triethylamin, THF, khuấy đều, 16 h; (c) NH 2 OH.HCl, KOH, MeOH,

khuấy đều, 15 phút.

Kết quả thử hoạt tính ức chế HDAC cho thấy một số dẫn chất trong các acidisoxazol-hydroxamic tổng hợp ức chế cả 5 tuýp HDAC1, 2, 3, 6 và 10 với IC50 trungbình khoảng 150 nM [48] Tác dụng này kém hơn nhiều so với các acid

phenylthiazol-hydroxamic (1) và acid biphenyl-hydroxamic (2) Có thể nhận xét, khi

có mặt vòng isoxazol cạnh nhóm hydroxamic, nhóm khóa hoạt động là quinolin hoặcbiphenyl không tối ưu cho hoạt tính, trong khi hai dẫn chất với vòng 5-phenylthiazol

(3a, 3b) có tác dụng ức chế HDAC khá mạnh, gần tương đương SAHA (hình 1.8).

Đây cũng là hai dẫn chất thể hiện độc tính tế bào mạnh nhất với IC50 thấp đến 1 µM

Điều ngạc nhiên là mặc dù 3b ức chế HDAC mạnh hơn 3a song 3a lại có độc tính tế bào mạnh hơn 3b [48] Có thể sự có mặt của nhóm 3-amino ở 3b đã làm giảm tính thấm qua màng tế bào của chất này, dẫn đến độc tính tế bào thấp hơn so với 3a Có

H N

O

3c Ar = Quinolin-3-yl 3d Ar = Biphenyl-4-yl 3e Ar = Cyclopentyl 3f Ar = Cycloheptyl

N N N

OCH3

O n Ar

N N N

NHOH

O n Ar

a

b

4

Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid triazol-hydroxamic (4).

* Tác nhân và điều kiện: (a) CuI, Hunig base, THF, khuấy đều; (b) dd NH 2 OH, KCN, THF/MeOH

(1/1), khuấy đều.

Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế HDAC cho thấy cầu nối giữa phầnhydroxamic và triazol 5, 6 carbon là tối ưu Tuy nhiên, không thấy có quy luật rõràng khi so sánh hai dẫn chất có cùng nhóm khóa hoạt động Ar và khác nhau về độdài cầu nối Với nhóm Ar cồng kềnh, dẫn chất 5C thường có tác dụng ức chếHDAC mạnh hơn trong khi những chất có Ar nhỏ, dẫn chất 6C thường biểu thị hoạttính trên HDAC mạnh hơn Khi so sánh với SAHA, rất nhiều dẫn chất triazol chứng

tỏ có ái lực mạnh hơn với HDAC Đánh giá in vitro, 4 dẫn chất 4t, 4v, 4y, 4w gây

độc đối với dòng tế bào ung thư tiền liệt tuyến của người DU145 với IC50 thấp nhấtđến 2,25 µM, tương đương với SAHA (hình 1.9) [44]

N N

NHOH

O Ar

Hình 1.9: Các triazol-hydroxamic

Nhận thấy khả năng ức chế HDAC của các dẫn chất N-hyroxybenzamid,Huansheng Fu và các cộng sự đã công bố kết quả tổng hợp và thử hoạt tính sinh họccủa một dãy các chất saccarin của N-hydroxybenzamid ở bảng 1.3 [4]

Bảng 1.3: Khả năng ức chế HDAC của các saccarin của N-hydroxybenzamid

N S O O

O

R

N

O OH Linker

Saccarin 5 N-hydroxybenzamid

hydroxamic

IC50 of HDACs (µM)

Kết quả cho thấy, khi nhóm hydroxylamic ở vị trí meta trên nhân benzen, các

chất 5a-e không có khả năng ức chế HDAC Trong khi đó, hầu hết các chất còn lại

với vị trí para của nhóm hydroylamic cho thấy hoạt động ức chế HDAC tốt Đáng

chú ý là 5j với giá trị IC50 < 0,5 µM Do đó chất 5j và SAHA được docking với

HDAC2 Kết quả cho thấy cả 2 chất đều tạo chelat với Zn2+ cũng như tạo liên kết

hydro với Tyr308 của HDAC2 Bên cạnh đó, nhóm nhận diện bề mặt của 5j cũng có tương tác π-π với Phe155 và His183, điều đó cũng làm tăng tương tác của 5j và HDAC2 Các đánh giá sinh học sâu hơn cho thấy 5j có hoạt tính kháng tế bào ung

thư MDA-MB-231 (tế bào ung thư vú) tương đương với SAHA

Cùng hướng thiết kế các chất có N-hydroxybenzamid như là nhóm BZG,Jinhong Feng và cộng sự đã thiết kế dãy chất N-hydroxy-4-(3-phenylpropanamido)benzamid (HPPB) Trong đó N-hydroxy-4-(4-(2-(3-methoxy-4-(thiophen-2-yloxy)

phenyl) acetamido) phenethyl)benzamid (6) thể hiện khả năng ức chế HDAC tốt nhất Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy, 6 có khả năng ức chế HDAC1,

HDAC8 và trên tế bào Hela (tế bào ung hư cổ tử cung) thể hiện ở bảng 1.4 [20]

Bảng 1.4: Tác dụng ức chế HDAC và tế bào ung thư Hela của

N-hydroxy-4-(4-(2-(3-methoxy-4-(thiophen-2-yloxy)phenyl)acetamido)phenethyl)benzamid

NHOH O

N O

O S

Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của chất của 7a-d của Jie Jiao và cộng sự cho thấy chất 7c và 7d có tác dụng ức chế HDAC yếu hơn SAHA nhưng mạnh hơn 7a và 7b Ngoại trừ 7a, các chất còn lại đều có hoạt tính kháng tế bào ung thư đại tràng (HCT 116) tốt hơn SAHA (bảng 1.5) [21] Chất 7c và 7d được dùng như chất

dẫn đường để nghiên cứu về HPPD trong tương lai

Bảng 1.5: Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của chất của 7a-d

N H

NHOH O

O

H3CO

O

7a R = Bn 7b R = n-Bn

R

N H

NHOH O

O

H 3 CO

O

7c R = Bn 7d R = n-Bn

Các nhà khoa học Mỹ đã tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học in vitro của

chất CRA-024781, một N-hydroxybenzamid có tác dụng ức chế nhiều loại HDAC

(HDAC1, HDAC3, HDAC6, HDAC8, HDAC10) và có hoạt tính kháng ung thưtrên nhiều dòng tế bào ung thư người [27] Hiện nay, CRA-024781, tên mới là PCI-

24781 (hay abexinostat) đang được thử nghiệm lâm sàng phase II với triển vọngđiều trị u lympho không Hodgkin và bệnh bạch cầu lympho bào mạn tính (hình1.10) [41]

NHOH O

H N O O N

Hình 1.10: Công thức của CRA-024781/ PCI-24781/Abexinostat

Hướng nghiên cứu sử dụng N-hydroxybenzamid như một BZG đưa lạinhiều triển vọng điều trị các loại ung thư Xiaoyang Li và cộng sự đã thiết kế cácN-hydroxybenzamid có vòng indonlin như một nhóm khóa hoạt động Kết quả

cho thấy chất 8r và 8l có hoạt tính kháng ung thư in vitro tương đương hoặc tốt

hơn SAHA [32]

Bảng 1.6: Kết quả đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

của N-hydroxybenzamid có vòng indon.

1.4 NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ CỦA CÁC TRIAZOL

Dị vòng 1,2,3-triazol giữ vai trò quan trọng không chỉ trong hóa học hữu cơ

mà còn cả trong hóa dược do có thể tổng hợp dễ dàng bằng phản ứng 1,2,3-triazol

ổn định với sự thủy phân và điều kiện oxy hóa khử, là một hợp chất thơm có tính ổnđịnh cao Hơn nữa, dị vòng này có moment lưỡng cực vào và có khả năng liên kếthydro, điều đó thuận lợi cho sự liên kết với các mục tiêu phân tử sinh học 1,2,3-triazol là một trong những đơn vị cấu trúc quan trọng được tìm thấy trong một loạtlớn các phân tử có hoạt tính sinh học như chống nấm, kháng khuẩn [14], chống dịứng [15], chống HIV [37, 38], chống lao và chống viêm [12, 13, 42] Một số thuốc

có chứa 1,2,3-triazol trong phân tử hiện có trên thị trường bao gồm tazobactam,cefatrizin, carboxyamidotriazol

Trong những năm gần đây, con người đang ngày càng tập trung vào các hoạtđộng chống bệnh ung thư Bằng cách kết hợp 1,2,3-triazol với các pharmacophorkhác thông qua phản ứng Click, một số hợp chất có tiềm năng chống khối u đã đượctổng hợp

Lara S Kallander và cộng sự đã tổng hợp 4-aryl-1,2,3-triazol là các chất ứcchế enzym methionin aminopeptidase type 2 của người (hMetAP2), được quan tâmnhư một phương pháp điều trị ung thư tiềm năng Các tác giả kết luận rằng N-1 và

N-2 của 9 tích cực tham gia liên kết với các vị trí enzyme hoạt động và là những

yếu tố then chốt cho sự ức chế Hơn nữa nó đã được đề xuất rằng các loại hợp chấtnhư vậy có thể được tối ưu hóa hơn nữa để điều trị ung thư (sơ đồ 1.3) [31]

9

Sơ đồ 1.3: Tổng hợp các 4-aryl-1,2,3-triazol

Các 20,30-dideoxy-20,30-diethanethioribo nucleosid mới và kết hợp với vòngtriazol đã được tổng hợp hoàn chỉnh Hoạt tính chống khối u của chúng được đánh

hoạt tính kháng ung thư trên các dòng tế bào ung thư gan (HepG2), tế bào ung thưphổi (A549) và dòng tế bào Hela mạnh hơn chất đối chiếu Những kết quả này cóthể chỉ ra rằng các hiệu ứng liên hợp của vòng triazol với hệ thống thơm là quantrọng đối với hoạt tính sinh học.

O N

N N

O

10

Hình 1.11: Các nucleosid có vòng triazol

Các chất 11 kết hợp giữa 3-phenylpyrazolopyrimidin và 1,2,3-triazol đã được

tổng hợp bởi A.Kumar và cộng sự đã sử dụng phản ứng Click (hình 1.12) [6] Tất

cả các hợp chất này được đánh giá đối với sự ức chế enzym Src kinase và ung thưbuồng trứng (SK-Ov-3), ung thư vú (MDA-MB-361), ung thư đại tràng (HT-29)

R O

Hình 1.12: Các chất kết hợp giữa 3-phenylpyrazolopyrimidin và 1,2,3-triazol

Cheng và cộng sự đã tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học của cyano-2H-1,2,3-triazol mang một loạt các nhóm thay thế ở vị trí 4-phenyl có tác

4-Aryl-5-dụng ức chế protein HER2 [6] Các dẫn 14 được chứng minh có tác 4-Aryl-5-dụng ức chế sự

tăng trưởng của tế bào ung thư vú người (MDAMB-453) thông qua ức chế sựphosphoryl hóa HER2 trong tế bào (hình 1.13).

N NH N

trong những phân tử trong đó chất 13 cho thấy hoạt động gây độc tế bào trên các dòng

tế bào ung thư bạch cầu (CCRF-CEM) với giá trị GI50 là 0,9 µM (hình 1.14)

N N N

HO

O X

Y

Y = OH, OMe

X = Ph(CH 2 ) 3

13

Hình 1.14: Các phân tử nhỏ giống Lavendustin

Dos Anjos và cộng sự đã tổng được các chất từ phản ứng của acetyl-β-D-glucopyranosyl azid với propynyl 3-[3-(aryl)-1,2,4-oxadiazol-5-yl]

2,3,4,6-tetra-O-propionat [16] Tất cả các chất 14 có hoạt tính gây độc tế bào yếu (ức chế 22-25%

sự tăng trưởng tế bào NCL-H-292 (ung thư phổi) và Hep-2 (ung thư thanh quản))(hình 1.15)

O AcO

AcO

OAc

OAc

N N

Hình 1.15: Các chất kết hợp giữa 2,3,4,6-tetra-O-acetyl- β-D -glucopyranosyl azid

với propynyl 3-[3-(aryl)-1,2,4-oxadiazol-5-yl] propionat

Nhận thấy khả năng gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng tế bào ung thư củacác dẫn chất 1,2,3-triazol, chúng tôi hướng đến mục tiêu thiết kế các N-hydrobenzamid sử dụng 1,2,3-triazol như cầu nối trong công thức của HDIs

1.5 NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ CỦA CÁC ISATIN

Isatin và dẫn chất là một trong những hợp chất hữu cơ đã được nghiên cứu có hệ thống về mặt hóa học cũng như tác dụng sinh học Rất nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học của các dẫn chất isatin đã cho thấy chúng có tác dụng khá phong phú và đa dạng như tác dụng kháng khuẩn, khắng nấm, kháng lao, kháng virus, chống phân bào, cức chế men monoamino-oxydase (MAO) [28].

Pop F.D đã tổng hợp và công bố tác dụng chống khối u của các dẫn

chất 3-(o-nitrophenyl)hydrazon isatin [22] Các chất này kìm hãm sự phát

triển của Carcinosarcoma walker 256 (hình 1.17).

R R' = H, CHR= H, Halogen3, CH3CO

15

Hình 1.17: Công thức cấu tạo của các chất 3-(o-nitrophenyl)hydrazon isatin

M Movrin và D Maysinger đã tổng hợp 22 dẫn chất là isatin và các base Shiff và base Mannich của chúng Các tác giả đã thử tác dụng chống

phân bào của các dẫn chất này Trong đó 3 chất 16p, 16m, 16n có tác dụng ức

chế phân bào mạnh nhất (ở nồng độ 5.10-4 mol/l) [40] (hình 1.18).

(n) R=H, R'=morpholino, R"=C6H4CF3

16

Hình 1.18: Các base Shiff và base Mannich cuả isatin

Năm trong số các dẫn chất base 2,4-dion-1,3-dimannich được N.H Eshba và H.M Salama tổng hợp và được thử tác dụng trên tế bào bạch huyết P3888 của chuột Trong số các chất này thì dẫn chất có nhóm thế dimethylaminomethyl ở vị trí 3 của nhân thiazolidindion có hoạt tính chống ung thư cao nhất Kết quả thử cũng cho thấy thế brom vào vị trí số 5 của nhân isatin làm tăng hoạt tính chống ung thư [19] (hình 1.19).

W Tang và G Eisenbrand đã tổng hợp và thử tác dụng chống ung thư

của indirubin và dẫn chất (18, 19) Thử tác dụng cho thất indirubin ức chế ung

thư biểu bì và Carcinosarconma walker 256 trên chuột Nghiên cứu lâm sàng cho thấy khi dung indirubin điều trị cho bệnh nhân mắc bênh bạch cầu tủy sống mạn ở liều 300-450mg/ngày thấy 26% khỏi hẳn, 33,4% giảm bệnh Đối với bênh nhân mắc bệnh bạch cầu tủy mạn tính khi điều trị với indirubin trong thời gian 1,5 – 6 tháng thì đã làm tăng rõ rệt hoạt tính 5’-nucleotidas của bạch cầu và trong các ca bệnh này có sự thuyên giảm bệnh Thử hoạt tính chống u với Carcinosarcoma walker 256, các dẫn chất của indirubin như N,N’- dimethylindirubin, N-methylindirubinmonooxim, N-acetylindirubin, N- methylindirubin monomethyloxim cho hoạt tính tương đương hoặc hơi cao một chút 3,3’-bisindol có hoạt tính ức chế cao đối với sự tạo thành AND trong tế bào ung thư và trong hệ thống tế bào tự do N-methylisoindigo có hoạt tính trên Carcinosarcoma walker 256 của chuột mạnh hơn indirubin [25].

N H

N H

O

CH3

H N O

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

Các hóa chất và dung môi khác: N,N-dimethylformamid (DMF),

dicloromethan (DCM), methanol, aceton, NaOH

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

 Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt, sinhhàn hồi lưu, máy cất quay chân không, tủ lạnh, tủ sấy, pipet, phễu thủy tinh, giấylọc, cân phân tích, cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lớp mỏng (SKLM), chị thị màuvạn năng

 SKLM tiến hành trên bản mỏng silicagel 60 F254 tráng sẵn

 Nhiệt độ nóng chảy (to nc) được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảynhiệt điện (Electrothermal digital)

 Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Agilent Resolutions Pro tại bộ mônHóa vật liệu – Khoa hóa – Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia

Hà Nội

 Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phổ LTQ-Orbital-XL tại bộmôn Hóa vật liệu – Khoa hóa – Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốcgia Hà Nội

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H - NMR) và carbon (13C - NMR) được ghibằng máy Bruker AV-500 tại Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Tổng hợp hóa học

- Khảo sát và tổng hợp 6 chất với công thức như sau:

N N

- Kiểm tra độ tinh khiết

- Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được

2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được

- Thử tác dụng ức chế HDAC2

- Thử độc tính trên các dòng tế bào ung thư SW620, PC-3 và AsPC-1

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Tổng hợp hóa học

2.3.1.1 Tổng hợp

- Dựa trên những nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ đểtổng hợp các dẫn chất theo thiết kế Tổng hợp 6 chất mục tiêu theo sơ đồ sau:

O O R

N

O O R

N N

N

N OCH3

O O

O R

Sơ đồ 2.1: Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất

N-hydroxybenzamid mang khung 2-oxoindolin và cầu nối triazol.

Tác nhân và điều kiện: i) Propargyl bromid, KI, K 2 CO 3 , DMF, 50 o C, 3h; ii) Methyl 4-(azidomethyl)benzoat, CuI, MeCN, 50 o C, 4h; iii) NH 2 OH.

HCl, KCN, MeOH, -5 o C, 30 phút.

- Theo dõi quá trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy

- Nhiệt độ nóng chảy: Đo bằng máy đo điểm chảy nhiệt điện (Electrothermaldigital).

- Sắc ký lớp mỏng: Dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời điểm

kết thúc phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế

+ Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng silicagel 60 F254 tráng sẵn,hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút Hệ dung môi tùy thuộc vào đặc điểm củatừng chất Mẫu thử được hòa tan trong dung môi thích hợp Chấm khoảng2l

+ Để bản mỏng trong bình sắc ký đã bão hòa dung môi ở nhiệt độ phòng,cho dung môi chạy khoảng 8 cm

+ Quan sát kết quả dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

Các dẫn chất sau khi tổng hợp được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổhồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR

- Phổ hồng ngoại (IR): được ghi tại bộ môn Hóa vật liệu – Khoa hóa –Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội trên máy AgilentResolutions Pro với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-600 cm-1 Các mẫu rắnđược phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏngdưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm

- Phổ khối lượng (MS): được đo bằng máy khối phổ LTQ-Orbital-XL tại bộmôn Hóa vật liệu – Khoa hóa – Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốcgia Hà Nội, chế độ +ESI-MS, dung môi methanol

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR và carbon 13C-NMR được ghitrên máy Bruker AV-500 tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dung

môi DMSO-d6 Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu

(ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS)

2.3.2 Thử tác dụng sinh học

2.3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC

Định lượng nồng độ HDAC2 bị ức chế bằng phương pháp huỳnhquang Tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất tổng hợp được thử tại KhoaDược Trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Enzym HDAC2được cung cấp bởi BPS Bioscience (San Diego, CA, USA) và sử dụng bộ kitđịnh lượng Fluoregenic HDAC Assay Kit (BPS Bioscience) Các bước tiếnhành được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit thử nghiệm Tóm tắt cácbước như sau:

Enzym HDAC2 được ủ với KBH-A42 ở nhiều nồng độ khác nhau ở

37oC trong 30 phút với sự có mặt của cơ chất HDAC có gắn huỳnh quang.HDAC developer (tạo chất phát huỳnh quang trong hỗn hợp phản ứng) đượcthêm vào sau khi ủ Mức độ phát huỳnh quang được ghi bằng máy VICTOR

bước sóng phát xạ 460 nm Kết quả được ghi lại và giá trị IC50 được tínhtoán bằng phần mềm GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA,USA)

2.3.2.2 Thử độc tính tế bào

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro đượcthực hiện tại Khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju,Hàn Quốc theo phương pháp Sulforhodamin B (SRB)

Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thư đại tràng), PC-3 (tếbào ung thư tiền liệt tuyến) và AsPC-1 (tế bào ung thư tuyến tuỵ)

Các tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Việnnghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB)

* Nguyên tắc thử

Dựa trên khả năng gắn của thuốc nhuộm với các acid amin cơ bản củaprotein trong tế bào, sử dụng phương pháp đo màu để tính tổng lượngprotein, từ đó suy ra số lượng tế bào [7]

* Các bước tiến hành:

Bước 1: Chuẩn bị tế bào (đĩa A)

- Sử dụng các tế bào đang ở pha logarit hoặc được trypsin hoá (vớicác dòng tế bào bám dính)

- Phân tán dòng tế bào trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10%FBS (huyết thanh bào thai bò), 1% glutamin, 1% pen/ strep (100 U/mlpenicillin và 100 µg/ml streptomycin) hoặc các môi trường phù hợp khác,điều chỉnh đến nồng độ 300-500.103 tế bào/ml

- Thu lấy mỗi giếng 100000 tế bào và phân tán vào 10 ml môi trườnggồm 20% FBS, 1% glutamin và 1% pen/ strep

- Từ 100 000 tế bào trong 10 ml môi trường, dùng pipet hút 100 µl

- Hàng đầu tiên được sử dụng làm mẫu trắng, hàng tiếp theo là cácmẫu đối chứng (không có mẫu thử).

Bước 2: Chuẩn bị mẫu (đĩa B)

- Thêm 125 µl môi trường RPMI 1640 vào mỗi giếng của đĩa 96giếng

- Thêm 125 µl mẫu thử (hoà tan trong DMSO) vào hàng đầu tiên, trộnđều, sau đó lấy 125 µl hỗn hợp ở hàng đầu tiên thêm vào các giếng ở hàngthứ hai, lặp lại quá trình này cho đến hàng cuối cùng để có được các nồng độpha loãng

- Hút 100 µl ở hàng thứ 10 của đĩa B thêm vào hàng cuối cùng của đĩa

A (để dung dịch nồng độ nhỏ hơn ít ảnh hưởng đến nồng độ dung dịch đượchút ở các lần tiếp theo), lần lượt như vậy cho đến hàng thứ 3 của đĩa A

- Thêm 100 µl môi trường RPMI 1640 (không chứa mẫu thử) vàohàng mẫu đối chứng để được 200 µl hỗn dịch với 10% FBS trong mỗi giếng

- Thêm 200 µl môi trường vào hàng mẫu trắng

Ủ trong 48 h

Bước 3: Tiến hành thử:

- Chuẩn bị dung dịch gốc 50% TCA, làm lạnh ở 4oC rồi thêm 50 µldung dịch đã làm lạnh vào mỗi giếng chứa 200 µl hỗn dịch tế bào và môitrường để tạo nồng độ 10% TCA ở mỗi giếng

- Đặt đĩa 96 giếng ở 4oC trong 1 h để cố định tế bào

- Chuẩn bị dung dịch 0,4% SRB (kl/tt) trong 1% acid acetic và thêm

70 µl dung dịch này vào mỗi giếng, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

- Rửa đĩa với 1% acid acetic 5 lần để rửa trôi lượng SRB chưa gắn

- Chuẩn bị dung dịch gốc 10 mM tris (hydroxymethyl)aminomethan(base Trizma) và thêm 200 µl dung dịch này vào mỗi giếng để hoà tan cácSRB đã gắn Đặt đĩa 96 giếng vào máy lắc trong ít nhất 10 phút

- Đọc độ hấp thụ ở 492 nm với các đĩa vi thể (microplate), loại trừ độhấp thụ của nền (đĩa microplate) ở bước sóng 620 nm

* Tính kết quả

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi50% so với mẫu đối chứng Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3lần đo độc lập với độ sai khác không quá 5% Giá trị IC50 được tính dựatheo phương pháp Probits

2.3.2.3 Nghiên cứu docking

Sau khi thiết kế dãy dẫn chất, để nghiên cứu sơ bộ tương tác của các chất vớiHDAC, chúng tôi đã tiến hành docking cho các chất tổng hợp được với HDAC2.Cấu trúc HDAC2 được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein (Protein Data Bank (PDB))(PDB ID: 4LXZ) HDAC2 là enzym thuộc nhóm 1 – nhóm mà các dẫn chất acidhydroxamic có tác dụng ức chế mạnh nhất Tiến hành docking nhằm dự đoán khảnăng ức chế của 6 chất đối với HDAC2 căn cứ vào sự phù hợp về hình dạng, kíchthước và năng lượng tương tác giữa 6 chất và HDAC2 Docking được thực hiệnbằng chương trìn AutoDock Vina, sau đó dự đoán năng lượng của tương tác liên kết

từ sự gắn kết trên sau khi SAHA rời khỏi hệ tương tác [49]

Nghiên cứu docking được thực hiện tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc Đại họcQuốc gia Seoul, Hàn Quốc

Kết quả được minh họa bằng hình ảnh docking và số liệu dự đoán tương tác

Chương 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 HÓA HỌC

3.1.1 Tổng hợp hóa học

3.1.1.1 Tổng hợp chất yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)benzamid (IVa)

N-hydroxy-4-((4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-Chất IVa được tổng hợp theo sơ đồ 3.1:

N

O O

5 o C, 30 phút.

a Tổng hợp chất IIa

Tổng hợp 1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IIa) từ indolin-2,3-dion (Ia)

bằng phán ứng thế với propagyl bromid với xúc tác là KI, K2CO3 trong dung môiDMF theo sơ đồ 3.2

Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất IIa

+ Lọc thu tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh Thu được IIa

+ Sấy khô tủa IIa bằng tủ sấy ở 60°C

4-((4-((2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)benzoat từ IIa và methyl 4-(azidomethyl)benzoat, xúc tác CuI, dung môi

MeCN theo sơ đồ 3.3

N N

O

OCH 3

O O

Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp chất IIIa Tiến hành phản ứng

+ Hòa tan 0,111g (0,6 mmol) IIa và 0,123g (0,7 mmol) methyl

4-(azidomethyl)benzoat trong vừa đủ dung môi MeCN, thêm 0,115g (0,6 mmol) CuI.Phản ứng đặt ở 50oC trong 4h

+ Theo dõi phản ứng bằng SKLM với pha động là DCM:MeOH = 9:1

Xử lý phản ứng

+ Loại dung môi MeCN bằng máy cất quay ở 60°C

+ Phân tán cắn vào 30 ml DCM, gia nhiệt ở nhiệt độ 60°C sau đó gạn lọcbằng giấy lọc Tiếp tục gạn lọc như trên thêm 2 lần, loại bỏ tủa CuI Thu chung dịchlọc của 3 lần, làm khan dịch lọc bằng Na2SO4 khan

+ Loại dung môi DCM bằng máy cất quay ở 60°C thu được cắn

+ Hòa tan cắn vào 1 lượng MeCN tối thiểu, thêm từ từ nước cất vào đến khithấy tủa không tăng nữa thì dừng Gạn, lọc thu tủa, rửa tủa với nhiều lần nước cất

Thu được IIIa.

+ Sấy khô tủa IIIa bằng tủ sấy ở 60°C.

O

NH2OH.HCl NaOH, MeOH

Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp chất IVa

Tiến hành phản ứng

+ Phân tán 0,188 g (0,5 mmol) chất IIIa và 0,035 g (5,0 mmol) NH2OH.HCl

vào 4,0 ml MeOH trong bình cầu sạch dung tích 50 ml Khuấy hỗn hợp trong bìnhđồng thời làm lạnh bình phản ứng đến -5°C bằng hỗn hợp đá muối

+ Chuẩn bị dung dịch NaOH bão hòa, đã được làm lạnh Thêm từ từ dungdịch NaOH vào bình phản ứng đến pH = 12

+ Tiếp tục cho phản ứng thêm 30 phút ở -5°C

+ Theo dõi phản ứng bằng thuốc thử FeCl3 5% và SKLM với pha động

DCM: MeOH Khi thấy vết ester IIIa đã mất đi hoàn toàn thì dừng phản ứng

Xử lý phản ứng

+ Acid hóa hỗn hợp trong bình phản ứng đến pH = 6 bằng HCl lạnh 5% + Thêm vào 20 ml nước cất lạnh Lọc thu tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh.+ Sấy khô tủa bằng tủ sấy ở 60°C

4-((4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-Chất IVb được tổng hợp theo sơ đồ 3.5.

O O

N

O O

N

O O

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất IVb.

Tác nhân và điều kiện: i) Propargyl bromid, KI, K 2 CO 3 , DMF, 50 o C, 3h; ii) Methyl 4-(azidomethyl)benzoat, CuI, MeCN, 50 o C, 4h; iii) NH 2 OH HCl, MeOH, -

5 o C, 30 phút.

a Tổng hợp chất IIb

Tổng hợp 5-fluoro-1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IIb) từ 0,165g (1mmol) chất 5-fluoroindolin-2,3-dion (Ib) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất IIa

Kết quả thu được như sau:

+ Cảm quan: bột kết tinh, màu vàng nhạt

4-((4-((5-fluoro-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)benzoat (IIIb) từ 0,122 g (0,6 mmol) chất IIa và 0,123 g (0,7

mmol) methyl 4-(azidomethyl)benzoat được thực hiện tương tự như tổng hợp

chất IIIa

Kết quả như sau:

+ Cảm quan: bột kết tinh, màu vàng nhạt

+ Hiệu suất: 83,5% (0,197 g)

+ Kiểm tra bằng SKLM với pha động DCM: MeOH = 9:1, Rf = 0.47

c Tổng hợp chất IVb

Tổng hợp

4-((4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (IVb) từ 0,20 g (0,5 mmol) chất IIIb

được thực hiện tương tự như tổng hợp chất IVa

Kết quả thu được như sau:

+ Cảm quan: bột kết tinh, màu vàng cam

+ Hiệu suất: 66,7% (0,132g)

+ Tonc: 251 – 254oC

+ Kiểm tra bằng SKLM với pha động DCM: MeOH = 9:1, Rf = 0,45

3.1.1.3 Tổng hợp 1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (IVc)

4-((4-((5-cloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-Tổng hợp chất IVc theo sơ đồ 3.6.

N

O O

5 o C, 30 phút.

a Tổng hợp chất IIc

Tổng hợp 5-cloro-1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IIc) từ 0,182 g (1mmol) chất 5-cloroindolin-2,3-dion (Ic) được thực hiện tương tự như tổng hợp