SÀNG lọc và GIẢI TRÌNH tự GEN mã hóa ENDO 1,4 β GLUCANASE từ nấm mốc CHỊU NHIỆT thielavia spp

Trong các vi sinh vật tự nhiên sinh enzyme thủyphân cellulose, nấm mốc được cho là nguồn sinh hệ cellulase tiềm năng có hoạttính cao và khả năng bền nhiệt, chịu pH thấp đáp ứng được các

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊNKHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn: PGS Vũ Nguyên Thành

TS Phạm Thế Hải

Hà Nội - 2016

-Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới toàn thể cán bộ của Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm, đặc biệt cảm ơn tới ThS Nguyễn Thanh Thủy, ThS Đặng Thị Kim Anh đã nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian thực tập tại trung tâm.

Hơn thế nữa, tôi cũng mong muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo

và toàn thể cán bộ nhân viên trong khoa khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường, cho tôi những nền tảng kiến thức vững chắc và những định hướng trong tương lai.

Đặc biệt, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh bên tôi, động viên, khích lệ và luôn là nền tảng tinh thần vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài này.

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2016

Người viết

Bùi Ngọc Anh

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Cấu trúc phân tử cellulose [12] 3

Hình 2 Cấu trúc không gian của một số cellulose [9] 7

Hình 3 Cơ chế thủy phân cellulose của hệ enzyme celluase [1] 8

Hình 4 Đường chuẩn D-glucose ở pH 5 20

Hình 5 Điện di sản phẩm PCR - fingerprinting của 28 chủng nấm mốc chịu nhiệt Thielavia trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5× 26

Hình 6 Cây phát sinh chủng loại mô tả mối quan hệ giữa các chủng nấm mốc chịu nhiệt thuộc chi Thielavia .29

Hình 7 Thử hoạt tính CMCase bằng phương pháp đục lỗ thạch 30

Hình 8 Hoạt tính CMCase của các chủng nấm mốc chịu nhiệt Thielavia ở pH5, 50°C 31

Hình 9 Sơ đồ vector biểu hiện pPICZαA và trình tự vùng đa điểm cắt [17].αA và trình tự vùng đa điểm cắt [17].A và trình tự vùng đa điểm cắt [17] 32

Hình 10 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5× 34

Hình 11 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5× 34

Hình 12 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5× 35

Hình 13 Kết quả phân tích trình tự gen Cel1 của chủng LPH 195 trên phần mềm Augustus 37

Hình 14 Kết quả phân tích trình tự gen Cel1 của chủng LPH 195 trên phần mềm NetAspGene 1.0 38

Hình 15 Kết quả xác định peptide tín hiệu của chủng LPH 195 trên phần mềm SignalIP 4.1 39

Hình 16 So sánh trình tự DNA với trình tự protein của nhóm 1 40

Hình 17 So sánh trình tự DNA với trình tự protein của nhóm 2 41

Hình 18 So sánh trình tự DNA với trình tự protein của nhóm 3 41Hình 19 So sánh trình tự DNA với trình tự protein của nhóm 4 42Hình 20 Cây phát sinh chủng loại mô tả mối quan hệ protein Cel1 giữa các chủng nấmmốc chịu nhiệt 42

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Tổng quan về enzyme cellulase nấm mốc và các đặc tính của chúng [2] 6

Bảng 2 Danh sách các chủng nấm mốc sử dụng trong nghiên cứu 16

Bảng 3 Thành phần mastermix PCR 22

Bảng 4 Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting 26

Bảng 5 Kết quả phân loại các chủng nấm mốc bằng phương pháp đọc trình tự vùng ITS của rDNA 27

Bảng 6 Danh sách các chủng đã tối ưu phản ứng PCR với cặp mồi Cel1 35

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CBD Cellulose blinding domain

ITS Internal transcribed spacer

PCR Polymerase chain reaction (kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase)PDA Potato Dextrose Agar

MỤC LỤC

PHẦN MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 2

1.1.CELLULASE VÀ HOẠT ĐỘNG THỦY PHÂN CELLULOSE 2

1.1.1.Cellulose 2

1.1.2 Enzyme thủy phân cellulose 3

1.1.2.1 Nguồn gốc enzyme cellulase 3

1.1.2.2 Phân loại cellulase 5

1.1.2.3 Cấu trúc của enzyme cellulase 6

1.1.2.4 Cơ chế thủy phân cellulose của enzyme cellulase 8

1.1.3 Ứng dụng của cellulase 9

1.2.NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ NẤM MỐC CHỊU NHIỆT VÀ CELLULASE TÁI TỔ HỢP 10

1.2.1 Nghiên cứu về cellulase tái tổ hợp 10

1.2.2 Nấm mốc chịu nhiệt và cellulase tái tổ hợp 13

CHƯƠNG HAI: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 ĐỐI TƯỢNG 16

2.2 VẬT LIỆU 17

2.2.1 Hóa chất 17

2.2.2 Thiết bị 17

2.2.3 Môi trường 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy và chiết enzyme trên môi trường cơ chất rắn 18

2.3.2 Phươngpháp xác định hoạt tính CMCase 18

2.3.2.1 Thử hoạt tính enzyme bằng phương pháp đục lỗ thạch 18

2.3.2.2 Xác định hoạt tính CMCase của enzyme bằng phương pháp DNS 19

2.4.3 Phương pháp tách chiết và tinh chế DNA tổng số của nấm mốc 21

2.4.3.1 Tách chiết DNA tổng số 21

2.4.3.2 Tinh sạch DNA 21

2.4.4 Phương pháp PCR 22

2.4.5 Phương pháp PCR fingerprinting 22

2.4.6 Phương pháp điện di DNA 23

2.4.7 Giải trình tự gen 23

2.4.8 Phương pháp phân tích số liệu 24

2.4.7.1 Phân tích số liệu hoạt tính 24

2.4.7.2 Phân tích trình tự DNA 24

CHƯƠNG BA: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 PHÂN NHÓM BẰNG KỸ THUẬT PCR FINGERPRINTING 26

3.2 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CMCASE TỪ CÁC CHỦNG NẤM MỐC CHỊU NHIỆT Thielavia spp 29

3.3 THIẾT KẾ MỒI CHO ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENDO-1,4-β-GLUCANASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM MỐC CHỊU NHIỆT Thielavia spp 31

3.4 TỐI ƯU HÓA PHẢN ỨNG PCR VỚI CẶP MỒI CEL1 33

3.5 GIẢI TRÌNH TỰ GEN THITE_72629 CỦA 20 CHỦNG NẤM MỐC CHỊU NHIỆT Thielavia spp 36

3.6 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ TRÌNH TỰ 36

3.6.1 Xác định trình tự protein của 19 chủng nấm mốc chịu nhiệt Thielavia spp 36

3.6.2 Xác định trình tự peptide tín hiệu 38

3.6.3 So sánh các trình tự DNA và trình tự protein trưởng thành của các chủng nấm mốc chịu nhiệt Thielavia spp 39

KẾT LUẬN 44

KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC 1 50

PHỤ LỤC 2 61

ăn thường thực hiện ở nhiệt độ cao 70-85°C và hoạt động tốt ở pH thấp do môitrường axit trong dạ dày vật nuôi Trong các vi sinh vật tự nhiên sinh enzyme thủyphân cellulose, nấm mốc được cho là nguồn sinh hệ cellulase tiềm năng có hoạttính cao và khả năng bền nhiệt, chịu pH thấp đáp ứng được các yêu cầu cơ bảntrong sản xuất thức ăn chăn nuôi

Các enzyme tự nhiên thường có hạn chế là không ổn định, khó đưa vào sảnxuất do dịch lên men có thể chứa các thành phần không mong muốn, tế bào nấmsợi dễ bị đứt gãy khi khuấy đảo, sinh khối gây tắc đường ống, Bởi vậy, nghiêncứu tạo ra các enzyme tái tổ hợp có chất lượng cao đáp ứng được yêu cầu sản xuất

là một hướng đi rất được quan tâm hiện nay Để tạo vật liệu di truyền phục vụ việcsản xuất các enzyme tái tổ hợp này cần tiến hành sàng lọc, tinh chế enzymecellulase từ các chủng nấm mốc tự nhiên, từ đó tìm ra enzyme tốt nhất để tiến hànhnhân dòng gen mã hóa và sinh tổng hợp cellulase tái tổ hợp trên hệ biểu hiện thíchhợp

Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Sàng lọc và giải

trình tự gen mã hóa cho endo-1,4-β-glucanase từ nấm mốc chịu nhiệt Thielavia

spp.” Mục đích của đề tài là giải mã và so sánh trình tự các gen mã hóa

endo-1,4-β-glucanase từ các chủng nấm mốc chịu nhiệt này nhằm tìm kiếm nguồn gen tốtcho các nghiên cứu tiếp theo.

Cấu trúc của cellulose được mô tả trong Hình 1 Cellulose là phân tử polymermạch thẳng không cuộn xoắn, được tạo nên từ các gốc β-glucose thông qua liên kếtβ-1,4-glucoside (liên kết cộng hóa trị giữa C1 của một phân tử glucose với C4 củaphân tử glucose kế tiếp) Mức độ polymer hóa được đánh giá dựa vào số phân tử β-glucose trong chuỗi Cellulose trong tự nhiên có khoảng 10.000 - 15.000 đơn vị β-glucose, như ở trong gỗ có xấp xỉ 10.000 và trong bông xấp xỉ 15.000 đơn vị β-glucose với khối lượng phân tử cả chuỗi khoảng 1,5×106 Da, dài 5µm [15] Cácnhóm -OH ở hai đầu mạch có tính chất hoàn toàn khác nhau, cấu trúc hemiacetaltại C1 có tính khử, trong khi đó -OH tại C4 có tính chất rượu [1,6] Liên kết β-1,4-glucoside giữa các gốc β-glucose trong chuỗi đóng vai trò quan trọng trong việctạo nên những đặc tính riêng của cellulose Nhờ liên kết này mà các chuỗi cellulosetrở nên ít linh động, chúng kết hợp với nhau tạo cấu trúc dạng sợi bền vững, chặtchẽ.

Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất và chúngthường tồn tại 2 vùng chính là vùng kết tinh và vùng vô định hình:

Vùng vô định hình: cấu trúc không chặt chẽ, các mạch tập hợp với nhau nhờ

lực Van der Waals, dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài Khi gặp nước chúng

có thể hấp thu nước và trương phồng lên

Vùng kết tinh: các mạch cellulose liên kết với nhau theo một trật tự đều đặn

nhờ liên kết hydrogen giữa nhóm -OH thứ nhất của mạch này với nhóm -OH thứ

ba của mạch khác Do cấu trúc có trật tự cao này, enzyme cũng như nhiều phần tửkhác khó có thể xâm nhập được vào bên trong phân tử cellulose để phân hủy Hơnthế, chỉ một số ít nhóm hydroxyl trong vùng kết tinh có tương tác với nước, do đó

ở điều kiện bình thường cellulase chỉ có thể tác động lên bề mặt sợi cellulose

Hình 1 Cấu trúc phân tử cellulose [12]

Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do, gốchydro của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hóa học như metyl hoặc gốc acetyl tạonên các dẫn xuất ete hoặc este của cellulose Một trong những dẫn xuất được ứng dụngnhiều nhất là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằnggốc -OCH2COOH

Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose,pectin, và với lignin điều này làm cho cellulose khá bền vững với tác động củaenzyme cũng như hóa chất Việc thủy phân cellulose chỉ có thể diễn ra khicellulose đã tách khỏi các thành phần cùng cấu tạo nên thành tế bào thực vật.Chính vì vậy, để có thể phân giải được cellulose tự nhiên cần phải có sự kết hợpgiữa các enzyme

1.1.2 Enzyme thủy phân cellulose

1.1.2.1 Nguồn gốc enzyme cellulase

Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết glycoside trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chấttương tự khác [9]

β-1,4-O-Cellulase được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên như từ động

vật (dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm như Mytilus edulis,…), từ thực vật (trong

hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì,…) và từ vi sinh vật ( nấm mốc

T reesei, ) Trong đó, hệ vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose vô cùng phong

phú và đa dạng Bản chất của quá trình này là do các vi sinh vật tổng hợp nên enzymecellulase xúc tác cho quá trình thủy phân cellulose thành các cellobiose, glucose và sửdụng các hợp chất sinh ra làm nguồn carbon và năng lượng cho sự tồn tại

Vi khuẩn được xem là một trong những đối tượng có khả năng sinh tổnghợp cellulase khá phong phú với chu kỳ sinh trưởng ngắn Nó có khả năng phângiải cellulose mạnh nhưng hoạt độ không bằng nấm do lượng enzyme tiết ra môitrường ít hơn và các thành phần của enzyme không đầy đủ Thông thường mỗi loài

vi khuẩn chỉ có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme cellulase nhất định Chính

vì thế để có thể phân huỷ hoàn toàn cơ chất cellulose trong tự nhiên bắt buộc chúngphải kết hợp với các vi khuẩn khác trong mối quan hệ hỗ sinh [1] Nhiều vi khuẩn

hiếu khí đã được nghiên cứu như Acidothemus cellulobuticus, Bacillus pumilis, các giống Cytophaga, Sporocytophaga, Soragium Ngoài ra còn thấy các loại thuộc giống Cellvibrio cũng có khả năng phân giải cellulose Trong điều kiện yếm khí,

các loại vi khuẩn ưa ấm và ưa nhiệt cũng có khả năng phân giải cellulose Đại diện

điển hình cho vi khuẩn ưa ấm là Clostridium omelanskii, chúng phát triển mạnh mẽ

ở 30 - 40°C Đại diện cho vi khuẩn ưa nhiệt là loài Clostridium thermocellum và B.

dellulosae, nhiệt độ tốt nhất cho sự hoạt động của chúng là 60 - 65°C, giới hạn

nhiệt độ cao nhất thường là 70°C , còn ở 40 - 50°C người ta nhận thấy chúng bắtđầu phát triển kém [33]

Bên cạnh vi khuẩn, nhiều chủng xạ khuẩn cũng được các nhà nghiên cứuchú ý đến Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đặc biệt, tế bào của chúng rất đặc trưngbởi sự phân nhánh, đa số sống trong đất và phát triển trong điều kiện hiếu khí Cómột số ít loài thuộc vi hiếu khí hoặc có thể sống trong điều kiện kỵ khí Cellulasecủa xạ khuẩn là enzyme ngoại bào Một số xạ khuẩn có hoạt tính phân giải

cellulose là: Streptomyces reticuli [5], Actinomyces griseus [39], các chủng thuộc chi Streptosproagium, Micromonospora,

Nấm mốc là nhóm có khả năng tiết ra ngoài môi trường một lượng lớnenzyme cellulase hoàn chỉnh, đầy đủ các thành phần nên có thể phân giải cellulose

rất mạnh mẽ và triệt để ví dụ như nấm mốc T reesei có khả năng sinh một loạt các

enzyme phân hủy lignocellulose thành đường và các cấu thành khác Một số loài

nấm khác thuộc các chi Aspergillus, Trichoderma, Penecillium, Phanerochaete,…

đã được nghiên cứu cho thấy cũng có hoạt tính phân giải cellulose khá cao như A.

niger, A wenttii, A flavus, A oryzae, Mucor pusilus, F solani, F lini, T viride, P fumiculosum, P inophinum, Sporotrichum pulverulentum và Sclevotium rolfsii,

[3,16,19] Một số nghiên cứu cho thấy, các loại nấm ưa nhiệt như Chaetormium

thermophile có khả năng tổng hợp được cả Exo-glucanase, Endo-glucanase và

β-glucosidase, chúng là những enzyme bền nhiệt, có thể giữ được hoạt tính ở 77°Ctrong 30 phút và ở 58°C trong 10 giờ, sinh trưởng ở nhiệt độ tối ưu là 45 - 50°C,nhiệt độ tối thiểu là 27°C, pH=5 [11]

1.1.2.2 Phân loại cellulase

Cellulase là hệ enzyme xúc tác quá trình chuyển hóa cellulose thành cácsản phẩm hòa tan bằng việc phân cắt liên kết β-1,4-glycoside giữa các đơn vịglucose Có thể phân loại cellulose theo nhiều cách khác nhau

Theo hệ thống phân loại EC, dựa vào vị trí xúc tác có thể chia enzymecelluase thành 3 loại chính [1]:

Endoglucanase (EG) (EC 3.2.1.4, endocellulase): Endo-1,4-glucanase haycòn được gọi là carboxymethylcellulase (CMCase) tham gia xúc tác phản ứng thủyphân liên kết β-1,4-glucanase bên trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương

tự khác giải phóng ra cellodextrin, cellobiose và glucose Sản phẩm phân cắt sau

đó sẽ được β-glucosidase tiếp tục thủy phân thành các phân tử glucose Enzymenày thể hiện hoạt tính mạnh mẽ trên vùng cellulose vô định hình và hoạt động tốttrong dải pH 4,0 - 5,0; tối ưu ở nhiệt độ 50 - 70°C

Cellobiohydrolase (CHB) (EC 3.3.1.91, exocellulase): exo-β-1,4-glucanasegồm có CHB I và CHB II, xúc tác phân cắt liên tiếp các đơn vị đường từ đầuchuỗi Sản phẩm thủy phân chính là cellobiose, ngoài ra còn giải phóng cácsaccharide nhỏ như cellotriose và cellotetraose từ chuỗi cellulose Cáccellobiohydrolase có khả năng cắt phân tử cellulose ở cả vùng kết tinh và vùng vôđịnh hình, tuy nhiên tác dụng lên vùng kết tinh không rõ ràng [19] Nhóm enzyme

này cũng hoạt động tốt trong khoảng pH 4,0 5,0 và phổ nhiệt tối ưu rộng từ 37 60°C.

-β-glucosidase (EC 3.2.1.21): còn được gọi là cellobiase, -β-glucosidase thủyphân cellobiose hòa tan và các cellodextrin thành glucose Đối với cellulose vàdextrin cao phân tử thì enzyme này không có tác dụng Theo vị trí không gian, β-glucosidase có thể được nhóm thành 3 loại bao gồm β-glucosidase nội bào, β-glucosidase liên kết thành tế bào và β-glucosidase ngoại bào pH tối ưu của chúngkhác nhau dựa trên vị trí không gian, tuy nhiên nhiệt độ tối ưu dao động khoảng 45

- 75°C Chức năng của enzyme này có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảmứng của cellulose

Bảng 1 Tổng quan về enzyme cellulase nấm mốc và các đặc tính của chúng [2].

Enzyme Cơ chất tối ưu Trọng lượng phân tử (kDa)

Nhiệt độ tối ưu (°C)

Monomer

Chủ yếu 4-5

Không có hoặc rất thấpCellobiohydrolase Cellulose tinh

thể

Monomer

Chủ yếu 4-5

Không có hoặc rất thấpβ-glucosidase Cellobiose, cellodextrin

Monomer, dimer, trimer (35-450)

45-75 Khác nhau Thường rất cao

Theo hệ thống phân loại GH, enzyme được phân loại dựa vào đặc điểmtrình tự Glycoside hydrolase Đây là nhóm chứa nhiều các enzyme thủy phân liênkết glycosidic giữa hai hay nhiều carbohydrate hoặc giữa một carbohydrate vớimột không phải là carbohydrate Cellulase của nấm mốc chủ yếu được tìm thấy ởmột vài họ trong GH bao gồm GH5, 6, 7, 8, 9, 12, 44, 48, 61 và 74 [2]

1.1.2.3 Cấu trúc của enzyme cellulase

Các cellulase ngoại bào thường tồn tại dưới dạng cellulosome là phức hệenzyme đa vùng, mỗi vùng có cấu trúc và chức năng riêng biệt nhưng lại tương tác chặtchẽ với nhau tạo thành một thể thống nhất Về cấu trúc, cellulosome gồm 3 thành phầnchính: vùng cấu trúc, vùng chức năng và vùng liên kết với cellulose [1]

Thường trong một cellulose có nhiều vùng cấu trúc Vùng cấu trúc thứ nhấtthường có vai trò liên kết với vùng xúc tác và chứa vị trí liên kết carbohydrate (CBM)

Khi vùng xúc tác được liên kết với vùng CBM không có hoạt tính xúc tác của cácenzyme GH, cơ chất sẽ bị tóm bắt tạo điều kiện cho phản ứng enzyme xảy ra Vùngcấu trúc thứ hai được gọi là mỏ neo giữ lại các bộ phận, có vai trò liên kết bề mặt tếbào Vùng cấu trúc thứ ba thì chứa vị trí cạnh tranh cơ chất (cohensive) và vị trí liênkết với các protein khác (dockerin).

Vùng xúc tác là vùng quan trọng nhất trong cấu túc của cellulase, tại đây diễn raquá trình xúc tác enzyme với thành phần gồm các gốc axit amin quan trọng là Asp vàGlu Cho đến nay việc nghiên cứu cấu trúc của vùng xúc tác được mở rộng trên cả lĩnhvực gen, nhiều gen mã hóa cho các cellulase đã được nhân dòng và giải trình tự DNA.Một số gen mã hóa cho cellulase có trình tự rất khác biệt chứng tỏ sự đa dạng củacellulase trong tự nhiên Các họ cellulase khác nhau điển hình ở vùng xúc tác vì thế mà

cơ chế phản ứng của chúng cũng khác nhau

Vùng liên kết cellulose (CBD) là vùng đặc biệt trên cellulase có chức năng liênkết với cơ chất cellulose giúp cho các enzyme phản ứng được dễ dàng hơn CBD gắnvào vùng xúc tác thông qua một liên kết glycoside linh hoạt, giúp cho nó có thể gắnhay thả cơ chất một cách dễ dàng

Cellulase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khácnhau Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối lượng phân tử, thànhphần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi polypeptide Chẳng hạn như

chủng A oryzae KBN616 sinh tổng hợp được hai loại endoglucanase là CelA và CelB.

Phân tử CelA gồm 239 amino acid với khối lượng phân tử 31 kDa và được xếp vào họcellulase H trong khi CelB gồm 416 amino acid và khối lượng phân tử 53 kDa được

xếp vào họ cellulase C [26] Hay như endogluanase từ A aculeatus gồm 410 amino acid với khối lượng phân tử 53 kDa Các endoglucanase từ A niger ZαA và trình tự vùng đa điểm cắt [17].10 có khối lượng phân tử 83 kDa và 50 kDa, từ A terreus là 25 kDa, từ T reesei là 48 kDa và 55 kDa, từ

Bacillus sp D04 là 35 kDa.

Hình 2 Cấu trúc không gian của một số cellulose [9]

A: endoglucanase của A.niger, B: β-glucosidase của T.reesei, C: exoglucanase của Cellulomonas fimi

1.1.2.4 Cơ chế thủy phân cellulose của enzyme cellulase

Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thànhcellobiose và cuối cùng tạo thành glucose Sự thủy phân này đòi hỏi có sự tham gia của

cả ba loại enzyme cellulase, thiếu một trong ba loại đều không thể phân hủy celluloseđến sản phẩm cuối cùng Từ những nghiên cứu riêng rẽ với từng loại enzyme đếnnghiên cứu tác động tổng hợp của chúng, nhiều nhà khoa học đã đưa ra kết luận là cácenzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose Cũng có nhiều cách giải thíchkhác nhau về cơ chế này

Theo Mandels và Reese (1964) thì đầu tiên enzyme C1 (exo-β-1,4-glucanase)phá vỡ liên kết hydrogen trong phân tử cellulose tạo thành cellulose phản ứng Sau đó,

Cx (β-glucosidase, endo-β-1,4-glucanase) tiếp tục phân hủy cellulose phản ứng thànhcác phân tử cellobise Cuối cùng, β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose [30]

Theo Eikson và Goksoyr (1977) thì cơ chế tác động hiệp đồng của ba enzymenhư sau: đầu tiên endoglucanase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulosecắt liên kết β-1,4-glucoside và tạo ra các đầu mạch tự do Tiếp đó exoglucanase tấncông cắt ra từng đoạn, cellobiose từ đầu mạch được tạo thành Kết quả tác động củaendoglucanase và exoglucanase sẽ tạo ra các cellooligosacchatide mạch ngắn,cellobiose, glucose Cuối cùng β-glucosidase phân hủy tiếp vào tạo thành glucose [14]

Hình 3 Cơ chế thủy phân cellulose của hệ enzyme celluase [1]

Năm 2002, Lee và cộng sự cũng đã đưa ra cơ chế phản ứng của phức hệcellulose Theo nghiên cứu này thì mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theomột cơ chế riêng, tuy nhiên chúng lại phối hợp với nhau để thủy phân hoàn toàn cơchất thành sản phẩm cuối cùng là glucose Endoglucanase thủy phân các liên kết β-1,4-glycoside của phân tử celllose, sản phẩm phân cắt là các oligosaccharide Exoglucansaethủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của các phân tử cơ chất, giải phóngcác oligosaccharide, cellobiose, glucose β-glucosidase thủy phân các phân tửcellodextrin và các cellobiose tạo thành phân tử glucose [24]

1.1.3 Ứng dụng của cellulase

Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung cellulase trong khâunghiền nguyên liệu làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose làm tăng khả năngnghiền và tiết kiệm 20 - 40% năng lượng Để tẩy trắng giấy người ta sử dụngcellulase trong quá trình tái chế giấy Phương pháp này giữ cho sợi giấy không bị

ăn mòn nhiều và không ảnh hưởng đến môi trường so với phương pháp tẩy trắnggiấy bằng acid HCl

Trong công nghiệp dệt, người ta sử dụng cellulase để giữ màu vải sáng, bền

và không bị sờn cũ Đối với vải jean, cellulase được dùng để làm mềm vải và tạo ra

các vệt mài Người ta có thể tăng độ đậm nhạt của các vệt này bằng cách tăng haygiảm hàm lượng cellulase sử dụng trong giai đoạn giặt.

Trong xử lý môi trường, phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nướcthải do các nhà máy giấy thải ra Cellulase góp phần làm rút ngắn thời gian phânhủy rác hữu cơ có bản chất cellulose Điều này có ý nghĩa trong việc bảo vệ môitrường (hạn chế sự ô nhiễm đất, nước) đồng thời thúc đẩy quá trình chuyển hóa vậtchất trong tự nhiên Các chế phẩm vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase mạnhkhi được bón vào đất trồng có nhiều chất hữu cơ chứa cellulose sẽ giúp phân hủynhanh các chất hữu cơ tạo thành mùn giúp cây trồng sinh trưởng tốt

Trong công nghiệp thực phẩm và đồ uống, cellulase có những ứng dụng rấtquan trọng Việc bổ sung cellulase trong quá trình sản xuất bia góp phần ngăn chặn

sự tạo thành diacetyl, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia Hơn nữa cellulase làmgiảm đáng kể lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng tới khả năng lọc và gây đục chobia Trong quá trình sản xuất cà phê, cellulase và pectinase được dùng để xử lý bóc

vỏ cà phê và làm tăng khả năng trích ly dịch quả Trong sản xuất nước quả,cellulase được thêm vào giai đoạn dịch hóa, làm cho độ đồng hóa của nước quả cóthịt tốt hơn Cellulase góp phần làm giảm độ nhớt của dịch quả thuận lợi cho quátrình tách chiết và làm trong nước quả Ngoài ra cellulase còn được sử dụng trong

sản xuất bánh mì, bánh quy và thực phẩm chức năng Cellulase từ Humicola

insolens được ứng dụng trong sản xuất làm tăng độ mềm và xốp của bánh mỳ [9].

Trong sản xuất cồn nhiên liệu, cellulase có vai trò quan trọng trong việc sảnxuất ethanol thế hệ hai từ nguồn nguyên liệu có bản chất lignocellulose Việc sửdụng các enzyme thủy phân lignocellulse trong giai đoạn tiền xử lý góp phần đáng

kể vào hiệu quả quá trình lên men, giảm chi phí tiêu tốn năng lượng và thân thiệnhơn so với các phương pháp tiền xử lý bằng vật lý hay hóa học khác

Đặc biệt, các ứng dụng của cellulase và hemicellulase trong sản xuất thức ănchăn nuôi đã và đang nhận được sự quan tâm đáng kể vì tiềm năng của chúng trongviệc nâng cao giá trị nguyên liệu và hiệu suất chăn nuôi [13] Các enzyme có thểloại bỏ các yếu tố không có giá trị dinh dưỡng trong các loại thức ăn, giảm khẩuphần thức ăn nhất định để nâng cao giá trị dinh dưỡng và cung cấp các enzyme tiêuhóa bổ trợ như protease, amylase và glucanase [10] Ví dụ, chất xơ bao gồm

polysaccharide không phải tinh bột như arabinoxylan, nhiều thành phần thực vậtkhác như dextrin, lignin, chitin, pectin,…có thể hoạt động như yếu tố kháng dinhdưỡng cho một số động vật như lợn Trong trường hợp này, các cellulase sẽ pháthuy hiệu quả thủy phân giúp cải thiện đáng kể sức khỏe vật nuôi Hơn thế nữa, quytrình sản xuất thức ăn chăn nuôi luôn bao gồm quy trình gia nhiệt nhằm bất hoạtvirus, vi sinh vật gây bệnh và loại bỏ tạp chất Viêc sử dụng cellulase bền nhiệt sẽtạo nên sự kết hợp hoàn hảo giữa xử lý nhiệt với biến đổi thức ăn chỉ trong mộtbước duy nhất.

1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ NẤM MỐC CHỊU NHIỆT VÀ CELLULASE TÁI

TỔ HỢP

1.2.1 Nghiên cứu về cellulase tái tổ hợp

Cho đến nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có nhiều tác giả nghiên cứu

về cellulase tái tổ hợp trong nhiều hệ thống biểu hiện khác nhau Những nghiên cứunày thường tập trung biểu hiện gen mã hóa cellulase có nguồn gốc từ sinh vật nhân sơ

và nhân chuẩn trong hệ thống biểu hiện vi khuẩn, nấm men và nấm mốc Bên cạnh đócũng có một số nghiên cứu biểu hiện cellulase tái tổ hợp trong tế bào thực vật

Biểu hiện trong E coli

Năm 2010, Yang và cộng sự đã nhân dòng và biểu hiện cellulase bền nhiệt

từ chủng Bacillus subtilis trong E coli BL21 (DE3) Hoạt tính cellulase tái tổ hợp

đạt 6,78 U/ml, cao hơn nhiều so với enzyme ban đầu (đạt 2,82 U/ml) Enzyme tái

tổ hợp hoạt động tối ưu ở 60°C, pH 6; hoạt tính duy trì được khoảng 90% sau khi ủ

2 giờ ở 65°C [7] Năm 2011, Peng và cộng sự đã biểu hiện thành công gen mã hóa

cellulase bền nhiệt từ Clostridium thermocellum trong E coli Hoạt tính enzyme tái

tổ hợp đạt 6,4 U/ml, tăng 1,5 lần so với chủng tự nhiên [27] Một số gen như

β-glucanase I, II, III tách dòng từ Trichorderma reesei QM9414 đã được biểu hiện trong E.coli có hoạt tính đặc hiệu với cơ chất CMC của EG I, II, III tái tổ hợp

tương ứng là 65, 49 và 15 U/mg [25]

Biểu hiện trong Bacillus

Bacillus là hệ thông biểu hiện được quan tâm nhằm thu được một lượng lớn

enzyme cellulase Người ta đã đưa gen mã hóa cellulase phân lập từ một số loài vi

khuẩn thuộc các chi Pyrococcus và Clostridium biểu hiện trong Bacillus subtilisvà

Bacillus brevis Các gen này đã được biểu hiện tốt và thu được lượng cellulase cao

hơn nhiều so với biểu hiện trong E coli và so với chủng tự nhiên [20] Năm 2004, Kashima và cộng sự khi nghiên cứu biểu hiện cellulase chịu nhiệt từ P horikoshii trong B brevis đã thu được năng suất biểu hiện enzyme tái tổ hợp đạt khoảng 100 mg/l môi trường, cao hơn 300 lần so với sản xuất enzyme tái tổ hợp trong E.coli

[9]

Biểu hiện trong nấm mốc

Năm 1998, Takashima và cộng sự đã biểu hiện cellulase từ T reesei trong A.

oryzae dưới sự điều khiển của promoter Taka-amylase Cellulase tái tổ hợp hoạt động

tốt nhất ở 50 - 70°C và pH 4 - 5, hoạt tính đạt cao nhất sau 3 - 4 ngày nuôi biểu hiện

[36] Năm 2002, Rose và ZαA và trình tự vùng đa điểm cắt [17].yl đã biểu hiện thành công β-glucanase I từ T reesei trong

A niger D15 dưới sự kiểm soát của promoter glyceraldehydes-6-phosphate

dehydrogenase (GDP) và terminator glaA Enzyme tái tổ hợp hoạt động tối ưu ở pH 5

và nhiệt độ 50°C Hoạt tính enzyme còn trên 80% sau khi ủ ở 50°C trong 3 giờ [32].Năm 2008, Rashid và cộng sự đã biểu hiện F1-CMCase (kích thước 24 kDa với 221

axit amin) từ A aculeatus trong A oryzae D300 Hoạt tính enzyme tái tổ hợp đạt cao

nhất đạt 18,3 U/ml sau 120 giờ biểu hiện trong môi trường chứa nguồn tinh bột Hoạtđộng tối ưu ở 50o C, pH 4 – 5; bền ở pH 2-9 và dưới 45°C [29] Năm 2010, Todaka và

cộng sự đã biểu hiện gen mã hóa β-glucanase từ Reticulitermes speratus (một loài cộng sinh ở mối) trong A oryzae cho thấy enzyme tái tổ hợp tinh sạch có hoạt tính riêng 769,6 U/mg cao hơn so với β-glucanase tái tổ hợp trong T reesei [38].

Biểu hiện trong nấm men

Năm 2001, Hong và cộng sự đã phân lập gen mã hóa β-glucanase từ A niger IF031125 và biểu hiện trong nấm men Saccharomyces cerevisiae Kết quả cho thấy

hoạt tính của enzyme tái tổ hợp còn lại 56% hoạt tính sau khi ủ 1 giờ ở 80°C và hoạtđộng tối ưu ở 70°C [7] Để nâng cao hiệu quả biểu hiện của endoglucanase tái tổ hợp,

ZαA và trình tự vùng đa điểm cắt [17].hao và cộng sự đã sử dụng phương pháp tối ưu hóa codon gen Eng1 từ A niger

IFO31125 bằng cách thay đổi 193 nucleotide, thành phần G+C giảm từ 54% xuống

44% để thu được gen syn-egl Sau đó gen này được chèn vào vector pPIC9K, biểu hiện trong hệ biểu hiện P pastoris GS115 Kết quả hoạt tính của enzyme tái tổ hợp đạt 3,3

U/ml với cơ chất CMC sau 96 giờ nuôi cấy và 120 U/ml với cơ chất β-glucan, tối ưu ở

pH 5 và nhiệt độ tối thích ở 70°C [40] Gen F1-CMCase từ A aculeatus đã biểu hiện trong S cereseviae với vector pYEC91dưới sự điều khiển của promoter GAP Hoạt

tính của enzyme tái tổ hợp đạt 60 U/l sau 48 giờ biểu hiện ở 30°C [26] Năm 2012, Shi

và cộng sự đã biểu hiện thành công gen Aucell12A mã hóa endoglucanase từ A usamii E001 trong P pastoris Hoạt tính cao nhất đạt 240 U/ml sau 96 giờ nuôi cấy ở 30° C.

Enzyme tái tổ hợp hoạt động tốt nhất ở 60°C và pH 5, bền ở 55°C và pH 3,5 - 7 [34]

Biểu hiện trong thưc vật

So với biểu hiện trong vi sinh vật, cellulase biểu hiện trong thực vật đượcnghiên cứu ít hơn tuy nhiên cũng có nhiều lợi thế do ta có thể sử dụng luôn nguồn thựcvật đã được chèn gen mã hóa cho enzyme này mà không cần bổ sung enzyme vào thức

ăn chăn nuôi Năm 2007, Sun và cộng sự đã biểu hiện gen mã hóa endoglucanase E1 từ

Acidothermus cellulolyticus trong bèo tấm Hoạt tính enzyme tái tổ hợp đạt 0,2 U/mg,

enzyme có nhiệt độ phản ứng tối ưu 80°C và pH tối ưu là 5 [36] Năm 2011, Jiang vàcộng sự đã biểu hiện thành công gen mã hóa cellulase E2, E3 và dạng lai E2-E3 từ vikhuẩn bền nhiệt trong cây thuốc lá Cây thuốc lá chuyển gen biểu hiện cellulase E2 cóhoạt tính cao hơn 1,5 lần so với chủng tự nhiên và bền ở nhiệt độ dưới 65°C [18]

Những năm gần đây, Việt Nam cũng đã có các nhóm nghiên cứu vềcellulase tái tổ hợp Năm 2009, Tô Kim Anh và cộng sự đã tách dòng gen mã hóa

endoglucanase từ Bacillus sp VLSH 08 và biểu hiện trên B subtilis Chủng tái tổ

hợp phát triển tối ưu và biểu hiện hoạt tính enzyme tối đa ở nhiệt độ 37°C và pH6,2 – 6,6 [8] Năm 2010, Vũ Thị Thùy Dung đã nghiên cứu tách dòng gen mã hóa

β-glucosidae từ A niger PBC và biểu hiện thành công trong nấm men P pastoris

SMD1168 với vector biểu hiện là pPIC9 Hoạt tính enzyme β-glucosidase tự nhiênđạt cao nhất ở 60°C, pH 4-5 trong khi enzyme tái tổ hợp hoạt động tốt nhất ở 50°C

và pH 5,5 [7] Cũng trong năm 2010, Trần Đình Mấn và cộng sự đã sử dụng kỹthuật Mega - PCR để gắn thành công đoạngen mã hóa exoglucanase (1450 bp) từ

Cellulomonas fimi ATCC484 và từ B subtilis biểu hiện trong E.coli có hoạt tính

0,25 U/ml Năm 2011, Phạm Thị Hòa và cộng sự đã nhân dòng và biểu hiện thành

công gen eglA mã hóa endoglucanase thuộc họ GH12 từ chủng A niger F021 trong nấm men P pastoris GS115 Endoglucanase tái tổ hợp (rEglA) hoạt

VTCC-động cao nhất ở 55°C và pH 5, bền ở 30 - 37°C và pH 3,5-4,5 Năm 2015, Trịnh

Đình Khá và cộng sự đã tiến hành biểu hiện gen meglA mã hóa endoglucanase A

tái tổ hợp không chứa peptide tín hiệu (rmEglA) của chủng A niger VTCC-F021 trong P pastoris GS115 Kết quả thu được endoglucanase A tái tổ hợp tinh sạch có

kích thước 32 kDa, enzyme hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 50°C và pH 3,5 và duy trìhoạt tính trong dải nhiệt độ 30 - 37°C, pH 3 - 8

1.2.2 Nấm mốc chịu nhiệt và cellulase tái tổ hợp

Hiện nay, nghiên cứu và ứng dụng cellulase chủ yếu tập trung vào các nhóm

ưa ấm thuộc các chi Trichoderma, Aspergillus và Penicillium Cellulase của nhóm

này hầu hết hoạt động trong dải nhiệt độ tối ưu là 40 - 50°C Ở nhiệt độ này, quátrình chuyển hóa hoàn toàn sinh khối polysaccharide đòi hỏi thời gian phản ứng dàitrong khi nồi phản ứng lại dễ bị ô nhiễm vi sinh vật không mong muốn Một cách

để khắc phục trở ngại này chính là nâng cao nhiệt độ phản ứng để làm tăng hiệuquả thủy phân và giảm ô nhiễm Tuy nhiên, nhiệt độ phản ứng cao hơn đòi hỏienzyme phải chịu được nhiệt độ cao hơn các enzyme từ nấm mốc thông thường.Enzyme từ nấm mốc chịu nhiệt do vậy được quan tâm

Trong số các loại nấm mốc chịu nhiệt thì Myceliophthora thermophila và

Thielavia terrestris là hai loài có đặc trưng tốt về các enzyme chịu nhiệt và hoạt

động thủy phân cellulase [31] Hệ gen của T terrestris dài 36.912.256 bp phân bố

trên 6 nhiễm sắc thể Đầu mút nhiễm sắc thể của loài này gồm trình tự TTAGGGlặp đi lặp lại, thường được tìm thấy ở nấm sợi Gen mã hóa protein trên hệ gen của

T terrestris là 9.813 gen, thấp hơn so với hệ protein ở các loài nấm khác trong lớp Sordariomycetes và thấp hơn đáng kể so với loài nấm thường Chaetomium globosum có quan hệ gần gũi chứa 11124 gene trên hệ gene dài 34,9 Mbp T terrestris đã được so sánh với 8 loài nấm khác về hệ gen mã hóa enzyme chuyển

hóa carbohydrate (Cazymes): Glycoside hydrolase (GHs), polysaccharide lyases(PLs), carbohydrate esterases, glycosyl transferase (GT) và carbohydrate-bindingmodules (CBM) Tương tự như các loài nấm khác đã được nghiên cứu, nấm chịunhiệt chứa lượng lớn (>210) enzyme GHs và PLs Thí nghiệm so sánh hoạt tính

cellulase của M thermophila và T terrestris với T reesei ở các nhiệt độ khác nhau cho thấy T terrestris sinh hoạt tính enzyme cao hơn hẳn hoạt tính cellulase từ M.

thermophila và T.reesei trong khoảng nhiệt độ từ 30 - 60°C Các cellulase từ T terrestris hoạt động hầu hết trên các cơ chất cellulose khác nhau Chúng có thể

phân giải 20% sợi bông tổng hợp, một chất kháng tiêu hóa, thành glucose ở 60°C

trong vòng 24 giờ Đồng thời, T terrestris còn có khả năng phát triển trên môi

trường axit nên ngoài đặc tính chịu nhiệt, enzyme cellulase sinh ra còn hoạt động

tốt ở pH thấp Như vậy, loài nấm mốc T terrestris được đánh giá là rất có tiềm

năng ứng dụng trong sản xuất enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

Năm 2014, chủng nấm mốc FCH 9.3 có trình tự ITS tương đồng 99,44 %

với loài Thielavia terrestris do Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp phân lập từ

xưởng trồng nấm ở Yên Nghĩa, Hà Đông có ưu điểm là có khả năng sinh tổng hợp

cellulase và xylanase trong môi trường nuôi cấy ở 50°C Ngoài ra, nhóm nghiên

cứu còn phân lập được khá nhiều chủng nấm mốc chịu nhiệt khác có quan hệ gần

với Thielavia terrestris Tuy nhiên, cho đến nay hệ enzyme thủy phân

lignocellulose của các loài này vẫn chưa được nghiên cứu Năm 2015, PGS VũNguyên Thành và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tinh chế được một endo-1,4-β-glucanase thuộc họ GH5 từ dịch enzyme thô của chủng FCH 9.3 Bằng phươngpháp khối phổ, nhóm nghiên cứu đã xác định được enzyme này tương đồng với

một endo-1,4-β-glucanase của Thielavia terrestris

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hànhsàng lọc và giải trình tự gen mã

hóa cho endo-1,4-β-glucanase từ nấm mốc chịu nhiệt Thielavia spp để tìm kiếm

nguồn gen tốt nhất cho quá trình tạo endo-1,4-β-glucanase tái tổ hợp đáp ứng đượccác yêu cầu trong sản xuất thức ăn chăn nuôi Kết quả thu được là cơ sở để chúngtôi tiếp tục thiết kế mồi nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa cho endo-1,4-β-

glucanase trưởng thành từ các chủng Thielavia spp.

CHƯƠNG HAI: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG

Các chủng nấm mốc chịu nhiệt Thielavia spp được tiếp nhận từ bộ sưu tập

giống của Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm (Bảng 2)

Bảng 2 Danh sách các chủng nấm mốc sử dụng trong nghiên cứu

6 LPH 198 Quảng Phương, Quảng Bình

7 LPH 200 Quảng Xuân, Quảng Bình

8 LPH 201 Quảng Đông, Quảng Bình

9 LPH 202 Quảng Phương, Quảng Bình

10 LPH 203 Quảng Phương, Quảng Bình

11 LPH 204 Quảng Đông, Quảng Bình

12 LPH 205 Quảng Đông, Quảng Bình

13 LPH 206 Quảng Đông, Quảng Bình

14 LPH 207 Quảng Đông, Quảng Bình

15 LPH 208 Quảng Đông, Quảng Bình

16 LPH 209 Quảng Long, Quảng Bình

17 LPH 210 Quảng Phương, Quảng Bình

18 LPH 211 Quảng Phương, Quảng Bình

19 LPH 212 Quảng Phương, Quảng Bình

20 LPH 214 Phong Nha, Quảng Bình

21 LPH 216 Phong Nha, Quảng Bình

22 LPH 217 Phong Nha, Quảng Bình

23 LPH 218 Dát Phong Lan, Vĩnh Phúc

24 LPH 219 Tam Đảo, Vĩnh Phúc

25 FCH 9.3 Yên Nghĩa, Hà Đông

26 FCH 136.2 Đông Anh, Hà Nội

27 FCH 142.2 Đông Anh, Hà Nội

28 FCH 151.3 Hoài Đức, Hà Nội2.2 VẬT LIỆU

2.2.1 Hóa chất

Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ tinh khiết ở mức độphân tích Các hóa chất dùng trong sinh học phân tử phần lớn có nguồn gốc từ các

hãng: Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Difco (Mỹ), Invitrogen (Mỹ), Thermo scientific(Mỹ), Roth (Đức) Các hóa chất dùng cho nuôi cấy, phân tích có nguồn gốc từ HànQuốc, Thụy Điển, Trung Quốc, Việt Nam.

Hóa chất dùng cho nuôi cấy: Agar (Việt Nam); Glucose(Trung Quốc);

Yeast extract (Scharlau, Tây Ban Nha); Peptone (Ấn Độ); Malt extract (Scharlau,Tây Ban Nha); dịch chiết khoai tây

Hóa chất dùng cho phân tích: 3,5 Dinitrosalicylic acid (DNS) (Trung

Quốc); Sodium hydroxide (Trung Quốc); Sodium potassium tartrate (Trung Quốc);Phenol tinh thể (Trung Quốc); Sodium metabisulfite (Trung Quốc); Sodium acetatetryhydrate (Trung Quốc); Carboxymethyl cellulose sodium salt (CMC) (Dae Jung,Hàn Quốc)

Hóa chất dùng cho tách chiết và tinh chế DNA: dung dịch SSC 2×(NaCl 300 mM, Natri citrate 30 mM, pH7); nướcdeion thanh trùng; Phenol/Chloroform (1:1); kit Silica Bead DNA Gel Extraction (Thermo Scientific, Mỹ)

Hóa chất dùng cho PCR: Enzyme Dream Taq DNA Polymerase (Thermo

Scientific, Mỹ); dNTPs (Thermo Scientific, Mỹ); thang chuẩn DNA 1kb (ThermoScientific, Mỹ); Agarose (BioBasic, Canada); Ethidium Bromide (Wako, Nhật)

2.2.2 Thiết bị.

Các thiết bị, máy móc dùng trong nghiên cứu bao gồm: bộ điện di ngang(Pharmacia Biotech, Mỹ); box cấy (BioblockScientific, Pháp); cân điện tử (Precisa,Thụy Điển); lò vi sóng (LG, Hàn Quốc); máy đo pH (Toledo, Anh); máy lắc ổn nhiệt(Eppendorf, Đức); máy ly tâm cao tốc (Heraeus–Sepatech, Đức); máy PCR C1000TouchTMThermal Cycler (Bio-rad, Mỹ); máy soi gel (Syngene,Mỹ); Nồi hấp thanhtrùng (Himayatoko, Nhật); tủ nuôi cấy (Sanyo, Nhật); máy phá tế bàoMini Beadbeater(Biospec, Mỹ); máy đo OD UV-VIS Spectrotometer Halo DB-20 (Dynamica, Pháp);máy cô chân không RVC 2-25 (Christ, Nhật); tủ sấy 70oC Lab-Ware Drying Oven DG

82 (Yamato, Nhật),…

2.2.3 Môi trường

Môi trường PDA: Glucose (10 g/l), agar (20 g/l), dịch chiết khoai tây.

Môi trường YM lỏng: Glucose (10 g/l), Yeast extract (3 g/l), Malt extract (3 g/l),

Peptone (5 g/l), nước cất

Môi trường lên men (cho 1 bình tam giác 100 ml): 1,5 g bã mía; 1,5 g bã

malt, 1,5 g cám gạo; 10 ml môi trường mandel (KH2PO4: 4 g/l, (NH4)2SO4: 13,6g/l, CaCl2.2H2O: 0,8 g/l, MgSO4.7H2O: 0,6 g/l, Bacto peptone: 6 g/l, Tween 80:1%); 10 µl vi lượng (FeSO4.7H2O: 10 g/l, MnSO4.H2O: 3,2 g/l, ZαA và trình tự vùng đa điểm cắt [17].nSO4.7H2O: 2,8 g/

l, CoCl.6H2O: 4 g/l)

Môi trường đục lỗ thạch: CMC 10 g/l, agar 18 g/l, đệm Natri acetate 50

mM, pH 5,0

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy và chiết enzyme trên môi trường cơ chất rắn.

Chuẩn bị: Các chủng nấm mốc được hoạt hóa trên đĩa PDA ở 50°C trong 2 - 3

ngày Giống sau khi hoạt hóa được cấy lại vào ống thạch nghiêng PDA nuôi tiếp trong

2 - 3 ngày nữa cho giống mọc kín mặt thạch Bổ sung 4ml Tween 80 0,05% đã thanhtrùng vào mỗi ống giống, cào giống hòa đều rồi hút 1ml giống vào mỗi bình tam giác

100 ml chứa cơ chất đã chuẩn bị sẵn Đảo đều giống với cơ chất sau đó nuôi ở 50°Ctrong 7 ngày, mỗi ngày đảo giống 1 lần (có thể bổ sung thêm nước cất đã hấp vô trùngkhi đảo giống tránh bị khô)

Chiết enzyme: sau khi nuôi 7 ngày, bổ sung vào mỗi bình giống 45ml đệm

Na-acetate 50 mM pH 5,0, lắc 130 vòng/phút ở 30°C trong 1 giờ Dịch enzyme được thu

và ly tâm 8000 vòng/phút ở 10°C trong 10 phút để loại bỏ hết cặn Dịch enzyme đượcbảo quản ở -30°C

2.3.2 Phươngpháp xác định hoạt tính CMCase

2.3.2.1 Thử hoạt tính enzyme bằng phương pháp đục lỗ thạch.

Mỗi lỗ thạch nhỏ 50 µl enzyme thô của 1 chủng nấm mốc thu được, đồng thời

có 1 lỗ được nhỏ 50 µl dịch enzyme thương phẩm Novozyme pha loãng 2000 lần làmđối chứng dương và 1 lỗ nhỏ 50 µl đệm Na-acetate 50 mM pH 5,0 làm đối chứng âm.Sau khi nhỏ dịch enzyme vào thì đậy nắp, để yên trong tủ 50°C qua đêm Đĩa ủ quađêm được bổ sung thuốc thử Congo red 0,1% trong 1 giờ sau đó đổ thuốc thử ra, rửanhiều lần bằng nước cất rồi bổ sung dung dich Nacl 1M vào Vòng thủy phân có màutrắng đục trên nền cơ chất màu hồng đỏ Chụp ảnh và phân tích dữ liệu

2.3.2.2 Xác định hoạt tính CMCase của enzyme bằng phương pháp DNS.

Định nghĩa: Hoạt tính CMCase (IU/ml) được tính bằng số µmol D-glucose

tạo ra khi thủy phân CMC trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C

Cơ chất CMC: CMC 1% trong đệm Natri-acetate 0.05 M pH 5 thanh trùng ở

121˚C/15 phút, bảo quản ở 4˚C

Thuốc thử DNS (1 lít): 708 ml nước cất; 5,3 g 3,5-Dinitrosalicylic acid

(DNS); 11,9 g Sodium hydroxide (NaOH);153 g Rochelle salts (sodium potassiumtartrate); 3,8 ml Phenol tinh thể; 4,15 g Sodium metabisulfite (Na2S2O5)

Đường chuẩn D-glucose: Đường D-glucose được sấy 105˚C trong 2 giờ.

Cân 0,5g đường hòa với 40 ml đệm Na-acetate 50 mM pH 5,0 trong cốc đong thủytinh, sau đó định mức đến 50 ml thu được dung dịch stock 10 mg/ml (bảo quản -20°C) Từ dung dịch stock D-glucose được pha loãng ra các nồng độ 0,2; 0,4; 0,6;0,8; 1; 1,2 mg/ml

Tiến hành dựng đường chuẩn:

- Bổ sung 0,3 ml dung dịch đường pha loãng vào các Eppendorf 1,5 ml

- Bổ sung tiếp 0,6ml DNS, trộn đều hỗn hợp bằng voltex, đun phản ứngmàu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá

- Bổ sung 0,4 ml dịch phản ứng vào 1,8 ml nước cất Đo OD 540 nm.Dựng được đường chuẩn: y = ax + b thông qua chương trình MicrosoftExcel

Hình 4 Đường chuẩn D-glucose ở pH 5,0

Tiến hành phân tích hoạt tính CMCase:

Mẫu thí nghiệm:

- Pha loãng mẫu với tỉ lệ thích hợp trong đệm phân tích (tùy phân tích hoạt tính ở

pH nào thì dùng đệm ở pH đó)

- Hút 0,2 ml cơ chất CMC vào eppendorf 1,5 ml Bổ sung 0,1 ml dịch enzyme (đã

pha loãng với tỷ lệ thích hợp), ủ ở 50°C trong 20 phút cho enzyme phản ứng với

cơ chất, làm lạnh nhanh bằng nước đá

- Bổ sung 0,6 ml DNS đun ở 100°C trong 5 phút cho phản ứng màu xảy ra, sau đó

làm lạnh nhanh bằng nước đá để ngừng phản ứng

- Bổ sung 0,4 ml dịch phản ứng vào 1,8 ml nước cất Đo OD 540 nm.

Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm, tuy nhiên dịchenzyme bị bất hoạt bằng cách đun enzyme trong 10 phút ở 100oC và làm lạnh nhanhtrước khi cho phản ứng

Mẫu Blank: làm tương thự mẫu thí nghiệm trong đó thay enzyme bằng 0,1 ml dungdịch đệm phân tích tương ứng

Công thức tính hoạt độ CMCase (IU/ml):

(Y1−Y0)∗D∗V

0.15∗t∗v = a∗(X1−X0)∗D∗V

0.15∗t∗v

Trong đó:

- Y1: hàm lượng cellulose (mg) trong mẫu thí nghiệm

- Y0: hàm lượng cellulose (mg) trong mẫu đối chứng

- X1: độ hấp phụ OD540 của mẫu thí nghiệm

- X0: độ hấp phụ OD540 của mẫu đối chứng

- a: hệ số góc của phương trình đường chuẩn D-glucose y= ax+b

Bổ sung 750 µl SSC 2×, lắc đều, ủ ở 100 °C trong 10 phút rồi ly tâm 12.000vòng/phút trong 10 phút ở 10°C Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 2 lầnbằng nước cất vô trùng Qua mỗi lần rửa, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút,loại bỏ dịch nổi Thêm 100 µl nước cất vô trùng, 100 µl hạt thủy tinh (0,2 - 0,5

mm, Roth) và 150µl Phenol/chloroform (tỷ lệ 1:1), đặt vào máy phá tế bào, lắctrong 1 phút Sau đó hỗn hợp được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4

°C Thu phần dịch trong bên trên chứa DNA tổng số, bảo quản ở -20°C

2.4.3.2 Tinh sạch DNA.

Do DNA của nấm mốc còn chứa rất nhiều chất ức chế phản ứng PCR nên trướckhi dùng DNA làm khuôn cho phản ứng PCR cần phải tinh sạch DNA bằng kit SilicaBead DNA gel extraction (Thermo, Mỹ) Quy trình được thực hiện như sau: Hút 50 µldung dịch DNA cho vào Eppendorf vô trùng Bổ sung 150 µl Binding Buffer có chứaSilica, trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút

ở 10°C, gạn bỏ dịch Kết tủa được rửa với 500 µl Washing buffer, sau đó ly tâm 12.000vòng/phút trong 1 phút ở 10°C Lặp lại bước rửa 3 lần Làm khô phần kết tủa bằng máy

cô chân không trong 10 phút ở 30 °C Bổ sung 15 µl nước deion thanh trùng và ủ ở50°C trong 5 phút Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút Thu dịch DNA tinh sạch vàbảo quản ở -20 ºC

2.4.4 Phương pháp PCR.

Nguyên lý: Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là phản ứng phối hợp khả năng

lại đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro của DNA polymarase thôngqua các chu trình lặp lại của phản ứng tổng hợp để nhân bản các đọa DNA quan tâm

lên theo hàm mũ Để nhân bản được đoạn DNA đích, ta cần biết trình tự nucleotide ởhai đầu của đoạn DNA mong muốn để thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR.

Dream Taq DNA polymerase (5u/l) 0,5 l

Nước deion thanh trùng 83,5l

2.4.5 Phương pháp PCR fingerprinting

Nguyên lý: phương pháp PCR fingerprinting là phương pháp dùng để phânnhóm dưới loài dựa trên sự tương đồng các đoạn DNA vệ tinh DNA vệ tinh là cácđoạn DNA có trình tự lặp lại lớn phần lớn ngẫu nhiên trong hệ gen của tế bào,thường không mã hóa cho gen và ít bị đột biến, thay đổi Do đó chúng thườngđược dùng làm công cụ đắc lực trong phân loại Sử dụng các mồi được thiết kếtheo trình tự của các DNA vệ tinh trong phản ứng PCR Sau đó các đoạn DNA vệtinh đã khuếch đại sẽ được điện di để so sánh kích thước Sự tương đồng phổ băngthể hiện sự gần gũi của các chủng nấm men

Thành phần matermix cho 100 µl phản ứng: 10µl Dream Taq buffer (10×); 2 µlMgCl2 (25 mM); 2 µl dNTPs (10 mM); 2 µl Mồi MST2 5’-(GAC)5- 3’(10 µM); 0,5 µlDream Taq DNA polymerase; 83,5 µl nước PCR Bổ sung thêm 1 µl DNA cho mỗiống PCR chứa 20 µl mastermix

Phản ứng PCRfingerprinting được tiến hành trên máy PCR C1000 TouchThermal Cycler với chu kỳ nhiệt: 94 °C: 3 phút; (94°C: 40 giây, 52°C: 40 giây, 72 °C:

2 phút)×35; 72°C: 10 phút và giữ mẫu ở 4°C đến khi phân tích

2.4.6 Phương pháp điện di DNA.

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% trong đệmTAE 0,5× Mẫu gồm 5 µl sản phẩm PCR trộn với 1 µl đệm mẫu có chứa: glycerol20%, chất chỉ thị màu bromophenol blue, xylene cyanol và nạp vào các giếng trên gel.Chạy điện di với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel Sau 25 phút, gel được lấy ra

và nhuôm trong dung dịch chứa ethidium bromide (EtBr) trong 10 phút Gel agaroseđược vớt ra và rửa bằng nước để loại bỏ EtBr bám không đặc hiệu Các băng DNAđược quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng UV bằng máy soi gel Synegene

2.4.7 Giải trình tự gen

Đoạn trình tự gen đặc hiệu sau khi được khuếch đại sẽ được pha loãng với nồng

độ thích hợp để làm khuôn cho phản ứng PCR xác định trình tự Về cơ bản, phản ứngPCR này có các thành phần giống như PCR thông thường nhưng có một số khác biệt là

sự có mặt của ddNTP và chỉ cần dùng một loại mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngược) CácddNTP khác với các dNTP là thiếu một nhóm 3’-OH nên khi được enzyme ADNpolymerase gắn vào chuỗi ADN đang tổng hợp thì chúng sẽ không thể hình thành liênkết phosphodiester với nucleotide được đưa vào kế tiếp và khiến cho quá trình kéo dàichuỗi bị ngừng lại Như vậy, từ một đoạn ADN ban đầu, nhiều sợi đơn mới được đánhdấu ở một đầu tận cùng bằng ddNTP sẽ được tổng hợp và các sợi này có độ dài khácbiệt nhau một nucleotide Các sợi đơn mới tổng hợp được phân tách trên gel điện diacrylamide dạng mao quản Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các kết quả để đưa ratrình tự đoạn ADN gốc Mức độ tin cậy của trình tự được hiển thị thông qua tín biểu đồtín hiệu huỳnh quang và được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng

2.4.8 Phương pháp phân tích số liệu

2.4.7.1 Phân tích số liệu hoạt tính.

Các số liệu trong khóa luận về hoạt tính được phân tích bằng phần mềmMicrosoft Office Excel 2007 một cách chính xác và cụ thể

2.4.7.2 Phân tích trình tự DNA

Dữ liệu DNA thô được mở bằng FinchTV để kiểm tra độ tin cậy Các trình tựđọc từ mồi xuôi và mồi ngược được lắp ghép với nhau bằng phần mềm Contig ExpressProject (Vector NTI Advance 11, Invitrogen) Trình tự sau khi lắp ghép sẽ được đốichiếu một lần nữa với dữ liệu thô để kiểm tra độ tin cậy của trình tự.

Chúng tôi sử dụng 2 phần mềm trực tuyến để tìm kiếm intron và exon của

(http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/submission.php) và NetAspGene 1.0Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetAspGene/), sau đó so sánh kết quả giữa

2 phần mềm để tìm được các đoạn intron và exon tin cậy Phần mềm Augustus cómột số đặc điểm là cho biết chính xác vị trí nucleotide cũng như kích thước của cácexon và intron Ngoài ra, phần mềm này còn cho dự đoán về trình tự axitamin củatrình tự đưa vào Phần mềm NetAspGene tìm kiếm exon và intron trên cả 2 sợi trựctiếp và gián tiếp theo nguyên lý tìm vị trí mở đầu GT và kết thúc bằng AG củaintron và kết hợp với hình ảnh mô tả vị trí của exon, intron Tuy nhiên kết quả trả

về không rõ ràng,chúng tôi cần phải phân tích thêm để đưa ra một kết quả duynhất Chính vì thế mà độ tin cậy của phần mềm này không cao

Cuối cùng dựa vào trình tự protein dự đoán, chúng tôi tìm kiếm trình tựpeptidetín hiệu (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) của đoạn gen Peptide tínhiệu là đoạn trình tự peptide ngắn (5 – 30 axit amin) nằm ở đầu N của đa số các proteinngoại bào mới được tổng hợp Đoạn peptide này có trình tự axit amin ở cuối giúpsignal peptidase nằm trên lưới nội chất nhận biết và cắt bỏ peptide tín hiệu, sau đó,protein tiết được vận chuyển đến phức hệ Golgi để thực hiện một số cải biến hìnhthành protein có chức năng sinh học

Như vậy sau khi dự đoán các intron, exon và peptide tín hiệu trong gen, chúngtôi sẽ xây dựng được một trình tự mã hóa endo-1,4-β-glucanase trưởng thành để từ đó

thiết kế mồi nhân dòng và biểu hiện trên Pichia pastoris nhằm sinh tổng hợp enzyme

có hoạt tính sinh học

CHƯƠNG BA: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 PHÂN NHÓM BẰNG KỸ THUẬT PCR FINGERPRINTING

Từ 28 chủng nấm mốc chịu nhiệt Thielavia spp đã được phân lập, chúng tôi

tiến hành tách DNA tổng số để phân nhóm bằng phương pháp PCR fingerprinting Phản ứng PCR - fingerprinting được thực hiện với mồi MTS2 theoquy trình trong phần 2.4.5 Kết quả điện di trên Hình 5 cho thấy sản phẩm PCR –fingerprinting của các chủng cho các phổ băng khác nhau và rất đa dạng do sựphân bố về số lượng bản sao cũng như vị trí các DNA vệ tinh trong hệ gen Cácchủng có cùng phổ băng chắn chắn sẽ cùng một loài khi phân loại bằng phươngpháp đọc trình tự vùng ITS, các chủng có phổ băng khác nhau có thể sẽ thuộc cácloài khác nhau tùy thuộc vào mức độ khác biệt

-Hình 5 Điện di sản phẩm PCR - fingerprinting của 28 chủng nấm mốc chịu nhiệt Thielavia trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5×

M: Thang DNA chuẩn 1kb (Thermo, Mỹ)

Sau khi điện di kiểm tra sản phẩm PCR – fingerprinting, các chủng có phổbăng giống hoặc tương tự nhau về kích thước thì có thể thuộc cùng một loài nênđược xếp vào một nhóm Các chủng có phổ băng khác nhau ít hay băng điện di mờ

sẽ được xếp thành các nhóm khác nhau để tránh bỏ sót Cuối cùng, chúng tôi đãchia 28 chủng nấm mốc thành 24 nhóm (Bảng 4), trong đó chỉ có LPH198 vàLPH218, LPH172 và LPH182, FCH136.2 và FCH142.4 được xếp vào cùng nhómvới nhau Tuy nhiên giữa các chủng LPH201 với LPH205 có phổ điện đi khácnhau nhưng lại cho kết quả đọc trình tự giống nhau và thuộc cùng một loài Điềunày cho thấy để phân loại chính xác phải dựa vào phương pháp đọc trình tự rDNAcủa nấm mốc