Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hàm lượng anilin và bước đầu đánh giá sự tồn dư của anilin trong nước thải bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Từ việc theo dõi sự phụ thuộc của chiều cao sóng cực phổ vào nồng độ củaanilin có thể định lượng được anilin trong các mẫu phân tích.. Anilin là chất dễ bay hơi nên có thể áp dụng phương

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này đã được thực hiện tại Bộ môn Hóa Phân tích – khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, em đã được đón nhận rất nhiều sự dạy dỗ, hướng dẫn và góp ý nhiệt tình của các thầy cô, bạn bè.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy giáo ThS Trần Thế Ngà - người đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo và hướng dẫn

em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Hóa Phân tích; các thầy cô trong khoa Hóa học – trường Đại học Sư phạm Hà Nội; cùng toàn thể các bạn bè đã giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Trần Thị Duy Ly

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

I.1 TỔNG QUAN VỀ ANILIN 3

I.1.1 Thông tin chung 3

I.1.2 Sơ lược về tính chất vật lý 3

I.1.3 Sơ lược về tính chất hóa học 5

I.1.4 Điều chế 5

I.1.5 Ứng dụng, tình hình sản xuất và sử dụng anilin 6

I.1.5.1.Ứng dụng 6

I.1.5.2 Tình hình sản xuất và sử dụng anilin 6

I.1.6 Độc tính 8

I.2.MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ANILIN 10

I.2.1 Phương pháp điện hoá – Cực phổ 10

I.2.2 Phương pháp trắc quang 11

I.2.3 Phương pháp sắc ký khí với máy dò ion hóa ngọn lửa (GC-FID) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 11

I.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 11

I.3 SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 13

I.3.1 Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao 13

I.3.1.1 Khái niệm về sắc ký 13

I.3.1.2 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC) 13

I.3.2 Nguyên tắc cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14

I.3.2.1 Hệ thống bơm cao áp 15

I.3.2.2 Bộ phận tiêm mẫu 15

I.3.2.3 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao 15

I.3.2.4 Detector 16

I.3.2.5 Bộ phận ghi tín hiệu 17

I.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích[3] 17

I.3.3.1 Ảnh hưởng của pha tĩnh 17

I.3.3.2 Ảnh hưởng của pha động 18

I.3.3.3 Ảnh hưởng của tốc độ dòng 18

I.3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 19

I.3.4 Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động 19

I.3.5 Cách đánh giá pic 20

I.3.6 Ứng dụng của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 20

I.3.6.1 Phân tích định tính 20

I.3.6.2 Phân tích định lượng 21

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 23

II.1 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM 23

II.2 HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 23

II.2.1 Hóa chất 23

II.2.2 Dụng cụ và thiết bị 23

II.2.2.1 Dụng cụ 23

II.2.2.2 Thiết bị 23

II.3 NỘI DUNG THỰC NGHIỆM 24

II.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu 24

II.3.1.1 Lựa chọn cột sắc kí 25

II.3.1.2 Chọn bước sóng 25

II.3.1.3 Khảo sát thành phần pha động và tỉ lệ pha động 25

II.3.1.4 Khảo sát tốc độ dòng 27

II.3.1.5.Khảo sát nhiệt độ cột 27

II.3.2 Xây dựng đường chuẩn 28

II.3.2.1 Xây dựng đường chuẩn 28

II.3.2.2 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 30

II.3.2.4 Xác định hàm lượng anilin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 32

II.3.3 Phân tích hàm lượng anilin trong mẫu nước thải tại nhà máy len nhuộm Hà Đông 33

II.3.3.1 Quy trình lấy mẫu 33

II.3.3.2 Xử lí mẫu 34

II.3.3.3 Phân tích mẫu 34

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

III.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU PHÂN TÍCH ANILIN 35

III.1.1 Lựa chọn cột sắc kí 35

III.1.2 Chọn bước sóng cực đại 35

III.1.3 Khảo sát thành phần pha động và tỉ lệ pha động 37

III.1.4 Khảo sát tốc độ dòng pha động 40

III.1.5 Khảo sát nhiệt độ cột 43

III.2 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN 45

III.2.1 Xây dựng đường chuẩn 45

III.2.2 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 47

III.2.2.1 Tính ổn định của máy sắc ký 47

II.2.2.2 Độ đúng của máy sắc ký 48

II.3.PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG ANILIN TRONG MẪU NƯỚC THẢI TẠI NHÀ MÁY LEN NHUỘM HÀ ĐÔNG 49

II.3.1 Phân tích mẫu số 1 50

II.3.2 Phân tích mẫu số 2 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 55

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Kí hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt

HPLC High Performance Liquid

Chromatoghraphy

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantity Giới hạn định lượng

SD Standard deviation Độ lệch chuẩn

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ pha động tới chiều cao và diện

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tốc độ pha động tới thời gian lưu

chiều cao và diện tích píc của anilin Trang 41

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ cột đến thời gian lưu, diện

tích, chiều cao pic của anilin và áp suất cột sắc ký Trang 43Bảng 3.4 Sự phụ thuộc của diện tích vào nồng độ của anilin Trang 45

Bảng 3.5 Kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp sắc ký Trang 47

Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp sắc ký Trang 48

Trang 36

Hình 3.2.b

Sắc ký đồ của anilin với thành phần pha động gồm60% methanol – 40% nước, tốc độ dòng là 0,5 ml/phút,nhiệt độ cột 40 Bước sóng 231 nm

Trang 37

Hình 3.3

Sắc ký đồ của anilin (a) Pha động chứa 30% metanol – 70% nước

(b) Pha động chứa 40% metanol – 60% nước

Trang 39

Hình 3.4

Sắc ký đồ của anilin với thành phần pha động gồm60% methanol – 40% nước cất, tốc độ dòng là 0,5ml/phút, nhiệt độ cột 40

Trang 40

Hình 3.5

Sắc ký đồ của anilin ứng với tốc độ pha động là0,25 ml/phút; 0,50 ml/phút; và 0,75 ml/phút vớithành phần pha động gồm 60% methanol – 40%

nước cất, nhiệt độ phân tích: 40C

Trang 41

Hình 3.6

Sắc ký đồ của anilin với tốc độ pha động là 0,50 ml/

phút với thành phần pha động gồm 70% metanol –40% nước cất; nhiệt độ cột 40oC

Trang 44

Hình 3.7 Sắc ký đồ của anilin tại các nồng độ trong dãy đường Trang 45

Hình 3.9 Sắc ký đồ của mẫu thật số 1 Trang 50Hình 3.10 Phổ UV- Vis của mẫu thật Trang 50Hình 3.11 Sắc ký đồ của mẫu thật số 2 Trang 51

MỞ ĐẦU

I Lý do chọn đề tài

Phân tích, đánh giá hàm lượng các chất hữu cơ độc hại có trong nước thảicủa các nhà máy, từ đó đánh giá chất lượng quy trình sản xuất cũng như quytrình xử lý nước thải đang là vấn đề nhận được nhiều sự quan tâm của dư luậnhiện nay Đặc biệt là trong tình trạng có rất nhiều nhà máy hay cơ sở sản xuất viphạm pháp luật về vấn đề bảo vệ môi trường khi xả trực tiếp chất thải chưa qua

xử lý hoặc xử lý chưa triệt để ra môi trường Điều này gây ra tình trạng ô nhiễmnghiêm trọng nguồn nước, đất ở khu vực xung quanh và ảnh hưởng nặng nề tớiđời sống của con người và các sinh vật

Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu áp dụng để phân tích hàm lượngcác chất hữu cơ độc hại trong nước, tuy nhiên các phương pháp đang áp dụnghoặc là có quy trình phức tạp, hoặc là thiết bị cồng kềnh, tốn kém Sắc kí lỏnghiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tối ưu đang được quan tâm lựa chọn choviệc phân tích đánh giá hàm lượng các chất hữu cơ trong nhiều đối tượng mẫukhác nhau Việc nghiên cứu phân tích trên thiết bị này sẽ mở ra hướng phân tíchhàng loạt các chất hữu cơ bằng phương pháp sắc kí lỏng

Trong các các chất gây ô nhiễm hiện nay, sự ô nhiễm gây ra bởi các hợpchất amin thơm, các hợp chất mang màu trong công nghiệp dệt may, côngnghiệp nhuộm đang ở tình trạng đáng báo động

Anilin là nguyên liệu đầu để tổng hợp nên các hợp chất mang màu, chính làcác loại phẩm màu azo được sử dụng trong quy trình nhuộm màu cho vải Khi sửdụng, một lượng đáng kể anilin được đưa vào môi trường do dư lượng trong quátrình sản xuất và chất lượng yếu kém của hệ thống xử lý nước thải trong các nhàmáy Anilin lại là một chất hữu cơ độc hại, do đó nó gây ô nhiễm nặng nề chomôi trường

Có nhiều phương pháp khác nhau để phân tích đánh giá hàm lượng anilintrong nước Tuy nhiên, như đã nói ở trên, HPLC là thiết bị có khả năng cho phép

phân tích đơn giản, nhanh, đồng thời nhiều chất và cho kết quả chính xác Từ các

lý do trên, em đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích

hàm lượng Anilin và bước đầu đánh giá sự tồn dư của Anilin trong nước thải bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao”.

II Mục đích nghiên cứu

Tìm quy trình phân tích tối ưu cho quá trình xác định hàm lượng anilinbằng phương pháp sắc kí lỏng Từ đó bước đầu phân tích hàm lượng anilin cótrong nguồn nước gần các cơ sở sản xuất hóa chất dệt nhuộm và đánh giá tìnhtrạng ô nhiễm anilin tại các khu vực này

III Nhiệm vụ nghiên cứu

 Nghiên cứu cơ sở lý luận về độc tính và các phương pháp xác địnhcủa anilin

 Tìm các điều kiện tối ưu cho việc phân tích định tính và định lượnganilin trên hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao

 Xây dựng đường chuẩn và kiểm tra tính thích hợp của hệ thống sắc

kí cho quá trình phân tích anilin

 Ứng dụng phân tích, đánh giá hàm lượng anilin trong các mẫu nướcthải

CHƯƠNG I: TỔNG QUANI.1 TỔNG QUAN VỀ ANILIN[10, 16]

I.1.1 Thông tin chung

Anilin, phenyl amin hay amino benzen là một amin thơm đơn giản có côngthức phân tử C6H7N và có rất nhiều ứng dụng quan trọng Anilin được phát hiệnlần đầu vào năm 1826, khi chưng khan phẩm màu inđigo Sau đó được thấytrong nhựa than đá (1834) và được Zinin tổng hợp từ nitrobenzen (1842)

-Công thức cấu tạo:

-Khối lượng phân tử: 93,13 g/mol

I.1.2 Sơ lược về tính chất vật lý

- Trạng thái tồn tại: Là chất lỏng, không màu, sánh như dầu, để lâu trong

không khí chuyển thành màu nâu

- Tính tan: Tan ít trong nước với độ tan 3,6g/100g nước, dễ tan trong etanol,ete, benzen

- Độ bền của anilin trong môi trường: Trong không khí, anilin bị phá vỡ đểchuyển thành các chất khác, cụ thể hơn là nó bị oxi hóa bởi oxi trong không khítạo các sản phẩm có cấu trúc phức tạp, do đó, để lâu trong không khí nó chuyển

từ không màu sang màu nâu

Cụ thể, ban đầu phản ứng tạo cation gốc:

Sau đó cation gốc hình thành từ anilin kết hợp với các phân tử anilin khác tạo thành hợp chất polime có màu nâu:

Ánh sáng mặt trời cũng làm phân hủy chậm anilin trong nước bề mặt Visinh vật sống trong nước và trong đất cũng có thể phá vỡ anilin Anilin là chấtlỏng nên nó không bị cố định trong lòng đất mà có khả năng di chuyển và hòatan vào mạch nước ngầm Như vậy, nhìn chung có thể kết luận là độ bền củaanilin trong môi trường khá thấp, dự đoán là anilin ít có khả năng tích tụ ở nướcmặt, dễ tích tụ ở các lớp nước sâu hơn, nước ngầm hoặc trầm tích

I.1.3 Sơ lược về tính chất hóa học

Anilin có tính bazơ do phân tử có nhóm – NH2, chính xác hơn là do nó cónguyên tử Nitơ với cặp electron chưa sử dụng Tuy nhiên, do ảnh hưởng củavòng benzen nên tính bazơ của nó rất yếu, yếu hơn amoniac và các amin nokhác, dung dịch của nó không làm đổi màu quỳ tím (pKb = 9,42)

Anilin phản ứng với axit mạnh tạo thành muối và nó tạo kết tủa với muốikẽm, nhôm và sắt

I.1.4 Điều chế

Anilin thường được điều chế trong công nghiệp qua hai bước từ benzen.Đầu tiên, benzen được nitro hoá bởi hỗn hợp đậm đặc axit nitric và axit

Ở bước thứ hai, nitrobenzen được hiđro hoá bằng hiđro mới sinh, tạo thànhanilin

Tóm lại, anilin được điều chế theo sơ đồ:

Anilin cũng được điều chế từ phenol và amoniac, phenol được thu từ việc

oxi hóa cumen

I.1.5 Ứng dụng, tình hình sản xuất và sử dụng anilin[21]

I.1.5.1.Ứng dụng

Anilin là nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp, dùng để sản xuất

metylen điisoxianat điphenyl (MDI), phẩm nhuộm (phẩm azo, đen anilin, ),polime (nhựa anilin-fomandehit, ), dược phẩm (streptoxit, sunfaguanidin, ),phẩm màu, nông nghiệp, chế tạo mực, hóa chất chụp ảnh, thuốc trừ sâu, chất nổ

và các ngành công nghiệp cao su Nó cũng được sử dụng như một dung môi và

đã được sử dụng như một hợp chất chống nổ cho xăng

Nhiều dẫn xuất của anilin (axit picric, đimetylanilin, nitrobenzen,nitroanilin, toludin, xylidin) được sử dụng rộng rãi để tổng hợp các hoá chất.Phenacetin, một thuốc chữa bệnh cũng là dẫn xuất của anilin

I.1.5.2 Tình hình sản xuất và sử dụng anilin

- Sản lượng: Vì có rất nhiều ứng dụng quan trọng nên anilin được sản xuất

với số lượng rất lớn Theo đà phát triển của kinh tế thế giới, lượng tiêu thụ và sảnxuất anilin tăng nhanh theo thời gian Năm 1988, sản lượng anilin thế giới chỉ cókhoảng 1,5 triệu tấn/năm, vào năm 1996 lên khoảng 2,2 triệu tấn/năm, vào năm

2000 lên khoảng 2,97 triệu tấn/năm Trong những năm gần đây, cụ thể là trongnăm 2010 tổng công suất sản xuất trên thế giới đạt khoảng 4 triệu tấn/năm Theobáo cáo mới nhất của các nhà phân tích ngành công nghiệp toàn cầu, lượnganilin tiêu thụ toàn cầu ước tính sẽ đạt 6,2 triệu tấn vào năm 2015

- Tốc độ tăng trưởng: Trong giai đoạn 1990-1997, tốc độ tăng trưởng tiêu

thụ hàng năm của anilin trên thế giới là khoảng 4% so với năm trước đó (nghĩa lànăm sau tăng lên 4% so với năm trước) Đến giai đoạn 2006 - 2010 là 3%, vàgần 10% mỗi năm từ năm 2010 đến năm 2012

Thị trường anilin đã bị ảnh hưởng đáng kể bởi cuộc khủng hoảng kinh tếtoàn cầu vào năm 2008 Trước khi suy thoái kinh tế toàn cầu, nhu cầu về benzen

và dẫn xuất benzen bao gồm anilin đã tăng trưởng đều đặn Anilin có tốc độ tăng

trưởng lượng tiêu thụ cao nhất trong số các hợp chất thơm trong giai đoạn

2002-2007 do bùng nổ ngành công nghiệp ô tô, xây dựng và thiết bị điện tử, đặc biệt làtại các thị trường Châu Á-Thái Bình Dương

Sau khủng hoảng, tiêu thụ anilin được thúc đẩy bởi sự phục hồi mạnh mẽcủa các nền kinh tế trong hầu hết các khu vực và các quốc gia kể từ năm 2010.Lượng tiêu thụ anilin của cả thế giới được dự báo sẽ tăng trưởng với tốc độ trungbình hàng năm 4,3% trong giai đoạn 2012-2018 Nhu cầu về anilin tiếp tục tăngtrưởng nhanh chóng ở một số vùng, đặc biệt là ở Trung Quốc Trong năm 2012,mức tiêu thụ của anilin ở Trung Quốc đạt 1,1 triệu tấn, đứng đầu về lượng tiêuthụ anilin trên thế giới

Hình 1.1 Lượng tiêu thụ anilin của các quốc gia trên thế giới

- Phân bố sử dụng: Sản xuất MDI chiếm hơn 76% lượng tiêu thụ anilin thế

giới vào năm 2012 Các ứng dụng lớn khác bao gồm thuốc nhuộm, cao su và cáclĩnh vực khác Nhu cầu tương lai về anilin sẽ tiếp tục phụ thuộc phần lớn vàolượng sử dụng MDI

I.1.6 Độc tính[14, 18, 19, 20]

Ảnh hưởng của anilin tới sức khỏe con người và môi trường phụ thuộc vàohàm lượng anilin và tần suất tiếp xúc Nó cũng phụ thuộc vào sức khỏe sẵn cócủa người tiếp xúc hoặc tình trạng của môi trường xảy ra phơi nhiễm

Trong tự nhiên, một lượng nhỏ anilin có thể được tìm thấy trong một số loạithực phẩm, chẳng hạn như ngô, ngũ cốc, đại hoàng, táo, đậu, hạt cải dầu và thức

ăn gia súc Tuy nhiên hàm lượng của nó trong những thực phẩm này thường làkhông đáng kể và không gây độc, chủ yếu nó gây độc do thoát ra từ các nhà máy

có sử dụng anilin với số lượng lớn hoặc do các vụ tai nạn rò rỉ hóa chất

Nhiễm độc anilin thường xảy ra do hít thở trong không khí bị ô nhiễmanilin Anilin cũng có thể thâm nhập vào cơ thể do ăn phải thực phẩm, uống phảinước có chứa anilin hoặc da tiếp xúc với anilin

Tuy nhiên, tiếp xúc với anilin ở các cấp độ nền bình thường dường nhưkhông có bất kỳ ảnh hưởng xấu nào đến sức khỏe con người và nó không tồn tạitrong cơ thể con người do cơ chế tự đào thải, chủ yếu nó gây độc do biến đổithành các chất khác và các chất này mới thực sự là nguyên nhân gây độc

Đối với con người:

-Đường xâm nhập: tiêu hoá, hô hấp, qua da

-Độc tính: ngộ độc 1gam anilin có thể gây tử vong

-Sinh lý bệnh:

Anilin được coi là có độc tính cấp cao, dựa trên thử nghiệm ngắn hạn ởchuột Với cơ thể con người, tiếp xúc với anilin ở nồng độ cao dẫn đến ảnhhưởng đến phổi, như kích ứng đường hô hấp, khó thở Uống phải anilin có thểdẫn đến kích ứng tiêu hóa, buồn nôn, nôn và tiêu chảy Nếu uống phải anilin vớinồng độ cao có thể dẫn đến hiệu ứng tương tự như đối với đường hô hấp Da,mắt và niêm mạc tiếp xúc với anilin có thể bị kích ứng mạnh Hấp thụ một lượnglớn anilin qua da có thể gây ra tác dụng tương tự như đối với đường hô hấp

Anilin và những dẫn xuất của chất này có khả năng oxi hoá sắt (II) củahuyết sắc tố thành sắt (III) chuyển hemoglobin thành methemoglobin, cản trởhồng cầu vận chuyển oxi Điều này dẫn tới tình trạng thiếu oxi ở các mô tế bào

và có thể dẫn đến chết ngạt

-Triệu chứng:

 Ngộ độc cấp tính: Tím tái do trong máu có methemoglobin khiến các tếbào của cơ thể thiếu oxi dẫn đến choáng váng, hôn mê và thậm chí là tử vong,đau thắt ngực, mày đay, nôn, co giật, tan huyết, vàng da do tan tế bào, suy thận

 Ngộ độc mãn tính: Thiếu máu, trong hồng cầu có những tiểu thể Heinz, unhú ở bàng quang, trong nước tiểu có N-axetyl-para-aminophenol

Có bằng chứng cho thấy anilin cũng có thể gây ra các tác dụng về sinh sản.Nghiên cứu trên chuột cho kết quả một số những con chuột mang thai ăn thức ăn

có nhiễm anilin chết trong khi mang thai, trong khi bên nhóm đối chứng không

có hiện tượng này Do vậy, anilin cũng có thể gây ra những ảnh hưởng tương tựvới con người

Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cho thấy, tiếp xúc thường xuyên vớimột lượng lớn và thời gian dài anilin trong chế độ ăn uống gây ra ung thư ở độngvật Do đó ta có thể dự đoán anilin có thể gây ra ung thư ở người Ngoài ra, tiếpxúc thường xuyên với số lượng lớn anilin trong chế độ ăn uống cũng gây ra tácdụng phụ khác như ảnh hưởng đến lá lách và máu của động vật, thậm chí là gâybiến đổi gen Điều này đã được ghi nhận qua thí nghiệm với chuột bạch Tuyvậy, vẫn chưa thực sự có đủ dữ liệu và căn cứ để kết luận rằng anilin có thực sự

là chất gây ung thư cho con người hay không

Qua thực tế cũng ghi nhận nhiều trường hợp công nhân tại các cơ sở sảnxuất thuốc nhuộm, sau một thời gian dài tiếp xúc với anilin thường hay bị ungthư bàng quang, kể từ u nhú đơn thuần lành tính tới ung thư xâm lấn, và ung thưbàng quang cũng là một trong các ung thư nghề nghiệp thường gặp nhất Bắt đầu

từ giữa thế kỷ XIX, công nghiệp nhuộm azo đã phát triển nhanh chóng Vào cuối

thế kỷ này, những trường hợp ung thư bàng quang đầu tiên đã được phát hiện ởcác thợ thường tiếp xúc với chất anilin Nhưng qua nghiên cứu người ta pháthiện ra rằng những khối u này không phải do chính anilin gây ra, hay nói cáchkhác chất anilin tự nó không sinh ra ung thư ở người và động vật nhưng là doanilin bị tạp nhiễm (arylamin), ví dụ như 4-aminđiphenyl; benziđin; 2-naphtylamin; 4-aminođiphenyl Nói cách khác, đây mới là thủ phạm thực sự gây

ra ung thư bàng quang cho các công nhân Người ta đã cố gắng loại bỏ các chấttạp nhiễm này khỏi quá trình chế tạo Do đó những công nhân bắt đầu lao độngtrong công nghiệp với anilin sau thời điểm đó thì nguy cơ có khối u bàng quang

đã giảm đáng kể Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn thống nhất xếp anilin vàonhóm các chất có nguy cơ gây ung thư, đặc biệt là ung thư bàng quang và cầnhạn chế tiếp xúc

Đối với môi trường: Anilin gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng tới đời

sống của các sinh vật, do độ bền trong môi trường không cao, dễ dàng bị chuyểnhóa sau vài ngày nên nó có thể gây độc sơ cấp khi vừa xuất hiện hoặc gây độcthứ cấp sau khi đã bị biến đổi thành chất khác

Các xét nghiệm cho thấy anilin có độc tính cao đến đời sống thủy sinh và cóbằng chứng cho thấy nó tác động đến quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật

I.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ANILIN

I.2.1 Phương pháp điện hoá – Cực phổ[9]

Anilin là chất dễ dàng tham gia các phản ứng oxi hóa khử trên điện cực nên

có thể được phân tích bằng phương pháp điện hóa với các kĩ thuật như xung viphân, sóng vuông,

Từ việc theo dõi sự phụ thuộc của chiều cao sóng cực phổ vào nồng độ củaanilin có thể định lượng được anilin trong các mẫu phân tích

Ưu điểm của phương pháp này là có độ chính xác cao, phân tích được ở cảnhững nồng độ nhỏ Tuy nhiên, phương pháp này có hạn chế là làm việc với điệncực thủy ngân độc hại, khó phân tích đồng thời nhiều chất trong mẫu

I.2.2 Phương pháp trắc quang[9, 10]

Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào định luật hấp thụ ánh sáng Buger –Lamber – Beer để định lượng chất Nghĩa là cấu tử cần xác định hàm lượng phải

có màu hoặc tạo được phức chất có màu với các chất khác, thường là tạo phứcvới các ion kim loại

Tuy nhiên, anilin là chất không màu, lại ít có khả năng tạo các phức màuvới các ion kim loại do cặp electron đã tham gia vào hệ liên hợp với vòng thơmnên ít phân tích các phức màu của anilin với các ion kim loại

Để phân tích anilin theo phương pháp đo quang phân tử, có thể cho anilinngưng tụ với các anđehit thơm tạo thành các hợp chất mang màu

I.2.3 Phương pháp sắc ký khí với máy dò ion hóa ngọn lửa (GC-FID) và sắc

ký khí khối phổ (GC-MS).

Anilin là chất dễ bay hơi nên có thể áp dụng phương pháp này để phân tích.Nguyên tắc của nó là dựa vào sự khác biệt trong phân bố của chất phân tíchgiữa pha động và pha tĩnh để tách các thành phần trong hỗn hợp Khi có dòngkhí (pha động) liên tục chạy qua cột sắc kí, chất phân tích ở trạng thái hơi sẽ bịphân tách ở các thời điểm khác nhau và sẽ được detector nhận diện ở các thờiđiểm phân tích

Phương pháp này có ưu điểm là phân tích được nhiều chất có bản chấtgiống nhau hoặc gần giống nhau Tuy nhiên, phương pháp này cần các thiết bịđắt tiền và có quy trình phân tích phức tạp, nên chỉ áp dụng cho việc phân tíchcác chất có thành phần rất phức tạp như mẫu đất, trầm tích, sinh học

I.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)[1]

a Nguyên tắc

Phương pháp HPLC dựa vào ái lực khác nhau của các chất phân tích vớipha động và pha tĩnh Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhấtđịnh dưới áp suất cao, pha tĩnh là chất rắn dưới dạng hạt mịn Pha động cùng vớimẫu thử được bơm qua cột dưới áp suất cao, các chất phân tích sẽ di chuyển theo

pha động qua cột với tốc độ khác nhau tùy theo ái lực của chúng với hai pha vàdẫn đến sự tách các chất Sử dụng một detector phù hợp sẽ phát hiện được cácchất thoát ra khỏi cột ở các thời điểm khác nhau.

b Ưu điểm

- Phân tích được rất nhiều hợp chất khác nhau, phân tích được các loạichất phân cực tới không phân cực, chất bay hơi tới không bay hơi, từ các chấttrung tính tới các chất điện ly

- Tính linh hoạt của phương pháp này cũng cao hơn các phương pháp khácnhờ vào cơ chế tách, pha động, pha tĩnh đa dạng, phong phú

- Khi kết hợp với các phương pháp phổ hiện đại thì sẽ cung cấp nhiềuthông tin có giá trị cho việc phân tích và định lượng chất

- Dễ dàng phân tích được các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb thậmchí ppt

- Có thể phân lập được các chất tinh khiết (sắc ký điều chế)

c Nhược điểm

- Dung môi sử dụng thải ra ngoài không thân thiện với môi trường

- Thiết bị máy móc khá đắt tiền

- Bảo quản, sử dụng và vận hành máy cần có chuyên môn

Trong các phương pháp nêu trên, em thấy phương pháp sử dụng sắc kýlỏng hiệu năng cao (HPLC) có tính linh hoạt cao đồng thời phân tích đượcnhiều hợp chất hữu cơ khác nhau cho các thông tin về chất đang nghiên cứumột cách đầy đủ, chi tiết So với các phương pháp còn lại để phân tích anilin thìphương pháp HPLC có nhiều ưu điểm hơn Vì thế mà hiện nay người ta thường

sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để tách các hợp chất hữu cơ và

có thể định tính, định lượng chúng một cách chính xác Trong nghiên cứu này

em cũng chọn HPLC để phân tích hàm lượng anilin trong các mẫu nước thải

I.3 SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO I.3.1 Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao

I.3.1.1 Khái niệm về sắc ký[2]

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phầncủa một hỗn hợp dựa trên sự phân chia khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc vàkhông hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động

I.3.1.2 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC)[2,15,16]

HPLC là chữ viết tắt của bốn chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương phápsắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trướckia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp Sở dĩ có tên như vậy vì pha độngđược sử dụng là chất lỏng và quá trình sắc ký diễn ra nhanh hơn các phươngpháp sắc ký khác rất nhiều (như sắc ký giấy hay sắc ký bản mỏng) do sử dụng hệthống bơm cao áp để phân tách các chất một cách nhanh chóng

Phương pháp này ra đời năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từphương pháp sắc ký cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển

và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phântích Nó được áp dụng rất nhiều trong ngành kiểm nghiệm, đặc biệt là ứng dụngcho ngành kiểm nghiệm thuốc Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích cácthuốc đa thành phần, cho phép định tính và định lượng

Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định dưới áp suấtcao, còn pha tĩnh là một chất rắn dưới dạng hạt mịn hoặc chất lỏng được bao trênmột chất mang rắn, hoặc một chất mang rắn đã được liên kết hóa học với cácnhóm hữu cơ Pha động cùng với mẫu thử được bơm qua cột dưới áp suất cao,các chất phân tích sẽ di chuyển theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau tùytheo ái lực của chúng với hai pha và dẫn đến sự tách các chất Các chất sau khi rakhỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện là detector Quá trình sắc ký dựatrên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay rây phân tử là tùy thuộc loại phatĩnh sử dụng

Như vậy, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là sự kết hợp của quátrình sắc kí lỏng với quá trình phát hiện chất phân tích nhờ một detector thíchhợp Trong đó, quá trình sắc ký có vai trò xác định tách các chất còn quá trìnhnhận diện bằng detector có vai trò nhận diện và định lượng chất đó.

I.3.2 Nguyên tắc cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)[1, 13, 15]

Do bản chất hóa học của chất phân tích khác nhau nên có nhiều kỹ thuật đểtách định lượng bằng sắc ký lỏng Tuy vậy nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc

ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận kết nối với nhau, được thể hiện

I.3.2.1 Hệ thống bơm cao áp

- Hệ bơm HPLC có chức năng tạo áp suất cao để đẩy pha động từ bình dungmôi qua hệ thống sắc ký

- Hệ bơm hiện đại hiện nay được điều khiển bằng máy tính có thể lậpchương trình để thay đổi tỉ lệ các thành phần pha động theo yêu cầu (sắc kýgradient)

- Bơm HPLC cần phải đáp ứng một số yêu cầu

 Tạo được áp suất cao 3000-6000 psi (250-500 atm)

 Lưu lượng bơm khoảng 0,1-10 ml/phút

 Không bị ăn mòn với các thành phần pha động

 Có tốc độ bơm không đổi

I.3.2.2 Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột có thể bơm mẫu bằng tay hay bơm mẫu bằng hệ bơmmẫu tự động Thể tích bơm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (bơm tay) haytrong hệ bơm mẫu tự động Sai số bơm mẫu dùng van khoảng 0,5%

I.3.2.3 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao

Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ,thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4÷10 mm.Thường có cột nhồi và cột bảo vệ

Cột nhồi thường có hạt cỡ 5÷10 µm Gần đây có loại cột nhỏ với đườngkính trong 1÷2 mm, dài 3÷7,5 cm Cột có thể được làm nóng để đạt hiệu quả

phân tách tốt hơn, nhưng hiếm khi tiến hành ở nhiệt độ trên 600C vì nhiệt độ cao

có thể làm suy giảm hiệu lực cột hoặc làm pha động bay hơi

Chất nhồi cột thường là Silicagel có bao một lớp mỏng chất hữu cơ (hoặcliên kết hóa học với một chất hữu cơ) Bên cạnh Silicagel người ta còn dùngnhững hạt khác: nhôm oxit, polyme xốp, chất trao đổi ion

Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt trong pha động

và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi thọ của cột

Hoặc ta có thể phân loại cột sử dụng trong HPLC như sau:

Có hai loại được sử dụng trong HPLC tùy thuộc vào sự phân cực tương đốicủa dung môi và pha tĩnh

HPLC bình thường

Cột được làm đầy với các hạt silica rất nhỏ, và dung môi không phân cực hexan Một cột điển hình có đường kính 4,6 mm (có thể ít hơn), và chiều dài150-250 mm

-Các hợp chất có cực trong hỗn hợp qua cột sẽ bị giữ trên cột lâu hơn so vớicác hợp chất không phân cực Những chất không phân cực do đó sẽ vượt qua cộtnhanh hơn

HPLC pha đảo

Trong trường hợp này, kích thước cột là như nhau, nhưng silica được thayđổi để làm cho nó không phân cực bằng cách gắn các chuỗi hydrocacbon lên bềmặt của nó - thường là 8 hoặc 18 nguyên tử cacbon Một dung môi phân cựcđược sử dụng - ví dụ, một hỗn hợp của nước và rượu như metanol

Điều đó có nghĩa các phân tử phân cực sẽ đi qua cột một cách nhanh chóng.Đảo ngược giai đoạn HPLC là hình thức được sử dụng phổ biến nhất củaHPLC

I.3.2.4 Detector

- Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho tín hiệu đượcghi trên sắc đồ

- Detector trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:

 Đáp ứng nhanh và lặp lại

 Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc nồng độthấp

 Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng

 Khoảng hoạt động tuyến tính rộng

 Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

Đầu dò có gắn đèn UV (thường là đèn deuterim 180-360nm) và đèn Vis(đèn tungsten, 360-800 nm) Vì vậy, các hợp phần hấp thu ánh sáng từ khoảng180- 800 nm sẽ được đầu dò phát hiện

Chất phân tích sau khi rửa giải ra khỏi cột chuyển qua một tế bào cảm biếnhình trụ Ánh sáng trong vùng UV/Vis truyền qua tế bào tới mảng quang điện.Nếu chất phân tích hấp thụ được ánh sáng ở một bước sóng nào đó, mảng quangđiện sẽ phát hiện ra sự thay đổi Tín hiệu phát ra từ mảng quang điện sẽ chuyểntới bộ khuếch đại đến bộ ghi đo và hệ thống thu dữ liệu

Diện tích hoặc chiều cao pic thu được trên sắc kí đồ tỉ lệ với nồng độ củachất phân tích theo phương trình dạng X = k.C Anilin có bước sóng hấp thụ ở

231 nm, vì vậy có thể sử dụng đầu dò UV/Vis Trong HPLC định lượng, có thểdùng UV/Vis kết hợp với ECD hoặc với MS

I.3.2.5 Bộ phận ghi tín hiệu

Gồm có máy ghi, máy tích phân, máy tính

I.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích[2].

I.3.3.1 Ảnh hưởng của pha tĩnh

Pha tĩnh là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sắc ký, với mỗi chất

sẽ phù hợp với một cột pha tĩnh riêng Pha tĩnh ảnh hưởng đến:

- Thời gian lưu của chất phân tích

- Hiệu quả tách của hỗn hợp chất

Yêu cầu của pha tĩnh

- Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký.

- Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định

- Tính chất bề mặt ổn định, đặc biệt là đặc trưng xốp của nó

- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt

- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất

I.3.3.2 Ảnh hưởng của pha động

Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất phân tích) ra khỏicột tách để thực hiện một quá trình sắc ký

Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ hay hỗn hợp của

2, 3 dung môi theo tỉ lệ nhất định Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệusuất tách sắc ký của một hỗn hợp, thời gian lưu (tR) và hiệu quả tách

Pha động và thành phần pha động ảnh hưởng đến:

Yêu cầu của pha động

- Phải trơ và không có tác dụng hóa học với pha tĩnh

- Phải hòa tan tốt được chất mẫu

- Phải bền và ổn định trong quá trình chạy sắc ký

- Phải có độ tinh khiết cao

- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

- Phù hợp với loại detector

- Phải có tính kinh tế và phù hợp với môi trường

I.3.3.3 Ảnh hưởng của tốc độ dòng

Tốc độ dòng ảnh hưởng nhiều đến thời gian lưu của chất, khi tốc độ dònglớn làm áp suất cột tăng lên, như thế làm chất phân tích bị đẩy ra sớm, việc này

gây khó khăn khi cần phân tách nhiều chất, hơn nữa nếu áp suất cột tăng cao thìlớp pha tĩnh trong cột dễ bị hỏng Vì thế, để thuận lợi cho quá trình phân tíchchất cần chọn tốc độ dòng phù hợp để chất phân tích xuất hiện trong khoảng thờigian hợp lý.

I.3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình phân tíchmẫu Nếu để nhiệt độ bên ngoài ảnh hưởng đến cột phân tích thì quá trình phântích sẽ không ổn định, ảnh hưởng đến thời gian lưu và hiệu quả tách chất Do đócần đặt điều kiện nhiệt độ cột hợp lý cho quá trình phân tích và thường là 40oC(nếu nhiệt độ cao quá có thể làm dung môi bay hơi)

I.3.4 Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động[1, 15]

Cách lựa chọn pha tĩnh và pha động thích hợp để tách được hỗn hợp chấtcần phân tích là rất quan trọng Dựa vào tính chất của mỗi pha đã nêu trên người

ta chọn pha tĩnh, pha động phù hợp nhau, chẳng hạn:

- Sắc ký pha thuận: Pha động là các dung môi hữu cơ kị nước, không phâncực hay ít phân cực Cột hay sử dụng là cột Lichrosorb Si 60

- Sắc ký pha đảo: Pha động là hệ dung môi phân cực, các dung môi tanđược trong nước, điển hình là metanol, axetonitrin, nước cất, ancol… Ngoài cácdung môi chính còn có các dung dịch đệm pH (hay sử dụng dung dịch đệmphotphat) để ổn định cho quá trình sắc ký Sắc ký pha đảo thường dùng để táchcác chất kém phân cực hoặc không phân cực Có nhiều cột để lựa chọn, loạithường sử dụng là cột ankyl hóa C8, C18 với các tên thương phẩm khác nhau Tùytheo điều kiện cơ sở và phương pháp tiến hành thí nghiệm mà người ta chọn loạicột thích hợp

Việc lựa chọn pha tĩnh và pha động phù hợp với chất phân tích có tính chấtquyết định đối với quá trình sắc ký Do đó cần lựa chọn, thay đổi sao cho phùhợp để việc phân tích đạt kết quả cao nhất Tuy nhiên cũng cần lưu ý đến chi phíkhi lựa chọn pha tĩnh và pha động

I.3.5 Cách đánh giá pic

Đánh giá diện tích pic: Để tính diện tích pic, người ta có thể dùng tích phân

kế hoặc dùng máy tính đã cài đặt sẵn trong chương trình

Đánh giá chiều cao pic: Đo chiều cao pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử

từ thấp đến trung bình

I.3.6 Ứng dụng của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)[1, 15, 16]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có rất nhiều điểm ưu việt hơn so với sắc

ký cổ điển như: độ nhạy cao, khả năng tách được nhiều loại hỗn hợp các chất,tốc độ phân tích lớn, nhanh chóng cho kết quả, tốn ít mẫu Do đó, hiện nay nóđược ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như:

- Công nghiệp hóa học, hóa dầu

- Các chất phụ gia thực phẩm, nông nghiệp, thuốc trừ sâu

I.3.6.2 Phân tích định lượng

Cơ sở của phương pháp định lượng là dựa vào sự phụ thuộc của tín hiệu đo

X = kC Trong đó X có thể là diện tích pic hoặc chiều cao pic, k là hằng sốtrong một điều kiện thực nghiệm cụ thể, C là nồng độ của anilin.

Dữ liệu thực nghiệm dùng trong định lượng là chiều cao pic hoặc diện tíchpic Chiều cao pic dễ đo tuy nhiên chỉ dùng được khi pic hẹp, cân đối Diện tíchđược dùng phổ biến và đảm bảo cho kết quả tin cậy

Các phương pháp định lượng:

 Phương pháp sử dụng một điểm chuẩn: Áp dụng khi chỉ cần phân tíchnồng độ của một mẫu Khi đã có mẫu chuẩn biết rõ nồng độ và diện tích pic thìmẫu cẫn phân tích đưa vào đo được diện tích pic rồi từ đó lấy tỉ lệ tính đượcnồng độ chất phân tích theo công thức:

Cchất phân tích = Cchất chuẩn.Schất phân tích / Schất chuẩn

 Phương pháp sử dụng đường chuẩn: Áp dụng khi cần phân tích một dãycác mẫu phân tích Sau khi xây dựng đường chuẩn bởi một dãy chất chuẩn thìtiến hành đo diện tích các mẫu phân tích rồi tính theo phương trình đường chuẩn

để tính ra nồng độ mỗi mẫu phân tích

 Phương pháp thêm chuẩn: Áp dụng khi cần phân tích một chất có nồng

độ nhỏ, không nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn thì thêm mộtlượng chất chuẩn vào mẫu phân tích để tăng nồng độ chất phân tích sao cho nồng

độ nằm trong khoảng tuyến tính Tiến hành sắc ký cả hai dung dịch mẫu phântích và mẫu thêm chất chuẩn trong cùng một điều kiện sắc ký Kết quả được tínhtoán dựa vào sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng diệntích pic

 Phương pháp sử dụng đường thêm chuẩn: Áp dụng khi cần phân tích dãychất ở nồng độ nhỏ vì khi chất có nồng độ nhỏ thì dễ bị ảnh hưởng bởi mẫu nền

do đó sử dụng đường thêm chuẩn sẽ loại được ảnh hưởng của mẫu nền, cho kếtquả phân tích tốt nhất

 Phương pháp pha loãng: Áp dụng khi chất phân tích có nồng độ quá lớn,nồng độ chất phân tích không nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn, khi

đó cần pha loãng dung dịch phân tích theo hệ số pha loãng để giảm nồng độ chấtphân tích Tiến hành phân tích sắc ký rồi tính toán ra lượng chất ban đầu.

 Phương pháp tính theo phần trăm diện tích pic: Hàm lượng phần trămcủa các chất cần phân tích trong mẫu thử được tính bằng phần trăm diện tích piccủa nó so với tổng diện tích tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ Phươngpháp này chỉ đúng khi có sự đáp ứng của detector trên các chất là như nhau, nếukhông như nhau có thể được cải thiện bằng sử dụng hệ số đáp ứng hiệu chỉnh

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM

II.1 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM

Với mục tiêu xác định các điều kiện tối ưu để xây dựng quy trình phân tíchhàm lượng anilin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và bướcđầu ứng dụng phân tích anilin trong nước thải Trong khóa luận này, các nộidung sau được tiến hành:

- Khảo sát các điều kiên tối ưu cho việc xác định anilin trên máy HPLCbao gồm: lựa chọn cột, bước sóng hấp thụ cực đại, tỉ lệ pha động, tốc độ dòng,nhiệt độ

- Xây dựng đường chuẩn

- Metanol – hóa chất tinh khiết của Merck (Đức)

- Các dung dịch đều được pha bằng nước cất 2 lần

II.2.2 Dụng cụ và thiết bị

II.2.2.1 Dụng cụ

- Các dụng cụ thủy tinh như: cốc, bình định mức, pipet, …

- Micro pipet loại 200 l và 1000 l

- Bộ lọc hút chân không để lọc dung dịch mẫu thực với màng lọc loại cóđường kính lỗ màng lọc 0,45 m

II.3 NỘI DUNG THỰC NGHIỆM

II.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu

Nguyên tắc của việc khảo sát này là khi muốn khảo sát yếu tố nào thì ta sẽgiữ cố định các yếu tố còn lại Sau đó, căn cứ vào kết quả thu được ta sẽ lựachọn điều kiện tối ưu nhất của từng yếu tố, với mỗi điều kiện khảo sát được ta sẽ

cố định lại và dùng điều kiện đó để khảo sát các yếu tố tiếp theo

Các phép phân tích trên đều được thực hiện với một dung dịch chuẩn duynhất, nghĩa là nồng độ của dung dịch đo là như nhau Thời gian của một lần đo là

15 phút, lượng dung dịch mẫu bơm vào là 10µl cho một lần đo

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 0,0460 gam chất chuẩn anilin cho vào

bình định mức 100 ml, thêm nước cất và lắc, sau đó định mức đến vạch địnhmức Tiếp tục pha loãng bằng cách dùng pipet 25 ml để lấy chính xác 25 mldung dịch đã pha cho vào bình một định mức 100 ml khác, thêm nước, lắc đều

và định mức đến vạch định mức Ta được dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1150g/l

Tiêu chuẩn chọn điều kiện tối ưu: Điều kiện được chọn là điều kiện tối ưu

nếu đảm bảo các yếu tố sau:

- Thời gian lưu phù hợp: Thời gian lưu của chất là khoảng thời gian được

tính từ thời điểm mẫu được bơm đến thời điểm sắc ký đồ hiển thị cao nhất Các

hợp chất khác nhau có thời gian lưu khác nhau Đối với một hợp chất, thời

gian lưu giữ sẽ khác nhau tùy thuộc vào:

+ Tốc độ dòng

+ Tính chất của pha tĩnh

+ Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

+ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

+ Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động

Trong một phép phân tích nếu thời gian lưu nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếuthời gian lưu quá lớn dẫn đến thời gian phân tích rất dài gây mất thời gian đồng

thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất,… Để thay đổithời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên đã trình bày, cụ thể ở đây là tốc độdòng và tỉ lệ dung môi Điều đó có nghĩa là để xác định thời gian lưu của chất thìphải thống nhất các điều kiện trên như nhau ở các lần đo khác nhau Từ đó, ta kếtluận ở các điều kiện này thì chất có thời gian lưu tương ứng Nói chung, trong mộtphép phân tích thì thời gian lưu phù hợp là từ 3 đến 7 phút.

- Pic thu được cân đối, chân pic hẹp, chiều cao và diện tích lớn nhất

Cụ thể, ta sẽ tiến hành khảo sát từng điều kiện như sau:

II.3.1.1 Lựa chọn cột sắc kí

Anilin là chất kém phân cực sẽ dễ phân bố trên pha tĩnh kém phân cực Dovậy, ta lựa chọn kiểu sắc ký pha đảo với cột ODS C-18 để tiến hành các phépphân tích Sau đó, em tiến hành khảo sát các yếu tố như: tỉ lệ dung môi, tốc độdòng, bước sóng cực đại,

II.3.1.2 Chọn bước sóng

Anilin hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại, vì vậy để xác định bước sóng cựcđại, độ hấp thụ quang của anilin được khảo sát trong vùng bước sóng từ 180 nmđến 400 nm Trong phép đo này, các thông số của các thành phần khác được giữ

cố định và tiến hành quét bước sóng Tiến hành đo với dung dịch chuẩn ở mộtđiều kiện ngẫu nhiên để xuất hiện pic anilin và đợi khi pic gần lên tới đỉnh caonhất, ta tiến hành quét bước sóng trong khoảng từ 180 nm đến 400 nm Sau đó tiếnhành quét để xác định phổ UV của anilin Từ phổ UV thu được, tiến hành đo ởcác cực đại hấp thụ khác nhau Phân tích, so sánh các pic thu được để chọn bướcsóng tối ưu, ứng với sự hấp thụ là cực đại

II.3.1.3 Khảo sát thành phần pha động và tỉ lệ pha động

Nguyên tắc để lựa chọn pha động sao cho phù hợp với chất cần phân tích đó

là pha động phải có ái lực với pha tĩnh nhỏ hơn bất kỳ cấu tử nào cần tách trongmẫu Khi đó, các cấu tử cần tách di chuyển với tốc độ chậm hơn so với chất rửa

giải Chất nào có ái lực càng cao với pha tĩnh thì bị giữ lại trên cột tức là dichuyển càng chậm qua cột.

Dựa vào cấu trúc hóa học của anilin ta thấy đây là một chất kém phân cực,cột sắc ký sử dụng trong máy HPLC là cột C18 kém phân cực Có nghĩa là anilin

có ái lực tốt đối với pha tĩnh do đó ta cần chọn thành phần pha động tương đốiphân cực để tăng khả năng rửa giải Mặt khác, nếu thành phần pha động kémphân cực thì chất được chạy qua cột rất chậm, thời gian lưu dài, tốn dung môi,chân pic cũng không cân đối và gọn do chất bị đẩy ra chậm và việc tăng độ nhớtlàm tăng áp suất trong cột Nhưng nếu pha động mà kém phân cực thì khả năngrửa giải nhanh, chất bị đẩy ra sớm và quan trọng là không xác định được sự cómặt của chất trong dung dịch

Ở đây ta sử dụng phương pháp HPLC pha đảo để thực hiện các phép phântích, với HPLC pha đảo, pha động thông dụng nhất là axetonitrin, metanol, nướchay hỗn hợp của axetonitrin (metanol) với nước hoặc với đệm photphat Tùytheo bản chất của chất cần phân tích mà lựa chọn thành phần dung môi cho phùhợp Với anilin, không cần dùng thêm axetonitrin vì bản thân anilin khá phù hợpvới phương pháp HPLC, do anilin là chất rất kém phân cực nên không cần dùngthêm dung môi axetonitrin để tách nó khỏi dung môi phân cực nữa, như vậy vừahạn chế lượng chất thải độc hại ra môi trường lại vừa tiết kiệm được chi phí vìdung môi axetonitrin tương đối đắt tiền Anilin là một bazơ yếu (pKa = 4,6) dovậy cân bằng chuyển dịch về phía ra OH- là không đáng kể, do đó không cầndùng hệ đệm để duy trì pH cho dung dịch anilin

Từ những phân tích trên, em chọn thành phần dung môi pha động bao gồm:metanol và nước cất Nhưng do anilin là chất kém phân cực nên khả năng hòatan vào dung môi kém phân cực sẽ tốt hơn vì thế để anilin không bị giữ trong cộtlâu thì pha động sẽ chứa nhiều metanol hơn Do đó ta tập trung khảo sát những tỉ

lệ mà metanol lớn hơn 50% Tiến hành đo với dung dịch chuẩn ở bước sóng đãchọn, cố định tốc độ dòng, nhiệt độ, thay đổi tỉ lệ pha động theo bảng sau:

Tiến hành đo với dung dịch chuẩn C = 0,1150 (g/l) ở bước sóng hấp thụ cựcđại đã chọn, cố định thành phần và tỉ lệ pha động, nhiệt độ, thay đổi tốc độ dòng

ở các điều kiện sau: 0,25 ml/phút; 0,50 ml/phút và 0,75 ml/phút Từ đó lựa chọnđiều kiện tốc độ dòng sao cho pic cân đối, diện tích và chiều cao lớn nhất, thờigian lưu phù hợp

II.3.1.5 Khảo sát nhiệt độ cột

Nhiệt độ góp phần không nhỏ vào hiệu quả của một phép phân tích bằngHPLC Thông thường, để tăng hiệu quả tách, tăng khả năng di chuyển và rửa giảicủa dung môi thì nhiệt độ cột được nâng cao hơn nhiệt độ phòng Đồng thời

nhiệt độ cột được giữ ổn định trong suốt quá trình phân tích Vì nếu để nhiệt độbên ngoài ảnh hưởng đến cột phân tích thì quá trình phân tích sẽ không ổn định,ảnh hưởng đến thời gian lưu và hiệu quả tách chất Tuy nhiên, nhiệt độ cột cũngkhông nên để quá cao (thường nhỏ hơn 60oC) vì có thể làm dung môi bay hơi vàảnh hưởng đên độ bền của hệ thống Do đó cần đặt điều kiện nhiệt độ cột hợp lýcho quá trình phân tích và thường là 40oC.

Từ những phân tích trên, ta tiến hành khảo sát tại các nhiệt độ: 30oC, 40oC

và 50 oC Tiến hành đo với dung dịch chuẩn C = 0,1150 (g/l) ở bước sóng hấpthụ cực đại, cố định các điều kiện đã chọn, lần lượt thay đổi nhiệt độ của mỗiphép đo Từ đó ta lựa chọn điều kiện nhiệt độ sao cho pic cân đối, diện tích vàchiều cao lớn nhất, thời gian lưu phù hợp

Kết luận: Sau khi khảo sát để thu được điều kiện tối ưu cho tất cả các yếu

tố, ta cố định các điều kiện đo và tiến hành xây dựng đường chuẩn cũng như phân tích hàm lượng anilin theo các điều kiện này.

II.3.2 Xây dựng đường chuẩn

II.3.2.1 Xây dựng đường chuẩn

Chuẩn bị một dãy gồm các dung dịch có nồng độ tăng dần từ 1,9531×10-4 g/

l, đến 4,0000×10-1 g/l bằng cách pha loãng từ dung dịch anilin gốc có nồng độ4,0000×10-1 g/l Dung dịch anilin gốc có nồng độ 4,0000×10-1 g/l được chuẩn bịnhư sau: Cân chính xác 0,0400 gam anilin, hòa tan bằng nước cất trong cốc thủytinh dung tích 20 ml, sau đó chuyển toàn bộ vào bình định mức 100 ml, địnhmức bằng nước cất 2 lần tới vạch định mức ta thu được dung dịch anilin gốc cóđược nồng độ C0 = 4,0000.10-1 g/l

Từ dung dịch gốc đó, ta pha loãng 2 lần để được dung dịch nồng độ 2,0000

×10-1 g/l, tiến hành lần lượt như vậy ta thu được dãy các dung dịch có nồng độgiảm dần đi 2 lần Chọn các dung dịch sau để đo và xây dựng đường chuẩn: C1 =2,0000.10-1 g/l, C2 = 1,0000.10-1 g/l, C3 = 2,5000.10-2 g/l, C4 = 1,2500.10-2 g/l,