THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH NHẬN DẠNG 10 týp KHÁNG NGUYÊN PHẾ cầu TRONG vắc XIN SYNFLORIX™

Vắc xin là chế phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật, được làm mất khả năng gây bệnh hoặc từ vật liệu sinh học không phải vi sinh vật nhưng có khả năng kích thích sự hình thành miễn dịch đặc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOVIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

──────*****──────

LÊ THỊ HÒA

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH NHẬN DẠNG 10 TÝP KHÁNG NGUYÊN PHẾ CẦU TRONG VẮC XIN

SYNFLORIX™

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOVIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

──────*****──────

LÊ THỊ HÒA

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH NHẬN DẠNG 10 TÝP KHÁNG NGUYÊN PHẾ CẦU TRONG VẮC XIN SYNFLORIX™

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Văn Hùng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Luận văn “Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™” là công trình nghiên cứu

của cá nhân tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Phạm Văn Hùng Các nội dung nghiên cứu và kết quả được trình bày trong luận văn là trung thực và

Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên

hướng dẫn: TS Phạm Văn Hùng, Phó viện trưởng Viện Kiểm định Quốc gia

Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tận tình hướng dẫn và truyền dạy nhiều kiến thức quý báu đồng thời luôn động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo và các đồng nghiệp tại Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật-Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã giúp đỡ, chia sẻ và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức bổ ích trong quá trình tôi học tập tại Viện.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các anh, chị đồng nghiệp Khoa Quản lý chất lượng Viện kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế đã luôn động viên, chia sẻ và hỗ trợ công việc để tôi có điều kiện học tập và thực hiện tốt đề tài nghiên cứu và luận văn này

Nhân dịp này tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ban Lãnh đạo Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, Ths Lưu Anh Thư và các đồng nghiệp Khoa Kiểm định vắc xin Vi khuẩn, phòng Tổ chức cán bộ, phòng Khoa học và Đào tạo đã luôn hỗ trợ và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, làm việc để tôi hoàn thành luận văn này

Đặc biệt, tôi xin dành những tình cảm thân thương nhất gửi tới gia đình của tôi, những người đã luôn bên tôi, ủng hộ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Xin trân trọng cảm ơn !

Học viên

Lê Thị Hòa

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BSA Bovine Serum Albumin Huyết thanh bào thai bê

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent

assay

Phương pháp miễn dịch gắn Enzyme

GMP Good Manufacturing Practice Thực hành sản xuất tốt

GSK Glaxo Smith Kline

ICH International Conference on

Harmonization

Hiệp hội quốc tế về hài hòa

kỹ thuật về Dược phẩmIEC International Electrotechnical

Commission

Ủy ban kỹ thuật điện quốc tế

ISO International Organization for

Standardization Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế

LAL Limulusamoebocyte lysate

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

SOP Standard Operating Procedure Qui trình chuẩn

NICVB National Institute for Control of

Vaccine and Biologicals

Viện kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế

NTHi Non-typeable H influenzae Haemophilus influenza

không định týp

TRS Technical Report Series Báo cáo kỹ thuật

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

USP United States of Pharmacopeia Dược điển Mỹ

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Phế cầu khuẩn và một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn 4

1.1.1 Phế cầu khuẩn 4

1.1.2 Một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn 7

1.2 Vắc xin phế cầu và vắc xin Synflorix™ 7

1.2.1 Vắc xin phế cầu 7

1.2.2 Vắc xin Synflorix™ 10

1.3 Phương pháp phân tích miễn dịch sử dụng emzym đánh dấu (ELISA) 15

1.3.1 Nguyên lý chung 15

1.3.2 Một số phương pháp ELISA 15

1.4 Thẩm định quy trình 18

1.4.1 Định nghĩa thẩm định quy trình 18

1.4.2 Phân loại thẩm định quy trình 19

1.4.3 Các thông số trong thẩm định quy trình 23

1.5 Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin SynflorixTM bằng phương pháp ELISA 26

1.5.1.Quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin SynflorixTM bằng phương pháp ELISA 26

1.5.2 Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin SynflorixTM bằng phương pháp ELISA 29

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.2 Vật liệu nghiên cứu 31

2.3 Phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 Thiết kế thử nghiệm 32

2.3.2 Cỡ mẫu 33

2.3.3 Xây dựng quy trình thẩm định cho từng thông số và tiêu chuẩn chấp thuận của từng thông số cần thẩm định 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 36

3.1 Giới hạn phát hiện 36

3.2 Độ mạnh 42

3.3 Độ đặc hiệu 46

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 57

4.1 Giới hạn phát hiện 57

4.2 Độ mạnh 58

4.3 Độ đặc hiệu 58

KẾT LUẬN 60

KIẾN NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

.65

PHỤ LỤC 65

Bảng 1 1 Thành phần týp kháng nguyên phế cầu của vắc xin

Synflorix™ 11

Bảng 1.2 Các thông số dùng trong thẩm định toàn phần 20

Bảng 1.3 Các thông số dùng trong thẩm định một phần 21

Bảng 1.4 Các thông số dùng trong tái thẩm định 21

Bảng 1.5 Các thông số dùng trong thẩm định 26

Bảng 2.1 Mẫu chuẩn, hóa chất sử dụng cho thí nghiệm 31

Bảng 2.2 Dụng cụ, thiết bị sử dụng cho thí nghiệm 32

Bảng 3.1 Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 1 qua 6 lần thử nghiệm 36

Bảng 3.2 Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 4 qua 6 lần thử nghiệm 37

Bảng 3.3 Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 7F qua 6 lần thử nghiệm 37

Bảng 3.4 Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 14 qua 6 lần thử nghiệm 38

Bảng 3.5 Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 19F qua 6 lần thử nghiệm 39

Bảng 3.6 Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên

qua 6 lần thử nghiệm 39 Bảng 3.7 Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên

qua 6 lần thử nghiệm 40 Bảng 3.8 Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên

qua 6 lần thử nghiệm 40 Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên

qua 6 lần thử nghiệm 41 Bảng 3.10 Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên

qua 6 lần thử nghiệm 42 Bảng 3.11 Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng 10 kháng nguyên phế cầu 43 Bảng 3.12 Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng 10 kháng nguyên do 2 người thực hiện 45 Bảng 3.13 Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 1 của

3 mẫu thử 47 Bảng 3.14 Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 4 của

3 mẫu thử 48 Bảng 3.15 Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 7F

Bảng 3.16 Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 14 của

3 mẫu thử 49 Bảng 3.17 Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 19F của 3 mẫu thử 51 Bảng 3.18 Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng týp 5 của 3 mẫu thử 51 Bảng 3.19 Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 9V của 3 mẫu thử 52 Bảng 3.20 Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 18C của 3 mẫu thử 53 Bảng 3.21 Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 6B của 3 mẫu thử 54 Bảng 3.22 Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 23F của 3 mẫu thử 56 Bảng 4 1 Giới hạn phát hiện của từng týp kháng nguyên phế cầu 57

DANH MỤC HÌNH ẢNH

ĐẶT VẤN ĐỀ

Có thể tổng kết trong suốt hai thế kỷ vừa qua, với sự phát minh của Bác

sỹ người Anh E Jenner ra chủng đậu bò dùng phòng ngừa dịch đậu mùa vào cuối Thế kỷ 18 Từ nền tảng khoa học đó suốt giai đoạn 1857-1885 nhà bác học thiên tài người Pháp L Pasteur trở thành “Ông tổ” của ngành Vi sinh vật

và cũng là người đầu tiên chế tạo ra vắc xin phòng bệnh than, bệnh dại và nhiều vắc xin khác tạo ra một trường phái riêng về sử dụng vắc xin phòng bệnh truyền nhiễm tồn tại cho tới ngày nay [5] Vì vậy, hiện nay Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã công nhận và khuyến cáo trên toàn cầu rằng tiêm phòng vắc xin là phương thức bảo vệ hiệu quả nhất giúp nhân loại tránh được các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho cộng đồng

Khoa học công nghệ ngày càng phát triển trong các lĩnh vực vi sinh, miễn dịch, sinh học phân tử, di truyền, hóa, lý, tin học và công nghệ nano, peptid, gene và protein đã hỗ trợ đắc lực cho công cuộc nghiên cứu và sản xuất ra nhiều loại vắc xin an toàn, hiệu quả và tiện lợi sử dụng hơn Vắc xin học cũng đã tiếp cận sang nhiều lĩnh vực mới như bệnh dị ứng, bệnh xã hội, các bệnh nan y (ung thư, HIV/AIDS), bệnh ký sinh trùng (sốt rét) và đạt nhiều thành quả đáng kể

Vắc xin là chế phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật, được làm mất khả năng gây bệnh hoặc từ vật liệu sinh học không phải vi sinh vật nhưng có khả năng kích thích sự hình thành miễn dịch đặc hiệu để chống đỡ các mầm bệnh tương ứng hoặc được dùng với mục đích khác, vắc xin dùng để bảo vệ cho toàn thể cộng đồng người [6],[7]; Vì vậy việc kiểm soát chất lượng vắc xin trước và trong quá trình sử dụng, bảo quản là đặc biệt quan trọng và phải tuân thủ theo các yêu cầu khắt khe theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cũng như tiêu chuẩn của Dược điển của các quốc gia, khu vực toàn

cầu Theo qui định chung, tất cả các loạt vắc xin và sinh phẩm y tế trước khi cấp phép xuất xưởng để sử dụng với mục đích phòng bệnh đều phải được kiểm định nghiêm ngặt về chất lượng với các tiêu chí như: tính chất vật lý, an toàn, nhận dạng đặc hiệu, công hiệu, vô trùng, chất gây sốt, và các đặc tính về hoá lý [19].

Một trong các loại vắc xin công nghệ mới được sử dụng hiện nay là vắc xin SynflorixTM phòng bệnh do phế cầu (Streptocuccus Pneumoniae) gây ra

như: Viêm phổi, nhiễm trùng máu, viêm màng não đã được nghiên cứu và sử dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới và đã làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong Vắc xin Synflorix™ là một vắc xin Polysaccharide cộng hợp với Protein D của

Haemophilus influenzae không định týp (NTHi) và giải độc tố Bạch hầu và

Uốn ván, hấp phụ với nhôm phosphate, giúp bảo vệ trẻ nhỏ phòng được các bệnh gây bởi 10 týp kháng nguyên phế cầu (1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F) [26] Khoảng 40% quốc gia và lãnh thổ áp dụng chương trình tiêm chủng mở rộng vắc xin cộng hợp phế cầu (PCV) đang sử dụng vắc xin Synflorix™ Tại Việt Nam, Synflorix™ là vắc xin được nhập khẩu từ nhà sản xuất GSK Để đảm bảo tính an toàn cho người sử dụng, việc đảm bảo chất lượng vắc xin là rất quan trọng Quy trình kiểm định chất lượng vắc xin gồm rất nhiều chỉ tiêu, trong đó thử nghiệm nhận dạng là một trong những chỉ tiêu quan trọng; Tuy nhiên thử nghiệm nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™ chưa được thẩm định và chưa được xác nhận giá trị

sử dụng theo tiêu chuẩn của ISO 17025, theo tổ chức Y tế thế giới Chính vì vậy, với mục đích sử dụng quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên chứa trong vắc xin Synflorix™ áp dụng tại phòng kiểm định của NICVB Chúng

tôi tiến hành đề tài “Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™”.

Với mục tiêu cụ thể như sau:

1 Đánh giá độ mạnh của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™

2 Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™.

3 Giới hạn phát hiện của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Phế cầu khuẩn và một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn

1.1.1 Phế cầu khuẩn

Hình thái:

Phế cầu-Streptococcus pneumoniae là thành viên phổ biến của hệ vi

khuẩn chí vùng hầu họng, nhưng cũng là một tác nhân chủ yếu của viêm phổi

và viêm màng não ở trẻ em và người lớn [40]

S pneumoniae còn được gọi là Diplococcus pneumoniae hoặc pneumococcus (phế cầu khuẩn) là một tác nhân gây bệnh ở người được phân

lập đầu tiên ở Pháp bởi LouisPasteur năm 1880 từ mủ apxe Năm 1883, Talamon (Pháp) phát hiện được phế cầu khuẩn trong đờm, trong máu và trong khối viêm phổi gan hóa của bệnh nhân và mô tả nó Vai trò của phế cầu gây viêm màng não cấp đã được Netter phát hiện vào năm 1909 khi quan sát thấy hội chứng nhiễm trùng thần kinh trung ương ở một số người bệnh có triệu chứng viêm phổi nặng [40]

Các chủng phế cầu khác nhau có thể được phân biệt nhờ vào cấu trúc kháng nguyên của lớp vỏ polysaccharide bao bọc bên ngoài tế bào Lớp vỏ polysaccharide tạo nên 1 trong những đặc tính của vi khuẩn khi phát triển trên môi trường nuôi cấy nhân tạo

+ Pneumococcus dạng S (smooth) có bề mặt khuẩn lạc nhẵn, tròn, kích

thước 1mm, mặt bóng hơi lõm được tạo nên bởi những vi khuẩn có vỏ và có khả năng gây bệnh

+ Pneumococcus dạng R (rough) là những phế cầu bị mất vỏ

khuẩn hoặc nuôi cấy trong một thời gian dài), tạo nên những khuẩn lạc có bề mặt sần, bờ không đều, mặt gồ ghề, khô những phế cầu này ít có khả năng gây bệnh [40].

Dạng S có thể biến thành dạng R, mất vỏ và mất khả năng gây bệnh Ngược lại dạng R có thể biến thành dạng S khi cho vào môi trường nuôi cấy chất ADN của dạng S

Trên môi trường thạch máu 5% (cừu, thỏ), khuẩn lạc tròn bóng ướt do

vi khuẩn [40]

Phế cầu - Streptococcus pneumoniae là những cầu khuẩn dạng ngọn

nến, thường xếp đôi, đường kính khoảng 0,5 – 1,25 μm; là vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào; trong bệnh phẩm hay môi trường chứa nhiều albumin thì có vỏ [1],[9]

Hình 1 1 Hình thái của phế cầu Streptococcus pneumonia sau khi nhuộm Gram dưới

kính hiển vi

Tính chất nuôi cấy:

Vi khuẩn phế cầu phát triển thích hợp ở 370C trong điều kiện hiếu khí

và kỵ khí tùy tiện; phát triển dễ dàng trong các môi trường chứa nhiều chất

dinh dưỡng Trên thạch máu, khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, trơn trong như giọt sương, xung quanh có vòng tan máu alpha Trên môi trường nghèo dinh dưỡng, phế cầu kém phát triển, khuẩn lạc thô, nhỏ, xù xì, những khuẩn lạc có

vỏ thường lớn, hơi nhày và có màu xám nhẹ Có thể có khuẩn lạc trung gian

Phế cầu được lây nhiễm qua tiếp xúc trực tiếp với các chất tiết hô hấp

của người bệnh Vỏ của Streptococcus pneumonia là nhân tố gây bệnh chủ

yếu, vỏ phế cầu bao gồm các polysaccharide, chúng tạo thành các gel và nước trên tế bào vi khuẩn Vỏ phế cầu có tác dụng bão hòa opsonin hóa, làm vô hiệu hóa tác dụng của IgG và bổ thể Do vậy khả năng thực bào vi khuẩn bị giảm xuống và phế cầu vẫn tồn tại để gây bệnh [1],[9]

Tính chất kháng nguyên:

Vỏ Polysaccharide là cơ sở duy nhất cho sự phân loại và là yếu tố độc lực duy nhất được biết Hiện có trên 90 týp huyết thanh phế cầu khuẩn

(pneumococci) đã được nhận biết Phế cầu týp 23 gây bệnh phổ biến nhất Vỏ

của phế cầu là yếu tố độc lực quan trọng và có tính quyết định trong bệnh sinh Vỏ ức chế sự thực bào, tạo điều kiện cho vi khuẩn tồn tại, nhân lên trong

tổ chức vật chủ và sinh bệnh Vỏ kích thích tạo kháng thể đặc hiệu loài, có tính bảo vệ vật chủ thông qua việc tăng khả năng thực bào, giết vi khuẩn ngay

Phức hợp Polysaccharide vỏ phế cầu có thành phần là: glucose, acetamido-2, 4, 6-trideoxy galactose, galactosamine, ribitolphosphate và cholinphosphate [43].

2-1.1.2 Một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn

Phế cầu gây ra các bệnh lý xâm lấn nghiêm trọng như viêm màng não, nhiễm trùng huyết, viêm phổi, viêm xoang và những bệnh không xâm lấn thông thường như viêm tai giữa [23]

Hình 1.2 Hình ảnh một số bệnh gây bởi phế cầu Streptococcus pneumonia

1.2 Vắc xin phế cầu và vắc xin Synflorix™

1.2.1 Vắc xin phế cầu

Theo tổ chức Y tế Thế giới, ước lượng hàng năm có khoảng 476.000 trường hợp tử vong do bệnh phế cầu ở trẻ em dưới 5 tuổi [38]

Nhiễm phế cầu là nguyên nhân chính gây tử vong và gánh nặng bệnh tật ở trẻ

em trên toàn thế giới đặc biệt là các nước đang phát triển [14] Ở Việt Nam tỷ

lệ mắc phải bệnh phế cầu xâm lấn được ước tính ít nhất là: 48,7 ca/100.000 trẻ em dưới 5 tuổi theo nghiên cứu trước đây được tiến hành tại tỉnh Khánh Hòa năm 2005-2006 [13] Các týp kháng nguyên phế cầu phổ biến nhất được phát hiện ở trẻ dưới 5 tuổi tại Hà nội giữa những năm 1997-1999 là: các týp 23F, 19F,6B và 14 [15] Theo một nghiên cứu hồi cứu vào năm 2008-2009 sự phân bố các týp kháng nguyên tương tự được quan sát ở những người Việt Nam mắc bệnh ở tất cả các lứa tuổi cho thấy các týp kháng nguyên phế cầu chủ yếu là các týp: 19F, 23F, 14,11 và 6B [22]

Do phế cầu thường lây theo đường hô hấp nên việc phòng bệnh không đặc hiệu rất khó khăn [18]

Phòng bệnh đặc hiệu đã được sử dụng ở một số nước bằng vắc xin polysaccharide của vỏ phế cầu Trên thế giới, có rất nhiều sản phẩm thương mại vắc xin phòng bệnh gây ra bởi phế cầu: Synflorix™ (GSK), Pneumo 23 (Sanofi Pasteur), Prevenar (Phzer) [18]

Có 2 loại vắc xin phế cầu: vắc xin vỏ polysaccharide phế cầu và vắc xin phế cầu cộng hợp [18]

Vắc xin vỏ polysaccharide phế cầu (PPV – Pneumococcal polysaccharide vaccine) được cấp phép sử dụng từ năm 1977 Những vắc xin này gây ra được miễn dịch nhớ, nhưng với trẻ em dưới 2 tuổi lại không tạo đáp ứng miễn dịch [30] Vắc xin Pneumo 23 do hãng Sanofi Pasteur sản xuất là vắc xin polysaccharide vỏ phế cầu, chứa 23 týp kháng nguyên: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17, 18C, 19A, 19, 20, 22F, 23F, 33F Vắc xin này được sử dụng cho người trên 2 tuổi có nguy cơ cao nhiễm phế cầu: người già trên 65 tuổi, người bị HIV, người giảm đáp ứng miễn dịch, người nghiện rượu, nghiện thuốc lá [18], đang được lưu hành trên thị trường Việt Nam

Hình 1 3 Hình ảnh của vắc xin vỏ phế cầu Pneumo 23

Vắc xin phế cầu cộng hợp (PCV – Pneumococcal conjugate vaccine)

gồm các polysaccharide của vỏ vi khuẩn Streptococcus pnemoniae được cộng

hợp với protein mang Bằng việc sử dụng công nghệ cộng hợp, kháng nguyên polysaccharide làm cho tế bào T đáp ứng miễn dịch, khả dụng đối với trẻ nhỏ Khác với vắc xin polysaccharide vỏ phế cầu, PCV bảo vệ được trẻ dưới 2 tuổi PCV phòng được các bệnh phế cầu nặng như: Viêm màng não, viêm phổi, nhiễm trùng huyết, viêm tai giữa PCV không bảo vệ được trong trường hợp bệnh gây bởi loại kháng nguyên khác, hoặc các týp kháng nguyên không có trong vắc xin PCV Vắc xin cộng hợp đầu tiên Prevnar 7 gồm 7 týp kháng nguyên (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F và 23F) được cộng hợp với protein CRM197 đã được cho phép sử dụng tại EU (2001) cho trẻ từ 2 tháng tuổi Hai loại vắc xin thế hệ sau được sử dụng từ năm 2009 là Synflorix™ gồm 10 týp kháng nguyên (1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F) và Prevnar 13 gồm 13 týp kháng nguyên (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, and 23F) [17],[18]

1.2.2 Vắc xin Synflorix™

1.2.2.1 Đặc điểm vắc xin Synflorix™

Vắc xin Synflorix là vắc xin phế cầu cộng hợp, hấp phụ, gồm các vỏ

polysaccharide (PS) của 10 týp kháng nguyên phế cầu S pneumoniae: 1, 4 , 5,

6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F và 23F, được cộng hợp với một protein mang (carrier protein – CP): protein D – protein bề mặt tế bào của vi khuẩn không

điển hình Haemophilus influenzae (PD), giải độc tố uốn ván (tetanus toxoid -

TT), giải độc tố bạch hầu (diphtheria toxoid – DT)

Hình 1 4 Hình ảnh của vắc xin phế cầu cộng hợp Synflorix ™

Vắc xin Synflorix™ là vắc xin dạng lỏng, không chứa chất bảo quản, được hồi chỉnh bằng nhôm phosphate, được trình bày dưới dạng liều đơn (0,5

ml, chứa trong sylanh Vắc xin này được tiêm bằng đường tiêm bắp, đang lưu hành trên thị trường Việt Nam

Dưới đây là bảng thành phần các týp kháng nguyên phế cầu cho 1 liều đơn dành cho người (0,5 ml) của vắc xin Synflorix™, vắc xin này được pha theo tỉ lệ hàm lượng polysaccharide và hàm lượng protein mang, do các týp kháng nguyên là khác nhau nên tỉ lệ trên cũng khác nhau

Bảng 1 1 Thành phần týp kháng nguyên phế cầu của vắc xin Synflorix™

với protein mang

Hàm lượng của từng týp (μg/ml)

1.2.2.2 Tóm tắt quy trình sản xuất vắc xin phế cầu Synflorix™

Chủng làm việc tương ứng với từng týp huyết thanh

Hoạt hóa, nuôi cấy

Gặt vi khuẩn

Tách, thu polysaccharide

Tinh chế polysaccharide

Cộng hợp với protein mang

Thêm nhôm phosphate

Phối trộn với các týp khác

AlPO 4→ ← NaCl Bán thành phẩm cuối cùng

Đóng lọ

(vắc xin thành phẩm)

Hình 1 5 Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất vắc xin Synflorix™

1.2.2.3 Kiểm định chất lượng vắc xin phế cầu Synflorix™

Yêu cầu chung:

Trong sản xuất vắc xin Synflorix™ việc kiểm tra đánh giá, chất lượng

là rất quan trọng Thứ nhất, sản phẩm phải đủ an toàn để dùng cho người Thứ hai, vắc xin synflorix™ là sản phẩm có nguồn gốc từ vỏ polysaccharide của phế cầu khuẩn thông qua quá trình hoạt hóa, nuôi cấy, gặt, tách, thu, tinh chế polysaccharide, cộng hợp với protein mang và phối trộn các týp với nhau sau

đó thêm các tá dược và sản xuất thành vắc xin thành phẩm, sau khi sản xuất xong điều quan trọng mà ta cần quan tâm đến đầu tiên đó chính là xem trong vắc xin có chứa 10 týp kháng nguyên của phế cầu khuẩn hay không Do đó, việc kiểm tra nhận dạng kháng nguyên trong vắc xin synflorix™ phải được thực hiện trong từng loạt sản xuất và ở từng công đoạn (từ nguyên liệu đầu đến bán thành phẩm và thành phẩm cuối cùng)

Việc đảm bảo chất lượng sản phẩm là một công việc phức tạp bắt đầu

từ công việc kiểm định nguồn nguyên liệu đầu, giám sát qui trình sản xuất và tuân theo thực hành sản xuất tốt (Good Manufacturing Practice, GMP) một cách nghiêm ngặt để xuất xưởng sản phẩm có chất lượng tốt Việc kiểm tra đánh giá chất lượng vắc xin và sinh phẩm đòi hỏi tính khách quan và chính xác, tuân thủ chặt chẽ các qui trình, các phương pháp, kỹ thuật của WHO và Kiểm định quốc gia qui định nhằm đảm bảo độ chính xác cao [28]

Chất lượng của vắc xin synflorix™ được đánh giá bao gồm các chỉ số về

vô khuẩn, an toàn, công hiệu, nhận dạng và các tính chất lý, hóa học Các chỉ số này cần được thực hiện theo thường qui thống nhất chung [26],[28]

Tiêu chuẩn đăng ký và tiêu chuẩn xuất xưởng của vắc xin synflorix™:

Trong phòng thí nghiệm, kiểm định chất lượng vắc xin này dựa trên các tiêu chí chính sau đây [11],[26],[28]:

+ Nhận dạng:

Sử dụng phương pháp ELISA

Tiêu chuẩn: dương tính với các huyết thanh đặc hiệu tương ứng.

+ Vô khuẩn:

Cấy trực tiếp vắc xin vào môi trường nuôi cấy phù hợp với sự phát triển của vi khuẩn và nấm Ủ môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 300C đến 350C đối với

vi khuẩn, 200C đến 250C đối với vi nấm

Tiêu chuẩn: Không có vi khuẩn và nấm mọc sau 14 ngày theo dõi

Sử dụng phương pháp LAL (Limulusamoebocyte lysate) test

Tiêu chuẩn: ≤ 12,5 IU/liều

+ Hàm lượng nhôm:

Sử dụng phương pháp so màu

Tiêu chuẩn: Hàm lượng nhôm 0,4-0,6 mg/liều

+ An toàn không đặc hiệu:

Tiêm ổ bụng 0,5 ml vắc xin vào từng 5 chuột nhắt trọng lượng 18-22 g,

5 ml vào từng 2 chuột lang trọng lượng 280 – 350 g

Tiêu chuẩn: Sau 7 ngày theo dõi, chuột khỏe manh, tăng cân và không

1.3 Phương pháp phân tích miễn dịch sử dụng emzym đánh dấu (ELISA)

1.3.1 Nguyên lý chung

ELISA (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay) được phát triển lần đầu tiên năm 1971 – 1972 do các tác giả Bauke Van Weeman vàAnton Shuurs (Hà Lan), Peter Perlmann và Eva Engvall (Thụy Điển) ELISA là phương pháp miễn dịch sử dụng chất đánh dấu là enzym [31]

Phản ứng ELISA dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ phản ứng với cơ chất tạo thành chất

có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể đã xảy ra, và thông qua cường độ màu sẽ phát hiện và xác định nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần tìm

Người ta sử dụng phiến làm bằng chất dẻo để gắn các thành phần tham gia phản ứng Những thành phần không tham gia phản ứng sẽ bị loại bỏ khi rửa phiến

Enzyme đánh dấu thường là các enzyme không làm thay đổi tính chất kháng nguyên hoặc tính kháng thể của các thành phần tham gia phản ứng (photphatase, peroxidase, )

1.3.2 Một số phương pháp ELISA

1.3.2.1 Phương pháp ELISA trực tiếp (Direct ELISA)

Thường dùng để phát hiện kháng nguyên [31]

Kháng nguyên được gắn lên pha rắn và được xác định trực tiếp bằng phản ứng kết hợp đặc hiệu với kháng thể tương ứng đã được gắn enzym và thông qua phản ứng lên màu của cơ chất

Hình 1.6 Kỹ thuật ELISA trực tiếp

1.3.2.2 Phương pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)

Khác với kỹ thuật ELISA gián tiếp, kháng nguyên gắn lên pha rắn được xác định thông qua hai yếu tố phát hiện: đầu tiên là kháng thể tương ứng (kháng thể sơ cấp) kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên; sau đó là sự kết hợp đặc hiệu của kháng thể đó với kháng kháng thể gắn enzyme (kháng thể thứ cấp) thông qua phản ứng lên màu của cơ chất Kháng thể thứ cấp có thể là kháng kháng thể hoặc Protein A [31]

Hình 1.7 Kỹ thuật ELISA gián tiếp

Hình 1.8 Kỹ thuật ELISA Sandwich

1.3.2.4 Phương pháp cạnh tranh (Competitive ELISA)

Hình 1.10 Kỹ thuật ELISA cạnh tranh

Kỹ thuật ELISA cạnh tranh rất hiệu quả cho việc định lượng với hàm lượng kháng nguyên trong mẫu với lượng nhỏ ELISA cạnh tranh sử dụng một lượng kháng nguyên cùng loại được gắn enzyme (kháng nguyên cạnh tranh) với kháng nguyên cần định lượng trong mẫu Phản ứng kết hợp đặc hiệu kháng nguyên với kháng thể tương ứng đã được cố định trên pha rắn xảy

ra Ở đây có sự cạnh tranh giữa hai loại kháng nguyên để kết hợp đặc hiệu với kháng thể Đo lượng kháng nguyên cạnh tranh này thông qua phản ứng thủy phân lên màu cơ chất bởi enzyme được liên kết với nó Kháng nguyên cạnh tranh càng hiện diện nhiều thì kháng nguyên cần xác định trong mẫu càng ít

Có rất nhiều định nghĩa về thẩm định quy trình được đưa ra bởi các tổ chức

uy tín trên thế giới, dưới đây là một số định nghĩa:

+ Theo ISO/IEC 17025: Thẩm định quy trình là việc khẳng định bằng cách kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan rằng các thông số cần xác

định cho việc sử dụng một quy trình cụ thể đã được thực hiện [4],[28]

+ Theo WHO: Là quá trình thiết lập một hoặc nhiều hơn các đặc tính: Độ đúng, độ chính xác, độ tuyến tính, vùng tuyến tính, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ mạnh phù hợp với từng phương pháp [32],[33],[35]

Việc thẩm định quy trình làm nhằm chứng minh quy trình đó có phù

khi: áp dụng một quy trình mới, áp dụng các quy trình có trong Dược điển, hoặc nếu có thay đổi lớn về quy trình thử nghiệm (thay đổi dụng cụ, trang thiết bị, công thức hoặc quy trình thực hiện)

1.4.2 Phân loại thẩm định quy trình

Có 03 loại thẩm định quy trình [10],[16],[20],[21],[37]:

Thẩm định toàn phần: là xem xét và đánh giá một cách khoa học tất cả

các thông số quy định cho quy trình này Loại thẩm định này được áp dụng khi:

+ Quy trình thực hiện theo phương pháp thử nội bộ hoặc phương pháp

cũ nhưng có một số thay đổi

+ Phát hiện sự không ổn định của quy trình đã phê duyệt

+ Quy trình có thay đổi hoặc sử dụng ngoài phạm vi so với phương pháp tiêu chuẩn

+ Quy trình thực hiện theo phương pháp do nhà sản xuất cung cấp hoặc đăng trong tạp chí khoa học Quy trình thực hiện theo phương pháp do các bộ, ngành, tổ chức kỹ thuật ban hành mà chưa có thông tin chi tiết về tính khoa học của phương pháp

Các thông số dùng trong thẩm định toàn phần:

Bảng 1.2 Các thông số dùng trong thẩm định toàn phần

Độ đúng

Độ chính xác

Độ mạnh

Tính tuyến tính

Độ đặc hiệu

thể, kết quả chỉ được biểu

hiện đạt hoặc không đạt:

cảm quan mẫu thử, kiểm tra

chất lượng môi trường…)

-Chú thích: “+”: Thông số cần đánh giá; “ – ”: Thông số không cần đánh giá

Thẩm định một phần: Xem xét và đánh giá một hay nhiều thông số cần xác

định phù hợp với quy trình Loại thẩm định này được áp dụng khi:

+ Quy trình thực hiện theo phương pháp đã có trong Dược điển

+ Quy trình thực hiện theo phương pháp đã có trong tiêu chuẩn quốc gia

Bảng 1.3 Các thông số dùng trong thẩm định một phần

Phương pháp thử

Tiêu chí thẩm định

Độ đúng

Độ chính xác

Độ mạnh

Tính tuyến tính

Độ đặc hiệu

thể, kết quả chỉ được biểu

hiện đạt hoặc không đạt:

cảm quan mẫu thử, kiểm tra

chất lượng môi trường…)

Chú thích: “+”: Thông số cần đánh giá; “ – ”: Thông số không cần đánh giá

Tái thẩm định: Được áp dụng khi quy trình đã được thẩm định có sự thay

đổi Loại thẩm định này được áp dụng khi: Thay đổi phần mềm, vị trí đặt máy, nguyên liệu đầu vào, kỹ thuật, trang thiết bị, dụng cụ

Các thông số dùng trong tái thẩm định:

Bảng 1.4 Các thông số dùng trong tái thẩm định

Phương pháp thử Tiêu chí thẩm định

Độ đúng

Độ chính xác

Độ mạnh

Tính tuyến tính

Độ đặc hiệu

thể, kết quả chỉ được biểu

hiện đạt hoặc không đạt:

cảm quan mẫu thử, kiểm tra

chất lượng môi trường…)

Chú thích: “+”: Thông số cần đánh giá; “ – ”: Thông số không cần đánh giá

Quá trình tái thẩm định có thể là toàn phần hay một phần tùy theo sự đánh giá mức độ ảnh hưởng của sự thay đổi Quy trình sau khi được thẩm định được viết thành SOP (quy trình chuẩn) để thực hiện thường qui [10],[16],[34],[38]

Điều quan trọng nhất trong quá trình thẩm định là các qui trình đó được diễn ra trong các điều kiện thực tức là mọi hoạt động diễn ra tương tự như các hoạt động thường xuyên mà qui trình đó được thực hiện trong quá trình làm

giám sát môi trường, thao tác thực hiện giống như công việc thực hàng ngày khi áp dụng qui trình cần thẩm định [33].

Tất cả các số liệu liên quan thu được trong quá trình thẩm định và các công thức được sử dụng để tính toán các đại lượng đặc trưng của việc thẩm định cần được đưa ra và thảo luận Các chất đối chiếu được sử dụng trong quá trình thẩm định cần phải được đánh giá rõ ràng và kèm theo tài liệu về độ tinh khiết Mức độ tinh khiết phụ thuộc vào mục đích sử dụng [20]

1.4.3 Các thông số trong thẩm định quy trình

- Tính đúng được tính thông qua độ chệch (bias) hoặc độ thu hồi (recovery)

1.4.3.2 Độ chính xác (Precision)

- Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả mức độ phù hợp chặt chẽ (độ phân tán) giữa một loạt các số đo thu được từ nhiều lần lấy mẫu khác nhau của cùng một mẫu đồng nhất trong những điều kiện quy định Độ chính xác phải được nghiên cứu trên các mẫu đích thực đồng nhất Tuy nhiên nếu không có được một mẫu đồng nhất có thể nghiên cứu sử dụng các mẫu tạo ra hoặc dung dịch mẫu [10],[21],[33],[34],[37]

- Độ chính xác xủa quy trình là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử nghiệm riêng rẽ Độ chính xác được đánh giá bằng độ phân tán của các kết quả thử nghiệm so với giá trị trung bình và thường được biểu thị bằng độ lệch chuẩn (standard deviation) hoặc bằng hệ số biến sai /độ lệch chuẩn tương đối (coefficient of variation/relative standard deviation) khi quy trình thử hoàn thiện được tiến hành lặp lại trên những mấu thử giống nhau, riêng biệt được

rút ra từ một lô vật liệu đồng nhất.

- Độ chính xác được chia thành 3 mức:

+ Độ lặp lại (Repeatability): Thực hiện thử nghiệm trong cùng một phòng

xét nghiệm, cùng người thao tác và sử dụng cùng một thiết bị, hóa chất, mẫu thử đồng nhất (từ khâu chuẩn bị và xử lý mẫu), trong khoảng thời gian ngắn

+ Độ chính xác trung gian (Intermediate precision): Diễn tả mức dao động

của kết quả trong cùng một phòng xét nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau hoặc các thiết bị, hóa chất khác nhau

+ Độ tái lặp (Reproducibility): Thực hiện thử nghiệm trong các phòng xét

nghiệm khác nhau, thường được áp dụng để tiêu chuẩn hóa phương pháp hoặc đánh giá năng lực một phòng thí nghiệm

- Độ chính xác là khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng

độ lệch chuẩn (Standard Deviation/SD), hệ số biến thiên (Coefficient of Variation/CV) hay độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation/ RSD) Độ chính xác càng cao thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng nhỏ 1.4.3.3 Độ tuyến tính và vùng tuyến tính (Linearity and Range)

- Độ tuyến tính của một phương pháp thử là khả năng cho các kết quả tỷ

lệ thuận với lượng chất có trong mẫu thử [10],[21],[25],[33],[34],[37]

- Vùng tuyến tính của phép thử biểu thị mức độ thấp nhất và cao nhất của chất thử có thể xác định được với độ chính xác, độ đúng và độ tuyến tính chấp nhận được

- Độ tuyến tính và vùng tuyến tính được xác định bằng cách áp dụng phương pháp thử trên một loạt mẫu thử trên một loạt mẫu thử có nồng độ chất thử trải ra trong giới hạn của phương pháp thử Khi mối quan hệ giữa kết quả

và nồng độ không tuyến tính, cần phải chuẩn hóa bằng một đường cong chuẩn

- Để xác định độ tuyến tính và vùng tuyến tính cần đưa ra các dữ liệu sau: Phương trình hồi quy đơn biến (y = ax + b) và hệ số tương quan (r)

1.4.3.4 Độ đặc hiệu (Specificity/Selectivity)

- Tính đặc hiệu là khả năng để đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi

có các thành phần khác được cho là có mặt trong chất phân tích: các tạp chất, sản phẩm phân hủy, chất nền [10],[21],[25],[33],[34],[37]

- Tính không đặc hiệu của một quy trình phân tích riêng biệt có thể khắc phục bằng các quy trình phân tích hỗ trợ

1.4.3.5 Độ mạnh (Robustness)

- Độ mạnh là khả năng của quy trình tạo ra những kết quả phân tích có

độ chính xác và độ đúng chấp nhận được trong các điều kiện khác nhau Độ mạnh xác định phạm vi ảnh hưởng của các thay đổi trong thao tác và môi trường đến các kết quả thu được từ các mẫu riêng biệt, được coi là như nhau của cùng một lô vật liệu đồng nhất nhưng vẫn phù hợp với các tiêu chuẩn đặt

1.4.3.6 Giới hạn phát hiện (LOD – Limit of Detection)

- Là lượng mẫu nhỏ nhất mà một quy trình kỹ thuật có thể phát hiện được nhưng không định lượng được giá trị thực của nó Giá trị này càng nhỏ thì quy trình (phương pháp) càng “nhạy” [10],[21],[25],[33],[34],[37]

1.4.3.7 Giới hạn định lượng (LOQ – Limit of Quantitation)

- Giới hạn định lượng là lượng nhỏ nhất trong mẫu phân tích có thể định lượng được và thoả mãn tính đúng, tính chính xác [10],[21],[25],[33],[34],[37]

- Xác định LOQ bằng cách pha loãng đến nồng độ tối thiểu có thể phát hiện được chất thử với tính đúng và tính chính xác theo yêu cầu

Tuỳ thuộc vào từng loại thử nghiệm mà áp dụng các thông số dưới đây phù hợp

Bảng 1.5 Các thông số dùng trong thẩm định

công hiệu

Xác định thành phần Định lượng Định tính

Chú thích: “+”: Thông số cần đánh giá; “ – ”: Thông số không cần đánh giá

1.5 Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix TM bằng phương pháp ELISA

1.5.1.Quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin

Synflorix TM bằng phương pháp ELISA

Được thực hiện theo phương pháp ELISA gián tiếp

Hình 1.11 Tóm tắt quy trình nhận dạng týp kháng nguyên phế cầu

1 Kháng nguyên được gắn lên phiến

2 Cố định kháng nguyên trên phiến

3 Gắn kháng thể đặc hiệu

4 Bổ sung phức hợp protein A- peroxidase, protein A này là thụ thể cho Fc của phân tử IgG (kháng thể đặc hiệu)

5 Bổ sung cơ chất, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu

Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với

kháng nguyên

1.5.1.1 Chuẩn bị mẫu và phủ phiến

Lấy mẫu thử: Hỗn 1,5 ml mẫu vắc xin

Pha loãng 10 lần mẫu thử và chứng dương bằng dung dịch đệm cacbonat 0,05M

- Nhỏ 100 µl dung dịch chứng dương đã pha loãng vào các giếng A1÷A11, B1÷B11

- Nhỏ 100 µl dung dịch mẫu thử đã pha loãng vào các giếng C1÷C11, D1÷D11

- Ủ phiến ở 37oC trong 2h

- Pha loãng các kháng thể đặc hiệu bằng dung dịch post-coating.

- Nhỏ 100 µl dung dịch post-coating vào các giếng A11 - D11

- Nhỏ 100 µl dung dịch kháng thể kháng từng týp đã pha loãng vào các giếng: