Phát hiện sớm dấu ấn sinh học chẩn đoán sớm ung thư vòm mũi họng

methyl hoá AND của EBV và Gen ức chế ung thư được cho là có liên quan đến sự hình thành, xâm lấn và di căn của nhiều loại ung thư như: U lympho Burrkit, Ung thư phổi, ung thư dạ dày và u

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo báo cáo của tổ chức ung thư quốc tế (IARC – 1903), ung thư vòm mũi họng là một trong tám loại ung thư hay gặp [Error: Reference source notfound] Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi rất khác nhau ở các quần thể dân cư và các vùng địa lý khác nhau trên thế giới Nơi có tỷ lệ ung thư vòm cao nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen, trong khi ở châu Âu lại có tỷ lệ rất thấp Các nước đông nam Á, trong đó có Việt Nam có tỷ lệ UTVMH trung bình [2] Điều đáng qua tâm là UTVMH đứng hàng đầu trong các ung thư vùng đầu, cổ và đứng hàng thứ năm trong các loại ung thư ở Việt Nam, chủ yếu gặp ở nam giới [3] Virut Epstein-Barr (EBV), các yếu tố môi trường khác và sự nhạy cảm di truyền đều được cho là liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm mũi họng và EBV là yếu tố được nghiên cứu nhiều nhất

EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô không biệt hóa [UCNT] và duy trì các thể nhiễm tiềm ẩn I hoặc II, trong đó EBV biểu lộ các gen quan trọng là EBNA1, LMP1 và LMP2 [4], [5] EBNA1 giúp duy trì bộ gen EBV trong tế bào chủ, trong khi LMP1 lại là một gen có chức năng quan trọng liên quan đến dẫn truyền tín hiệu, chống lại sự chết theo chương trình của tế bào và có khả năng sinh ung thư cho các tế bào bị nhiễm Các gen này nằm cách xa nhau trong bộ gen EBV và được biểu lộ bởi sự hoạt hóa cl,l,ác promoter khác nhau EBNA1 được biểu lộ ở các thể nhiễm tiềm ẩn nhờ sự hoạt hóa các promoter: Cp, Wp và Qp Tuy nhiên, trong ung thư vòm mũi họng hai promoter Cp và Wp không hoạt động mà chỉ có Qp điều hòa biểu lộ gen EBNA1[Error: Reference source not found] [5]

Sự điều hòa biểu lộ gen do nhiều yếu tố tham gia, trong đó sự methyl hóa của Cytosin ở các vị trí CpG của vùng promoter có vai trò quan trọng [6]

Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh sự phức tạp của ung thư ở

methyl hoá AND của EBV và Gen ức chế ung thư được cho là có liên quan đến sự hình thành, xâm lấn và di căn của nhiều loại ung thư như: U lympho Burrkit, Ung thư phổi, ung thư dạ dày và ung thư vòm mũi họng [39].

Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là một khối u biểu mô, thường phát sinh từ các hố Rosemüller, vị trí giàu mô lympho của vòm họng, và vòi Eustachian Khối u này thường phát triển từ nóc vòm họng, và ít khi xuất hiện

ở các thành phía trước và dưới của vòm họng [9] Do vị trí giải phẫu như vậy, nên UTVMH là một trong những bệnh khó được chẩn đoán ở giai đoạn sớm, khi mà các triệu chứng lâm sàng của UTVMH cũng rất nghèo nàn Bệnh nhân thường chỉ đến viện khi khối u đã phát triển và gây ra các triệu chứng như chảy nước mũi lẫn máu, khạc ra đờm lẫn máu, tắc mũi, ù tai và nghe kém; Hoặc thậm chí ở những giai đoạn muộn hơn khi các tế bào ung thư đã di căn sang các hạch bạch huyết, hoặc xâm lấn vào nền sọ làm cho bệnh nhân có thể

bị đau đầu thường xuyên [9] Khoảng 70% bệnh nhân mới được chẩn đoán UTVMH đều ở giai đoạn bệnh đang tiên triển và có tiên lượng xấu Do vậy, chẩn đoán sớm UTVMH là rất quan trọng để bệnh nhân được điều trị sớm, góp phần làm giảm tỷ lệ tử vong và nâng cao chất lượng cuộc sống Vì vậy,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phát hiện sớm dấu ấn sinh học chẩn đoán sớm ung thư vòm mũi họng”.

Đề tài dự kiến nghiên cứu với mục tiêu như sau:

1 Xác định mức độ methyl hoá ở ADN EBV tách chiết từ mẫu bệnh phẩm.

2 Xác định mức độ methyl hoá của gen ức chế ung thư RASSF1A, DAPK

và BLU ở người

3 Tìm hiểu mối tương quan giữa mức độ methyl hoá và biểu lộ gen.

Chương 1 TỔNG QUAN1.1 Tình hình ung thư vòm mũi họng trên thế giới và Việt Nam.

Ung thư vòm mũi họng (UTVMH), một khối u phát triển từ các tế bào biểu mô nằm ở vị trí cửa mũi sau và vòm họng, là loại bệnh đứng hàng đầu trong số các ung thư vùng đầu mặt cổ với tính chất dịch tễ học khá đặc biệt là liên quan tới địa lý Tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi trên thế giới có thể xếp thành 3 vùng rất khác nhau: Khu vực có tỷ lệ mắc cao nhất là miền Nam Trung Quốc

và Grơnlen với tỷ lệ mới mắc từ 30 - 40/100.000 dân/năm Ngược lại, vùng có

tỷ lệ mắc thấp gồm châu Âu, Mỹ chỉ từ 0,7 - 1/100.000 dân/ năm Còn lại là vùng có tỷ lệ mắc trung bình nhưng ngày càng có xu hướng tăng lên, đó là vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee và đông nam Á với tỷ lệ từ 8 - 12/100.000 dân

Ở Việt Nam, ung thư biểu mô vòm mũi họng là bệnh đứng hàng đầu trong các ung thư vùng đầu mặt cổ Theo ghi nhận về tình hình ung thư Hà Nội năm 1996 thì UTVMH đứng hàng thứ 5 trong các ung thư nói chung với

tỷ lệ mắc bệnh chuẩn theo tuổi là 7,4/100.000 dân và thứ 8 ở nữ với tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi là 4,7/100.000 dân Mỗi năm có khoảng 350 tới 400 bệnh nhân UTVMH được điều trị tại bệnh viện K [13]

1.2 Những yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVMH.

1.2.1 Vai trò của virut Epstein-Barr.

Cho đến nay người ta đã khẳng định UTVMH là loại ung thư liên quan gần gũi với virut Epstein Barr (EBV) [2], và là một trong các yếu tố môi trường được xem là quan trọng nhất Người ta phát hiện thấy EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô không biệt hóa (UCNT) [14], [15], [6] Ngoài ra, các sản phẩm gen của EBV là EBER, EBNA1 và LMP-1,-2 đã được xác định ở hầu hết các mẫu sinh thiết UTVMH hoặc ở tổn thương quá sản tại biểu mô vòm họng gồm những dòng tế bào tiền

ác tính nhiễm EBV [16] Điều này phù hợp với giả thuyết cho rằng EBV là một trong những yếu tố khởi phát trong cả quá trình nhiều bước dẫn đến sự phát triển của UTVMH [17].

Ngoài việc phát hiện EBV và sản phẩm của nó trong khối u vòm họng, người ta cũng xác định được các kháng thể chống EBV trong huyết thanh bệnh nhân với hiệu giá rất cao[18], [19]

Người ta cho rằng sự tái hoạt hóa, sao chép và nhân lên của EBV là hiện tượng xảy ra trong suốt quá trình phát triển của UTVMH và nó tương quan với nồng độ IgA/VCA Ở bệnh nhân UTVMH nồng độ IgA/VCA cao hơn 8 -

10 lần so với những bệnh nhân ung thư đầu mặt cổ khác hoặc người khỏe về lâm sàng [20] Đặc biệt xác định IgA/VCA (kháng nguyên vỏ của EBV) cũng

là một xét nghiệm sử dụng rộng rãi, ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam với giá trị để theo dõi và phát hiện nguy cơ mắc UTVMH, đồng thời là một dấu ấn quan trọng theo dõi tái phát sau điều trị bệnh khi nó tăng cao [20]

1.2.2 Môi trường sống và thói quen sinh hoạt

Nhiều tác giả đã đề cập đến môi trường sống như khí hậu, bụi, khói ô nhiễm liên quan đến UTVMH, nhưng được nói đến nhiều nhất là tập quán ăn uống Nhiều nghiên cứu bệnh - chứng được tiến hành đã thu được những kết quả phù hợp với ý kiến cho rằng, tập quán ăn cá mối của người Trung Quốc (vùng Quảng Đông) là nguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan này lớn hơn nếu ăn cá muối ngay từ nhỏ Dùng cá muối hàng ngày có thể làm tăng tỷ lệ UTVMH lên 1.8 đến 7.5 lần [21] Sử dụng thuốc là cây cỏ cũng liên quan đến UTVMH thông qua hoạt hóa EBV hoặc trực tiếp thông qua ảnh hưởng đến tăng trưởng đến các tế bào chuyển dạng do EBV [22] Các bằng chứng khác như hút thuốc lá hoặc dùng formadehyde có giá trị thấp trong bệnh sinh ung thư vòm họng

1.2.3 Yếu tố di truyền

Người ta thấy rằng người Trung Quốc sinh ra ở Bắc Mỹ có một tỷ lệ mắc thấp hơn so với những người sinh ra ở đất nước Trung Quốc, nhưng tỷ lệ mắc chuẩn vẫn cao hơn dân số nói chung Điều đó cho thấy rằng yếu tố di truyền

có vai trò trong bệnh sinh của UTVMH Nghiên cứu ở Trung quốc chỉ ra rằng UTVMH có mối liên quan đến HLA-A2, B14 và B46 [23] Ở Việt Nam, các kháng nguyên A11, A2, B17 và liên kết mất cân bằng A2-B17, A11- B17 có liên quan đến UTVMH [24] Việc xác định các gen khác liên quan với tính cảm thụ bệnh lý cũng đã được nghiên cứu: CYP 2E1 (chuyển hóa nitrosamine), glutathion transferase M Cơ chế tác động của chúng cho đến nay vẫn chưa được rõ ràng, song điều hiện nay đã và đang được khẳng định là

sự phát triển UTVMH là do sự phối hợp tác động của 3 yếu tố là môi trường sống, EBV và HLA

1.3 Bệnh học ung thư vòm mũi họng [20]

1.3.1 Triệu chứng lâm sàng

UTVMH là một loại ung thư biểu mô thường xuất phát từ hố Rosemuller, một vùng vòm mũi họng giàu mô lympho và các đệm Eustachian Ung thư này có thể cũng xuất phát từ nóc vòm mũi họng, rất hiếm khi xuất phát từ thành trước và dưới vòm họng Do cấu tạo giải phẫu như vậy nên UTVMH rất khó chẩn đoán ở giai đoạn sớm vì hầu như không có triệu chứng đặc hiệu

Các dấu hiệu sớm thường nghèo nàn, bệnh nhân thường không để ý, ngay cả khi đến khám ở các cơ sở y tế cũng bị nhầm lẫn và dễ bị bỏ qua Các dấu hiệu sớm thường là đau đầu thoáng qua, ngạt mũi thoáng qua, hiếm thấy chảy mũi, khi có thường ở một bên, có thể có ù tai

Các dấu hiệu muộn thường sau 6 tháng kể từ khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên do khối u phát triển tại chỗ và xâm lấn gây ra

- Triệu chứng hạch: hạch cổ phổ biến nhất là vị trí hạch cổ cao, đặc biệt hạch

cổ sau trên (hạch cơ nhị thân) hay gặp nhất Di căn sớm lan đến hạch sau hầu của Rouviere có thể ở một hoặc hai bên cổ Có thể có hạch cổ bên đối diện

- Triệu chứng mũi : ngạt tắc mũi, chảy máu mũi, xì ra nhày lẫn máu

- Triệu chứng tai: mất nghe một bên do u làm tắc vòi Eustachi

- Triệu chứng mắt thường xuất hiện giai đoạn muộn do u xâm lấn rộng gây chèn ép tổn thương dây thần kinh chi phối vận động mắt : lác, nhìn đôi, sụp

mi, giảm hoặc mất thị lực

- Triệu chứng thần kinh thường gặp do tổn thương liệt các dây thần kinh sọ,

có thể đơn lẻ hoặc phối hợp

 Phân loại mô bệnh học

NPC hoặc những di căn hạch liên quan được chẩn đoán và phân loại bằng kính hiển vi quang học, đồng thời cung cấp các thông tin cho chẩn đoán xác định trên lâm sàng Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) sự khác biệt về

mô bệnh học của NPC được phân thành 3 loại: ung thư biểu mô tế bào vảy, được gọi là WHO1, biệt hóa cao, với các điểm đặc trưng là sự tăng trưởng biểu mô và sợi keratin; Ung thư không keratin hóa WHO2 vẫn có một hình dạng bình thường và các mẫu biểu mô bình thường của tăng trưởng, và ung thư WHO3 thể không biệt hóa (UCNT) sản xuất keratin và thiếu một mô hình tăng trưởng biệt hóa Những ung thư không biệt hóa bao gồm ung thư biểu

mô lympho có các tế bào ác tính thâm nhập vào biểu mô và nhiều tế bào lympho không ác tính [5]

Tỷ lệ các loại NPC thì khác nhau ở các vùng dịch tễ và không dịch tễ Ở Hoa Kỳ (USA), các loại WHO1 chiếm hơn hai phần ba các trường hợp, trong khi ở châu Á, cũng như trong những người nhập cư châu Á đến Mỹ, loại WHO2 và các khối u ung thư WHO3 không biệt hóa chiếm ưu thế Điều trị bằng xạ trị cho khối u thể WHO2 và -3 có hiệu quả hơn so với WHO1 [25].

 Chẩn đoán tế bào học và mô bệnh học.

Xác định chẩn đoán bằng xét nghiệm mô bệnh học (tiêu chuẩn vàng) trên mảnh sinh thiết khối u vòm họng

Xét nghiệm tế bào bong trong trường hợp bệnh nhân bị khít hàm hoặc

để kiểm tra tế bào ác tính còn sót lại sau điều trị

Chọc hút hạch bất thường ở cổ bằng kim nhỏ để tìm tế bào ác tính giúp định hướng tìm u nguyên phát trong những trường hợp thể hạch, thể ẩn

Các dạng mô bệnh học: Theo phân loại của tổ chức Y tế thế giới (WHO):

- Hay gặp nhất là ung thư biểu mô không biệt hoá UCNT- Undifferenciated carcinoma nasopharyngeal type) chiếm 75-85% (type III)

- Ung thư biểu mô dạng biểu bì không sừng hoá (type II)

- Ung thư biểu mô dạng biểu bì sừng hoá (type I)

- Ung thư biểu mô dạng tuyến nang

- Các loại khác

1.3.2.3.Chẩn đoán giai đoạn.

Việc đánh giá mức độ lan rộng của UTVMH và xếp hạng lâm sàng dựa theo phân loại T.N.M và giai đoạn lâm sàng của Liên ban phân loại ung thư Hoa Kỳ (AJCC Cancer staging manual) [6]

+ Giai đoạn I: T1,N0,M0

+ Giai đoạn IIa: T2a, N0, M0 ; Giai đoạn IIb: T1-2, N0-1, M0

+ Giai đoạn III :T1, N2, M0 hoặc T2a,b,N2,M0 hoặc T3, N0-2, M0

+ Giai đoạn IVA: T4, N0-2, M0; Giai đoạn IVB: T bất kỳ, N3, M0 ; Giai đoạn IVC: T bất kỳ, N bất kỳ, M1

1.3.3 Điều trị

Do khối u nằm trong hốc sâu, gần nền sọ, nên điều trị khó khăn, kết quả bị hạn chế Điều trị chủ yếu là dùng hóa, xạ trị, phẫu thuật nạo vét hạch cổ trước hoặc sau xạ trị rất ít được sử dụng vì vòm họng nằm sâu, phẫu thuật khó khăn

dễ gây nhiều tai biến và khó kiểm soát bệnh

Ngoài ra có thể điều trị bằng các phương pháp tác động đến hệ miễn dịch của cơ thể như: Miễn dịch trị liệu, chủ yếu là tăng khả năng miễn dịch cho cơ thể ngăn chặn tế bào ung thư di chuyển và tạo di căn, đồng thời hỗ trợ trong

xạ trị Liệu pháp vacxin, điều trị dự phòng bằng vacxin ngăn ngừa EBV Điều trị bằng các tế bào lympho T có khả năng tiêu diệt EBV

Gen liệu pháp và điều trị bằng quang động học hiện nay cũng đang được nghiên cứu và ứng dụng

K vòm để càng muộn tiên lượng càng xấu

Tiên lượng của K vòm là khả quan vì phần lớn là UCNT rất nhạy cảm với tia xạ và hóa chất, do đó tỉ lệ sống trên 5 năm cao hơn nhiều loại K khác

Nói chung tỉ lệ sống trên 5 năm ở nước ngoài là 15 - 40%, nhưng ở Việt Nam là 5% [26]

1.4 Virut Epstein-Barr (EBV)

1.4.1 Sinh học của EBV

Virut Epstein-Barr là một loại gamma herpesvirus gây nhiễm trùng tiềm

ẩn ở hơn 90 % người trưởng thành trên thế giới và nó tồn tại lâu dài trong cơ thể nhiễm [27] Việc lây nhiễm EBV chủ yếu thông qua nước bọt và ở lứa tuổi rất sớm của đời sống con người mà thường không có triệu chứng Ngoài ra, EBV có thể được lây nhiễm qua máu, tổ chức và cũng có thể qua sữa của mẹ truyền sang con, thậm chí là thông qua quan hệ tình dục EBV nhân lên trong

tế bào biểu mô tuyến nước bọt, sau đó qua biểu mô vòm họng rồi xâp nhập vào tế bào lympho B qua thụ thể CD21 trên bề mặt tế bào Sau khi đi vào nhân tế bào, EBV tồn tại ở dạng vòng là chủ yếu và tự nhân lên nhờ nguyên liệu của tế bào [28] Tuy nhiên, EBV cũng tích hợp vào ADN của nhiễm sắc thể tế bào chủ, ví dụ ở tế bào dòng Namalwa, nó tích hợp vào nhiễm sắc thể ở

vị trí 1p35 Ở thể nhiễm tiềm ẩn trong lympho B, EBV biểu lộ rất ít kháng nguyên, hơn nữa với số lượng tế bào nhiễm quá thấp (1 tế bào lympho B/1ml máu) do đó EBV khó bị tiêu diệt bởi hệ miễn dịch Khi ở thể dung giải, EBV nhân lên nhiều và giải phóng ra ngoài rồi lại nhiễm vào các tế bào lympho khác, chúng đến tuyến nước bọt và hình thành chu kỳ nhân lên EBV trong cơ thể

Với những tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho rằng virut có thể vào bằng những cách sau: Khả năng thứ nhất: có thể xảy ra

là sự tiếp cận giữa tế bào biểu mô vòm họng và tế bào nhiễm EBV Tế bào B

đi vào chu trình dung giải, bung ra các bản sao của virus, cung cấp một số lượng lớn các hạt virus mới cho các tế bào khác trên một diện rộng Và khả năng thứ hai: virus vào tế bào biểu mô bởi hiện tượng thực bào qua trung gian receptor với IgA [29] Ngoài ra, phân tử MHC lớp II cũng có thể là con đường chính virus xâm nhập vào tế bào biểu mô [30] Ngoài các tế bào lympho B và tế bào biểu mô, đôi khi EBV còn bị tấn công bởi các tế bào máu

khác như đai thực bào, lympho T hoặc tế bào diệt tự nhiên (Natural Killer cell) [31]

1.4.2 Cấu trúc của EBV

EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài bộ gen của nó khoảng 172-kb và ADN là chuỗi đôi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid EBV hình thành phân tử ADN dạng vòng ở tế bào bị nhiễm (hình 1A) Khi xử lý EBV của dòng tế bào B95-8 bằng emzym cắt giới hạn BamHI, các đoạn gen tạo ra được ký hiệu theo bảng chữ cái và theo thứ tự kích thước giảm dần (hình 1B) Thuật ngữ sử dụng cho từng đoạn như sau: Mỗi chữ cái là ký hiệu cho từng đoạn (A, B …), khung đọc mở trái hoặc phải và tiếp theo là thứ tự (0,1,2,3…)

ví dụ như BARF0 và BARF1 Toàn bộ bộ gen EBV của dòng tế bào B95-8 được giải trình tự gen đầu tiên, và có mã số tại ngân hàng gen là V01555.Các EBV sản xuất khoảng 100 kháng nguyên khác nhau (các phân tử protein lớn) trong thể dung giải của nó, ngược lại, chỉ có khoảng 10 kháng nguyên được sản xuất trong các thể nhiễm tiềm ẩn [25]

BamHI

B

AA

Hình 1 Sơ đồ cấu trúc của EBV

A) Cấu trúc EBV dạng vòng biểu thị các vùng promoter và các gen thể

nhiễm tiềm ẩn: EBER1 và 2: EBV Early ARN, EBNA1-6: EBV Nuclear

Antigen, LMP1 và 2: Latent Membrane Protein B) EBV ở dạng thẳng gồm

các đoạn gen được tạo ra sau khi xử lý với enzym giới hạn BamH1 và vị trí các gen của thể tiềm ẩn

1.4.3 Thể tiềm ẩn của EBV

Giống như tất cả các virut herpes, EBV có thể tồn tại dạng không hoạt động trong tế bào bị nhiễm Ở thể này, EBV biểu lộ 12 gen, nhưng chỉ có 10 gen trong số này được dịch mã để tổng hợp protein, bao gồm 6 loại protein là kháng nguyên nhân (EBV Nuclear Antigen ): EBNA1, 2,3A,3B,3C, -LP; 3 loại protenin màng tiềm ẩn (Latent Membrane Protein): LMP1, LMP2A và 2B; 2 loại ARN không mã hóa protein (EBV Early ARN): EBER1, 2 UTVMH thuộc thể nhiễm tiềm ẩn II và III

1.4.4 Một số gen EBV của thể tiềm ẩn

1.4.4.1 EBNA1

Protein EBNA1 của EBV thuộc dòng tế bào B95-8, có trọng lượng khoảng 66-95 kDa và chiều dài là 641 axit amin Kích thước này được thay đổi ở các chủng khác nhau do sự khác nhau ở đoạn lặp lại glycin- alanin (Gly-Ala) [32] Các cấu trúc cơ bản của EBNA1 được chia thành bốn vùng rõ ràng: một vùng cơ bản nằm ở đầu N gồm 89 acid amin, vùng lặp lại Gly-Ala gồm

239 acid amin, vùng cơ bản ngắn và một vùng gắn ADN ở đầu C có chiều dài

từ axit amin 459-64 [16] (Hình 2)

Hình 2 Cấu trúc của EBNA1: EBNA1 bao gồm 641 axit amin và trong trình tự ADN không có intron EBNA1 có hai dầu Nitơ và Cacboxy, các vùng chức năng của EBNA1 được chỉ ra trong hình Trong đó vùng liên kết ADN (459-604) là vùng có chức năng điều hòa phiên mã, có nghĩa là

nó tương tác với ADN ở các vùng promoter để hoạt hóa hay ức chế biểu

lộ gen của bản thân nó và một số gen khác.

EBNA1 là protein biểu lộ hầu như tất cả các tế bào nhiễm EBV và nó đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì episom của EBV (dạng vòng) trong nhân tế bào chủ, cũng như chức năng phiên mã của virut [33] Vùng gắn ADN của protein EBNA1 tương tác với hai khu vực nằm ở vùng oriP của promoter Cp, bao gồm gia đình lặp đi lặp lại FR (Family of Repeat) có chứa

20 đoạn nucleotid có trình tự lặp, đoạn DS (Dyad Symmetry) có 4 vị trí gắn,

và một vùng có hai vị trí gắn sau promoter của Qp

Liên kết EBNA1 với vùng FR có ái tính cao nhất so với DS và Qp và khi gắn với FR thì nó điều hòa phiên mã các gen EBNA Các gen này được biểu

lộ dưới sự kiểm soát của promoter Cp hay Wp EBNA1 cũng có thể liên kết với các intron đầu tiên xuôi chiều của promoter Qp làm tự điều hòa biểu lộ protein EBNA1 Ở các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, các promoter Cp và Wp không hoạt động và biểu lộ của EBNA1 được thực hiện bởi Qp Cp và Wp không hoạt động do các yếu tố phiên mã và methyl hóa ADN [34]

1.4.4.2 LMP1

Protein LMP1 được phiên mã từ vùng BNLF1 nằm ở gần cuối đầu 3' của

bộ gen EBV và có trọng lượng khoảng 60-66kD, tùy thuộc vào chủng virus

Ở chủng EBV của tế bào dòng B95-8, protein này có 386 axit amin và chia thành ba vùng, (i) một vùng đầu N gồm 24 axit amin, (ii) sáu vùng xuyên màng kỵ nước được kết nối bởi ba vòng bên ngoài và hai vòng nội bào, (iii) một vùng đầu C có 200 axít amin bao gồm hai lĩnh vực chức năng quan trọng được gọi là vùng hoạt hóa CTAR1 (C-Terminal Activation Region 1: aa194-232) và CTAR2 (aa 351-386)

LMP1 tham gia ba chức năng chính là chuyển dạng, di căn và chống lại chết theo chương trình LMP1 được coi là sản phẩm của một gen sinh ung thư

vì nó có thể làm chuyển dạng các nguyên bào sợi động vật gặm nhấm Biểu hiện của LMP1 cũng tác động ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng của tế bào biểu mô, ức chế sự biệt hóa của chúng, gây biến đổi hình thái của một số dòng tế bào biểu mô và làm tăng biểu hiện các yếu tố tăng trưởng biểu bì EGFR [35].

1.5 Yếu tố biến đổi ngoài gen (epigenetic)

Biến đổi ngoài gen (epigenetic) là nghiên cứu các cơ chế làm không biểu

lộ gen mà không liên quan đến sự thay đổi trình tự nucleotid của gen Những biến đổi biến đổi ngoài gen (epigenetic) có thể di truyền được từ thế hệ tế bào này sang tế bào khác Khi nói đến biến đổi ngoài gen (epigenetic) người ta thường nhấn mạnh 3 yếu tố là: methyl hóa ADN, sửa chữa histon và nucleosom Các thay đổi này là độc lập với nhau và methyl hóa xảy ra ở mức

độ ADN trong khi 2 yếu tố còn lại diễn ra ở mức độ protein

1.5.1 Methyl hóa ADN và điều hòa biểu lộ gen

Methyl hóa ADN là sự kiện diễn ra do một gốc CH3 liên kết đồng hóa trị với vị trí cacbon số 5 của Cytosin nằm ở vị trí hai nucleotid Cytosin-Guanin viết tắt là CpG (p là liên kết phosphodieste) Khi CpG tập hợp nhiều trong khoảng 200bp tại một ví trí nào đó trong gen có GC chiếm hơn 50% thì người

ta gọi là đảo CpG Khoảng 10-15% CpG ở động vật có vú nằm ở vùng đảo CpG và nó thường xuất hiện ở vị trí vùng promoter và exon 1 của khoảng 40% các gen của động vật có vú Cơ chế gắn gốc CH3 vào ADN trong quá trình phân bào nhờ các enzym methyltransferase (DNMT) Có 4 loại DNMT được xác định ở động vật có vú và cả 4 enzym đều chuyển nhóm CH3 từ S-adenosyl methionin sang ADN Trong các mô bình thường các đảo CpG thường không bị methyl hóa Khi chúng bị methyl hóa ở vùng promoter dẫn đến hai cơ chế điều hòa biểu lộ gen: Một là, ức chế các yếu tố điều hòa biểu

lộ gen gắn vào vùng khởi động do gốc CH3 gắn vào Cytosin, cơ chế này được minh họa trong (Hình 3A và 3B) Hai là, có các protein gắn đặc hiệu với CpG methyl hóa dẫn đến cơ chế làm mất axetyl của histon và làm cấu trúc sợi chromatin co lại, cuối cùng dẫn đến các yếu tố phiên mã không gắn được vào vùng đó của ADN (Hình 3C).

C Hình 3: Hai cơ chế không biểu lộ gen bởi methyl hóa ADN.

A) Hai nucleotid CpG ở vùng promoter không methyl hóa, cho phép thực hiện

phiên mã trong các tế bào bình thường B) Phiên mã bị chặn bởi tăng methyl hóa trong vùng promoter C) Khi ADN bị methyl hóa, các protein gắn đặc hiệu với CpG sẽ gắn vào làm sợi chromatin co lại, dẫn đến ức chế phiên mã (Theo Worm J , Guldberg P J Oral Pathol PubMed 2002 Sep;31(8):443-9)

Methyl hóa AND là một biến đổi ngoài gen (epigenetic) rất đặc trưng hệ gen người và có vai trò quan trọng cho tế bào bình thường, bao gồm cả quy

mô, phát triển, biểu hiện di truyền, sự hoạt động bộ gen, bất hoạt nhiễm sắc thể X, sửa chữa ADN Methyl hóa ADN ở người xảy ra gần như độc quyền ở

vị trí CpG trong vùng promoter của gen Sự thay đổi trong methyl hóa ADN gây bệnh phát triển, chẳng hạn như ung thư Vì vậy kỹ thật nhạy cảm phát hiện methyl hóa là quan trọng cho nghiên cứu ngoài gen, tiên lượng bệnh ung thư và trị liệu [37]

1.5.3 Methyl hóa ADN các promotor của EBNA1

EBNA1 được biểu lộ trong tế bào nhiễm nhờ sự hoạt hóa của các promoter khác nhau ở những thể tiềm ẩn khác nhau (Wp, Cp và Qp) và chu

kỳ dung giải (Fp) Ở chu kỳ dung giải, EBNA1 biểu lộ do promoter Fp hoạt hóa, trong khi các promoter khác không hoạt động Ngược lại, trong thể nhiễm tiềm ẩn Wp, Cp và Qp được hoạt hóa, tuy nhiên phụ thuộc vào từng thể nhiễm tiềm ẩn I, II hay III Ở thể nhiễm tiềm ẩn I và II chỉ có Qp hoạt động, còn thể nhiễm tiềm ẩn III, cả hai promoter Wp và Cp hoạt động Hai promoter này hoạt động luân phiên và Wp được hoạt động trước ở một thời gian ngắn, sau đó mới chuyển sang Cp hoạt động lâu dài hơn

Việc các promoter đóng hoặc mở được thực hiện bởi các yếu tố khác nhau, trong đó có methyl hóa các CpG vùng promoter Ở thể nhiễm tiềm ẩn I

và II, các promoter Wp và Cp bị đóng lại, do đó EBV chỉ biểu lộ EBNA1 do

Qp như trong trường hợp UTVMH

Theo Qian Tao và cs 1998, các CpG ở Qp không bị methyl hóa ở các khối u có EBV và các tế bào dòng Đây là trường hợp ngoại lệ của mối liên quan giữa mức độ methyl hóa và điều hòa biểu lộ gen của EBNA1

Hình 4 Các promotor của EBV điểu khiển phiên mã EBNA1

EBV đã mở vòng tại vị trí TR (Terminal region), trở thành dạng thẳng Các promoter Cp, Wp, Qp và Fp tham gia điều hòa biểu lộ gen ở các thể nhiễm dung giải và thể nhiễm tiềm ẩn khác nhau Các promoter này nằm xa gen EBNA1 và sự biểu lộ gen được thể hiện bởi các đường gạch nối các exon EBNA1 có tác dụng điều hòa dương đối với promoter Cp và Wp làm biểu lộ các gen EBNA và điều hòa âm đối với Qp, để ức chế biểu lộ chính nó [38].

Để xác định sự methyl hóa các gen đặc hiệu người ta sử dụng các kỹ thuật khác nhau như PCR đặc hiệu methyl hóa (methylation Specific PCR-MSP), giải trình tự gen đặc hiệu methyl hóa, kỹ thuật MPS đa mồi multiplex methylation specific PCR-MMSP Mỗi loại kỹ thuật có những ưu điểm và nhược điểm khác nhau Tuy nhiên, MSP vẫn là kỹ thuật phổ biến nhất để xác định tình trạng methyl hóa của các promoter của gen Trong một nghiên cứu

đã thu thập mẫu bệnh phẩm từ các nước khác nhau trong khu vực Châu Á bằng phương pháp không xâm nhập (ngoáy họng bằng tăm bông) và mẫu sinh thiết của 49 bệnh nhân UTVMH và 20 người khỏe mạnh bình thường làm

nhóm chứng Kết quả cho thấy độ nhạy phát hiện UTVMH của phương pháp không xâm nhập là 98% và độ đặc hiệu là 100% [39]

1.6 Những biến đổi ngoài gen liên quan đến các thông số lâm sàng của UTVMH.

Gen ức chế ung thư (TSGs) thường xuyên biến đổi methyl hóa trong các khối u đã được sử dụng như dấu ấn sinh học cho phát hiện các tế bào ác tính

từ nguyên liệu lâm sàng khác nhau Nó cung cấp khả năng phát hiện ung thư sớm và theo dõi tái phát các bệnh nhân ung thư sau điều trị [40] (Schulz 2005) Dấu ấn sinh học methyl hóa DNA giữ một số ưu điểm so với các loại dấu ấn sinh học khác như protein, biểu hiện gen và đột biến DNA, sự tiến triển của khối UTVMH được đặc trưng bằng một số promoter biểu có biến đổi ngoại di truyền tổ hợp riêng biệt bao gồm methyl hóa DNA của hơn 30 gen Do đó, những trình tự DNA methyl hóa có thể đại diện cho dấu sinh học tiềm năng chẩn đoán sớm khối u tiên phát hoặc tiên lượng và theo dõi đáp ứng điều trị hoặc khối u tái phát [41]

- Gen RASF1A: thường xuyên bị bất hoạt bởi promoter methyl hoá cao [42], [43] Protein Ras phục vụ như là một nút trong việc dẫn truyền thông tin từ một loạt các tế bào thụ thể bề mặt với một mảng của các con đường truyền tín hiệu nội bào Hoạt động Ras được quy định bởi chu trình giữa GDP-bám không hoạt động và GTP-bám hoạt động Khi Ras gắn vào GTP- bám, nó sẽ kích hoạt một loạt các phân tử hiệu ứng Protein GTPase-kích hoạt (GAP), chẳng hạn như p120GAP và NF1, kích hoạt thủy phân GTP lại mẫu GDP-bám không hoạt động [44] Bởi vì Ras GAP tắt tín hiệu Ras đã luôn luôn được coi

là tiềm năng gen ức chế khối u

- Gen DAPK là một Ca / calmodulin-quy serine / threonine kinase, đóng vai

trò điều hoà tích cực sự chết theo chương trình Mất biểu hiện DAPK đã được chứng minh có sự liên kết với vùng promoter methyl hóa trong UTVMH

Methyl hóa promoter đã được tìm thấy trong 76% các NPC, cũng như huyết tương của bệnh nhân với NPC [45] Một tác nhân khử methyl, 5-aza-2'- deoxycytidine, có thể làm chậm sự tăng trưởng của tế bào UTVMH in vitro

và in vivo bằng cách kích hoạt lại các Gen DAPK im lặng bởi de novo methyl hóa [46]

- Gen BLU là một gen ức chế khổi u nằm trong khu vực thường xuyên bị đột

biến mất đoạn 3p21 phổ biến trong nhiều loại ung thư bao gồm UTVMH, Trong một nghiên cứu đã xác định Blu bị bất hoạt bởi methyl hoá ở mức cao

và khi Điều trị các tế bào dòng của UTVMH với 5-aza-2'-deoxycytidine sẽ kích hoạt biểu hiện BLU cùng với promoter không methyl hoá

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.Cỡ mẫu:

150 bệnh nhân của 3 giai đoạn (I-III), và 100 người chứng (chỉ lấy máu ngoại vi và nước bọt, một số sinh thiết của những bệnh nhân không phải ung thư vòm mũi họng có thể làm chứng)

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn vào nghiên cứu:

Là những bệnh nhân UTVMH người Việt nam thể ung thư biểu mô không biệt hóa, giai đoạn bệnh từ I-III được chẩn đoán xác định bằng kết quả sinh thiết giải phẫu mô bệnh học

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ:

Các trường hợp bị ung thư tế bào vảy, ung thư đầu mặt cổ khác như amidal, khoang miệng, lưỡi hoặc UTVMH ở giai đoạn IV đều bị loại ra khỏi đối tượng nghiên cứu

2.1.4 Tiêu chuẩn chọn nhóm chứng

Là những người khỏe mạnh bình thường, không có yếu tố nguy cơ bị UTVMH (không có tiền sử gia đình; không hút thuốc lá, thuốc lào; không uống rượu; không ăn nhiều cá khô và các thức ăn được bảo quản đông lạnh như thịt, trứng, rau, hoa quả; hoặc thức ăn được ướp muối lâu ngày như dưa muối, cà muối, mơ muối, chanh muối; không làm việc trong những điều kiện môi trường có nhiều khói bụi hoặc các hóa chất độc hại)

• Toàn bộ các đối tượng nghiên cứu và nhóm chứng đều được thăm khám lâm sàng và phỏng vấn theo bộ câu hỏi thiết kế sẵn

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu: Bệnh – chứng

2.2.2 Cỡ mẫu

Chọn cỡ mẫu không xác suất, loại mẫu có chủ đích ( không yêu cầu tính cỡ mẫu)

2.2.3 Biến số nghiên cứu

Chọn biến số nghiên cứu là các biến định lượng, định tính, mô tả mối tương quan các biến độc lập và phụ thuộc

2.2.4 Phương pháp tiến hành nghiên cứu

2.2.4.1 Thu thập các chỉ tiêu theo chẩn đoán lâm sàng

Sử dụng phương pháp nghiên cứu ngang, mô tả lâm sàng trong đó :

- Thống kê các số liệu lâm sàng phục vụ cho mục đích và nội dung nghiên cứu theo bệnh án mẫu

- Thăm khám qua nội soi tai mũi họng để mô tả, ghi nhận các tổn thương lâm sàng, chụp ảnh phục vụ cho nghiên cứu

- Sinh thiết các khối u, lấy mẫu bệnh phẩm, bảo quản để phục vụ cho chẩn đoán mô bệnh học và chẩn đoán gen

2.2.4.2 Nghiên cứu chẩn đoán gen

- Các mẫu sinh thiết tươi (hoặc khối đúc paraffin) được lấy từ khối u

UTVMH theo phương pháp nội soi vòm họng để chẩn đoán mô bệnh học Nếu là sinh tiết tươi, một phần mảnh sinh thiết được chẩn đoán mô bệnh học, phần khác được lấy, vận chuyển theo quy trình lạnh và bảo quản ở tủ lạnh sâu -800C đến khi chiết tách các thành phần như ADN, ARN và protein

- Nước bọt: 2ml nước bọt từ bệnh nhân và người bình thường được thu

thập và chiết tách ADN theo quy trình của kit có trên thị trường

- Máu ngoại vi: 5ml-10ml máu ngoại vi của bệnh nhân và người thường

được chống đông bằng EDTA, vận chuyển về labo và tách huyết tương và bảo quản ở nhiệt độ -300C ngay trong ngày lấy máu cho đến khi tách ADN Phần tế

bào máu sẽ được bảo quản trong ngân hàng cho mục đích phân tích gen bổ sung khi cần thiết.

• Sau khi nhận được các cặp mồi, các phản ứng PCR đơn mồi sẽ được thực hiện đối với ADN của EBV trên dòng tế bào Namalwa được xử lý bisulfite, kiểm tra sự hoạt động của các cặp mồi, độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Sau đó, nếu chúng hoạt động tốt, phản ứng PCR đa mồi được thực hiện và cũng tìm điều kiện tối ưu trên dòng tế bào Namalwa Khi các cặp mồi hoạt động tốt, mẫu ADN từ sinh thiết và nước bọt của bệnh nhân đã được xử lý bởi bisulfite sẽ được sử dụng để phân tích Kỹ thuật điện di trên gel và nhuộm ethidium bromide sẽ được sử dụng để phát hiện sản phẩm PCR Kết quả được đọc và chụp ảnh dưới đèn UV

• ADN được chiết tách từ nước bọt bởi kit theo quy trình của công ty hoặc bằng quy trình được đăng tải với các hóa chất thông dụng dành cho sinh học phân tử Chất lượng của các sản phẩm được đo bằng quang phổ kế

• Để xác định mức độ methyl hóa của các vùng promoter các gen nghiên cứu, ADN phải được xử lý bằng bisulfite để chuyển các nucleotid Cytosin

ở vị trí CpG chưa bị methyl hóa thành Thymin có thể được sử dụng bằng hai phương pháp là dùng agarose nóng chảy ở nhiệt độ thấp hoặc dùng kit

• Phản ứng PCR: PCR là phản ứng khuếch đại chuỗi in vitro, cho phép

khuếch đại các đoạn gen mong muốn từ một chuỗi thành một tỷ chuỗi sau

30 chu kỳ Phản ứng này có thể dùng cho cả ADN chưa và được xử lý với bisulfite Tuy nhiên, phải dùng các cặp mồi được thiết kế riêng cho ADN chưa và được xử lý với bisulfite Kỹ thuật PCR là một công cụ mạnh trong sinh học phân tử, sản phẩm của nó có thể dùng cho nhiều mục đích khác nhau như giải trình tự gen trực tiếp, tạo dòng phân tử

• Đối với ADN chưa được xử lý bisulfite, các cặp mồi được thiết kế cho PCR, sau đó dùng chính các mồi này để giải trình tự gen Mục đích của