Nghiên cứu một số đặc điểm di truyền, sinh học phân tử ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng lympho

Lơ xê mi cấp dòng lympho đặc trưng bằng sự tăng sinh ác tính của các tế bào tiền thân dòng lympho, có thể có các biến đổi di truyền, dẫn đến sự lấn át các dòng tế bào khác và rối loại qu

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lơ xê mi (LXM) cấp là bệnh lý ác tính thường gặp nhất của hệ tạo máu,rối loạn cơ bản của bệnh là sự tăng sinh không kiểm soát được của một hoặcvài dòng tế bào non tại tủy xương Bệnh lơ xê mi cấp bao gồm lơ xê mi cấpdòng tủy và lơ xê mi cấp dòng lympho Bệnh thường tiến triển nhanh và tỷ lệ

tử vong cao

Trước đây, việc chẩn đoán và xếp loại lơ xê mi cấp chủ yếu dựa trênphương pháp hình thái học và nhuộm hóa học tế bào theo FAB (French -American – Britsh) Ngày nay, với sự ra đời của máy đếm tế bào dòng chảy(Flow Cytometry) đã xếp loại đưuọc các phụ nhóm như lơ xê mi cấp dònglympho tế bào B và lơ xê mi cấp dòng lympho tế bào T Từ năm 2001, Tổchức y tế thế giới (WHO) đã xếp loại lơ xê mi cấp dựa trên các biến đổi ditruyền và đến năm 2008 xếp loại theo di truyền đã được cải tiến và bổ sung

Sự phát hiện và nghiên cứu các biến đổi di truyền đã góp phần rất lớn trongviệc tiên lượng và điều trị cho bệnh nhân lơ xê mi cấp

Lơ xê mi cấp dòng lympho đặc trưng bằng sự tăng sinh ác tính của các

tế bào tiền thân dòng lympho, có thể có các biến đổi di truyền, dẫn đến sự lấn

át các dòng tế bào khác và rối loại quá trình sinh máu của cơ thể Lơ xê micấp dòng lympho chiếm khoảng 1% trong số ung thư người lớn và khoảng25% ung thư ở trẻ em Lơ xê mi cấp dòng tế bào B chiếm khoảng 88% cáctrường hợp [1] Khoảng 60-70% lơ xê mi cấp dòng lympho có các biến đổi ditruyền [2] Những biến đổi di truyền này cùng với các yếu tố nguy cơ có liênquan đến xếp loại, hướng điều trị, kết quả điều trị và chỉ định ghép tế bào gốccho bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng lympho

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về biến đổi di truyền ở bệnh nhân

lơ xê mi cấp dòng lympho Tuy nhiên ở Việt Nam các nghiên cứu về di truyền

trong lơ xê mi nói chung còn hạn chế, riêng các nghiên cứu di truyền ở bệnhnhân lơ xê mi cấp dòng lympho còn ít hơn nữa Chính vì vậy, chúng tôi thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm di truyền, sinh học phân tử ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng lympho” với mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu một số bất thường Nhiễm sắc thể và biến đổi gen ABL/BCR, TEL/AML1, MLL/AF4, E2A/PBX1 ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng lympho.

2 Bước đầu phân tích một số đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm ở bệnh nhân được phát hiện có bất thường gen ABL/BCR, TEL/AML1, MLL/ AF4, E2A/PBX1.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ LƠ XÊ MI CẤP DÒNG LYMPHO

1.1.1 Khái niệm và dịch tễ học

Lơ xê mi cấp không phải là một bệnh đơn thuần mà là một nhóm bệnhđặc trưng bởi sự tăng sinh và tích lũy trong tủy xương và máu ngoại vi những

tế bào tạo máu chưa trưởng thành, ác tính Những tế bào này sẽ dần thay thế

và ức chế quá trình trưởng thành và phát triển của các dòng tế bào máu bìnhthường trong tủy xương [3]

Lơ xê mi cấp dòng lympho là bệnh lý ác tính do bất thường nhiễm sắcthể ở tế bào tiền thân dòng lympho B hoặc T ở các giai đoạn phát triển riêng

lẻ Sự tăng sinh và tích tụ tế bảo bất thường (tế bào Blast) ở tủy xương dẫnđến ức chế sự tạo máu và thâm nhiễm nhiều cơ quan khác nhất là màng não,tuyến sinh dục, tuyến ức, gan lách và hạch bạch huyết [4]

Tuổi trung bình của bệnh nhân khi được chẩn đoán là 14 tuổi, có tới 60%bệnh nhân được chẩn đoán dưới 20 tuổi, 24% bệnh nhân chẩn đoán ở tuổi 45hoặc hơn, chỉ 11% bệnh nhân được chẩn đoán từ 65 tuổi [5]

1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh

Phần lớn không rõ nguyên nhân, nhiều yếu tố được gợi ý như virus, tia

xạ, chất độc nhưng chưa có bằng chứng xác nhận Tuy nhiên, quan niệm vềmối tác động qua lại giữa các yếu tố di truyền và môi trường cần được khẳngđịnh bởi các nghiên cứu về quần thể và dịch tễ học phân tử

1.1.2.1 Yếu tố di truyền

- Yếu tố gia đình: khả năng mặc bệnh cao gấp 3 lần ở những đứa con có

bố hoặc mẹ mắc bệnh lơ xê mi cấp Trong 2 trẻ sinh đôi cùng trứng nếu 1 trẻ

mắc bệnh thì khả năng mắc bệnh của trẻ thứ 2 là 15% và thường xảy ra dưới 2tuổi [6], [7].

- Bệnh di truyền: tỷ lệ mắc bệnh lơ xê mi cấp trong nhóm các bệnh ditruyền như Down, Klinefelter…cao hơn so với nhóm bệnh không di truyền

1.1.2.2 Yếu tố môi trường

Sự tiếp xúc với tia xạ, chất hóa học cũng liên quan đến sự phát triểnbệnh lơ xê mi cấp

- Tia xạ: tỷ lệ mắc bệnh trong nhóm những nạn nhân sống sót sau vụ nổbom hạt nhân tại Hirosima và Nagasaki cao gấp 20 lần so với nhóm chứng.Tiếp xúc với cường độ trung bình cũng liên quan tới sự phát triển của bệnh.Trẻ em sống gần những nhà máy điện nguyên tử có tỷ lệ mắc bệnh lơ xê micấp cao hơn so với nhóm trẻ em khác Các bức xạ ion cũng gây biến đổi gentiền ung thư (proto oncogen) thành gen ung thư thực sự (oncogen) [8]

- Các chất hóa học: tỷ lệ mắc bệnh của công nhân trong các nhà máy cao

su, thuộc da thường xuyên tiếp xúc benzene cao hơn so với công nhân cácngành khác Hiện nay, lơ xê mi cấp liên quan đến điều trị hóa chất chiếm 10-15% tổng số lơ xê mi cấp Các thuốc chống ung thư thuộc nhóm ankylan,nitrosourea, procarbazin có khả năng gây ung thư thứ phát cao

1.1.2.3 Virus

Cho đến nay, các nhà huyết học trên thế giới chưa tìm ra được bằngchứng xác nhận mối liên quan trực tiếp giữa bệnh lơ xê mi cấp và virus Tuynhiên hiện nay có những bằng chứng xác nhận mối liên quan gián tiếp giữa lơ

xê mi cấp và virus: giữa HTLV1 (human T cell leukemia virus 1) và bệnh lơ

xê mi cấp hay u lympho tế bào T [9]

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh Lơ xê mi cấp

1.1.3.1 Sinh tế bào máu bình thường và LXM cấp

Bằng các nghiên cứu thực nghiệm in vivo và nuôi cấy tế bào in vitro,

người ta phát hiện rằng tạo máu là một quá trình tăng sinh và biệt hóa, bắtnguồn từ tế bào gốc vạn năng tạo ra các tế bào máu đa năng rồi tới tế bào máuđầu dòng cho từng dòng [10] Tế bào gốc được biệt hóa theo dòng nào là donhu cầu của cơ thể thông qua cơ chế điều khiển ngược mà đích tác động cuốicùng là gen có vai trò trong biệt hóa Khi có rối loạn một khâu nào trong dâychuyền này sẽ dẫn đến sự tăng sinh không kiểm soát được của tế bào, hoặclàm tế bào ngừng trưởng thành nhưng vẫn phân chia và dẫn đến LXM cấp [4].

1.1.3.2 Sự liên quan giữa hệ thống gen trong tế bào với ung thư

Có hai hệ thống gen với các chức năng khác nhau, cùng phối hợp đểkiểm soát sự tăng sinh ác tính, duy trì quá trình sống bình thường của tế bào

và cơ thể:

 Các tiền gen sinh ung thư (proto-oncogene): Là các gen có vai trò trong quátrình tăng sinh và biệt hoá tế bào Sự ổn định tương đối về cấu trúc và chứcnăng của các gen này giúp tế bào phát triển bình thường Ngược lại, khi có rốiloạn cấu trúc đáng kể như bị tái tổ hợp với retrovirus thì nó sẽ chuyển thànhgen ung thư (oncogene) và sinh ra một protein ung thư, tác động lên chính bộmáy phân bào và tạo ra các đặc tính ác tính [4]

 Các gen ức chế u (anti-oncogene): Có vai trò ức chế sự phát triển của khối u

Sự đột biến, sắp xếp lại hoặc chuyển đoạn làm bất hoạt các gen này, mất khảnăng ức chế sự tăng sinh ác tính [11] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cácgen này thường đóng vai trò trong sự tiến triển của bệnh từ âm ỉ trở thànhtoàn phát

Sự hoạt hoá gen ung thư và bất hoạt gen ức chế u làm cho tế bào tăngsinh dễ dàng và thoát khỏi sự kiểm soát bình thường và có thể dẫn đến bệnh

ác tính Trong cơ thể, gen sinh ung thư và gen bình thường có thể tồn tại songhành, trong đó gen sinh ung thư là gen trội [12]

1.1.3.3 Cơ chế tổn thương phân tử dẫn đến LXMc

Tổn thương gen truyền tín hiệu kích thích phát triển tế bào

Những gen này truyền tín hiệu kích thích phát triển tế bào thông quareceptor tyrosin kinase làm quá trình kích hoạt phosphoryn hóa làm cho tếbào tăng sinh Do đột biến gen này trở thành oncogene làm thay đổi hình thểprotein dẫn đến thay đổi chức năng của chúng Một số gen hoạt động theo conđường này là BCR-ABL, c-Kit, FLT3.Gen này có vai trò trong sự tiến triểnthành LXMc chứ không có vai trò trong biến đổi ác tính tiên phát [4]

Tổn thương các gen hoạt hóa sự sao chép

Các gen Ig lymphocyte B và gen receptor lymphocyte T: khi các tế bào

T và B chưa trưởng thành, thường có hiện tượng xoắn hai chuỗi đơn củaADN lại để tạo ra các protein đa dạng, có khả năng gắn với các protein lạ (các

Ig và các receptor tế bào T) Quá trình này dễ bị sai lạc và nếu sai lạc xảy ra ởcác proto-oncogene thì có thể dẫn đến tăng sinh ác tính [12]

Tổn thương gen liên quan đến quá trình tế bào chết theo chương

Hoạt hóa oncogene ở bệnh máu ác tính

Có nhiều mối liên quan rõ ràng giữa sự hoạt hóa của các oncogene hoặc

sự mất chức năng của các anti-oncogene với cán sự tăng sinh và biệt hóa tếbào Nếu chỉ có sự hoạt hóa của một oncogene thì chưa đủ điều kiện dẫn tớichuyển dạng ác tính Cần có sự phối hợp của nhiều oncogen hoặc sự biến đổi

anti-oncogene mới làm các tế bào bình thường chuyển thành ác tính Cơ chếchuyển dạng ác tính gồm 4 dạng chính sau:

 Chuyển đoạn và cấu trúc lại NST:

Chuyển một đoạn của NST này tới NST khác tạo nên sự sắp xếp mới,tạo ra gen lai mới, phiên mã một protein mới có hoạt tính tăng sinh tế bào

 Đột biến điểm:

Là những bất thường do thay đổi thành phần hoặc số lượng các nucleotidtrên ADN gồm các dạng thêm bớt, thay thế hay đảo vị trí của một vài cặpnucleotid trên gen [13], [14]

 Nhân gen:

Có nhiều nghiên cứu cho thấy thừa NST số 8 sẽ thừa gen MYC và gâyLXM cấp

 Virus RNA, DNA gây ung thư

Khác với virus gây bệnh nhiễm trùng khi vào tế bào sẽ nhân lên nhiềulần và phá vỡ tế bào tiếp tục chu kỳ mới, các virus gây ung thư tìm cách gắn

bộ gen vào vị trí các oncogen làm cho các gen này hoạt động dẫn đến kíchthích tế bào tăng sinh [14]

Bất hoạt gen ức chế u

Khác với cơ chế sinh bệnh do hoạt hóa oncogen đa số do gen trội quyđịnh, gen ức chế u đa số là do gen lặn quy định nên chỉ xảy ra ung thư khi cảhai alen đều bị bất hoạt Trường hợp dị hợp tử bất hoạt gen ức chế u dễ bị mắcbệnh là do alen lành còn lại bị mất hoặc bị đột biến [15]

1.1.4 Chẩn đoán lơ xê mi cấp

1.1.4.1 Lâm sàng

Biểu hiện lâm sàng của bệnh là hậu quả của quá trình sản sinh quá nhiều

“tế bào non”, ác tính, thiếu các tế bào máu bình thường Bệnh có nhiều thể,

mỗi thể có những đặc điểm riêng, nhưng chung nhất là các biểu hiện lâm sàngdiễn biến nhanh:

+ Biểu hiện mệt mỏi gầy sút

+ Bệnh nhân có các biểu hiện của hội chứng: thiếu máu, nhiễm trùng,xuất huyết, các biểu hiện này diễn biến nhanh

+ Biểu hiện hội chứng thâm nhiễm, loét, hoại tử

1.1.4.2 Cận lâm sàng:

a) Xét nghiệm máu

+ Số lượng hồng cầu có thể giảm, thiếu máu bình sắc

+ Số lượng tiểu cầu giảm

+ Số lượng bạch cầu tăng, cũng có thể bình thường hoặc giảm Trongcông thức bạch cầu có nhiều tế bào non, ác tính và đặc biệt giảm các tếbàomáu trưởng thành bình thường

b) Xét nghiệm tủy xương

+ Số lượng tế bào tủy xương tăng hoặc bình thường

+ Có tế bào non ác tính Tiêu chuẩn chẩn đoán là tế bào ác tính trên 20%trong tủy xương Trường hợp tỷ lệ tế bào blast dưới 20% nhưng phát hiệnđược bất thường NST hoặc gen đặc trưng là t(8;21), hay t(15;17) và inv (16)cũng có thể chẩn đoán lơ xê mi cấp

+ Giảm các tế bào tủy bình thường

+ Số lượng hồng cầu lưới ở máu và tủy giảm

c) Xét nghiệm miễn dịch và di truyền.

+ Phát hiện nhiều tế bào có kháng nguyên (CD) đặc trưng giai đoạn sớmtrong quá trình biệt hóa và trưởng thành

+ Xét nghiệm di truyền: phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể và genđặc trưng trong lơ xê mi cấp

1.1.5 Xếp loại lơ xê mi cấp dòng lympho

1.1.5.1 Xếp loại bằng phương pháp hình thái học - FAB 1976

Nhờ cách gọi đơn giản, yêu cầu để xếp loại không quá cao,nhiều phòng xét nghiệm có thể sử dụng được nên phương pháp xếp loại năm

1976 nhanh chóng được công nhận và được áp dụng trên toàn thế gới [16].Tuy nhiên, lơ xê mi có nhiều biến đổi, các chỉ tiêu về hình thái thường bịảnh hưởng bởi chủ quan Sau một thời gian áp dụng, năm 1982 các nhà huyếthọc Pháp, Mỹ và Anh xem xét và bổ sung một số tiêu chuẩn [17]

Trong phương pháp này Lơ xê mi cấp dòng lympho được phân ra badưới nhóm L1, L2, L3:

+L1: Tế bào lơ xê mi có kích thước nhỏ và đồng đều

+L2: Tế bào lơ xê mi có kích thước to và không đồng đều

+L3: Tế bào lơ xê mi to, có nhiều hốc trong nguyên sinh chất

Hình 1.1 Các thể lơ xê mi cấp xếp loại theo FAB

(A) L1 lymphoblasts (B) L2 lymphoblasts (C) L3 lymphoblasts

1.1.5.2 Xếp loại miễn dịch

Trong khi phương pháp xếp loại FAB tỏ ra có giá trị cho lơ xê mi tủycấp thì phương pháp xếp loại miễn dịch rất có giá trị cho lơ xê mi cấp, nhất làxác định bản chất dòng

Xếp loại dấu ấn miễn dịch dòng lympho B và T được WHO đưa ra năm

2001 khi nhận thấy xếp loại theo hình thái không có hiệu quả cao trong tiênlượng và điều trị bệnh

- Các dấu ấn của tế bào lympho B: CD19, CD20, CD22, CD79a, CD10

- Các dấu ấn của tế bào lympho T: CD2, CD3, CD7

Bảng 1.2 Các dấu ấn miễn dịch trên tế bào lympho [9].

1.1.5.3 Xếp loại bằng phương pháp di truyền tế bào- sinh học phân tử

Theo WHO( 2008) một số bất thường di truyền có thể được sử dụng đểchẩn đoán lơ xê mi cấp mà không cần đủ tiêu chuẩn tế bào blast hơn 20%trong tủy xương [19]

Khi nghiên cứu về lơ xê mi cấp dòng lympho có rất nhiều các bất thường

di truyền được ghi nhận Các bất thường này có ý nghĩa rất lớn trong việc tiênlượng bệnh nhân [20]

Bảng 1.3 Các biến đổi di truyền và tiên lượng trong lơ xê mi cấp dòng lympho [9], [21].

Tốt Đa bội >50 NSTChuyển đoạn t(12;21) và gen lai TEL/AML1

Trung bình

Đa bội 47- 50 NST

Bộ NST bình thườngChuyển đoạn t(1;19) và gen lai E2A/PBX1

Xấu

Thiểu bội, mất NSTChuyển đoạn t(9 ;22) và gen lai ABL/BCRChuyển đoạn t(11q23), t(4;11)

Chuyển đoạn t(5;14) và gen lai IL3-IGH

Các bất thường di truyền được ghi nhận 80-90% lơ xê mi cấp lympho B,

vì có giá trị cao trong tiên lượng bệnh nên tổ chức y tế thế giới (WHO) đã sửdụng các bất thường di truyền để xếp loại lơ xê mi cấp dòng lympho B [21],[22] Với dòng lympho T, các bất thường di truyền ghi nhận 50-60% cáctrường hợp và các bất thường này không có giá trị cao trong tiên lượng bệnhnên WHO không đề cao vai trò các bất thường di truyền trong xếp loại lơ xê

mi cấp dòng lympho T [9], [23]

Theo xếp loại WHO 2008, xếp loại lơ xê mi cấp lympho (cả u lympho)

tế bào B thành các dưới nhóm sau :

- Dưới nhóm t(9;22)(q34;q11) và gen lai ABL /BCR

- Dưới nhóm có t(v;11q23) và bất thường gen MLL (variant : các NSTkhác nhau)

- Dưới nhóm có t(12;21) và gen lai TEL-AML1 (còn gọi là RUNK1)

ETV6 Dưới nhóm có t(1;19) và gen lai E2AETV6 PBX 1

- Dưới nhóm có t(5;14)(q31;q32) và gen lai IL3-IGH

- Dưới nhóm có đa bội NST

- Dưới nhóm có thiểu bội NST.

1.2 CÁC BẤT THƯỜNG DI TRUYỀN Ở LƠ XÊ MI CẤP DÒNG

LYMPHO

1.2.1 Các bất thường về số lượng NST

- Bất thường trên lưỡng bội tương đối thường gặp, theo Heim vàMitelman thì có tới 15% lơ xê mi lympho cấp L1 và L2 có tế bào thừa NST,nhiều trường hợp có trên 50 NST

+ Trên lưỡng bội trên 50 NST : loại bất thường này gặp 25-30% LXMcấp ở trẻ em Các nhóm NST thường gặp thêm là NST số 2, 3, 4, 10, 18, cótiên lượng tốt Tuy nhiên, nếu đi kèm các chuyển đoạn khác thì bệnh chỉ tiênlượng ở mức độ trung bình [24], [25]

+ Trên lưỡng bội từ 47-50 NST : nhóm các nhiễm sắc thể hay thêm là 8,

13, 21 Không có nhiều khác biệt về đặc điểm lâm sàng, hình thái, miễn dịch

so với nhóm trên 50 NST nhưng có thể tuổi cao hơn và số lượng bạch cầumáu ngoại vi tăng cao hơn [26], [27], [9],

- Bộ nhiễm sắc thể bình thường : chiếm 30% trong số người trưởngthành Nhóm này tiên lượng bệnh trung bình [9]

- Các bất thường dưới lưỡng bội: Theo Bernheim thì bất thường dướilưỡng bội gặp tỷ lệ thấp ( dưới 5%) Bộ NST có dưới 46 NST Nhóm nàykhông có đặc điểm lâm sàng, hình thái, miễn dịch khác biệt [9]

Ngoài ra còn có dạng bất thường gần đơn bội, tức là cụm kỳ giữa có sốNST gần 23

Đây chính là bất thường tạo nên NST Ph Từ năm 1970 nhiều tác giả đãphát hiện NST Ph ở bệnh nhân lơ xê mi lympho cấp, lúc đầu một số ngườicòn coi đó là những trường hợp chuyển cấp của bệnh lơ xê mi hạt kinh.Nhưng đến nay người ta thấy trong lơ xê mi lympho cấp người lớn thì chuyểnđoạn thường gặp là t(9;22).

Bernheim tổng hợp các nghiên cứu cho thấy khoảng 20-30% trường hợp

Lơ xê mi lỵmho cấp người lớn và khoảng 5% lơ xê mi lympho cấp trẻ em cóNST Ph Khác với bệnh lơ xê mi hạt kinh, các trường hợp lơ xê mi lymphocấp có NST Ph thì khi được điều trị lui bệnh sẽ không còn NST Ph ở tuỷxương [2]

Là đột biến chuyển đoạn gen ABL (albenson) trên NST 9q34 và BCR(breakpoint cluster region) trên NST 22q11 Chuyển đoạn này thường gặptrên bệnh nhân bạch cầu kinh dòng hạt Tuy nhiên khi nghiên cứu bằng kỹthuật sinh học phân tử như phản ứng khuếch đại gen – PCR, lai tại chỗ huỳnhquang – FISH, cho thấy dạng đột biến này hay gặp ở lơ xê mi cấp trẻ em và ½người lớn có tiền sử lơ xê mi kinh có điểm đứt gãy BCR Trong lơ xê mi kinhdòng hạt phân tử chuyển đoạn có kích thước 210 kD, là sản phẩm điểm đứtgãy chính Điểm đứt gãy chính gồm 5 exon từ b1-b5, tương ứng với exon 12-

16 của gene BCR Trong vùng Major điểm đứt gãy thường ở giữa b2- b3 hayb3- b4 Trong lơ xê mi cấp dòng lympho, phân tử chuyển đoạn tạo ra protein

có kích thước 190kD, là sản phẩm gen đứt gãy phụ [9], điểm này nằm trongkhoảng giữa intron thứ nhất của gene BCR Ở gen ABL cho dù là Lơ xê mikinh dòng bach cầu hạt hay Lơ xê mi cấp dòng lympho thì điểm đứt gãythường ở intron thứ nhất của ABL gen NST số 22 bị đứt ở vị trí băng 11 vàchuyển đoạn tương hỗ với vị trí băng 34 của NST số 9

Hình 1.2 Chuyển đoạn t(9;22)(q34;q11)

Bệnh nhân có chuyển đoạn này có đặc điểm hình thái tế bào bất thường :

tế bào lớn, nhân to, thô, nguyên sinh chất có thể thấy hạt Về lâm sàng, bệnhnhân có chuyển đoạn ABL/BCR thường lớn tuổi, số lượng bạch cầu nhiều,hay thâm nhiễm nội tạng và hệ thần kinh trung ương [28], [29]

1.2.2.2 Chuyển đoạn t(4 ;11)(q21 ;q23) và gen lai MLL/AF4

Năm 1977 Oshimura là người đầu tiên phát hiện chuyển đoạn (4q-;11q+)

ở bệnh nhân lơ xê mi dòng lympho cấp

Năm 1991 Ziemin-van và CS đã phát hiện gen MLL (MyeloidLymphoid Leukemia hoạc Mixed lineage leukemia) tại vị trí 11q23, gen nàygồm ít nhất 12 exon [30] Nghiên cứu phân tử về MLL, Pui CH (2008) thấyrằng gene MLL có thể có sự kết hợp đầu N trên gen MLL và đầu C trên 40

gene khác, tạo ra tổ hợp gen mới [31], AF4 chứa khoảng 20 exon và mã hóacho protein giàu serine-proline Trong đó tổ hợp gene MLL/AF4 tạo ra sảnphẩm là MLL protein, protein này thúc đẩy hoạt động phiên mã, dẫn đến sựhoạt động bất thường của gen HOX, gây tăng cao số lượng bạch cầu và tế bàobất thường Chuyển đoạn t(4 ;11) tạo ra ít nhất 10 dạng bảng mã khác nhaucủa gen MLL/AF4 đã được phát hiện do các điểm đứt gãy nằm trên các intronkhác nhau và do hiện tượng ghép nối khác nhau.

Hình 1.3 Hình chuyển đoạn t(4 ;11)(q21 ;q23) và gen lai MLL/AF4

Chuyển đoạn này thường gặp ở trẻ em dưới 1 tuổi với tần suất 50-70%,người lớn là 5% Bệnh nhân có chuyển đoạn này thường có số lượng bạch cầutăng cao và hay thâm nhiễm thần kinh trung ương [32] Tỷ lệ sống sót củanhóm này thấp [33], [34]

1.2.2.3 Chuyển đoạn t(1;19)(q23;p13) và gen lai E2A/PBX1

Đây là một trong những chuyển đoạn hay gặp ở trẻ em Chuyển đoạnnày có thể cân bằng t(1;19)(q23;p13) hoặc không cân bằng der(19)(q23;p13)

Kết quả của các chuyển đoạn này là sự hoạt động của gen kết thúc của genE2A trên NST 19p13 và gen PBX1 trên NST 1q23 [35], [36], [32] Tổ hợpgen E2A/PBX1 mã hóa cho yếu tố hoạt động phiên mã liên tục còn gọi làoncoprotein Từ đó làm tế bào tăng sinh quá mức không kiểm soát được Đốivới gen E2A điểm đứt gãy xuất hiện một cách chuyên biệt ở vùng intron dài3.5 kb giữa exon 13 và 14 Còn PBX1 điểm đứt gãy nằm rải rác ở vùng introndài 50 kb ở giữa exon 1 và 2 Bản mã thường gặp nhất là vị trí exon 13 củaE2A và exon 2 của PBX1.

Hình 1.4 Chuyển đoạn t(1;19)(q23;p13) và gen lai E2A/PBX1

Với chuyển đoạn này các tế bào bất thường không có nhiều đặc điểmhình thái khác biệt nhưng có đặc điểm dấu ấn miễn dịch có nhiều khác biệt :CD10, CD19 thường dương tính nhưng CD20 âm tính [37] Chuyển đoạn genE2A/PBX1 có tiên lượng xấu [38]

1.2.2.4 Chuyển đoạn t(12 ;21)(p13 ;q22) và gen lai TEL/AML1

Chuyển đoạn này không dễ phát hiện khi phân tích karyotype vì kíchthước nhiếm sắc thể thay đổi không đáng kể, thường được phát hiện bằng kỹ

thuật FISH Chuyển đoạn này thường không gặp trên lưỡng bội trên 50NSTnhưng có thể gặp với các bất thường số lượng NST khác [39] Chuyển đoạnnày được Romana nhận dạng đầu tiên năm 1994 bằng kỹ thuật FISH Năm

1995 Golub đã chứng minh được tổ hợp gen trong chuyển đoạn này làTEL/AML1 Gene TEL có kích thước lớn gồm 5 exon nhưng vùng mangđiểm đứt gãy có kích thước khoảng 15kb nằm giữa exon 5 và 6 Gene AML1điểm đứt gãy thường ở intron 1 có kích thước lớn hoặc điểm đứt gãy phụ nằmtrên intron thứ 2, từ đó tạo ra 2 dạng bản mã khác nhau của gen TEL/AML1

Cả hai gen này đều mã hóa cho yếu tố điều hòa phiên mã nhân Tổ hợp gennày làm phá vỡ chức năng bình thường của gene TEL và tạo ra yếu tố ức chếphiên mã làm suy giảm biểu hiện của gen AML1

Về hình thái và đặc điểm miễn dịch của tế bào non có chuyển đoạn nàykhông có nhiều điểm khác biệt Chuyển đoạn này có tiên lượng tốt, nguy cơbội nhiễm thấp, kết quả điều trị sống khoảng 90% [40]

1.3 Tình hình nghiên cứu Lơ xê mi cấp dòng lympho tại Việt Nam

Từ những năm 1974 đã có những nghiên cứu về lơ xê mi cấp ở ViệtNam Theo Nguyễn Thị Minh An, Vũ Thị Minh Châu và cộng sự (1996),Trần Thị Minh Hương (2000), tỷ lệ lơ xê mi cấp ngày càng tăng [41], [42].Năm 1980, Bạch Quốc Tuyên, Đỗ Xuân Thiêm đã đưa ra bộ xét nghiệmhóa học tế bào để chẩn đoán bệnh theo tiêu chuẩn FAB và vẫn được sử dụngtới ngày nay [43]

Trong những năm tiếp theo, Nguyễn Ngọc Minh, Nguyễn Công Khanh,Dương Bá Trực đã phân loại Lơ xê mi cấp ở bệnh nhân điều trị tại Huế vàtrên bệnh nhi điều trị tại Viện Nhi Trung Ương [37], [44]

Năm 1990, phân loại lơ xê mi cấp dựa trên các dấu ấn màng tế bào đượcđưa vào Việt Nam Năm 1997 Trần Văn Bé, Lê Hữu Tài đã đưa ra phân loại

lơ xê mi cấp dựa trên các tiêu chuẩn dấu ấn miễn dịch [45]

Năm 2004 Bạch Quốc Khánh, Nguyễn Hà Thanh, Đỗ Trung Phấn đưa

ra nhận xét đặc điểm bệnh nhân lơ xê mi cấp lympho điều trị tại viện Huyếthọc – Truyền máu Trung ương [46]

Năm 1980 khi bắt đầu nhuộm Giemsa nhiễm sắc thể và sau này lànhuộm băng đã phát hiện nhiều bất thường di truyền ở bệnh nhân lơ xê micấp Năm 1986 Nguyễn Ngọc Minh đã đưa ra những nhận xét về bất thường

di truyền bệnh nhân lơ xê mi cấp tại Huế [44] Năm 2003 Phạm Quang Vinh

đã đưa ra nhận xét về biến đổi nhiễm sắc thể trên 200 bệnh nhân lơ xê mi cấpdòng tủy và dòng lympho [47] Năm 2007 Nguyễn Thiên Lữ, Phạm QuangVinh đã sử dụng kỹ thuật PCR, FISH đưa ra nhận xét về đột biến genABL/BCR [48]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là 62 bệnh nhân được điều trị tại Viện huyết học vàtruyền máu trung ương từ 01/01/2013- 01/03/2015 Đáp ứng các tiêu chuẩnsau:

- Bệnh nhân vào viện lần đầu

- Chẩn đoán xác định lơ xê mi cấp dòng lympho theo WHO 2001 và xếp loạitheo FAB có sửa đổi bổ sung năm 1986

- Chưa điều trị hóa chất trước đó

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Máu ngoại vi của bệnh nhân

- Dịch tủy xương của bệnh nhân

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang hồi cứu

2.3.2 Nội dung và biến số nghiên cứu

- Nghiên cứu các bất thường nhiễm sắc thể và đột biến gen ABL/BCR,MLL/AF4, TEL/AML1, E2A/PBX1 : tỷ lệ xuất hiện, kiểu biến đổi, thể bệnhhay gặp, đối chiếu đột biến gen và bất thường nhiễm sắc thể

- Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, huyết học, sinh hóa của bệnh nhân lơ xê

mi cấp dòng lympho được phát hiện có biến đổi di truyền:

+ Đặc điểm lâm sàng: Sốt, thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng, thâm nhiễm + Các chỉ số máu ngoại vi và tủy, các chỉ số đông máu

+ Các chỉ số hóa sinh

2.3.3 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.3.3.1 Xét nghiệm huyết đồ

Tiến hành theo quy trình tiêu chuẩn của khoa tế bào và tổ chức học, việnhuyết học truyền máu, dựa trên kỹ thuật đã được Williams mô tả [49]

2.3.3.2 Xét nghiệm tủy đồ

Xét nghiệm số lượng tế bào tủy, % tế bào bất thường trong tủy [49]

2.3.3.3 Kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào

Nhuộm peroxydase (MPO), sudan đen, esterase đặc hiệu và không đặchiệu, PAS (Periodic acid–Schiff)

2.3.3.4 Kỹ thuật phân tích nhiễm sắc thể

- Kỹ thuật nuôi cấy tế bào tủy ngắn hạn

- Kỹ thuật nhuộm giemsa đánh giá sơ bộ

- Kỹ thuật nhuộm băng G phát hiện các bất thường NST

- Phân tích nhiễm sắc thể trên máy

2.3.3.5 Kỹ thuật xác định kháng nguyên màng tế bào

- Phân tích các CD dòng tủy để loại trừ: CD13, 14, 33, 34

- Phân tích các CD dòng lympho CD3, 7, 10, 19, 20

2.3.3.6 Kỹ thuật PCR phát hiện các đột biến gen ABL/BCR, MLL/AF4, TEL/AML1, E2A/PBX1

Các bước tiến hành như sau:

- Tách chiết tế bào bạch cầu: Tiến hành tách chiết bạch cầu hạt từ dịch tủyxương bằng ly tâm gradient tỷ trọng kép

- Tách chiết RNA từ tế bào bạch cầu

- Tổng hợp cDNA: RNA sau khi tách chiết sẽ dùng để tổng hợp cDNA

- Tiến hành PCR

2.3.4 Quy trình nghiên cứu

- Chẩn đoán xác định bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng lympho theo tiêu chuẩn

WHO 2001

- Thu thập các triệu chứng lâm sàng

- Xét nghiệm xếp loại miễn dịch

- Xét nghiệm công thức nhiễm sắc thể

- Xét nghiệm phát hiện các đột biến gen: ABL/BCR, MLL/AF4, TEL/AML1, E2A/PBX1

- Các xét nghiệm cơ bản

- Lập hồ sơ chi tiết

2.3.5 Các tiêu chuẩn đánh giá

2.3.5.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán lơ xê mi cấp dòng lympho

- Chẩn đoán lơ xê mi cấp:

+ Lâm sàng: bệnh có hội chứng xuất huyết, thiếu máu, nhiễm trùng,

thâm nhiễm

+ Xét nghiệm: Theo WHO chẩn đoán xác định khi tỷ lệ tế bào non ác tínhtrên 20% các tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu trong tủy xươnghoặc/và trong máu ngoại vi

- Chẩn đoán lơ xê mi cấp dòng lympho theo tiêu chuẩn WHO 2001 nhuộmPAS dương tính, xét nghiệm xếp loại miễn dịch :

+ CD10, CD19, CD20, CD21; CD38, CD79, TdT (Lympho B)

+ CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CyCD3 (Lympho T)

- Xếp loại lơ xê mi cấp dòng lympho theo FAB năm 1976

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ SỐ LIỆU

- Thu thập, xử lý các số liệu trung bình, độ lệch, trung vị,

giá trị lớn nhất, nhỏ nhất, so sánh sự chênh lệch có ý nghĩa thống ống kê giữa

2 biến (giá trị p) bằng chương trình SPSS 21.0

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NHÓM BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Đặc điểm về tuổi, giới

NAM; 56.45%

NỮ; 43.55%

ĐẶC ĐIỂM GIỚI TÍNH

Biểu đồ 3.1 : Đặc điểm về giới tính bệnh nhân nghiên cứu (n=62)

Nhận xét : Tổng số bệnh nhân nghiên cứu là 62, trong đó có 35 bệnh nhân

nam, chiếm 56,45%, nữ giới chiếm 43,55% Sự khác biệt về giới không có ýnghĩa thống kê (p=0.31>0.05)

Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi (n=62)

Tuổi trung bình của nhóm nghiên cứu (n=62) là 16.69 ± 16.49, thấp nhất

là 3 tuổi, cao nhất là 71 tuổi

Nhận xét : Trong nhóm nghiên cứu các bệnh nhân phân bố theo độ tuổi

không đều, tập trung nhiều vào nhóm trẻ tuổi ( dưới 20 tuổi) Nhóm bệnhnhân có độ tuổi dưới 10 chiếm tỷ lệ cao nhất với 40.3 % Nhóm bệnh nhân có

độ tuổi trên 60 chiếm tỷ lệ thấp nhất với 1,6%

3.1.2 Đặc điểm xếp loại bệnh nhân theo FAB 1987 và theo WHO 2001

Biểu đồ 3.2 : Phân bố bệnh nhân ALL theo thể bệnh FAB (n=62)

Nhận xét : Dựa trên kết quả xét nghiệm hình thái học, Lơ xê mi cấp thể L2

chiếm tỷ lệ cao nhất 79% Chiếm tỷ lệ thấp nhất là thể L1 với 9.7%

B sớ

m

B com

on Tiền B

Nhận xét : Nhóm nghiên cứu có 62 bệnh nhân được chẩn đoán thể bệnh bằng

các dấu ấn miễn dịch Trong đó, thể Lơ xê mi cấp tế bào B trưởng thànhchiếm tỷ lệ cao nhất với 35.5% Có 4.8% trường hợp thuộc dòng tế bào B

nhưng chưa xếp loại được thành các dưới nhóm, và 6.5% trường hợp dòng tếbào T chưa xếp loại được thành các dưới nhóm.

3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BẤT THƯỜNG DI TRUYỀN

Nghiên cứu trên 62 bệnh nhân Lơ xê mi cấp dòng lympho chúng tôi ghinhận các bất thường di truyền trên cả NST và gen với kết quả cụ thể như sau:

3.2.1 Kết quả phân tích nhiễm sắc thể

%

Biểu đồ 3.4: Kết quả phân tích nhiễm sắc thể tủy (n=62)

Nhận xét : Trong số 62 bệnh nhân nghiên cứu, tỷ lệ có NST bất thường chiếm

30.6% và dạng bất thường về cấu trúc NST hay gặp nhất trong các dạng bất

thường về NST

Nhận xét : Với 16 bệnh nhân có bất thường cấu trúc NST cho thấy chuyển

đoạn t(9 ;22) gặp tỷ lệ cao nhất và có nhiều bất thường phức tạp đi kèm vớichuyển đoạn t(9 ;22)

83.9 16.1

TỶ LỆ BỆNH NHÂN CÓ NHIỄM SẮC THỂ Ph1

KHÔNG CÓ NST Ph1

CÓ NST Ph1

Biểu đồ 3.5: Tỷ lệ bệnh nhân có NST Ph (n=62)

Nhận xét : Tỷ lệ bệnh nhân có NST Ph chiếm 16.1% trong tổng số 62 bệnh

nhân nghiên cứu

BẤT T

HƯỜN

G CẤ

U TRÚC

Nhận xét : Nhóm L2 có đầy đủ các loại bất thường NST và với tỷ lệ cao nhất.

Nhóm L1 không gặp các bất thường về số lượng NST đơn thuần Nhóm L3không gặp dạng phối hợp cả bất thường về số lượng và cấu trúc NST

Biều đồ 3.7: Mối liên quan giữa các bất thường NST và thể bệnh ALL

theo xếp loại miễn dịch (n=62)

Nhận xét : Trong số 62 bệnh nhân, các bất thường NST hầu như chỉ gặp ở

bệnh nhân Lơ xê mi cấp dòng lympho tế bào B, và một số ít ở nhóm tế bào T

3.2.2 Kết quả phân tích các đột biến gen

Phân tích các loại đột biến gen ABL/BCR, MLL/AF4, TEL/AML1, E2A/PBX1 trên 62 bệnh nhân Lơ xê mi cấp dòng lympho thực hiện tại phòng Ditruyền Viện huyết học và truyền máu Trung ương chúng tôi ghi nhận đượccác kết quả như sau:

Nhận xét : Nghiên cứu cho thấy 41.9 % bệnh nhân có đột biến gen Trong các

đột biến gen nghiên cứu thì gen ABL/BCR ( gồm p190 và p210) gặp nhiềuhơn với 21% Mức 21% cũng là tỷ lệ gặp của đột biến gen E2A/PBX1

Biểu đồ 3.8: Tỷ lệ các đột biến gen ABL/BCR p190, ABL/BCR p210 MLL/AF4, TEL/AML1, E2A/PBX1 theo giới (n=26)

Nhận xét: Sự xuất hiện của đa số các gen lai nhiều hơn ở nam Tuy nhiên sự

khác biệt không có ý nghĩa thống kê