Xác định sự liên quan giữa các điểm đa hình trên gen DKK1 với gãy xương cột sống do loãng xương trên phụ nữ mãn kinh

Loãng xương là một bệnh được đặc trưng bởi tình trạng mật độ xương thấp và cấu trúc xương bị suy đồi dẫn tới làm tăng nguy cơ gãy xương [5].. Định nghĩa loãng xương Theo Tổ chức Y tế Thế

ĐẶT VẤN ĐỀ

Loãng xương và gãy xương do loãng xương là một vấn đề y tế quan trọng, được coi là vấn đề sức khỏe cộng đồng đáng được quan tâm trên toàn cầu Hậu quả đáng ngại nhất của loãng xương là gãy xương dẫn đến thay đổi

mô hình bệnh tật và làm giảm chất lượng cuộc sống Mức độ nặng nề của biến chứng gãy xương trong bệnh loãng xương được xếp tương đương với bệnh mạch vành, tai biến mạch máu não Loãng xương là nguyên nhân của hơn 8,9 triệu ca gãy xương mỗi năm và dẫn tới mất khoảng 5,8 triệu năm sống có chất lượng [1] Gãy xương do loãng xương gây tổn thất lớn cho nền kinh tế quốc gia Ở châu Âu năm 2010 số tiền mà xã hội phải chi trả cho bệnh loãng xương

là 37 tỷ Euro [2] Ở Mỹ mỗi năm có khoảng 1,5 triệu ca gãy xương tương đương với khoảng 17 tỷ đô la chính phủ Mỹ phải chi trả Theo ước tính thì một nửa số ca gãy cổ xương đùi sẽ xẩy ra ở châu Á [3,4] Mặc dù vậy các nghiên cứu để làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh của loãng xương và gãy xương do loãng xương trên người châu Á còn hạn chế

Loãng xương là một bệnh được đặc trưng bởi tình trạng mật độ xương thấp và cấu trúc xương bị suy đồi dẫn tới làm tăng nguy cơ gãy xương [5] Đo mật độ xương bằng phương pháp hấp thụ tia X năng lượng kép là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán loãng xương và là yếu tố tốt nhất để tiên lượng nguy cơ gãy xương trên cả nam và nữ [6,7]

Phụ nữ mãn kinh là đối tượng có nguy cơ cao bị loãng xương do buồng trứng suy giảm chức năng sản xuất hormon estrogen Tại Việt Nam theo số liệu của Nguyễn Thị Thanh Hương tại Hà Nội năm 2009 tỷ lệ loãng xương ở phụ nữ trên 50 tuổi là 23,1% ở CXĐ và 49,5% ở CSTL Theo Hồ Phạm Thục Lan, phụ

nữ mãn kinh ở thành phố Hồ Chí Minh có tỷ lệ loãng xương CXĐ là 28,6% [8]

Tỷ lệ loãng xương của phụ nữ Việt Nam cao tương đương với phụ nữ da trắng ở

Úc (21%) [11], Mỹ (20%) [12], và cao hơn nhiều so với phụ nữ Đông Á như: Trung Quốc (10%) [13], Nhật Bản (17%) [14], Hàn Quốc (10%) [15].

Nghiên cứu trên các cặp song sinh và phả hệ đã chỉ ra rằng gen quyết định khoảng 50 - 80% trong sự thay đổi của mật độ xương [16] Tới nay đã có

56 loci được tìm thấy là có liên quan đến sự thay đổi mật độ xương [17], 14 loci mật độ xương liên quan đến nguy cơ gãy xương và 6 loci trong số đó đạt mức có ý nghĩa (p<5x108) bao gồm: 18p11.21 (C18orf19), 7q21.3 (SLC25A13), 11q13.2 (LRP5), 2q16.2 (SPTBN1), 4q22.1 (MEPE) và 10q21.1 (DKK1) [17] Khi sinh thiết xuyên xương chậu, biểu hiện của năm gen tương quan với mật độ xương CXĐ và/hoặc CSTL với p<0,001 bao gồm PSME4 (2p16.2), DKK1 (10q21.1), C17orf91 (17p13.3), SOST (17q21.31_1) và DUSP3 (17q21.31_1) Trong số đó DKK1 là tương quan đáng kể nhất với MĐX CXĐ (P = 1,3 x 10-3) và MĐX CSTL (p = 3,2 x 10-4) [18] Các nghiên cứu tại Trung Quốc và Iran đưa đến kết luận nồng độ DKK1 huyết thanh của những bệnh nhân là phụ nữ mãn kinh bị loãng xương thì cao hơn phụ nữ mãn kinh không bị loãng xương [64,65].Tuy nhiên cho tới nay chưa có nghiên cứu nào về đa hình gen DKK1 và loãng xương được tiến hành ở Đông Nam Á nói chung cũng như

Việt Nam nói riêng Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: "Xác định sự liên quan giữa các điểm đa hình trên gen DKK1 với gãy xương cột sống do loãng xương trên phụ nữ mãn kinh" với mục tiêu:

1 Xác định kiểu gen DKK1 tại SNP rs1373004 trên phụ nữ mãn kinh.

2 Mô tả sự liên quan giữa kiểu gen DKK1 tại SNP rs1373004 với gãy xương cột sống do loãng xương trên phụ nữ mãn kinh.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về bệnh loãng xương

1.1.1 Định nghĩa loãng xương

Theo Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) năm 1993, loãng xương được định nghĩa là một bệnh lý của xương, đặc trưng bởi sự giảm khối lượng xương kèm theo hư biến cấu trúc của xương, dẫn đến tăng tính dễ gãy của xương, tức là

có nguy cơ gãy xương Đến năm 2001 WHO định nghĩa loãng xương, đặc trưng bởi sự thay đổi sức mạnh của xương Sức mạnh này đặc trưng bởi mật

độ xương và chất lượng của xương Chất lượng xương được đánh giá bởi các thông số: cấu trúc của xương, chu chuyển xương, độ khoáng hóa, tổn thương tích lũy, tính chất của các chất cơ bản của xương Trong các thông số này chu chuyển xương đóng một vai trò quan trọng

Hình 1.1 Mô xương bình thường và mô xương bị loãng xương

(Nguồn:http://tuoitre.vn/tin/can-biet/20150703/bien-chung-loang-xuong-co-the-gay-tan-tat-suot-doi/770961.html)

1.1.2 Đặc điểm dịch tễ của loãng xương

Loãng xương với hậu quả là gãy xương là một bệnh phổ biến nhất hiện nay ở người lớn tuổi, chỉ đứng sau bệnh tim mạch [18] Bệnh gây nhiều hậu quả ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống và là nguyên nhân gia tăng tỷ

lệ tử vong

Loãng xương được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới, trong đó Châu

Âu, Châu Mỹ, Tây Thái Bình Dương và khu vực Đông Nam Á là những nơi

có tỷ lệ loãng xương cao Trên thế giới ước tính có khoảng hơn 200 triệu người bị loãng xương [3]

Ở Châu Âu năm 2010 có khoảng 22 triệu người phụ nữ mắc bệnh loãng xương trong đó 5,5 triệu người trong độ tuổi từ 50 đến 84 tuổi Tỷ lệ tử vong

do gãy xương ở phụ nữ là 50% đối với gãy CXĐ, 28% đối với gãy xương cột sống và 22% do các gãy xương khác [19] Tại Bỉ năm 2010 có khoảng 60 000 người trên 50 tuổi bị gãy xương do loãng xương [20]

Ở Châu Á tại Trung Quốc có 70 triệu người dân trên 50 tuổi bị ảnh hưởng bởi bệnh loãng xương và khoảng 687 000 trường hợp gãy CXĐ xẩy ra mỗi năm tại nước này[21] Ở Ấn Độ năm 2003 có khoảng 26 triệu bệnh nhân

bị loãng xương và dự kiến sẽ tăng lên 36 triệu vào năm 2013 [22]

Tại Việt Nam, tỷ lệ loãng xương và gãy xương do loãng xương cao tương đương với người da trắng và cao hơn so với một số nước Đông Á [9,23] Theo

số liệu của Nguyễn Thị Thanh Hương tại Hà Nội năm 2009 tỷ lệ loãng xương ở phụ nữ trên 50 tuổi là 23,1% ở CXĐ và 49,5% ở CSTL [23] Tỷ lệ loãng xương của nam giới là 8,5% ở cổ xương đùi và 12,4% ở đốt sống thắt lưng [24] Nhìn chung tỷ lệ loãng xương nguyên phát giữa nữ và nam là 4:1 [26] Nghiên cứu của tác giả Hồ Phạm Thục Lan tại thành phố Hồ Chí Minh năm 2011 thì tỷ lệ loãng xương ở phụ nữ trên 50 tuổi ở CXĐ là 28,6%[8] Các số liệu về tỷ lệ

loãng xương của phụ nữ mãn kinh người Việt tại Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh đều cao hơn Trung Quốc(10%), Nhật Bản (17%), Hàn Quốc (10%) và tương đương với người da trắng ở Úc (21%) và ở Mỹ (20%).

Khi tập trung nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến mật độ xương như lối sống, hormon sinh dục (estrogen và testosterone), vitamin D, phát hiện ra rằng có sự khác biệt giữa dân cư thành thị và nông thôn Cư dân ở thành thị có mật độ xương thấp hơn và loãng xương nhiều hơn ở nông thôn [24] Các nghiên cứu về loãng xương cũng chỉ ra rằng tuổi càng cao mật độ xương càng giảm, tỷ lệ gãy xương do loãng xương cũng tăng theo độ tuổi [25] Các nghiên cứu trên phụ nữ có thiếu hụt estrogen như phụ nữ sau mãn kinh, mãn kinh sớm, phụ nữ bị cắt buồng trứng trước 45 tuổi cho thấy tỷ lệ loãng xương tăng cao [27] Tuy nhiên, nếu xem xét trong mô hình phân tích

đa biến thì tất cả các yếu tố như tuổi, cân nặng, lối sống, hormone cũng chỉ giải thích được 15%-50% sự thay đổi của mật độ xương [24] Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu song sinh và phả hệ là gen quyết định 50%-85% sự thay đổi của mật độ xương [16,27]

1.1.3 Nguyên nhân và phân loại loãng xương

Loãng xương được chia làm hai loại là loãng xương nguyên phát và loãng xương thứ phát Loãng xương nguyên phát bao gồm loãng xương sau mãn kinh (typ 1) và loãng xương tuổi già (typ 2)

1.1.3.1 Loãng xương nguyên phát: (chiếm khoảng 80%): Là loại loãng xương

không tìm thấy căn nguyên nào khác và/hoặc tình trạng mãn kinh ở phụ nữ Nguyên nhân do quá trình lão hóa của tạo cốt bào, làm xuất hiện tình trạng mất cân bằng giữa hủy xương và tạo xương gây nên tình trạng suy giảm mật

độ xương và hư hỏng cấu trúc xương, làm gia tăng nguy cơ gãy xương Loãng xương nguyên phát được chia thành 2 typ

* Loãng xương sau mãn kinh - typ 1: Thường gặp ở phụ nữ đã mãn kinh vài năm hoặc cắt buồng trứng, khoảng từ 50 đến 60 tuổi.

Mãn kinh được định nghĩa là sự chấm dứt vĩnh viễn kinh nguyệt và khả năng sinh sản do việc mất hoạt tính nang buồng trứng Mãn kinh tự nhiên được công nhận là đã xẩy ra sau 12 tháng liên tiếp vô kinh mà không có bất

kỳ nguyên nhân sinh lý hoặc bệnh lý nào khác

Nguyên nhân chủ yếu của loãng xương sau mãn kinh là do sự thiếu hụt estrogen, ngoài ra có sự giảm tiết Parathyroid hormon (PTH), tăng thải canxi qua nước tiểu [25] Tổn thương chủ yếu là mất chất khoáng ở xương xốp, biểu hiện bằng sự gãy lún các đốt sống hoặc đầu dưới xương quay [18]

Quá trình phát triển của xương phải trải qua hai giai đoạn: Tạo mô hình và tái tạo mô hình để biệt hóa các nhóm tế bào xương giúp cho sự tạo thành xương hoặc làm mới xương [32] Tạo mô hình là quá trình chu chuyển xương lúc còn nhỏ để tạo hình dạng và chiều dài xương Tái tạo mô hình là quá trình xương liên tục sữa chữa và tự làm mới để duy trì mật độ xương ở mức tối thiểu

Tế bào hủy xương, tế bào tạo xương, cốt bào và các tế bào liên kết là những tế bào tham gia vào quá trình tạo xương

Hormon sinh dục estrogen và testosteron đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo xương ở cả nam và nữ [29,30] Hormon estrogen do tế bào hạt của buồng trứng bài tiết ra tác động đến xương thông qua thụ thể estrogen [30,31] Ảnh hưởng của estrogen là làm giảm số lượng và ức chế hoạt động của

tế bào hủy xương, dẫn đến kìm hãm quá trình phân hủy xương trong mọi giai đoạn của quá trình tái tạo mô hình [27] Vì một lý do nào đó lượng estrogen bị sụt giảm đột ngột và trầm trọng, các tế bào hủy xương thoát khỏi sự kìm hãm

về số lượng và hoạt động dẫn đến mất cân bằng giữa hai quá trình tạo xương và

hủy xương, quá trình hủy xương mạnh hơn làm cho lượng khoáng trong xương

bị suy giảm, xẩy ra tình trạng mất xương và loãng xương

Estrogen tồn tại trong cơ thể người gồm ba dạng chính là estradiol, estron và estriol Trước thời kỳ mãn kinh 95% lượng estradiol trong máu do buồng trứng bài tiết, một phần nhỏ do chuyển hóa từ estron dưới tác dụng của androgen vỏ thượng thận Khi phụ nữ mãn kinh tức là buồng trứng giảm tiết

và dần đi đến ngừng hoạt động do đó sẽ ảnh hưởng đến quá trình bài tiết estrogen Nồng độ estradiol, estron giảm rõ trong 12 tháng đầu tiên sau mãn kinh và tiếp tục giảm với tốc độ chậm hơn trong những năm tiếp theo

Androgen tác động lên xương thông qua cơ chế chuyển androgen thành estrogen tại chỗ và một phần thông qua tác động trực tiếp của androgen lên xương Tác dụng chủ yếu của androgen là kích thích quá trình phân chia tế bào tạo xương và ức chế quá trình chết theo chương trình [28] Huber và cộng

sự nghiên cứu năm 2001 đã tìm thấy sự có mặt của các recepter đặc hiệu androgen trên tế bào tạo xương được nuôi cấy [28] Năm 2004, Vanderschueren

và cộng sự đã nghiên cứu và cung cấp thêm bằng chứng củng cố cho tác dụng trực tiếp của androgen lên xương khi cho chuột điều trị bằng dihydrotestosteron

đã cho kết quả làm tăng tạo xương

Năm 2014 Nguyễn Thị Thanh Hương và cộng sự đã công bố sự thay đổi của nồng độ estrogen và testosteron huyết thanh toàn phần của nam và nữ người Việt tuổi từ 18 đến 83 Ở phụ nữ người Việt, nồng độ estrogen tương đối hằng định trước tuổi 40, sau đó giảm rõ rệt trong giai đoạn từ 40 đến 60 tuổi, sau tuổi 60 thì đạt giá trị hằng định thấp Trong khi đó nồng độ testosteron toàn phần giảm rõ rệt theo tuổi, xung quanh tuổi 50 nồng độ testosteron chỉ bằng một nửa so với tuổi 20 Đồng thời kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy cả hai hormon sinh dục đều có ý nghĩa thống kê trong mô hình tiên lượng MĐX ở cả nam và nữ [33]

Mối liên quan giữa loãng xương và mãn kinh đã được biết đến từ lâu Trước mãn kinh MĐX ở cổ xương đùi giảm 30% và sẽ tiếp tục giảm thêm 25% ngay sau mãn kinh Mức độ mất xương ở cột sống là khoảng 5-7% mỗi năm và khoảng 93-95% diện tích các khoang hủy xương được thay thế xương mới [34] Như vậy càng ngày các bè xương càng mỏng dần, xuất hiện các khoảng trống và có thể mất hết các bè xương Vỏ xương mỏng dần và trở nên xốp, làm thay đổi cấu trúc xương dẫn đến loãng xương [34].

* Loãng xương tuổi già - typ 2: Thường gặp ở cả nam và nữ trên 70 tuổi Là hậu quả của sự mất xương trong nhiều năm, liên quan đến 2 yếu tố giảm hấp thu canxi ở ruột và giảm chức năng của tế bào tạo xương gây cường cận giáp thứ phát làm tăng bài tiết canxi qua nước tiểu Tổn thương mất chất khoáng toàn thể cả xương xốp và xương đặc, biểu hiện chủ yếu là gãy CXĐ

* Các yếu tố nguy cơ gây loãng xương: Tuổi, oestrogen, yếu tố dinh dưỡng, tình trạng vận động, yếu tố di truyền và các bệnh lý ảnh hưởng đến mật độ xương

- Gene quyết định 50-85% mật độ xương

Nghiên cứu các gen cấu trúc của các bệnh phổ biến và phức tạp đã đạt được những bước đột phá trong khoảng 5 năm gần đây với sự ra đời của genome-wide [35] Những hiểu biết mới về gen sẽ làm sáng tỏ bản chất cơ chế bệnh sinh giúp chúng ta xây dựng chiến lược đánh giá nguy cơ và đưa ra được những giải pháp can thiệp mới Nghiên cứu trên các cặp song sinh và phả hệ đã chỉ ra rằng gen quyết định khoảng 50-85% trong sự thay đổi của mật độ xương [16] Tuy nhiên gãy xương do loãng xương di truyền theo cơ chế không hoàn toàn phụ thuộc vào mật độ xương [36] Hiện nay đã tìm thấy

56 loci liên quan đến sự thay đổi mật độ xương trong đó có 14 loci mật độ xương liên quan đến gãy xương và 6 loci trong số đó đạt mức có ý nghĩa (p<5x108) bao gồm: 18p11.21 (C18orf19), 7q21.3 (SLC25A13), 11q13.2 (LRP5), 2q16.2 (SPTBN1), 4q22.1 (MEPE) và 10q21.1 (DKK1) [17].

- Dựa vào Hiệp hội Loãng xương Quốc (IOF) tế ta có bảng đánh giá nguy cơ loãng xương trên cơ sở trả lời các câu hỏi sau:

1 Cha mẹ bạn có bị gãy cổ xương đùi sau chấn thương rất nhẹ không?

2 Bản thân bạn có bị gãy cổ xương đùi sau chấn thương rất nhẹ không?

3 Bạn đã từng dùng cortisol, prednisolon trên 3 tháng?

4 Chiều cao của bạn có bị giảm trên 3 cm?

5 Bạn có thường xuyên uống rượu không?

6 Bạn có hút trên 20 điếu thuốc lá mỗi ngày không?

7 Bạn có thường bị tiêu chảy không?

8 Bạn đã mãn kinh hoặc cắt bỏ buồng trứng trước 45 tuổi?

9 Bạn có mất kinh trên 12 tháng (không liên quan đến thai kỳ) không?

10 Riêng đối với nam: Bạn có bị bất lực, giảm ham muốn tình dục hoặc

có các tình trạng liên quan đến giảm testosteron ?

Càng có đồng thời nhiều yếu tố nguy cơ, khả năng loãng xương và/hoặc

có nguy cơ gãy xương càng lớn

1.1.3.2 Loãng xương thứ phát

Là loại loãng xương tìm thấy nguyên nhân do một số bệnh hoặc một số thuốc gây nên như: Cường vỏ thượng thận, dùng nội tiết tố thượng thận kéo dài, cường giáp trạng, cường cận giáp, thiếu calci, suy sinh dục rối loạn hấp thu, đa u tủy xương

1.1.4 Chẩn đoán loãng xương

* Rối loạn tư thế cột sống: Cột sống có thể bị biến dạng đặc biệt là khi xẹp nhiều đốt sống, bệnh nhân gù cong đoạn cột sống lưng, thắt lưng có thể tới mức các xương sườn 10-12 cọ sát vào thành chậu và bệnh nhân giảm chiều cao Khi có biến dạng cột sống thắt lưng thì bệnh nhân sẽ đau cột sống

*Gãy xương: Các vị trí thường gặp là đầu trên xương đùi, đầu trên xương cánh tay, đầu dưới xương cẳng tay, xương chậu, xương sườn và xương cùng

1.1.4.2 Triệu chứng cận lâm sàng

* X- quang

- Giai đoạn sớm là hình ảnh đốt sống tăng thấu quang đồng nhất hoặc có thể thấy hình ảnh đốt sống hình răng lược tức là chỉ mất các bè xương ngang còn lại bè dọc

- Giai đoạn muộn ngoài hình ảnh đốt sống tăng thấu quang có thể thấy biến dạng cột sống, tiến triển theo chỉ số Genant [69]

INCLUDEPICTURE

"http://www.iofbonehealth.org/sites/default/files/osteofound/filemanager/health_professionals/images/vert_fract_grading.gif" \* MERGEFORMAT

- Độ 0: Bình thường

- Độ 1: Biến dạng nhẹ: giảm chiều cao đốt sống từ 20-25%.

- Độ 2: Biến dạng trung bình: giảm chiều cao đốt sống từ 25-40%.

- Độ 3: Biến dạng nặng: giảm chiều cao đốt sống trên 40%.

Hình 1.2 Các dạng gãy xương cột sống qua đánh giá bằng X- quang

(chỉ số Genant)

Triệu chứng âm tính quan trọng trên X-quang là không có tổn thương hủy xương ở đốt sống, khe liên đốt sống không bị hẹp, các cung sau gần như bình thường

* Đo mật độ xương: Từ năm 2002 các hội nghị quốc tế về loãng xương

đã thống nhất quan điểm về giá trị các loại máy đo mật độ xương, chỉ có sử dụng máy đo hấp thụ tia X năng lượng kép (DEXA-Dual Energy X-ray Absorptiometry) tại các vị trí trung tâm như CSTL, CXĐ mới có giá trị chẩn đoán

* Các xét nghiệm sinh hóa

Trong loãng xương nguyên phát xét nghiệm hội chứng viêm, bilan phospho- calci bình thường

Ngay sau khi xuất hiện một lún xẹp đốt sống mới, tốc độ máu lắng giờ đầu có thể tăng tới 30mm, phosphatase kiềm tăng thoáng qua, song các chỉ số này sẽ trở về bình thường trong vòng 1 tuần

1.1.4.3 Chẩn đoán xác định

Hiện nay trên lâm sàng tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bệnh loãng xương

là dựa vào đo mật độ xương bằng phương pháp hấp thụ tia X năng lượng kép tại các vị trí trung tâm như CXĐ và CSTL Tiêu chuẩn chẩn đoán loãng xương của WHO dựa vào mật độ xương (BMD- Bone Mineral Density) tính theo T-score T- score của một cá thể là chỉ số mật độ xương BMD của cá thể

đó so với BMD của nhóm người trẻ tuổi làm chuẩn

Bảng 1.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán loãng xương của WHO dựa vào mật độ

xương tính theo T-score

(-2,5) ≤ T-score ≤ (-1) Thiểu xương

T-score < (-2,5) và có gãy xương Loãng xương nặng

1.2 Tổng quan nghiên cứu về DKK1

1.2.1 Vị trí và cấu trúc của gen DKK1

Ở người gen DKK1 nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 10 tại vị trí 10q21.1 từ nucleotid 52314281 đến nuceotid 52318042

Hình 1.3 Vị trí cấu trúc gen DKK1 trên nhiễm sắc thể 10.

1.2.2 Chức năng sinh hóa của protein DKK1

Protein DKK1 thuộc gia đình Dickkopf gồm DKK1-4 Protein DKK1 có kích thước 266aa với khối lượng phân tử 28.672 Da

DKK1 là một glycoprotein đối kháng đường truyền tín hiệu Wnt β

catenin và disheveled Wnt tín hiệu βcatenin là trung tâm của sự phát triển

xương Điều chỉnh tín hiệu Wnt bằng cách gắn vào các dòng thụ thể Wnt lipoprotein liên quan đến LRP5-6 và Kremen 1-2 DKK1 đối kháng tín hiệu Wnt có vai trò quan trọng cho sự phát triển của phôi thai có xương sống, tham gia vào trung bì và hình thành đốt sống, ngoại bì để tạo khuôn mẫu chi và tăng trưởng DKK1 tham gia trong điều chỉnh mật độ xương , tăng trưởng tóc, liên quan đến viêm loét, ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư trong đa u tủy xương, ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến (cùng với P53 là một chất ức chế khối u) [61,62,63]

Cơ chế để DKK1 đối kháng tín hiệu Wnt còn chưa rõ ràng Một số tác giả cho rằng DKK1 ái lực cao với LRP6/LRP5 và thúc đẩy chúng thoái hóa do đó

giảm mức độ LRP6/LRP5 trên bề mặt tế bào nên không đáp ứng với protein Wnt Một số tác giả khác lại cho rằng DKK1 ràng buộc để phá vỡ LRP6 Wnt/LRP5Wnt gây ra Frizz Led-LRP6/LRP5 và ức chế tín hiệu Wnt [61] DKK1 điều chỉnh sự phát triển của xương và duy trì khối lượng xương Ảnh hưởng qua lại của DKK1 và LRP6/LRP5 là cơ chế đặc trưng nhất điều chỉnh tín hiệu Wnt trong xương ở người Dữ liệu di truyền ảnh hưởng của DKK1 về khối lượng xương được hỗ trợ bởi các thí nghiệm trên chuột Ovariectoniezed đã khẳng định DKK1 làm tăng tác dụng của sự thiếu hụt estrogen và glucocorticoid trên trọng lượng xương DKK1 là yếu tố quyết định chính của trọng lượng xương và khớp trong các bệnh lý khớp Protein DKK1 tăng trong nguyên bào sợi hoạt dịch và tăng trong huyết thanh của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp Tác dụng của DKK1 trên xương thông qua

ức chế tín hiệu Wnt dẫn đến suy giảm hình thành xương mới và đồng thời kích hoạt hoạt động của tế bào hủy xương gây tiêu xương [61,62]

Hình 1.4 Cơ chế DKK1 điều chỉnh sự phát triển và duy trì

khối lượng xương

Gen DKK1 biểu hiện ở mức độ thấp nhất trong hầu hết các mô của người bình thường Nó biểu hiện trong các giai đoạn khác nhau của khối u trong ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, đại trực tràng, thực quản, phổi, đa u tủy xương DKK1 thúc đẩy sự tái hấp thu xương và tạo thuận lợi cho việc chuyển đổi di căn của tế bào tạo xương

1.3 Tình hình nghiên cứu về mối liên quan giữa gen và loãng xương, gãy xương

Các nghiên cứu về gen liên quan đến loãng xương và gãy xương đã được tiến hành ở một số nước trên thế giới Nghiên cứu trên toàn bộ gen của Karol Estrad và cộng sự năm 2012 đã xác định 56 loci liên quan với MĐX, 14 loci liên quan đến nguy cơ gãy xương [17] Trong đó, 6 loci có sự liên quan cao nhất với (p<5x108) bao gồm: 18p11.21 (C18orf19), 7q21.3 (SLC25A13), 11q13.2 (LRP5), 2q16.2 (SPTBN1), 4q22.1 (MEPE) và 10q21.1 (DKK1)[17] Khi sinh thiết xuyên xương chậu và phân tích Karol Estrad và cộng sự đã nhận thấy biểu hiện của năm gen tương quan với mật độ xương CXĐ và/hoặc CSTL với p<0,001 bao gồm PSME4 (2p16.2), DKK1 (10q21.1), C17orf91 (17p13.3), SOST (17q21.31-1) và DUSP3 (17q21.31-1) Trong số đó DKK1

là tương quan đáng kể nhất với MĐX CXĐ (P = 1,3 x 10-3) và MĐX CSTL (P

= 3,2 x 10-4) [17]

Theo Jun Jian và cộng sự năm 2015 ở Trung Quốc khi nghiên cứu trên

350 bệnh nhân là phụ nữ mãn kinh loãng xương và 150 người bình thường thì thấy nồng độ huyết thanh DKK1 của nhóm bệnh nhân lớn hơn nhóm chứng với p< 0,001 Phân tích hồi quy đa biến cho thấy DKK1 tương quan nghịch với βcatenin (β =-0,165; P = 0,009) và BMD (β = -0,139; p = 0,027)[64]

Ở Iran năm 2013, Mehrzad Hajialilo và cộng sự nghiên cứu trên 44 phụ

nữ mãn kinh loãng xương và 44 phụ nữ bình thường cho kết quả nồng độ DKK1 của nhóm bệnh là (2,91 ± 1,27) cao hơn đáng kể so với nhóm chứng

sự tương quan giữa 6 biến thể của DKK1 với loãng xương [66]

Tại Trung Quốc khi nghiên cứu trên 192 bệnh nhân bị chứng loạn sản khớp hông (DDH) và đối chứng với 191 người bình thường tác giả Liu Shengnan và cộng sự đã kết luận DKK1 có liên quan đến sự phát triển của DDH đặc biệt là các tần số alen A tai rs1569198 [67]

Theo Piters E và cộng sự (2010) nghiên cứu trên 783 nam giới da trắng từ 20-29 tuổi, kết quả không tìm thấy mối liên quan giữa DKK1 và BMD nhưng có

sự liên quan giữa rs1569198 với chiều dài trục hông (p = 0,012) [68]

1.4 Một số kỷ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong phát hiện đột biến gen

1.4.1 Kỹ thuật PCR

Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA polymerase Với nguyên liệu là 4 loại nucleotid, enzyme DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp một mạch AND mới từ mạch khuôn Phản ứng đòi hỏi sự

có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự AND khuôn

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau mỗi chu kỳ gồm

3 giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn tổng hợp hay kéo dài.

1.4.2 Kỷ thuật RFLP-PCR

Kỷ thuật RFLP-PCR là phương pháp nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn AND dựa trên điểm cắt của các enzym giới hạn Nói cách khác đây là phương pháp so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu bằng một enzyme giới hạn nhằm tìm hiểu xem có hay không đột biến điểm hoặc có hay không sự thay đổi một trình tự DNA Nếu trình tự DNA của hai cá thể cùng loài hoàn toàn giống nhau về số lượng và kích thước thì có sự giống nhau về các băng DNA sau khi chạy điện di Ngược lại nếu có sự xuất hiện đột biến điểm hoặc thay đổi trình tự đoạn DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA

Quá trình thực hiện kỷ thuật gồm các giai đoạn :

- Phản ứng PCR với cặp mồi thích hợp để khuyếch đại đoạn DNA chứa SNP cần phân tích

- Tiến hành phân cắt đoạn DNA với một enzyme giới hạn thích hợp

- Điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đưa ra kết luận

1.4.3 Kỷ thuật giải trình tự gen trực tiếp

DNA là cơ sở của gen Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai mạch đơn được tạo thành từ 4 loại nucleotid A, C, T, G Các nucleotid này liên kết với nhau theo một trật tự xác định Giải trình tự của một gen tức là phát hiện thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotid này trên phân tử DNA

Có nhiều phương pháp giải trình tự gen như: giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học, phương pháp enzyme và bằng máy tự động Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng sử dụng phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động

ABI PRISM 373xl Genetic Analyzer của Applied Biosystems, USA.

CHƯƠNG 2 ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

Chọn bệnh nhân là phụ nữ trên 40 tuổi đã mãn kinh (mất kinh liên tục từ 12 tháng trở lên) Các bệnh nhân được đo MĐX và chụp X-Quang CSL, CSTL.MĐX được đo ở CXĐ bên phải và CSTL từ L1 đến L4 Được chẩn đoán loãng xương nếu có chỉ số T- score < (-2,5) ở CXĐ và CSTL X-Quang chẩn đoán gãy xương cột sống theo chỉ số Genant Dựa vào kết quả đo MĐX và X-Quang các bệnh nhân sẽ được phân thành 2 nhóm:

- Nhóm bệnh: Bệnh nhân loãng xương và gãy xương cột sống

- Nhóm chứng: Bệnh nhân loãng xương không gãy xương cột sống

Cả hai nhóm bệnh nhân sẽ được phỏng vấn theo bộ câu hỏi sàng lọc, thăm khám lâm sàng theo một mẫu bệnh án nghiên cứu thống nhất bao gồm: chiều cao, cân nặng, BMI, các yếu tố nguy cơ loãng xương, tiền sử và các bệnh kèm theo (phụ lục 1) Các bệnh nhân sẽ được lấy máu làm công thức máu, các chỉ số sinh hóa thường quy

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân không có đầy đủ các tiêu chuẩn trên

- Bệnh nhân có bệnh mạn tính như bệnh gan, bệnh thận, ung thư, các bệnh nội tiết và các rối loạn chuyển hóa liên quan đến vitamin D, chuyển hóa xương như đái tháo đường, béo phì, hội chứng kém hấp thu, bệnh cường giáp trạng, hội chứng Cushing

- Bệnh nhân sử dụng các loại thuốc liên quan đến chuyển hóa vitamin D

và calci trong vòng 6 tháng như: corticoid, hormon thay thế, heparin

- Bệnh nhân có tiền sử gãy xương hoặc bất động lớn hơn 1 tháng

- Bệnh nhân bị cắt bỏ tử cung, buồng trứng, đang mang thai , cho con bú

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.3 Quy trình lấy máu

Tất cả các đối tượng thõa mãn nghiên cứu được lấy bệnh phẩm là 2 ml máu tĩnh mạch ngoại vi, chống đông bằng EDTA Bệnh phẩm lấy buổi sáng, lúc đói, sau đó 300 microlit máu chống đông được sử dụng để tách chiết DNA Số còn lại và bệnh phẩm chưa phân tích ngay sẽ được bảo quản trong

* Vị trí đo và phân tích kết quả: tại CSTL và CXĐ

- Tại CSTL: đo ở 4 vị trí từ L1 đến L4 Khối lượng xương được đo ở mặt cắt theo chiều trước sau ở vùng tương ứng với vùng đo MĐX Kết quả cuối cùng được tính bằng trung bình cộng của các chỉ số vùng đo MĐX hiển thị bằng chỉ số T do máy tự động tính theo công thức của WHO

- Tại CXĐ: đo ở 4 vị trí là CXĐ, tam giác Ward, mấu chuyển lớn, liên mấu chuyển Khối lượng xương được đo ở mặt cắt theo chiều trước sau ở vùng tương ứng với vùng đo MĐX Kết quả cuối cùng được tính bằng trung bình cộng của các chỉ số vùng đo MĐX hiển thị bằng chỉ số T do máy tự động tính theo công thức của WHO.

2.1.5 Quy trình chụp XQ và xác định các dạng gãy xương theo chỉ số Genant

* Thiết bị sử dụng: Máy DR TITAN 2000 Dual CCD - Hàn Quốc

Bệnh nhân sẽ được chụp 2 phim ở tư thế nghiêng 90 độ, một phim cột sống lưng từ D4-D12, một phim CSTL từ D12-L5

* Phân tích kết quả: Theo chỉ số Genant:

Dùng thước và compa đo các chiều cao trước, giữa và sau của thân đốt sống từ D4 –L4 Theo Genant:

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

* Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2015 đến tháng 10/2016

* Địa điểm nghiên cứu:

- Khoa Cơ Xương Khớp Bệnh viện Bạch Mai

- Bộ môn Sinh Lý trường Đại Học Y Hà Nội

2.3 Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu Bệnh – Chứng

2.4 Phương tiện nghiên cứu

2.4.1 Dụng cụ và máy móc

- Máy ly tâm Kubola 3300

- Máy minispin

- Máy lắc vortex

- Máy đo mật độ quang NanoDrop 1000

- Máy ủ nhiệt Thermomixer comfort

- Máy PCR mastercycle epgradient

- Máy điện di Mulpid Exu

- Đầu côn các loại khử trùng và không có DNAase

- Giá để ống, phiến lạnh để mẫu

- Găng tay, áo choàng, giấy thấm

- Nucleic Lysis Solution

- RNase Solution

- DNA rehydration Solution

- Protein Precipitation Solution

- Ethanol 70% ở nhiệt độ phòng

- Isopropanol tinh sạch (96-100%) ở nhiệt độ phòng

* Hóa chất để PCR, ủ enzyme, điện di

- 10X FastDigest Green Buffer

- Nước tinh sạch GIBCO UltraPure Distilled Water

- Mẫu bệnh phẩm DNA đã được tách chiết

(n = )

- Khám LS

- Đo MĐX

- X - Quang CSL, CSTL

- 2ml máu, chống đông bằng EDTA

- Tách DNA, Đo nồng độ DNA và OD

So sánh kiểu gen giữa hai nhóm

Sự liên quan giữa kiểu gen với GX-LX

và các chỉ số

nghiên cứuKết luận

2.6 Kỹ thuật phân tích mẫu nghiên cứu

- Tách DNA, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng phương pháp

đo mật độ quang bằng máy NanoDrop 1000

- Xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP-PCR

- Phương pháp giải trình tự gen trực tiếp

- Phân tích kết quả và trình bày dưới dạng tỷ lệ phần trăm

2.7 Phương pháp phân tích thống kê

Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 để phân tích thống kê

2.8 Vấn đề đạo đức của đề tài

- Các đối tượng tham gia nghiên cứu được cung cấp đầy đủ thông tin về mục đích của nghiên cứu, quy trình tiến hành và có quyền rút khỏi nghiên cứu khi không muốn tham gia

- Các thông tin liên quan đến bệnh nhân được đảm bảo bí mật

- Các kỷ thuật thao tác trên bệnh nhân được đảm bảo đúng chuyên môn

- Đề tài nghiên cứu được thực hiện hoàn toàn vì mục đích khoa hoc chứ không vì mục đích nào khác