Xác định đột biến gen FGFR trênbệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm

Hiện nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các phương tiện chẩnđoán hiện đại cho phép xác định được chính xác vị trí, kích thước khối u,mức độ xâm lấn, chèn ép não… giúp cho các bác

ĐẶT VẤN ĐỀ

U não là những khối u được hình thành do quá trình phân chia khôngkiểm soát được của tế bào thần kinh trong não Đây là căn nguyên gây tửvong đứng thứ 2 ở trẻ em (sau bệnh bạch cầu cấp) và đứng thứ 3 ở ngườitrưởng thành U não ác tính nguyên phát chiếm tỷ lệ thấp trong các loại u nãonhưng có tỷ lệ tử vong cao U nguyên bào thần kinh đệm (glioblastoma) làdạng thường gặp nhất của u não nguyên phát và được xếp vào loại ác tínhnhất (độ IV) với tỷ lệ mắc mới khoảng 3.19/100.000 người

Hiện nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các phương tiện chẩnđoán hiện đại cho phép xác định được chính xác vị trí, kích thước khối u,mức

độ xâm lấn, chèn ép não… giúp cho các bác sỹ lâm sàng đưa ra được phác đồđiều trị tối ưu nhất cho bệnh nhân Các phương pháp điều trị glioblastoma phổbiến bao gồm phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, miễn dịch… nhưng hiệu quả chưacao, thời gian sống sau điều trị còn ngắn Với sự phát triển của y học hiện đại,một phương pháp điều trị mới ra đời với mong muốn giúp kéo dài thời giansống cho bệnh nhân, đó là liệu pháp điều trị đích Liệu pháp điều trị đích này

có khả năng tác động đến thụ thể trên màng tế bào có hoạt tính tyrosin kinasegây ức chế con đường tín hiệu nội bào, ngăn chặn quá trình tăng sinh, di căn

và xâm lấn của tế bào ung thư

Gen FGFR là thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào sợi mã hóa choprotein nằm trên màng tế bào và có hoạt tính tyrosin kinase, protein này thamgia vào hoạt hóa con đường tín hiệu nội bào và được điều hòa nhờ sự bắt cặpphối tử đặc hiệu, kết quả là sự tăng sinh, xâm lấn, di căn và chết theo chươngtrình của tế bào Đột biến gen này liên quan đến cơ chế bệnh sinh của nhiềuloại ung thư như ung thư bàng quang, ung thư vú, tuyến tiền liệt… trong đó

có glioblastoma Việc xác định đột biến gen FGFR đóng vai trò quan trọngquyết định tính đáp ứng với thuốc điều trị đích.

Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào xác định đột biến gen FGFRquyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị đích bệnh glioblastoma Vì vậy

đề tài “Xác định đột biến gen FGFR trênbệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm” được thực hiện với 2 mục tiêu chính:

1 Hoàn thiện quy trình xác định đột biến N546K trên exon 12 và R576W trên exon 13 của gen FGFR trên mẫu bệnh phẩm đúc paraffin.

2 Bước đầu xác định một số đột biến N546K trên exon 12 và R576W trên exon 3 của gen FGFR ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương bệnh u nguyên bào thần kinh đệm.

U nguyên bào thần kinh đệm (glioblastoma) còn gọi là u tế bào hìnhsao độ III- IV, có thể tiên phát nhưng cũng có thể chuyển biến từ độ I, II Đó

là khối u ác tính, tại chỗ, không di căn xa, thường tái phát sau khi lấy toàn bộkhối u [1]

u nguyên bào thần kinh đệm ở Anh và Thụy Điển lần lượt là 7,53/100000 dân4,2/100000 dân

Tại Việt Nam:Theo nghiên cứu của Lê Xuân Trung và Nguyễn NhưBằng năm 1975, tỷ lệglioblastoma chiếm 8% u não [5].Theo nghiên cứu củaHoàng Minh Đỗ (2009), tỷ lệ glioblastoma chiếm 17,2% u thần kinh đệm [6]

1.1.2 Yếu tố nguy cơ

Theo Hội ung thư não Hoa Kì, nguyên nhân của những khối u não chưađược biết rõ Các nhà khoa học cho thấyviệc tiếp xúc với một số yếu tố làmtăng nguy cơ mắc ung thư não như:

Yếu tố môi trường, nghề nghiệp: Nghiên cứu cho thấy việc tiếp xúc

với các hóa chất làm tăng nguy cơ ung thư não Các chất trong một số nghềnghiệp sản xuất nhựa, chất dẻo như formaldehyde, vinyl chloride,acrylonitrile hoặc trong nông nghiệp do tiếp xúc với thuốc trừ sâu đều cónguy cơ cao mắc bệnh ung thư não Ngoài ra việc tiếp xúc với tia phóng xạtrong ngành công nghiệp hạt nhân hoặc điều trị bằng xạ trị đều có khả năngcao mắc ung thư não

Yếu tố nhân khẩu học:

- Tuổi: Thường gặp ở người trưởng thành từ 46-74 tuổi và gặp ở trẻ emvới tỷ lệ cao

- Giới: Ở nam gặp nhiều hơn nữ

- Chủng tộc: nghiên cứu cho thấy người da trắng có tỷ lệ mắcglioblastoma cao hơn những người thuộc chủng tộc khác

Yếu tố di truyền: một số rối loạn di truyền làm tăng nguy cơ mắc ung

thư não như: bệnh Von Hippel-Lindau, xơ cứng củ, hội chứng Li-Fraumeni,hội chứng Turcot, hội chứng Klinefelter… Những nghiên cứu gần đây chothấy một số biến đổi về gen như đột biến gen áp chế khối u P53 hoặc gen sinhung thư như EGFR, PDGFR, FGFR… làm tăng nguy cơ mắc glioblastoma sovới những người không mang đột biến [7]

1.1.3 Chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng

1.1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng

Vì u nguyên bào thần kinh đệm là một dạng của u não nguyên phát, cóthể gặp ở mọi vị trí của não bộ, do đó triệu chứng lâm sàng nằm trong bệnhcảnh chung của u não Các u não nói chung có hai triệu chứng lâm sàng:

- Hội chứng tăng áp lực nội sọ

+ Đau đầu: là triệu chứng phổ biến nhất của u não chiếm 50-60%, đauđầu dai dẳng tăng dần, đôi khi có từng cơn ngắn, đặc biệt tăng về ban đêm vàgần sáng, đau có đáp ứng với thuốc giảm đau giai đoạn đầu nhưng sau đó đáp

ứng kém hoặc không đáp ứng Đau đầu có thể khu trú hoặc toàn bộ đầu.Nguyên nhân đau đầu là do sự chèn ép của u não với tổ chức vùng đáy sọ,xoang tĩnh mạch và màng cứng [8].

+ Nôn hoặc buồn nôn: thường xuất hiện muộn hơn đau đầu, có khi xuấthiện cùng với đau đầu Nôn không liên quan đến yếu tố ăn uống hay sinh lýkhác Do tăng áp lực nội sọ kích thích các thụ cảm ở não thất IV Vì vậy u ởthân não, tiểu não đè trực tiếp vào trung tâm nôn, biểu hiện bằng “nôn vọt”thường gặp ở trẻ em [8]

+ Phù gai thị: là triệu chứng khách quan nhất của u não khi có sự tăng

áp lực trong sọ Phù gai thị thường xuất hiện sau đau dầu và tùy theo vị trí của

u não 12 gây đè ép, xâm lấn ảnh hưởng đến lưu thông dịch não tủy mà phùgai thị có sớm hay có muộn Biểu hiện là mờ bờ gai, phù gai thị, xuất huyếtgai thị cuối cùng là teo gai thị gây mất thị lực Phát hiện phù gai thị bằng soiđáy mắt [8]

+ Động kinh: gặp khoảng 30% u não, chủ yếu u ở trên lều tiểu não.Những cơn động kinh từng phần (cục bộ) hoặc toàn bộ [8] Rối loạn tâm thần:thay đổi tính tình, hay cáu gắt, trầm cảm, chậm chạp và giảm trí nhớ cũngthường gặp trong u não [8]

- Triệu chứng liên quan đến vị trí của khối u

+ Vùng thái dương: rối loạn ngữ do u ở cùng tiếng nói (Broca, Wernicke).+ Vùng trán: rối loạn tâm thần, thờ ơ, lãnh đạm,chậm chạp

+ Vùng chẩm: hiện tượng bán manh

+ Rối loạn vận động hoặc rối loạn cảm giác nửa người hoặc khu trú ở mặt, ởcánh tay hay ở chân

Khi có triệu chứng lâm sàng trên để khẳng định rõ và giúp cho việc điềutrị hiệu quả, chẩn đoán lâm sàng là bước quan trọng và quyết định hướng trị liệu

1.1.3.2 Chẩn đoán cận lâm sàng

- Chụp cắt lớp vi tính: là kỹ thuật dùng nhiều tia X – quang quét lênmột khu vực của cơ thể theo lát cắt ngang phối hợp với xử lý bằng máy vitính để có được hình ảnh 2 chiều hoặc 3 chiều của bộ phận cần chụp Đây

là phương pháp cho phép chụp hàng loạt hình rõ và phát hiện chính xáccác khối u

- Chụp cộng hưởng từ (MRI): Phát hiện những tổn thương mà chụp cắtlớp vi tính không phát hiện được, như những khối u có kích thước nhỏ hoặcnhững vùng khó xác định như ở vùng hố sau hay những vùng tổn thương có

tỷ trọng không rõ ràng khó xác định trên chụp cắt lớp vi tính

Tổn thương u nguyên bào thần kinh đệm trên MRI thường lan rộngxâm lấn các tổ chức xung quanh, bờ u không rõ, dấu hiệu choán chỗ mạnhhơn, tín hiệu có dạng tăng – giảm hỗn hợp trên cả T1 và T2 Tính hỗn độn củatín hiệu tăng lên do những ổ hoại tử trong u gây ra, có thể gặp ổ kén trong u.Trong u có thể thấy những ổ chảy máu với thời điểm khác nhau cho tín hiệukhác nhau trên ảnh T1 và T2 [5]

Hình 1.1: Hình ảnh chụp cộng hưởng từ glioblastoma

( http://www.ungthubachmai.com.vn/ )

Giá trị của chụp cắt lớp vi tính, đặc biệt là cộng hưởng từ đóng vai tròquyết định trong chẩn đoán u thần kinh đệm Với độ chính xác 98,5% đối vớichụp cắt lớp vi tính và 100% đối với cộng hưởng từ trong việc xác định vị trí,kích thước, ranh giới khối u trở nên dễ dàng Hình ảnh u thần kinh đệm trênphim chụp cắt lớp vi tính, cộng hưởng từ giúp các bác sĩ lâm sàng chỉ địnhphẫu thuật và tiên lượng được mức độ ác tính của bệnh

- Chụp cắt lớp tán xạ (PET-CT): Phương pháp này cho phép phát hiệnkhối u cũng như theo dõi sự tái phát ung thư, đánh giá kết quả của các phươngpháp điều trị Ghi hình khối u bằng PET-CT có độ nhạy và độ đặc hiệu caohơn nhiều so với các phương pháp chẩn đoán hình ảnh khác, đặc biệt là khảnăng phát hiện các khối u ở giai đoạn rất sớm khi mà các phương pháp chẩnđoán khác chưa phát hiện thấy

b Chẩn đoán mô bệnh học:

Phương pháp chẩn đoán mô bệnh học là tiêu chuẩn vàng phát hiện sựhiện diện của khối u và có thể cung cấp thông tin chẩn đoán khi phẫu thuậttrong vòng một giờ, nhưng thường được giới hạn ở số lượng mẫu xét nghiệm.Nguyên lý của phương pháp này dựa vào sự thay đổi hình thái tế bào, sự hiệndiện của các mạch máu bất thường trong mô được chẩn đoán

xạ trị sau phẫu thuật cùng với kết hợp điều trị bằng TMZlà tiêu chuẩn vàngcho điều trị glioblastoma [12],[13] Mặc dù đã tối ưu hóa phương thức điều trịnhưng thời gian sống 5 năm của bệnh nhân vẫn nhỏ hơn 5%.

Trong những năm gần đây, với sự phát triển của y học hiện đại nhiềuphương pháp mới trong điều trị ung thư đã được ứng dụng và đem lại hiệuquả vượt trội Một trong số đó là liệu pháp điều trị trúng đích, thế hệ thuốc

này có khả năng tác động đến các đích phân tử có vai trò quan trọng trong cơchế bệnh sinh ung thư Phương pháp này được kỳ vọng có thể kéo dài thờigian sống cho bệnh nhân Tuy nhiên để điều trị đích có hiệu quả, việc xácđịnh đột biến gen liên quan đến tính đáp ứng thuốc đóng vai trò quan trọngquyết định thành công của phương pháp [14],[15].

1.1.5 Gen FGFR và đột biến gen FGFR gây bệnh u nguyên bào thần kinh đệm

1.1.5.1 Vị trí và cấu trúc của gen FGFR

Gen FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor)mã hóa cho protein có

chức năng thụ thể màng tế bào có nguồn gốc biểu mô, trung mô Các proteinnày đóng vai trò quan trọng trong suốt quá trình phát triển và trưởng thànhcủa tế bào [16] [19] Họ gen FGFR gồm bốn thành viên là FGFR1, FGFR2,FGFR3, FGFR4 Trong đó, gen FGFR1 nằm trên nhánh ngắn của NST số 8, ởgiữa vị trí p11.22 và p11.23, dài 57 kb bao gồm 24 exon và mã hóa choprotein chứa 822 acid amin (Hình 1.2A) Gen FGFR3 nằm trên nhánh ngắncủa NST số 4, ở vị trí 4p16.3 dài 15kb bao gồm 19 exon, mã hóa cho proteinchứa 806 acid amin (Hình 1.2B) Gen FGFR1 và FGFR3 đều được xếp vàonhóm gen tiền sinh ung thư (pro-oncogen)

A

B

Hình 1.3: A Vị trí của gen FGFR1 trên NST

B Vị trí của gen FGFR3 trên NST

(Nguồn: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=FGFR)

Mỗi gen FGFR gồm một vùng ngoại bào, một vùng xuyên màng vàmột vùng nguyên sinh chất Vùng ngoại bào chứa 3 immunoglobulin – Ig cụthể IgI, IgII và IgIII, giữa IgI và IgII chứa chiều dài của tám hộp acidic liêntiếp nhau, vùng tận cùng của thụ thể chứa IgI và hộp acid có chức năng ứcchế thụ động, vùng IgII và IgIII cần thiết cho sự bắt cặp phối tử Vùng nộibào chứa một vùng tyrosine kinase và một đầu tận carboxy [16] (Hình 3-A).Vùng ngoại bào chứa yếu tố phát triển nguyên bào sợi FGF, FGF tiết raglycoprotein làm ổn định sự tương tác lẫn nhau của phối tử với thụ thể FGFnhờ protease [17].

Hình 1.4: Cấu trúc gen FGFR

(Nguồn: http://mcr.aacrjournals.org/content/8/11/1439/F1.large.jpg)

- TACC3 (Transforming, Acidic Coiled-Coil Containing Protein 3) là

một protein thuộc họ TACC TACC3 nằm trên nhánh ngắn của NST số 4, dài

23 kb bao gồm 18 exon, mã hóa cho protein chứa 838 acid amin

Hình 1.5: Vị trí của TACC3 trên NST số 4

(Nguồn: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TACC3)

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng TACC3 đóng một vai trò quantrọng trong việc duy trì cấu trúc vi ống [18] Những biến đổi cấu trúc củagen TACC3 được biết đến là nguyên nhân gây bệnh glicosarcoma vàglioblastoma.

1.1.5.2 Chức năng, cơ chế gây bệnh của gen FGFR.

a Chức năng

Gen FGFR mã hóa cho protein FGFR có hoạt tính tyrosine kinase, hoạt tínhnày đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển phôi, sự tăng sinh, hình thànhmạch, sự di căn và chu quá trình chết tự nhiên của tế bào [16] Nhiều nghiêncứu cho thấy sự biến đổi gen FGFR có liên quan đến cơ chế bệnh sinh gâyung thư não, trong đó có glioblatoma Vì vậy FGFR trở thành đích nhắmtrong điều trị đích glioblastoma [13]

b Cơ chế

Hoạt động của gen FGFR kích thích nhiều con đường tín hiệu nội bàophức tạp, được điều hòa và hoạt hóa nhờ sự bắt cặp của phối tử đặc hiệu Haicon đường tín hiệu chính được kích hoạt bởi FGFR là RAS/MAPK vàPI3K/AKT, ngoài ra còn có PLC-γ, PKC Ngay sau khi được hoạt hóa, vùngnội bào FGFR sẽ tự phosphoryl hóa, khởi đầu một dòng thác tín hiệu lan tỏakhắp tế bào gây kích thích quá trình tăng sinh, sự hình thành thành mạch, sự

di căn và ức chế quá trình chết của tế bào Trong tế bào bình thường, sự hoạthóa FGFR cần thiết cho nhiều chức năng quan trọng của tế bào như quá trìnhtăng sinh và sự biệt hóa tế bào Tuy nhiên, sự hoạt hóa FGFR quá mức khôngphụ thuộc vào sự hiện diện của phối tử vẫn có thể dẫn đến sự tăng sinh bấtthường cũng như sự chuyển dạng ác tính [16] (Hình 1.3-B) Có nhiều cơ chếdẫn đến sự bất thường của gen FGFR như sự khuếch đại quá mức của genFGFR, đột biến điểm, sự chuyển đoạn nhiễm sắc thể dẫn đến sự dung hợpgen… Khi có sự bất thường về gen FGFR thì các quá trình trên bị mất kiểm

soát, dẫn đến sự hình thành các khối u như ung thư vú, ung thư cổ tử cung,ung thư tyến tiền liệt, ung thư dạ dày… trong đó có gliobastoma Do FGFRđóng vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ung thư nên FGFR trở thành đíchnhắm tiềm năng cho các thế hệ thuốc điều trị mới ung thư [19].

1.1.5.3 Đột biến gen FGFR gây bệnh u nguyên bào thần kinh đệm

 Đột biến gen FGFR1

Gen FGFR khi đột biến sẽ mã hóa cho protein mới có khả năng kích hoạtcon đường tín hiệu xuôi dòng bất kể có hay không có sự hoạt hóa của thụ thể FGF.Đột biến gen FGFR xảy ra tại vùng tyrosine kinaseđược chứng minh đóng một vaitrò quan trọng trong quá trình tiến triển của ung thư và tạo nguy cơ kháng thuốc ứcchế FGFR của khối u [19] Theo nghiên cứu của Vikki Rand và cộng sự đã xácđịnh hai đột biến soma mã hóa thay đổi miền kinase trong glioblastoma Hai độtbiến trên gen FGFR1 là đột biến điểm xảy ra trên exon 12 tại vị trí N546K thay thếacid amin Asparagine (AAC) thành Lysin (AAA) và exon 13tại vị trí R576W thaythế Arginine (CGG) thành Tryptophan (TGG) [20]

Hình 1.6: Đột biến FGFR1 trong glioblastoma

(Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )

 Dung hợp gen FGFR3-TACC3

Sự dung hợp của gen FGFR3 với gen TACC3 đã được mô tả trong cơ

chế bệnh học của glioblastoma, ung thư biểu mô bàng quang, ung thư phổi vàung thư cổ tử cung… Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các vùng trên gentrên NST số 4 cho thấy sự dung hợp gen tại vị trí 1,808,966 của FGFR3 và1,737,080 của TACC3 Sự xóa đoạn của exon 17 trên gen FGFR3 và intron 7trên gen TACC3 dẫn đến sự thay đổi trong quá trình ghép nối, trong đóexon 16 của gen FGFR3 được ghép nối với exon 8 của gen TACC3

Theo nghiên cứu của Devendra Singh và cộng sự trên một nhóm nhỏbệnh nhân cho thấy khoảng 3,1% glioblastoma là do sự hợp nhất gen FGFR

PCR được Kary Mullis phát minh năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988,

kỹ thuật này nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu Y- Sinhhọc Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính và hồitính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNApolymerase Với nguyên liệu là bốn loại nucleotide, enzyme DNA polymerasexúc tác tổng hợp một mạch DNA mới từ DNA khuôn Phản ứng đòi hỏi sự cómặt của mồi xuôi, mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tựDNA khuôn

Một phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗichu kỳ gồm 3 giai đoạn: biến tính, bắt cặp, kéo dài chuỗi

* Giai đoạn biến tính: Trong một phản ứng bao gồm các thành phầncần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm(nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94-95ºC trong vòng 30 giây – 1phút Bước này DNA sợi kép tách thành DNA sợi đơn

* Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặpvới khuôn dao động khoảng 40-70ºC, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng

và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

* Giai đoạn kéo dài chuỗi: Nhiệt độ được tăng lên 72ºC để cho DNApolymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase,Pfu polymerase…) hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian phụ thuộc vào trình

tự DNA cần khuếch đại, thường từ 30 giây đến nhiều phút

Sau mỗi chu kỳ, các đoạn DNA được tổng hợp sẽ dùng làm khuôn cho

sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo Như vậy sản phẩm củaphản ứng tăng theo cấp số nhân sau mỗi chu kỳ, sau n chu kỳ số lượng DNA thuđược sẽ là bản copy Tuy nhiên, thông thường hiệu suất sẽ không đạt 100% vìvậy chúng ta tiến hành chạy 25-40 chu kỳ tùy nồng độ và mục đích cần khuếchđại DNA

Kết quả là từ một lượng nhỏ DNA khuôn ban đầu, ta thu được mộtlượng lớn DNA Song điều đó cũng có nghĩa trong quá trình tiến hànhchỉ cần nhiễm một lượng nhỏ DNA ngoại lai cũng dẫn đến sự thất bạicủa phản ứng.

Hình 1.8: Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR

(Nguồn: https://www.gene-quantification.de/block.html)

1.2.2 Kỹ thuật scorpion ARMS

Kỹ thuật scorpion ARMS (Scorpion Amplification Refractory MutationSystem) là sự kết hợp đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và công nghệ Scorpiontrong phản ứng real-time PCR để phát hiện các đột biến Trong đó nguyên lýkhuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tính Taq DNA polymerase chỉkhuếch đại hoàn chỉnh một phân tử DNA một khi đầu 3’ của mồi và khuôn bổsung hoàn toàn với nhau Khi đầu 3’ của mồi không bổ sung với sợi khuôn phảnứng PCR bị ức chế hoàn toàn Dựa trên nguyên lý này, kỹ thuật cho phép khuếchđại đặc hiệu một trình tự đột biến ngay cả trong trường hợp alen đột biến chiếmmột tỷ lệ nhỏ (1%) trong tổng số sợi khuôn DNA

Scorpion là phân từ có một đầu mang trình tự của đoạn mồi đặc hiệuvới alen đột biến cần khuếch đại, đầu trình tự này được nối với một đầu dò.Phần kích thích phát tín hiệu huỳnh quang của đầu dò được gắn với phần ứcchế có nhiệm vụ dập tắt tín hiệu huỳnh quang của phần kích thích Trongphản ứng PCR khi đầu dò bám với trình tự khuếch đại phần kích thích pháttín hiệu huỳnh quang được giải phóng khỏi phần ức chế, phát tín hiệu đến bộphận cảm biến của máy real-time PCR.

Kỹ thuật Scorpion ARMS cho phép xác định được đột biến điểm tạiexon 12 và exon 13 gen FGFR, kỹ thuật này có độ nhạy cao, thời gian ngắntuy nhiên chỉ phát hiện được những đột biến đã biết trước và chi phí thựchiện tốn kém

1.2.3 Kỹ thuật giải trình tự gen

Kỹ thuật giải trình tự gen do F.Sanger, Smith và Coulson phát hiện vàonăm 1977, là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các nucleotide A, T, G,

C trên phân tử DNA Hiện nay, người ta sử dụng phương pháp giải trình tựdideoxynucleotide bằng máy tự động Đoạn trình tự đã biết kết quả sẽ đượcđem so sánh với trình tự trên ngân hàng GenBank cho ta biết được biến đổitrên phân tử DNA

Nguyên lý của kỹ thuật giải trình tự gen: dideoxynucleotide (ddNTP) làmột phân tử nhân tạo, cấu trúc của nó tương tự như phân tử deoxynucleotid(dNTP), tuy nhiên ở cacbon số 3 của đường deoxyribose không có nhóm chứchydroxyl (-OH) mà là gốc hydro (-H) Thông thường, trong quá trình tổng hợpmạch đơn bổ sung, một dNTP tự do gắn vào chuỗi đang tổng hợp bằng liên kếtphosphodieste giữa 5’-phosphate với nhóm 3’-hydroxyl của nucleotide cuốicùng của chuỗi Tuy nhiên, nếu một ddNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi đang tổnghợp thì sự tổng hợp DNA sẽ dừng lại do không hình thành được liên kếtphosphodieste với nucleotide tiếp theo Hỗn hợp sau phản ứng bao gồm nhiều

đoạn DNA với kích thước khác nhau, hơn kém nhau 1 nucleotid, và có đầu tậncùng là phân tử ddNTP Dựa vào các tín hiệu huỳnh quang gắn trên các phân tửddNTP, người ta có thể xác định được trình tự gen Phương pháp giải trình tựgen có độ nhạy không cao tuy nhiên cho phép xác định được tất cả các đột biếntrên đoạn gen được khuếch đại, chi phí thực hiện thấp Do đó phương phápenzym của Sanger được sử dụng phổ biến cả ở Việt Nam lẫn thế giới Các phòngthí nghiệm đều giải trình tự theo phương pháp này, nhưng khi làm giải trình tựthì người ta dùng máy tự động chứ không dùng kỹ thuật ký xạ tự như trước đây.Với các máy thế hệ mới sau này, người ta có thể dùng 4 màu huỳnh quang khácnhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiệnchỉ trong một ống nghiệm.

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nhóm bệnh: 20 bệnh nhân được chẩn đoán xác định là bệnh u nguyên

bào thần kinh đệm dựa vào đặc điểm lâm sàng và giải phẫu bệnh tại bệnh việnViệt Đức, Hà Nội

- Tiêu chuẩn loại trừ: Chẩn đoán chưa rõ ràng, bệnh nhân có các khối

u ở các cơ quan khác, bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.2 Thời gian và địa điểm

Thời gian thực hiện khóa luận từ ngày 1/11/2015-31/5/2016

Địa điểm: Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein, Trường Đại học Y Hà Nội

2.3 Đạo đức trong nghiên cứu

Trước khi tiến hành thu thập thông tin, mẫu bệnh phẩm phải có sự đồng

ý của đối tượng nghiên cứu, tham gia tự nguyện vào nghiên cứu Bệnh nhânđược giải thích rõ ràng về mục tiêu nghiên cứu, được tư vấn và điều trị nhưmọi bệnh nhân khác Các thông tin riêng của bệnh nhân được đảm bảo giữ kín

bí mật Nghiên cứu đảm bảo tuân thủ các quy định đạo đức trong nghiên cứu

− Bình thủy tinh, cốc đong

− Cân điện tử AB204 (Mettler Toledo)

− Lò vi sóng (Saiko)

− Máy ly tâm để bàn Eppendorf (Đức): Centrifuge 5424R và Hitachi (Nhật)

− Máy Vortex hãng (Thermo)

− Máy spindown: E-centrifuge

− Máy rung lắc nhiệt: Thermomixer 5437 và Thermomixer comfortcho ống 1,5ml và Mixmate cho ống 2ml

− Máy điện di(Thermo)

− Máy soi gel và chụp ảnh tự động: UVP (Eppendorf)

− Máy đo OD: NanoDrop 1000 (Thermo)

− Máy PCR (Eppendorf)

2.4.2 Hóa chất

 Hóa chất tách chiết DNA:

− Xylen hoặc toluene (Merck)

− Dung dịch CI (Chloroform : Isoamyl alcohol = 24 : 1)

− Ethanol 100%, ethanol 70% bảo quản lạnh ở 0oC

− Sodium acetate (CH3COONa) 3M (pH = 5,2)

− Dung dịch hòa tan DNA: đệm TE (Tris - EDTA)

 Hóa chất cho PCR:

− Gold Taq chứa: dNTPs, Taq polymerase, MgCl2

− Mồi xuôi (PF), mồi ngược (PR)(Intergrated DNA Technologies)

Bảng 2.1: Trình tự mồi và kích thước sản phẩm của gen FGFR

FGFR1 exon

12 (F12)

PF: 5’ -GGG GGT CGA ACT TGA GGT AT- 3’

PR: 5’-ATG ATC ATG CGG GAG TGC-3’ 617bp

FGFR exon

13 (F13)

PF: 5’ -ACG CCA CCA CAA GAT AAG -3’

PR:5’- TCT GGA CTA TGC TGG GAG TAA-3’ 527 bp

 Hóa chất giải trình tự gen: Sử dụng bộ Kit Thermo Sequenase Cy5 DyeTerminator Cycle sequencing kit

 Hóa chất điện di:

− Dung dịch đệm TBE (Tris Borate EDTA) 1X gồm: Tris base, boricacid và EDTA (pH 8,0)

− Agarose ( Norgen Biotic)

− DNA Loading Dye

− Ethidium bromide 10mg/ml: ( Beckman) (Mỹ)

− Thang chuẩn DNA 100bp (Marker 100bp) (Thermo Scientific)

2.5 Phương pháp nghiên cứu

-Thết kế nghiên cứu: Nghiên cứu hồi cứu

-Quy trình nghiên cứu

2.5.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

Mẫu mô não sinh thiết của các bệnh nhân được chẩn đoán bằng môbệnh học tại Khoa Giải phẫu bệnh –Bệnh viện Việt Đức Những mẫu mô nàyđược cố định trong formon và đúc trong khối paraffin

2.5.2 Tách chiết DNA

Mẫu mô sau khi loại bỏ paraphin tiến hành tách chiết DNA theophương pháp Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Quy trình tách chiết tiến

hành qua các bước: Loại bỏ paraffin => Phá vỡ màng tế bào và màng nhân =>Loại bỏ protein => Tủa DNA => Rửa tủa => Hòa tan DNA.

− Cho thêm 650µl dung dịch Lysis buffer HD và 5µl proteinase K

− Vortex mạnh cho tan tủa rồi đem ủ ở 56oC cho đến khi tủa tan hết

 Loại bỏ tạp chất và tủa DNA:

− Sau khi ủ cho tủa tan hết, cho thêm 500µl dung dịch PCI (Phenol :Chloroform : Isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1)

− Trộn đều => Ly tâm 15000vòng/phút trong 10 phút ở 4oC

− Sau khi ly tâm, hỗn hợp phân thành 3 lớp: Lớp trên cùng có chứaDNA, lớp giữa là cặn tế bào và protein, lớp dưới cùng là dịch chiết.Thu lớp trên trong suốt ra một ống eppendorf 1,5ml sạch đã đượcđánh dấu sẵn

− Cho thêm 500µl dung dịch CI (Chloroform : Isoamyl alcohol = 24 : 1)

− Trộn đều => Ly tâm 15000vòng/phút trong 10 phút ở 4oC

− Hỗn hợp thu được phân thành 2 lớp, thu lớp trên trong suốt có chứaDNA ra một ống eppendorf mới

 Tủa và thu tủa DNA:

− Cho thêm 2,5V ethanol 100% và 0,1V Sodium acetate (CH3COONa)

− Lắc đều, quan sát tủa

− Để ở -20oC trong 2-3h cho DNA kết tủa hoàn toàn.

− Sau 2-3h, đem ly tâm 15000vòng/phút trong 15 phút ở 4oC => Loại

bỏ dịch nổi, thu tủa

− Cho thêm 1ml ethanol 70% để rửa tủa

− Trộn đều => Ly tâm 15000vòng/phút trong 15 phút ở 4oC

− Thu tủa DNA, để khô ở 56oC cho đến khi khô hẳn (thường hơn 30 phút)

− Cho thêm 50-60µl nước tinh khiết hoặc TE để hòa tan DNA

2.5.3 Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA

Sử dụng hai kỹ thuật:

 Điện di DNA tổng số

Mục đích: kiểm tra chất lượng và ước lượng nồng độ DNA tách chiết được.Nguyên lý: ở pH=8, acid nucleic mang điện tích âm, dưới tác dụng củadòng điện một chiều, acid nucleic sẽ di chuyển về cực dương Các đoạn DNA

có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau Tùy vào mụcđích có thể sử dụng các chất khác nhau để điện di acid nucleic, nhưng phổbiến nhất vẫn là sử dụng gel agarose Thông thường sử dụng nồng độ gel là0,8% Bản gel điện di được nhuộm bằng ethidium bromide sẽ phát sáng Chấtlượng của DNA tốt khi vạch điện di rõ nét, băng gọn Ngược lại, DNA đứtgãy, lẫn nhiều protein hoặc các tạp chất thì hình ảnh điện di là một vệt trải dàikhông tạo thành băng gọn

Tiến hành:

− Đổ bản gel agarose 0,8%, số giếng tùy thuộc vào số mẫu

− Trộn đều 2µl sản phẩm DNA tách chiết với 1µl DNA loading dye vàđiện di toàn bộ hỗn hợp

− Thời gian điện di 60 phút, điện thế 90V

− Nhuộm bản gel điện di trong ethidium bromide trong khoảng 5 phút

− Chụp ảnh bản gel

 Phương pháp quang phổ

Tiến hành:

− Trước khi đo nồng độ cần phải trắng bằng dung dịch hòa loãng DNA

ở bước tách mẫu

− Hút 2μl DNA hòa loãng vào mắt đọc Chú ý cần thấm hết dung dịchDNA của lần đo trước

− Nồng độ DNA đạt yêu cầu ≥ 50 ng/μl, độ tinh sạch A260/A280 = 1,8 ÷ 2,0

Chú ý: Sản phẩm DNA tách chiết cần được bảo quản ở nhiệt độ 4°C

trong thời gian ngắn hoặc ở nhiệt độ -20°C trong thời gian dài hơn

2.5.4 Khuếch đại đoạn gen FGFR bằng phương pháp PCR

DNA sau khi được tách chiết và kiểm tra độ tinh sạch, được dùng làmkhuôn mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại exon 12, exon 13 của gen FGFR.Tất cả các mẫu DNA sau khi được tách chiết đều được pha loãng về nồng độ50-100 ng/µl để thực hiện phản ứng PCR

Chuẩn bị PCR master mix:

STT Thành phần Thể tích (µl)

Chạy phản ứng PCR trên máy Eppendorf:

Chu trình nhiệt của phản ứng:

Biến tính hoàn toàn: 95ºC trong 5 phút

Biến tính: 95ºC trong 30 giây

Gắn mồi: 55ºC trong 30 giây x 35 chu kỳ

Kéo dài: 72ºC trong 1 phút