XÁC ĐỊNH đột BIẾN GEN FGFR TRÊN BỆNH NHÂN u NGUYÊN bào THẦN KINH đệm

Hiện nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các phương tiện chẩn đoán hiện đại cho phép xác định được chính xác vị trí, kích thước khối u, mức độ xâm lấn, chèn ép não… giúp cho các b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

***

PHẠM THỊ KIM HUYỀN

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN FGFR TRÊN BỆNH NHÂN

U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2012 - 2016

HÀ NỘI – 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

***

PHẠM THỊ KIM HUYỀN

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN FGFR TRÊN BỆNH NHÂN

U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2012 - 2016

Hướng dẫn khoa học:

PGS.TS TRẦN VÂN KHÁNH

HÀ NỘI – 2016

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành khóa luận, em đã nhận được rất nhiều sự hỗ trợ, giúp đỡ nhiệt tình từ các thầy cô, anh chị, gia đình và bạn bè

Trước hết em xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới

PGS.TS.Trần Vân Khánh- Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Protein, Trưởng bộ môn Bệnh học phân tử, cô đã tận tình dìu dắt, hướng

Gen-dẫn chi tiết em thực hiện đề tài nghiên cứu cũng như đưa ra những ý kiến góp

ý, bài học quý báu, giúp em sửa chữa và hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Tạ Thành Văn - Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, đã tạo cho em mọi điều kiện, quan tâm, giúp

đỡ em và các bạn trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận

Em xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Trường Đại Học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Em xin cảm ơn các anh chị tại Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ em rất nhiều để hoàn thành tốt khóa

luận Đặc biệt, em xin cảm ơn CN Trần Quốc Đạt, trung tâm nghiên cứu

Gen-Protein, người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình cho em những kỹ thuật, chia sẻ cho em nhiều kinh nghiệm trong quá trình thực hiện khóa luận

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới tất cả người thân trong gia đình, bạn bè đã quan tâm, động viên, chia sẻ mọi khó khăn với em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 6 năm 2016

Sinh viên

Phạm Thị Kim Huyền

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương bệnh u nguyên bào thần kinh đệm 3

1.1.1 Dịch tễ học 3

1.1.2 Yếu tố nguy cơ 3

1.1.3 Chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng 4

1.1.4 Điều trị 8

1.2 Gen FGFR và đột biến gen FGFR gây bệnh u nguyên bào thần kinh đệm 9

1.2.1 Vị trí và cấu trúc của gen FGFR 9

1.2.2 Chức năng, cơ chế gây bệnh của gen FGFR 11

1.2.3 Đột biến gen FGFR gây bệnh u nguyên bào thần kinh đệm 12

1.3 Các kỹ thuật phát hiện đột biến gen FGFR 13

1.3.1 Kỹ thuật PCR 13

1.3.2 Kỹ thuật scorpion ARMS 15

1.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen 16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Thời gian và địa điểm 18

2.3 Đạo đức trong nghiên cứu 18

2.4 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 18

2.4.1 Dụng cụ và trang thiết bị 18

2.4.2 Hóa chất 19

2.5 Phương pháp nghiên cứu 20

2.5.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu 20

2.5.2 Tách chiết DNA 21

2.5.3 Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA 22

2.5.4 Khuếch đại đoạn gen FGFR bằng phương pháp PCR 23

2.5.5 Giải trình tự gen FGFR theo phương pháp Sanger 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

3.1 Kết quả tách chiết DNA 27

3.2 Kết quả khuếch đại đoạn gen bằng kỹ thuật PCR 28

3.3 Kết quả giải trình tự gen phát hiện đột biến N546K trên exon 12 và R576W trên exon 13 gen FGFR 30

Chương 4: BÀN LUẬN 32

4.1 Kết quả tách chiết DNA 32

4.2 Kết quả khuếch đại gen PCR 33

4.3 Giải trình tự xác định đột biến gen FGFR 35

KẾT LUẬN 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

TACC3 Transforming, Acidic Coiled-Coil Containing Protein 3

FGFR Fibroblast growth factor receptor

PDGFR Platelet-Derived Growth Factor Receptor

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Trình tự mồi và kích thước sản phẩm của gen FGFR 20 Bảng 3.1: Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu DNA trên nhóm

bệnh nhân 28

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình ảnh chụp cộng hưởng từ glioblastoma 7

Hình 1.2: Hình ảnh mô bệnh học glioblastoma 8

Hình 1.3: A Vị trí của gen FGFR1 trên NSTB Vị trí của gen FGFR3 trên NST 9

Hình 1.4: Cấu trúc gen FGFR 10

Hình 1.5: Vị trí của TACC3 trên NST số 4 10

Hình 1.6: Đột biến FGFR1 trong glioblastoma 12

Hình 1.7: Dung hợp gen FGFR3-TACC3 trên NST số 4 13

Hình 1.8: Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR 15

Hình 3.1: Hình ảnh minh họa kết quả đo OD của mẫu DNA tách chiếtbằng máy Nanodrop 1000 27

Hình 3.2: Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 28

Hình 3.3: A Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại tại vị trí exon 12 trên gen FGFR B Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại tại vị trí exon 13 trên gen FGFR1 29

Hình 3.4: A Hình ảnh kết quả giải trình tự gen mẫu G1 trên exon 12 của gen FGFR1 B Hình ảnh kết quả giải trình tự gen mẫu G1 trên exon 13 của gen FGFR1 30

ĐẶT VẤN ĐỀ

U não là những khối u được hình thành do quá trình phân chia không kiểm soát được của tế bào thần kinh trong não Đây là căn nguyên gây tử vong đứng thứ 2 ở trẻ em (sau bệnh bạch cầu cấp) và đứng thứ 3 ở người trưởng thành U não ác tính nguyên phát chiếm tỷ lệ thấp trong các loại u não nhưng có tỷ lệ tử vong cao U nguyên bào thần kinh đệm (glioblastoma) là dạng thường gặp nhất của u não nguyên phátvà được xếp vào loại ác tính nhất (độ IV) với tỷ lệ mắc mới khoảng 3.19/100.000 người

Hiện nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các phương tiện chẩn đoán hiện đại cho phép xác định được chính xác vị trí, kích thước khối u, mức

độ xâm lấn, chèn ép não… giúp cho các bác sỹ lâm sàng đưa ra được phác đồ điều trị tối ưu nhất cho bệnh nhân Các phương pháp điều trị glioblastoma phổ biến bao gồm phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, miễn dịch… nhưng hiệu quả chưa cao, thời gian sống sau điều trị còn ngắn Với sự phát triển của y học hiện đại, một phương pháp điều trị mới ra đời với mong muốn giúp kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, đó là liệu pháp điều trị đích Liệu pháp điều trị đích này

có khả năng tác động đến thụ thể trên màng tế bào có hoạt tính tyrosin kinase gây ức chế con đường tín hiệu nội bào, ngăn chặn quá trình tăng sinh, di căn

và xâm lấn của tế bào ung thư

Gen FGFR là thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào sợi mã hóa cho protein nằm trên màng tế bào và có hoạt tính tyrosin kinase, protein này tham gia vào hoạt hóa con đường tín hiệu nội bào và được điều hòa nhờ sự bắt cặp phối tử đặc hiệu, kết quả là sự tăng sinh, xâm lấn, di căn và chết theo chương trình của tế bào Đột biến gen này liên quan đến cơ chế bệnh sinh của nhiều loại ung thư như ung thư bàng quang, ung thư vú, tuyến tiền liệt… trong đó

có glioblastoma Việc xác định đột biến gen FGFR đóng vai trò quan trọng quyết định tính đáp ứng với thuốc điều trị đích

Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào xác định đột biến gen FGFR quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị đích bệnh glioblastoma Vì vậy

đề tài “Xác định đột biến genFGFR trên bệnh nhân u nguyên bào thần

kinh đệm” được thực hiện với mục tiêu chính:

1 Bước đầu xác định một số đột biến N546K trên exon 12 và R576W trên exon 3 của gen FGFR ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương bệnh u nguyên bào thần kinh đệm

U nguyên bào thần kinh đệm (glioblastoma) còn gọi là u tế bào hình sao độ III- IV, có thể tiên phát nhưng cũng có thể chuyển biến từ độ I, II Đó

là khối u ác tính, tại chỗ, không di căn xa, thường tái phát sau khi lấy toàn bộ khối u [1]

u nguyên bào thần kinh đệm ở Anh và Thụy Điển lần lượt là 7,53/100000 dân 4,2/100000 dân

Tại Việt Nam: Theo nghiên cứu của Lê Xuân Trung và Nguyễn Như Bằng năm 1975, tỷ lệglioblastoma chiếm 8% u não [5].Theo nghiên cứu của Hoàng Minh Đỗ (2009), tỷ lệ glioblastoma chiếm 17,2% u thần kinh đệm [6]

1.1.2 Yếu tố nguy cơ

Theo Hội ung thư não Hoa Kì, nguyên nhân của những khối u não chưa được biết rõ Các nhà khoa học cho thấy việc tiếp xúc với một số yếu tố làm tăng nguy cơ mắc ung thư não như:

Yếu tố môi trường, nghề nghiệp: Nghiên cứu cho thấy việc tiếp xúc

với các hóa chất làm tăng nguy cơ ung thư não Các chất trong một số nghề nghiệp sản xuất nhựa, chất dẻo như formaldehyde, vinyl chloride, acrylonitrile hoặc trong nông nghiệp do tiếp xúc với thuốc trừ sâu đều có nguy cơ cao mắc bệnh ung thư não Ngoài ra việc tiếp xúc với tia phóng xạ trong ngành công nghiệp hạt nhân hoặc điều trị bằng xạ trị đều có khả năng cao mắc ung thư não

Yếu tố nhân khẩu học:

-Tuổi: Thường gặp ở người trưởng thành từ 46-74 tuổi và gặp ở trẻ em với tỷ lệ cao

-Giới: Ở nam gặp nhiều hơn nữ

-Chủng tộc: nghiên cứu cho thấy người da trắng có tỷ lệ mắc glioblastoma cao hơn những người thuộc chủng tộc khác

Yếu tố di truyền: một số rối loạn di truyền làm tăng nguy cơ mắc ung

thư não như: bệnh Von Hippel-Lindau, xơ cứng củ, hội chứng Li-Fraumeni, hội chứng Turcot, hội chứng Klinefelter… Những nghiên cứu gần đây cho thấy một số biến đổi về gen như đột biến gen áp chế khối u P53 hoặc gen sinh ung thư như EGFR, PDGFR, FGFR… làm tăng nguy cơ mắc glioblastoma so với những người không mang đột biến [7]

1.1.3 Chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng

1.1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng

Vì u nguyên bào thần kinh đệm là một dạng của u não nguyên phát, có thể gặp ở mọi vị trí của não bộ, do đó triệu chứng lâm sàng nằm trong bệnh cảnh chung của u não Các u não nói chung có hai triệu chứng lâm sàng:

- Hội chứng tăng áp lực nội sọ

+ Đau đầu: là triệu chứng phổ biến nhất của u não chiếm 50-60%, đau đầu dai dẳng tăng dần, đôi khi có từng cơn ngắn, đặc biệt tăng về ban đêm và

gần sáng, đau có đáp ứng với thuốc giảm đau giai đoạn đầu nhưng sau đó đáp ứng kém hoặc không đáp ứng Đau đầu có thể khu trú hoặc toàn bộ đầu Nguyên nhân đau đầu là do sự chèn ép của u não với tổ chức vùng đáy sọ, xoang tĩnh mạch và màng cứng [8]

+ Nôn hoặc buồn nôn: thường xuất hiện muộn hơn đau đầu, có khi xuất hiện cùng với đau đầu Nôn không liên quan đến yếu tố ăn uống hay sinh lý khác Do tăng áp lực nội sọ kích thích các thụ cảm ở não thất IV Vì vậy u ở thân não, tiểu não đè trực tiếp vào trung tâm nôn, biểu hiện bằng “nôn vọt” thường gặp ở trẻ em [8]

+ Phù gai thị: là triệu chứng khách quan nhất của u não khi có sự tăng

áp lực trong sọ Phù gai thị thường xuất hiện sau đau dầu và tùy theo vị trí của

u não 12 gây đè ép, xâm lấn ảnh hưởng đến lưu thông dịch não tủy mà phù gai thị có sớm hay có muộn Biểu hiện là mờ bờ gai, phù gai thị, xuất huyết gai thị cuối cùng là teo gai thị gây mất thị lực Phát hiện phù gai thị bằng soi đáy mắt [8]

+ Động kinh: gặp khoảng 30% u não, chủ yếu u ở trên lều tiểu não Những cơn động kinh từng phần (cục bộ) hoặc toàn bộ [8] Rối loạn tâm thần: thay đổi tính tình, hay cáu gắt, trầm cảm, chậm chạp và giảm trí nhớ cũng thường gặp trong u não [8]

- Triệu chứng liên quan đến vị trí của khối u

+ Vùng thái dương: rối loạn ngữ do u ở vùng tiếng nói (Broca, Wernicke) + Vùng trán: rối loạn tâm thần, thờ ơ, lãnh đạm,chậm chạp

+ Vùng chẩm: hiện tượng bán manh

+ Rối loạn vận động hoặc rối loạn cảm giác nửa người hoặc khu trú ở mặt, ở cánh tay hay ở chân

Khi có triệu chứng lâm sàng trên để khẳng định rõ và giúp cho việc điều trị hiệu quả, chẩn đoán lâm sàng là bước quan trọng và quyết định hướng trị liệu

- Chụp cắt lớp vi tính: là kỹ thuật dùng nhiều tia X – quang quét lên một khu vực của cơ thể theo lát cắt ngang phối hợp với xử lý bằng máy vi tính để có được hình ảnh 2 chiều hoặc 3 chiều của bộ phận cần chụp Đây

là phương pháp cho phép chụp hàng loạt hình rõ và phát hiện chính xác các khối u

- Chụp cộng hưởng từ (MRI): Phát hiện những tổn thương mà chụp cắt lớp vi tính không phát hiện được, như những khối u có kích thước nhỏ hoặc những vùng khó xác định như ở vùng hố sau hay những vùng tổn thương có

tỷ trọng không rõ ràng khó xác định trên chụp cắt lớp vi tính

Tổn thương u nguyên bào thần kinh đệm trên MRI thường lan rộng xâm lấn các tổ chức xung quanh, bờ u không rõ, dấu hiệu choán chỗ mạnh hơn, tín hiệu có dạng tăng – giảm hỗn hợp trên cả T1 và T2 Tính hỗn độn của tín hiệu tăng lên do những ổ hoại tử trong u gây ra, có thể gặp ổ kén trong u Trong u có thể thấy những ổ chảy máu với thời điểm khác nhau cho tín hiệu khác nhau trên ảnh T1 và T2 [5]

Hình 1.1: Hình ảnh chụp cộng hưởng từ glioblastoma

(http://www.ungthubachmai.com.vn/)

Giá trị của chụp cắt lớp vi tính, đặc biệt là cộng hưởng từ đóng vai trò quyết định trong chẩn đoán u thần kinh đệm Với độ chính xác 98,5% đối với chụp cắt lớp vi tính và 100% đối với cộng hưởng từ trong việc xác định vị trí, kích thước, ranh giới khối u trở nên dễ dàng Hình ảnh u thần kinh đệm trên phim chụp cắt lớp vi tính, cộng hưởng từ giúp các bác sĩ lâm sàng chỉ định phẫu thuật và tiên lượng được mức độ ác tính của bệnh

- Chụp cắt lớp tán xạ (PET-CT): Phương pháp này cho phép phát hiện khối u ung thư cũng như theo dõi sự tái phát ung thư, đánh giá kết quả của các phương pháp điều trị Ghi hình khối u bằng PET-CT có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn nhiều so với các phương pháp chẩn đoán hình ảnh khác, đặc biệt

là khả năng phát hiện các khối u ở giai đoạn rất sớm khi mà các phương pháp

chẩn đoán khác chưa phát hiện thấy

b Chẩn đoán mô bệnh học:

Phương pháp chẩn đoán mô bệnh học là tiêu chuẩn vàng phát hiện sự hiện diện của khối u và có thể cung cấp thông tin chẩn đoán khi phẫu thuật trong vòng một giờ, nhưng thường được giới hạn ở số lượng mẫu xét nghiệm Nguyên lý của phương pháp này dựa vào sự thay đổi hình thái tế bào, sự hiện diện của các mạch máu bất thường trong mô được chẩn đoán

xạ trị sau phẫu thuật cùng với kết hợp điều trị bằng TMZ là tiêu chuẩn vàng cho điều trị glioblastoma [12],[13] Mặc dù đã tối ưu hóa phương thức điều trị nhưng thời gian sống 5 năm của bệnh nhân vẫn nhỏ hơn 5%

Trong những năm gần đây, với sự phát triển của y học hiện đại nhiều phương pháp mới trong điều trị ung thư đã được ứng dụng và đem lại hiệu quả vượt trội Một trong số đó là liệu pháp điều trị trúng đích, thế hệ thuốc này có khả năng tác động đến các đích phân tử có vai trò quan trọng trong cơ

chế bệnh sinh ung thư Phương pháp này được kỳ vọng có thể kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân Tuy nhiên để điều trị đích có hiệu quả, việc xác định đột biến gen liên quan đến tính đáp ứng thuốc đóng vai trò quan trọng quyết định thành công của phương pháp [14],[15]

1.2 Gen FGFR và đột biến gen FGFR gây bệnh u nguyên bào thần kinh đệm

1.2.1 Vị trí và cấu trúc của gen FGFR

Gen FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor) mã hóa cho protein có

chức năng thụ thể màng tế bào có nguồn gốc biểu mô, trung mô Các protein này đóng vai trò quan trọng trong suốt quá trình phát triển và trưởng thành của tế bào [16] [19] Họ gen FGFR gồm bốn thành viên là FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4 Trong đó, gen FGFR1 nằm trên nhánh ngắn của NST số 8, ở giữa vị trí p11.22 và p11.23, dài 57 kb bao gồm 24 exon và mã hóa cho protein chứa 822 acid amin (Hình 1.2A) Gen FGFR3 nằm trên nhánh ngắn của NST số 4, ở vị trí 4p16.3 dài 15kb bao gồm 19 exon, mã hóa cho protein chứa 806 acid amin (Hình 1.2B) Gen FGFR1 và FGFR3 đều được xếp vào nhóm gen tiền sinh ung thư (pro-oncogen)

A

B

Hình 1.3: A Vị trí của gen FGFR1 trên NST

B Vị trí của gen FGFR3 trên NST

(Nguồn: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=FGFR)

Mỗi protein FGFR gồm một vùng ngoại bào, một vùng xuyên màng và một vùng nguyên sinh chất Vùng ngoại bào chứa 3 immunoglobulin – Ig cụ thể IgI, IgII và IgIII, giữa IgI và IgII chứa chiều dài của tám hộp acidic liên tiếp nhau, vùng tận cùng của thụ thể chứa IgI và hộp acid có chức năng ức chế thụ động, vùng IgII và IgIII cần thiết cho sự bắt cặp phối tử Vùng nội bào chứa một vùng tyrosine kinase và một đầu tận carboxy [16] (Hình 3-A).Vùng ngoại bào chứa yếu tố phát triển nguyên bào sợi FGF, FGF tiết ra glycoprotein làm ổn định sự tương tác lẫn nhau của phối tử với thụ thể FGF nhờ protease [17]

Hình 1.4: Cấu trúc protein FGFR

(Nguồn: http://mcr.aacrjournals.org/content/8/11/1439/F1.large.jpg)

- TACC3 (Transforming, Acidic Coiled-Coil Containing Protein 3) là

một protein thuộc họ TACC TACC3 nằm trên nhánh ngắn của NST số 4, dài

23 kb bao gồm 18 exon, mã hóa cho protein chứa 838 acid amin

Hình 1.5: Vị trí của TACC3 trên NST số 4

(Nguồn: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TACC3)

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng TACC3 đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc vi ống [18] Những biến đổi cấu trúc của gen TACC3 được biết đến là nguyên nhân gây bệnh glicosarcoma và glioblastoma

1.2.2 Chức năng, cơ chế gây bệnh của gen FGFR

a Chức năng

Gen FGFR mã hóa cho protein FGFR có hoạt tính tyrosine kinase, hoạt tính này đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển phôi, sự tăng sinh, hình thành mạch, sự di căn và chu quá trình chết tự nhiên của tế bào [16] Nhiều nghiên cứu cho thấy sự biến đổi gen FGFR có liên quan đến cơ chế bệnh sinh gây ung thư não, trong đó có glioblatoma Vì vậy FGFR trở thành đích nhắm trong điều trị đích glioblastoma [13]

b Cơ chế

Hoạt động của gen FGFR kích thích nhiều con đường tín hiệu nội bào phức tạp, được điều hòa và hoạt hóa nhờ sự bắt cặp của phối tử đặc hiệu Hai con đường tín hiệu chính được kích hoạt bởi FGFR là RAS/MAPK và PI3K/AKT, ngoài ra còn có PLC-γ, PKC Ngay sau khi được hoạt hóa, vùng nội bào FGFR sẽ tự phosphoryl hóa, khởi đầu một dòng thác tín hiệu lan tỏa khắp tế bào gây kích thích quá trình tăng sinh, sự hình thành thành mạch, sự

di căn và ức chế quá trình chết của tế bào Trong tế bào bình thường, sự hoạt hóa FGFR cần thiết cho nhiều chức năng quan trọng của tế bào như quá trình tăng sinh và sự biệt hóa tế bào Tuy nhiên, sự hoạt hóa FGFR quá mức không phụ thuộc vào sự hiện diện của phối tử vẫn có thể dẫn đến sự tăng sinh bất thường cũng như sự chuyển dạng ác tính [16] (Hình 1.3-B) Có nhiều cơ chế dẫn đến sự bất thường của gen FGFR như sự khuếch đại quá mức của gen FGFR, đột biến điểm, sự chuyển đoạn nhiễm sắc thể dẫn đến sự dung hợp gen… Khi có sự bất thường về gen FGFR thì các quá trình trên bị mất kiểm

soát, dẫn đến sự hình thành các khối u như ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư tyến tiền liệt, ung thư dạ dày… trong đó có gliobastoma Do FGFR đóng vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ung thư nên FGFR trở thành đích nhắm tiềm năng cho các thế hệ thuốc điều trị mới ung thư [19]

1.2.3 Đột biến gen FGFR gây bệnh u nguyên bào thần kinh đệm

1.2.3.1 Đột biến gen FGFR1

Gen FGFR khi đột biến sẽ mã hóa cho protein mới có khả năng kích hoạt con đường tín hiệu xuôi dòng bất kể có hay không có sự hoạt hóa của thụ thể FGF Đột biến gen FGFR xảy ra tại vùng tyrosine kinase được chứng minh đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tiến triển của ung thư và tạo nguy cơ kháng thuốc ức chế FGFR của khối u [19] Theo nghiên cứu của Vikki Rand và cộng sự

đã xác định hai đột biến soma mã hóa thay đổi miền kinase trong glioblastoma Hai đột biến trên gen FGFR1 là đột biến điểm xảy ra trên exon 12 tại vị trí N546K thay thế acid amin Asparagine (AAC) thành Lysin (AAA) và exon 13 tại

vị trí R576W thay thế Arginine (CGG) thành Tryptophan (TGG) [20]

Hình 1.6: Đột biến FGFR1 trong glioblastoma

(Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

1.2.3.2 Dung hợp gen FGFR3-TACC3

Sự dung hợp của gen FGFR3 với gen TACC3 đã được mô tả trong cơ

chế bệnh học của glioblastoma, ung thư biểu mô bàng quang, ung thư phổi và ung thư cổ tử cung… Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các vùng trên gen trên NST số 4 cho thấy sự dung hợp gen tại vị trí 1,808,966 của FGFR3 và 1,737,080 của TACC3 Sự xóa đoạn của exon 17 trên gen FGFR3 và intron 7 trên gen TACC3 dẫn đến sự thay đổi trong quá trình ghép nối, trong đó exon 16 của gen FGFR3 được ghép nối với exon 8 của gen TACC3

Theo nghiên cứu của Devendra Singh và cộng sự trên một nhóm nhỏ bệnh nhân cho thấy khoảng 3,1% glioblastoma là do sự hợp nhất gen FGFR

PCR được Kary Mullis phát minh năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988,

kỹ thuật này nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu Y- Sinh học Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính và hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA polymerase Với nguyên liệu là bốn loại nucleotide, enzyme DNA polymerase xúc tác tổng hợp một mạch DNA mới từ DNA khuôn Phản ứng đòi hỏi sự có mặt của mồi xuôi, mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn

Một phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: biến tính, bắt cặp, kéo dài chuỗi

* Giai đoạn biến tính: Trong một phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94-95ºC trong vòng 30 giây – 1 phút Bước này DNA sợi kép tách thành DNA sợi đơn

* Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn dao động khoảng 40-70ºC, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng

và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

* Giai đoạn kéo dài chuỗi: Nhiệt độ được tăng lên 72ºC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase…) hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian phụ thuộc vào trình

tự DNA cần khuếch đại, thường từ 30 giây đến nhiều phút

Sau mỗi chu kỳ, các đoạn DNA được tổng hợp sẽ dùng làm khuôn cho

sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo Như vậy sản phẩm của phản ứng tăng theo cấp số nhân sau mỗi chu kỳ, sau n chu kỳ số lượng DNA thu được sẽ là bản copy Tuy nhiên, thông thường hiệu suất sẽ không đạt 100%

vì vậy chúng ta tiến hành chạy 25-40 chu kỳ tùy nồng độ và mục đích cần khuếch đại DNA

Kết quả là từ một lượng nhỏ DNA khuôn ban đầu, ta thu được một lượng lớn DNA Song điều đó cũng có nghĩa trong quá trình tiến hành chỉ cần nhiễm một lượng nhỏ DNA ngoại lai cũng dẫn đến sự thất bại của phản ứng

Hình 1.8: Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR

(Nguồn: https://www.gene-quantification.de/block.html)

1.3.2 Kỹ thuật scorpion ARMS

Kỹ thuật scorpion ARMS (Scorpion Amplification Refractory Mutation System) là sự kết hợp đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và công nghệ Scorpion trong phản ứng real-time PCR để phát hiện các đột biến Trong đó nguyên lý khuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tính Taq DNA polymerase chỉ khuếch đại hoàn chỉnh một phân tử DNA một khi đầu 3’ của mồi và khuôn bổ sung hoàn toàn với nhau Khi đầu 3’ của mồi không bổ sung với sợi khuôn phản ứng PCR bị ức chế hoàn toàn Dựa trên nguyên lý này, kỹ thuật cho phép khuếch đại đặc hiệu một trình tự đột biến ngay cả trong trường hợp alen đột biến chiếm một tỷ lệ nhỏ (1%) trong tổng

số sợi khuôn DNA

Scorpion là phân từ có một đầu mang trình tự của đoạn mồi đặc hiệu với alen đột biến cần khuếch đại, đầu trình tự này được nối với một đầu dò Phần kích thích phát tín hiệu huỳnh quang của đầu dò được gắn với phần ức chế có nhiệm vụ dập tắt tín hiệu huỳnh quang của phần kích thích Trong phản ứng PCR khi đầu dò bám với trình tự khuếch đại phần kích thích phát tín hiệu huỳnh quang được giải phóng khỏi phần ức chế, phát tín hiệu đến bộ phận cảm biến của máy real-time PCR

Kỹ thuật Scorpion ARMS cho phép xác định được đột biến điểm tại exon 12 và exon 13 gen FGFR, kỹ thuật này có độ nhạy cao, thời gian ngắn tuy nhiên chỉ phát hiện được những đột biến đã biết trước và chi phí thực hiện tốn kém

1.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen

Kỹ thuật giải trình tự gen do F.Sanger, Smith và Coulson phát hiện vào năm 1977, là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các nucleotide A, T, G,

C trên phân tử DNA Hiện nay, người ta sử dụng phương pháp giải trình tự dideoxynucleotide bằng máy tự động Đoạn trình tự đã biết kết quả sẽ được đem so sánh với trình tự trên ngân hàng GenBank cho ta biết được biến đổi

trên phân tử DNA

Nguyên lý của kỹ thuật giải trình tự gen: dideoxynucleotide (ddNTP) là một phân tử nhân tạo, cấu trúc của nó tương tự như phân tử deoxynucleotid (dNTP), tuy nhiên ở cacbon số 3 của đường deoxyribose không có nhóm chức hydroxyl (-OH) mà là gốc hydro (-H) Thông thường, trong quá trình tổng hợp mạch đơn bổ sung, một dNTP tự do gắn vào chuỗi đang tổng hợp bằng liên kết phosphodieste giữa 5’-phosphate với nhóm 3’-hydroxyl của nucleotide cuối cùng của chuỗi Tuy nhiên, nếu một ddNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi đang tổng hợp thì sự tổng hợp DNA sẽ dừng lại do không hình thành được liên kết phosphodieste với nucleotide tiếp theo Hỗn hợp sau