NGHIÊN cứu ĐỊNH LƯỢNG STEROID NIỆU BẰNG GCMS TRONG CHẨN đoán rối LOẠN SINH TỔNG hợp STEROID bẩm SINH ở TRẺ EM

Sử dụng kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ GC/MS là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán xác định các rối loạn sinh tổng hợp và chuyểnhóa của hormon steroid, đem lại hình ảnh toàn diện về các hor

TRẦN THỊ NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG STEROID NIỆU BẰNG GC/MS TRONG CHẨN ĐOÁN RỐI LOẠN SINH TỔNG HỢP STEROID

BẨM SINH Ở TRẺ EM

ĐỀ CƯƠNG DỰ TUYỂN NGHIÊN CỨU SINH

HÀ NỘI - 2015

TRẦN THỊ NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG STEROID NIỆU BẰNG GC/MS TRONG CHẨN ĐOÁN RỐI LOẠN SINH TỔNG HỢP STEROID

BẨM SINH Ở TRẺ EM

Chuyên ngành: Hóa sinh y học

Mã số: 62720112

ĐỀ CƯƠNG DỰ TUYỂN NGHIÊN CỨU SINH

NGƯỜI DỰ KIẾN HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 TS Trần Thị Chi Mai

2 PGS.TS Trần Minh Điển

HÀ NỘI – 2015

BÀI LUẬN VỀ DỰ ĐỊNH NGHIÊN CỨU

Họ và tên thí sinh: TRẦN THỊ NGỌC ANH

Cơ quan công tác: Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức

Chuyên ngành dự tuyển: Hóa sinh y học Mã số: 62720112

1 LÝ DO LỰA CHỌN ĐỀ TÀI, LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU

Rối loạn sinh tổng hợp và chuyển hóa hormon steroid là bệnh lý của tuyếnthượng thận gây giảm sản xuất một hoặc nhiều hormon vỏ thượng thận do thiếu hụtenzyme đồng thời gây tăng tổng hợp hormone tiền chất trước vị trí enzyme thiếuhụt và hormone theo con đường khác Bệnh có thể phát hiện khi trẻ mới sinh hoặc ởtuổi thiếu niên, người trưởng thành Việc chẩn đoán và điều trị sớm có vài trò đặcbiệt quan trọng với trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ nhằm hạn chế biến chứng rối loạn muốinước, rối loạn phát triển giới tính Sử dụng kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ (GC/MS)

là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán xác định các rối loạn sinh tổng hợp và chuyểnhóa của hormon steroid, đem lại hình ảnh toàn diện về các hormon steroid có nguồngốc tuyến thượng thận thông qua các sản phẩm chuyển hóa trong nước tiểu Bệnhphẩm là nước tiểu nên phù hợp với trẻ sơ sinh, không gây tổn thương cho trẻ nhưbệnh phẩm máu Phát hiện và điều trị sớm cho trẻ bị rối loạn chuyển hóa hormonsteroid đem lại kết quả tốt cho sự phát triển và trưởng thành của trẻ

Việc triển khai và áp dụng kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ trong điều kiện ViệtNam tại khoa xét nghiệm Hóa sinh - Bệnh viện Nhi trung ương là rất cần thiết đểphục vụ chẩn đoán nhiều bệnh lý của trẻ em đặc biệt là các hội chứng rối loạnchuyển hóa Sự cần thiết là phải thiết lập được giá trị tham chiếu cho các xétnghiệm triển khai trên hệ thống này ở trẻ sơ sinh Việt Nam làm điều kiện để chẩnđoán bệnh lý rối loạn chuyển hóa hormon steroid Đồng thời, ứng dụng kỹ thuậtGC/MS để sàng lọc, chẩn đoán trẻ em có triệu chứng rối loạn chuyển hóa hormon

2. MỤC TIÊU VÀ MONG MUỐN ĐẠT ĐƯỢC KHI ĐĂNG KÝ ĐI HỌC NGHIÊN CỨU SINH

Ứng dụng các kỹ thuật trên thế giới vào điều kiện Việt Nam để nghiên cứuchuyên sâu về bệnh học, chẩn đoán và điều trị là rất cần thiết đặc biệt tại các bệnhviện chuyên khoa tuyến cuối Sau khi thực hiện đề tài này, tôi biết thêm về kỹ thuậtGC/MS và ứng dụng của kỹ thuật trong chẩn đoán các bệnh lý rối loạn chuyển hóasteroid cho trẻ em và người trưởng thành để chẩn đoán xác định và loại trừ Họcnghiên cứu sinh tại trường Đại học Y Hà Nội là cơ hội để tôi được tiếp thu kiếnthức chuyên môn, nâng cao trình độ và kỹ năng nghiên cứu Sau khi thực hiện đề tàinày, tôi có khả năng thực hiện các nghiên cứu cơ bản như đánh giá, so sánh các xétnghiệm hiện có tại phòng xét nghiệm nhằm đảm bảo và nâng cao chất lượng xétnghiệm Triển khai, áp dụng các xét nghiệm mới trên thế giới vào phòng xét nghiệmcủa mình để giúp các bác sỹ lâm sàng chẩn đoán sớm và chính xác bệnh lý mà lâmsàng yêu cầu, đặc biệt là nhóm bệnh lý rối loạn chuyển hóa thường gặp tại ViệtNam bằng các kỹ thuật cập nhật trên thế giới

3.LÝ DO LỰA CHỌN CƠ SỞ ĐÀO TẠO

Lựa chọn trường Đại học Y Hà Nội là cơ sở đào tạo nghiên cứu sinh vì đây làtrường đại học rất nổi tiếng, được thành lập từ năm 1902 với nhiều thành tích tronglĩnh vực đào tạo, nghiên cứu khoa học Tại đây, tôi có cơ hội học tập, nghiên cứu tối

đa với các thầy giỏi là chuyên gia đầu ngành trong chuyên ngành của mình TrườngĐại học Y Hà Nội là nơi tôi đã học tập trong hơn 8 năm khi còn là sinh viên và họcviên cao học, là nơi đào tạo tốt nhất với các bác sỹ

4.DỰ ĐỊNH VÀ KẾ HOẠCH THỰC HIỆN

Đề tài sẽ được thực hiện tại các cơ sở y tế lớn, có uy tín chất lượng như bệnhviện Nhi trung ương, bệnh viện Phụ sản Hà Nội, trường Đại học Y Hà Nội Đề tàigồm 3 mục tiêu:

 Xây dựng và chuẩn hóa quy trình kỹ thuật định lượng đồng thời một

số sản phẩm chuyển hóa của steroid trong nước tiểu bằng kỹ thuật GC/MS

 Ứng dụng kỹ thuật GC/MS phân tích steroid niệu để chẩn đoán bệnhnhi nghi ngờ rối loạn sinh tổng hợp và chuyển hóa hormon steroid vỏ thượngthận

Bước 1: Xây dựng và thẩm định quy trình chuẩn định lượng các sản phẩm chuyển

hóa của hormon steroid trong nước tiểu bằng kỹ thuật GC/MS trong điều kiệnphòng xét nghiệm tại Việt Nam: tính độ chính xác ngắn hạn và dài hạn, giới hạnđịnh lượng, độ xác thực bằng cách so sánh với kết quả ngoại kiểm

Bước 2: Thu thập mẫu nước tiểu tươi bất kỳ của 120 trẻ sơ sinh khỏe mạnh nam và

nữ tương đương được sinh ra tại các bệnh viện phụ sản ở Hà nội, làm xét nghiệmtrên hệ thống GC/MS để thiết lập giá trị tham chiếu cho trẻ sơ sinh Việt Nam

Bước 3: Những trẻ nghi ngờ mắc hội chứng rối loạn chuyển hóa hormon steroid

được phân tích trên GC/MS với mẫu nước tiểu tươi để chẩn đoán

Thời gian thực hiện: tháng 9/2015 đến 12/2017

Địa điểm thực hiện: Khoa Hóa sinh, Khoa nội tiết –Chuyển hóa - Di truyềnBệnh viện Nhi trung ương

5.KINH NGHIỆM

Tôi tốt nghiệp loại giỏi tại trường Đại học Y Hà Nội năm 2000, được chuyểntiếp học cao học khóa 9 năm 2001 – 2003 Sau khi tốt nghiệp đã làm việc tại khoaHóa Sinh – Bệnh viện Bạch Mai trong tám năm từ 2003 đến 2011 Khoa Hóa sinhbệnh viện Bạch Mai là cơ sở hàng đầu của chuyên ngành hóa sinh y học với các trangthiết bị rất hiện đại, tổ chức hoạt động chuyên nghiệp, khoa học Tôi có khả năng làmchủ các kỹ thuật mới, triển khai và áp dụng thành công hệ thống chuẩn bị mẫu tựđộng MPA (module preanalytic) đầu tiên của Việt Nam và đạt giải nhất khi tham giahội thao sáng tạo tuổi trẻ ngành y tế khu vực Hà Nội lần thứ XXIV – năm 2011

Từ tháng 8 năm 2011 đến nay, tôi công tác tại Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức,thực hiện công việc xét nghiệm Huyết học, hóa sinh, miễn dịch tại phòng xétnghiệm theo yêu cầu và thực hiện nhiều nghiên cứu về xét nghiệm hóa sinh, miễn

triển khai thêm nhiều kỹ thuật mới, hiện đại phù hợp để chẩn đoán sớm và chínhxác các bệnh lý rối loạn chuyển hóa thường gặp trong đó có rối loạn chuyển hóahormon steroid nguồn gốc tuyến thượng thận Cần thiết phối hợp từ nhiều chuyênngành khác nhau, đặc biệt là xét nghiệm để phục vụ chẩn đoán, theo dõi, điều trị.Với tiến bộ của nền y học trên thế giới, rất cần triển khai các kỹ thuật mới tại ViệtNam, với kinh nghiệm và kiến thức được đào tạo bài bản trong lĩnh vực xét nghiệm

cả hóa sinh và huyết học, tôi tự tin trong chuyên môn và có khả năng thực hiện các

kỹ thuật khó, mới triển khai

6. DỰ KIẾN VIỆC LÀM VÀ CÁC NGHIÊN CỨU TIẾP THEO SAU KHI TỐT NGHIỆP

Sau khi tốt nghiệp, tôi sẽ tiếp tục công tác tại Bệnh viện Việt Đức và thực hiệncác nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực cận lâm sàng (hóa sinh, huyết học) ưu tiênthực hiện các nghiên cứu cơ bản Các xét nghiệm mới sau khi đánh giá phươngpháp và xây dựng giá trị tham chiếu sẽ được thực hiện thường quy tại bệnh viện Nhitrung ương để chẩn đoán sớm và chính xác nhóm bệnh lý rối loạn chuyển hóahormon steroid cho trẻ sơ sinh và trẻ em tại Việt Nam

Tôi mong muốn tiếp tục thiết lập giá trị tham chiếu cho các xét nghiệm khácđang được sử dụng tại phòng xét nghiệm trong nước nhưng hiện vẫn lấy giá trị thamchiếu từ nước ngoài hoặc từ nghiên cứu trước đây không còn phù hợp với giá trịsinh học của người Việt Nam trong thời điểm hiện tại

7.ĐỀ XUẤT NGƯỜI HƯỚNG DẪN

Tiến sỹ Trần Thị Chi Mai, giảng viên bộ môn Hóa sinh, trường Đại học Y HàNội: Tiến sỹ có nhiều kinh nghiệm giảng dạy, nghiên cứu khoa học và hướng dẫnnhiều học viên sau đại học đạt kết quả cao Tiến sỹ có nhiều kinh nghiệm trong lĩnhvực hóa sinh y học và hóa sinh nhi khoa

và hướng dẫn nhiều học viên sau đại học.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Hormon steroid 4

1.1.1 Sinh tổng hợp hormon steroid vỏ thượng thận 4

1.1.2 Chuyển hóa của hormon steroid 6

1.1.3 Tác dụng sinh học của hormon steroid vỏ thượng thận 9

1.2 Bệnh lý rối loạn sinh tổng hợp và chuyển hóa hormon steroid 10

1.3 Các rối loạn khác của tuyến vỏ thượng thận 18

1.4 Các kỹ thuật phân tích steroid 19

1.4.1 Kỹ thuật miễn dịch 19

1.4.2 Kỹ thuật sắc ký 21

1.4.3 Kỹ thuật phân tích gen 24

1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật GC/MS trên thế giới và ở Việt Nam 25

1.6 Thẩm định phương pháp 27

1.7 Thiết lập giá trị tham chiếu 29

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Đối tượng nghiên cứu 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3 Trang bị, hoá chất và chất liệu nghiên cứu 30

2.3.1 Trang thiết bị 30

2.3.2 Hoá chất và vật tư tiêu hao 31

2.3.3 Chất liệu nghiên cứu 32

2.4 Nội dung nghiên cứu 33

2.4.1 Xây dựng và thẩm định quy trình chuẩn định lượng steroid niệu 33

2.5 Phân tích và xử lý số liệu 38

Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ 39

3.1 Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 39

3.2 Xây dựng và đánh giá quy trình chuẩn định lượng hormon steroid niệu 39

3.2.1 Các sản phẩm phân tích GC/MS 39

3.2.2 Giới hạn định lượng của sản phẩm khi phân tích bằng GC/MS 41

3.2.3 Độ thu hồi khi phân tích bằng GC/MS 42

3.2.4 Độ chụm của kỹ thuật phân tích steroid niệu bằng GC/MS 43

3.2.5 Độ xác thực của kết quả GC/MS khi so sánh với kết quả ngoại kiểm 43

3.3 Thiết lập giá trị tham chiếu cho xét nghiệm định lượng steroid niệu bằng kỹ thuật GCMS ở trẻ sơ sinh Việt Nam 44

3.4 Chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid vỏ thượng thận ở trẻ em 45

Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 48

4.1 Quy trình chuẩn định lượng hormon steroid niệu bằng kỹ thuật GC/MS 48

4.2 Giá trị tham chiếu của xét nghiệm steroid niệu bằng kỹ thuật GC/MS ở trẻ sơ sinh Việt Nam 49

4.3 Kết quả định lượng hormon steroid niệu ở trẻ em nghi ngờ mắc rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid 50

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 3.1: Các sản phẩm chuyển hóa chính của hormon steroid được định lượng

bằng GC/MS 39

Bảng 3.2: Giới hạn định lượng của các sản phẩm chuyển hóa steroid niệu 41

Bảng 3.3: Tỷ lệ % thu hồi của các sản phẩm chuyển hóa steroid niệu 42

Bảng 3.4: Độ chính xác ngắn hạn và dài hạn 43

Bảng 3.5: So sánh nồng độ của các sản phẩm chuyển hóa steroid của hai giới trẻ sơ sinh 44

Bảng 3.6: Nồng độ sản phẩm chuyển hóa steroid theo tuổi của trẻ sơ sinh 45

Bảng 3.7: Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán các bệnh lý thiếu hụt enzyme 45

Bảng 3.8: Đặc điểm xét nghiệm của bệnh nhi RLCH steroid 46

DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Sắc ký đồ các sản phẩm khi phân tích bằng khối phổ ở trẻ bình thường 40

Hình 3.2: Sắc ký đồ của bệnh nhân thiếu hụt 21-hydroxylase 46

Hình 3.3: Sắc ký đồ của bệnh nhân thiếu hụt 17α-hydroxylase 47

CAH Congenital adrenal hyperplasia

CBG Corticosteroid binding globulin

CMIA Chemiluminescent Microparticle Immunoassay

CLIA Clinical Laboratory Improvement Amendments

CV Coefficient variation

DELFIA Time resolved fluorometric assay

DHT Dehydro testosterone

DHEA Dehydroepiandosterone

DSD: Disorder of sexual development

ECLIA Electrochemiluminescence immunoassay

ELISA Enzym linked immunoassay

FSH Follice stimulating hormon

GC/MS Gas chromatography – mass spectrometry

GnRH Gonadotropin releasing hormon

IFCC International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory

SHBG Sex hormon binding globulin

SIM Selected ion monitoring

TMSI (N-trimethylsilyl) imidazole

TSTTBS Tăng sản thượng thận bẩm sinh

USP Urine steroid metabolomic profiling

UDPGA Uridine diphosphoglucuronic acid

17-OHP 17 hydroxy progesterone

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rối loạn sinh tổng hợp và chuyển hóa hormon steroid vỏ thượng thận ở trẻ em

là nhóm bệnh di truyền thường gặp, gây tăng sản thượng thận bẩm sinh (congenitaladrenal hyperplasia- CAH) và rối loạn phát triển giới tính (disorders of sexdevelopment-DSD), bệnh biểu hiện sớm ngay khi trẻ mới sinh hoặc sau đó [1] Cơchế bệnh sinh của tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là do thiếu hụt mộttrong bốn enzym tham gia tổng hợp cortisol hoặc bất thường protein vận chuyểncholesterol qua màng ty thể làm cơ chất để tổng hợp các hormon steroid Giảm nồng

độ cortisol trong máu, gây tăng tiết Adrenocorticotropic hormon (ACTH) theo cơ chếfeed-back dẫn tới tăng sinh vỏ thượng thận [2] Thường gặp nhất trong nhóm bệnhTSTTBS là do thiếu hụt enzym 21–hydroxylase (21-OHD), chiếm khoảng 90% cáctrường hợp TSTTBS [2],[3] Thiếu hụt 21–hydroxylase biểu hiện các triệu chứng dothừa androgen và thiếu cortisol, aldosterone trong máu [2] Ngoài ra, rối loạn sinhtổng hợp hormon steroid có thể do thiếu hụt các enzym khác tham gia bước cuối conđường tổng hợp hormon chuyển hóa muối nước, horrmon sinh dục vỏ thượng thậngây rối loạn thăng bằng nước điện giải và bất thường trong sự phát triển giới tính.Trong đó, thiếu hụt 17α-hydroxylase, 3β–hydroxysteroid dehydrogenase, 11β-hydroxylase, 20,22-desmolase, Aromatase, 17β–hydroxysteroid dehydrogenase và5α-reductase được ghi nhận trong các y văn trên thế giới [1],[3],[4] Bệnh TSTTBSnếu được chẩn đoán từ khi mới sinh và điều trị kịp thời bằng hormon glucocorticoidthay thế sẽ đem lại hiệu quả cao, hạn chế biến chứng, giảm tỷ lệ tử vong [4],[5].Năm 1977, lần đầu tiên Pang và cộng sự tiến hành sàng lọc cho trẻ sơ sinh đểphát hiện thiếu hụt 21-hydroxylase bằng kỹ thuật microfilter trên giấy [6] Phươngpháp này đo nồng độ 17-OHP trong máu bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassay-RIA) Từ đó đến nay, rất nhiều quốc gia trên thế giới đã xây dựngchương trình sàng lọc TSTTBS cho trẻ sơ sinh Tổ chức y tế của 13 quốc gia vàvùng lãnh thổ trong đó có Hoa Kỳ đã sàng lọc cho hơn 30 triệu trẻ sơ sinh bằng xétnghiệm 17-OHP và phát hiện tần xuất TSTTBS khác nhau giữa các nước [7] Tầnxuất TSTTBS ở các nước châu Âu như Pháp, Ý, Thụy Điển, Thụy Sỹ, Hà Lan

khoảng từ 1:10.000 đến 1:15.000 [8],[9],[10],[11] Tần xuất TSTTBS thấp hơn tại

Bỉ và New Zealand 1:25.000 [12] và 1:26.727 [13] tương ứng Tần xuất TSTTBSđặc biệt cao ở chủng tộc người Yupik Eskimos sống tại bang Alaska- Hoa Kỳ(1:282) [7] Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào công bố kết quả sàng lọc TSTTBScho trẻ sơ sinh Tuy nhiên, nhiều bệnh nhi TSTTBS được phát hiện và theo dõi điềutrị tại Bệnh viện Nhi trung ương khi có dấu hiệu rối loạn phát triển giới tính, rốiloạn điện giải và được chẩn đoán hội chứng sinh dục- thượng thận bằng xét nghiệm17-OHP trong máu

Đến nay, phần lớn trẻ sơ sinh và trẻ nghi ngờ mắc bệnh lý TSTTBS được sànglọc và chẩn đoán dựa trên xét nghiệm định lượng 17-OHP trong máu bằng phươngpháp miễn dịch vì phương pháp này có độ tin cậy và tính khả thi [7],[14] Kỹ thuậtnày có thể giúp ích cho nhiều trường hợp đặc biệt là thiếu hụt 21-hydroxylase thểkinh điển (classical 21-hydroxylase deficiency) Tuy nhiên, phương pháp miễn dịchkhông thể loại bỏ hết được phản ứng chéo và các yếu tố nhiễu ở trẻ sơ sinh do sảnphẩm steroid từ mẹ, nhau thai truyền sang dẫn đến dương tính giả [5],[14],[15].Đồng thời, một số ca bệnh TSTTBS không kinh điển có thể bị bỏ sót do nồng độ17-OHP không tăng hoặc chỉ tăng nhẹ thoáng qua [16] Các trường hợp rối loạnsinh tổng hợp hormon steroid khác như Lipoid adrenal hyperplasia hoặc thiếu hụtenzym 17α-hydroxylase, 5α-reductase, 17,20-lyase, thiếu hụt Cytochrom P450oxydoreductase không thể chẩn đoán dựa vào xét nghiệm định lượng 17-OHP vìnồng độ 17-OHP không tăng trong máu [2],[3] Từ những năm 1960, việc ứng dụng

kỹ thuật phân tích steroid niệu đem lại hiệu quả trong chẩn đoán rối loạn sinh tổnghợp và chuyển hóa hormon steroid [17] Các kỹ thuật được áp dụng bao gồm sắc kýlớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký khí – khối phổ, sắc ký lỏng – khối phổ [18], [19], [20].Các kỹ thuật này không ngừng được cải tiến, nâng cao độ nhạy, độ đặc hiệu và rútngắn thời gian phân tích, dễ dàng tự động hóa để có thể áp dụng thường quy tại cácphòng xét nghiệm [21],[22]

Sử dụng kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ (GC/MS) trong phân tích các sản phẩmchuyển hóa của steroid trong nước tiểu là rất có ích trong việc đánh giá nhiều rối

loạn khác nhau của tuyến vỏ thượng thận Kỹ thuật này có vai trò đặc biệt quantrọng trong chẩn đoán và theo dõi các bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh vàrối loạn phát triển giới tính do thiếu hụt các enzym [5], [14], [17],[20],[21] Ngoài

ra GC/MS còn góp phần chẩn đoán các rối loạn khác của tuyến vỏ thượng thận baogồm: hội chứng Cushing, hội chứng Addison, hội chứng Conn, ung thư vỏ thượngthận trong nhóm bệnh cường hoặc suy chức năng tuyến vỏ thượng thận [22],[23],[24],[25],[26] Các biến đổi steroid nước tiểu trong các bệnh này có mẫu hình đặctrưng, được sử dụng để chẩn đoán xác định Phân tích các steroid niệu bằng GC/MS

là thăm dò đầu tiên, cho ta một bức tranh toàn cảnh về sinh tổng hợp và chuyển hóahormon steroid, một kỹ thuật phân tích với độ nhạy và độ chính xác cao, giúp chocác bác sĩ lâm sàng có được chẩn đoán xác định cho những ca bệnh khó [5],[27].Mẫu bệnh phẩm sử dụng trong kỹ thuật này là nước tiểu, vì vậy không xâm phạm,rất tốt cho trẻ em đặc biệt là trẻ sơ sinh Trong khi định lượng steroid trong máu chỉphản ánh mẫu hình biến đổi tại một thời điểm lấy mẫu [17],[20] Ngoài ra, kỹ thuậtnày còn có thể giúp chẩn đoán trước sinh các rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid,xác định các đặc điểm mới của sinh tổng hợp và rối loạn chuyển hóa steroid [25],[28] Phương pháp phân tích steroid niệu bằng GC/MS hiện tại chưa được áp dụng

ở Việt Nam Việc phát triển một kỹ thuật phân tích hiện đại và phức tạp, có thể giúpchẩn đoán những ca bệnh khó tại những trung tâm chăm sóc sức khỏe chuyên sâutại Việt Nam là một việc làm cần thiết Do vậy, đề tài này được tiến hành nhằm mụctiêu:

1 Xây dựng và chuẩn hóa quy trình kỹ thuật định lượng đồng thời một số sản phẩm chuyển hóa của steroid trong nước tiểu bằng kỹ thuật GC/MS.

2 Thiết lập giá trị tham chiếu các sản phẩm chuyển hóa của steroid niệu ở trẻ

sơ sinh khỏe mạnh trên hệ thống GC/MS.

3 Ứng dụng kỹ thuật GC/MS phân tích steroid niệu để chẩn đoán các bệnh nhi nghi ngờ rối loạn sinh tổng hợp và chuyển hóa hormon steroid vỏ thượng thận.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hormon steroid

1.1.1 Sinh tổng hợp hormon steroid vỏ thượng thận

Tuyến thượng thận sản xuất ba nhóm hormon steroid chính là nhóm hormonchuyển hóa muối nước (mineralocorticoids), nhóm hormon tham gia chuyển hóaglucose (glucocorticoids), và nhóm hormon sinh dục (sex hormons) [1],[3] Phầnlớn hormon steroid có hoạt tính lưu thông trong máu được tổng hợp tại vùng vỏ củatuyến thượng thận Ngoài ra một số hormon sinh dục được tổng hợp tại tinh hoàn,buồng trứng, nhau thai trong từng thời kỳ phát triển cơ thể Một số cơ quan kháctrong cơ thể cũng có thể sản xuất ra hormon steroid nhưng không có hoạt tính làgan, thận, não và da [3] Các hormon steroid được tổng hợp từ một nguồn gốcchung là cholesterol

Tuyến thượng thận gồm hai tuyến nằm ở cực trên của hai thận, mối tuyến gồmhai vùng là vùng vỏ và vùng tủy thượng thận Kích thước của mỗi tuyến ở ngườitrưởng thành khoảng 2-3cm chiều rộng, 4-6cm chiều dài, trọng lượng khoảng 4g[29] Tuyến thượng thận có thể thay đổi kích thước phụ thuộc vào nồng độ ACTHtrong máu, khi ACTH tăng cao tuyến thượng thận tăng lượng máu đến và tăng kíchthước [1] Vùng vỏ thượng thận gồm 3 lớp, tổng hợp ba nhóm hormon steroid theocác con đường khác nhau như sau [30],[31]:

Lớp cầu: gồm các tế bào rất mỏng nằm ngoài cùng của tuyến, chiếm 15% thểtích tuyến thượng thận, lớp cầu chuyên sản xuất nhóm các hormon chuyển hóa muối

- nước gồm 21C, trong đó aldosterone giữ vai trò quan trọng nhất

Lớp bó: gồm các tế bào nằm ở giữa, chiếm đến 75% thể tích tuyến thượngthận, lớp bó chuyên sản xuất nhóm hormon chuyển hóa glucose gồm 21C trong đóhormon đóng vai trò quan trọng nhất là cortisol chiếm đến 95% tác dụng nhóm này.Lớp lưới: nằm trong cùng gần với tủy thượng thận Các tế bào lớp lưới có sảnxuất một lượng cortisol rất nhỏ và một nhóm hormon sinh dục vỏ thượng thận gọichung là androgen có 19C, bao gồm dehydroepiandrosterone (DHEA), DHEA

sulphat (DHEA-S) và ∆4-androstenedione Lượng hormon sinh dục được sản xuấtrất nhỏ, được chuyển thành dihydrotestosteron, estradiol tại các mô ngoại vi [2].Các tế bào lớp bó và lớp lưới còn sản xuất 11-deoxycorticosterone (DOC), 18-hydroxydeoxycorticosterone (18-OH-DOC) [1].

Tủy thượng thận nằm ở trung tâm của tuyến, sản xuất và bài tiết cáccatecholamine Tủy thượng thận được coi là hạch giao cảm lớn nhất mà các tế bàothần kinh mất đi sợi trục và trở thành các tế bào bài tiết adrenalin và noradrenalin.Nếu cắt bỏ vùng tủy của hai tuyến thượng thận trên động vật thực nghiệm sẽ gây rốiloạn huyết áp nhưng sau một thời gian huyết áp sẽ trở lại bình thường [1]

Ngược lại, nếu cắt bỏ vùng vỏ của hai tuyến thượng thận trên động vật thínghiệm sẽ gây rối loạn điện giải, mất cân bằng nội môi và mất khả năng chốngstress, con vật sẽ chết sau một vài ngày đến vài tuần Vì vậy, tuyến thượng thận cóvài trò đặc biệt quan trọng mang tính chất sinh mạng, vai trò này được thực hiệnqua các hormon steroid của vỏ thượng thận [1]

Toàn bộ các hormon của vỏ thượng thận đều được tổng hợp từ cholesterol tại

ty thể (mitochondria) của tế bào Hiện có khoảng 30 loại hormon steroid và tiềnchất của hormon được phân lập từ vỏ thượng thận [17],[32] Tuy nhiên chỉ một sốhormon steroid có chức năng quan trọng đối với sự phát triển và sinh tồn của cơ thểnhư cortisol, aldosteron, testosterone Khi rối loạn sinh tổng hợp những hormonquan trọng này gây ra bệnh lý ảnh hưởng đến sự tồn tại và phát triển của cơ thể.Toàn bộ các hormon steroid đều được tổng hợp từ pregnenolone là cơ chất đầu tiênđược tạo ra từ cholesterol Các hormon nhóm chuyển hóa muối nước và chuyển hóaglucose đều có chứa 21C, các hormon sinh dục đều có 19C Tại tuyến thượng thận,cholesterol được tổng hợp từ các mẩu acetyl Coenzym A (acety CoA) khi đáp ứngvới kích thích của ACTH dưới tác dụng của enzym HMGCoA reductase (3-hydroxy-3methylglutaryl coenzym A reductase) Enzym này giới hạn lượngcholesterol được tổng hợp, do vậy quyết định hoạt tính sinh tổng hợp hormonsteroid nói chung [1] Khi ACTH gắn với receptor trên màng tế bào, kích thích phảnứng chuyển ATP (Adenosin triphosphat) thành AMP vòng (cycle Adenosin

monophosphat), đồng thời hoạt hóa enzym HMGCoA reductase xúc tác tổng hợpcholesterol là cơ chất tổng hợp nên các hormon thượng thận.

Hình 1.1: Cấu trúc, quá trình tổng hợp các hormon steroid chính [33] 1.1.2 Chuyển hóa của hormon steroid

Tổng hợp hormon steroid: Người trưởng thành, các hormon steroid được tổnghợp chủ yếu tại tuyến nội tiết như tuyến thượng thận, tinh hoàn, buồng trứng và rauthai rồi được giải phóng vào hệ thống tuần hoàn Cortisol là hormon steroid đượctổng hợp với một lượng lớn nhất khoảng từ 8 đến 25 mg mỗi ngày [34] Trung bìnhkhoảng 9,9 ± 2,7 mg/ 24 giờ ở người trưởng thành [35] Các hormon steroid khácđược tổng hợp với lượng ít hơn khoảng từ 1 đến 4 mg/24 giờ [34],[35] Các hormonsinh dục bài tiết bởi buồng trứng thay đổi theo giai đoạn của chu kỳ kinh nguyệt

Sự tổng hợp và bài tiết hormon vỏ thượng thận lớp bó và lưới chịu tác độngkích thích lớn của ACTH, trong vòng 2-3 phút sau khi ACTH kích thích, lượng máuđến tuyến thượng thận tăng lên, cortisol được giải phóng nhanh chóng Trong vòng

một giờ, trọng lượng tuyến tăng lên, kích thước có thể gấp đôi so với trước khi kíchthích [1-389] Sự kích thích kéo dài của ACTH lên tuyến thượng thận gây tăng kíchthước và tăng sản tuyến thượng thận có thể là kết quả tác động của yếu tố phát triểngiống insulin (insulin-like growth factors, yếu tố phát triển tế bào sợi cơ bản (basicfibroblast growth factors), yếu tố phát triển biểu bì (epidermal growth factors) [30]trong khi làm giảm nồng độ các chất gây chết tế bào định kỳ trong các vùng này.Ngoài ra, khi nồng độ angiotensin II và kali máu cao sẽ làm tăng sản vùng cầu củatuyến thượng thận [30].

Vận chuyển hormon trong máu: Các hormon steroid không tan trong nước nênphần lớn được liên kết với gốc sulfat, liên hợp với glucuronid hay gắn với protein,albumin huyết tương [1] Khoảng 20-50% hormon steroid trong huyết tương gắnkhông đặc hiệu với albumin, phần còn lại gắn với globulin vận chuyển corticoid(corticosteroid binding globulin – CBG) hoặc globulin vận chuyển hormon sinh dục(sex hormon binding globulin – SHBG) trên cơ sở liên kết đặc hiệu [36] Một lượngnhỏ hormon ở dạng tự do (chiếm khoảng 1-10% nồng độ hormon trong huyếttương) có hoạt tính sinh học Hornmon steroid gắn với protein huyết tương sẽ giảiphóng từ từ các hormon tự do vào máu, tác động lên tế bào đích, phần còn lại đượcbảo vệ tránh tác dụng phân hủy của enzym nguồn gốc từ gan, làm kéo dài thời gianbán hủy của dạng hormon có hoạt tính sinh học [37],[38]

Chuyển hóa hormon steroid ở ngoại vi: hormon steroid hòa tan trong lipid nên

dễ dàng phân tán đi qua màng tế bào, khuyếch tán rất rộng trong các tế bào của cơthể Ở mô đích, hormon steroid được giải phóng sẽ gắn với receptor đặc hiệu là cácprotein gắn steroid (steroid binding protein) ở bên trong bào tương của tế bào đích

Các receptor này thuộc họ protein receptor gắn DNA của steroid/thyroid hormon.Phức hợp receptor - steroid được chuyển vào trong nhân tế bào đến vị trí đặc hiệutrên nhiễm sắc thể thường để tổng hợp nên mARN Từ đó mARN ra bào tương đểtổng hợp protein thể hiện tác dụng của hormon trên tế bào đích [30] Ngoài ra, mộtlượng lớn hormon steroid được thấy ở mô mỡ, tuy nhiên mô mỡ không phải là môđích của hormon steroid [39]

Một số hormon hormon steroid phải chuyển thành dạng hoạt tính trước khi gắnvào receptor đặc hiệu ở mô đích Testosterone không tác dụng trực tiếp lên tuyếntiền liệt mà phải chuyển thành 5a-DHT (androgen dihydrotestosterone) dưới tácdụng của enzym 5α-reductase để có tác dụng lên sự phát triển và chức năng củatuyến tiền liệt Vì vậy, khi thiếu hụt enzym 5α-reductase, testosterone không chuyểnthành 5a-DHT gây ra lưỡng giới giả (pseudohermaphroditism) Mặc dù người mangnhiễm sắc thể 46XY, nhưng biểu hiện bên ngoài giống với nữ vì nồng độtestosterone bình thường nhưng nồng độ 5a-DHT giảm nên không có tác dụng lêntuyến tiền liệt [27] Tương tự như vậy, progesterone chuyển thành 5a-DHP(dihydroprogesterone), mặc dù không tác dụng lên tử cung nhưng 5a-DHP tác dụngkích thích hoặc ức chế GnRH để giải phóng hormon LH [1]

Các hormon thượng thận phần lớn bị bất hoạt bởi các enzym của gan ở ngoại

vi để chuyển từ dạng có hoạt tính sinh học sang dạng không còn hoạt tính hoặc làmthay đổi giai đoạn có hoạt tính của hormon Một số hormon bị bất hoạt ở thận.Hormon bất hoạt phần lớn được đào thải ra nước tiểu dưới dạng các sản phẩmchuyển hóa (thường được liên hợp và hòa tan trong nước) mà không được tái hấpthu [1] Có 5 cách thức chuyển hóa của hormon steroid tùy thuộc cấu trúc củahormon như sau:

- Khử liên kết đôi tại vị trí C4 và khử nhóm oxo (tức nhóm chức keto -CHO)tại vị trí C3 tạo thành nhóm chức rượu (alcohol-OH) thứ hai

- Khử nhóm oxo tại vị trí C20 tạo thành nhóm chức rượu

- Oxy hóa nhóm chức 17β-hydroxyl

- Kết hợp hydroxy hóa và thay đổi vị trí của nhân steroid

- Liên hợp giữa hormon steroid với sulphate hoặc glucuronic

Liên hợp để tạo thành dạng hòa tan trong nước là một bước quan trọng trong giánghóa steroid, tất cả các sản phẩm bài tiết của steroid đều được liên hợp với sulphat hoặcglucuronid Steroid liên hợp với uridine diphosphoglucuronic acid (UDPGA) tạo thànhsteroid glucuronide hòa tan trong nước dưới tác dụng của enzym glucuronyl transferase

Steroid liên hợp với gốc sulphat dưới tác dụng của enzym sulphokinase tại bàotương của tế bào gan, tinh hoàn, thượng thận và các mô bào thai

1.1.3 Tác dụng sinh học của hormon steroid vỏ thượng thận.

Nhóm mineralocorticoid: Aldosteron có tác dụng chủ yếu của nhóm này.

Tác dụng tăng tái hấp thu ion Na+, ion Cl- và tăng bài xuất ion K+ ở ống thận,tuyến mồ hôi, tuyến nước bọt kéo theo sự tái hấp thu nước gây tăng thể tích dịchngoại bào Nếu thiếu hụt hormon gây mất Na+, giảm thể tích dịch ngoại bào đồngthời tăng nồng độ ion K+ gây độc cho cơ tim, mất muối qua đường mồ hôi gây rốiloạn thăng bằng điện giải [1],[3],[18]

Điều hòa bài tiết hormon mineralocorticoid bởi nồng độ các chất điện giảitrong máu thông qua hệ thống Renin- Angiotensin- Aldosterone [1]

Nhóm hormon glucocorticoid: Cortisol có vai trò chính chiếm 95% tác dụng

Tác dụng chống stress: Khi bị stress, cơ thể lập tức tăng tiết ACTH, sau vàiphút một lượng lớn cortisol được bài tiết vào máu có thể lên đến 300 mg/24 giờ[34] Cortisol có tác dụng huy động nhanh acid amin và lipid dự trữ, cung cấp nhiềunăng lượng cho tổ chức đồng thời sử dụng các acid amin để tổng hợp các chất cầnthiết duy trì sự sống của tế bào như purin, pyrimidin, creatin phosphat

Tác dụng chống viêm: Cortisol làm giảm tất cả các giai đoạn của phản ứngviêm do làm ổn định màng lysosom trong các tế bào và ức chế enzymphospholipase A2, ngăn cản sự hình thành các chất gây viêm như leukotrien,

prostaglandin nên có tác dụng hạn chế sự dãn mạch, tăng nhiệt độ và tăng tính thấmthành mạch nên giảm viêm mạnh.

Tác dụng chống dị ứng: Cortisol làm giảm tiết histamin trong các phản ứng dịứng làm giảm các triệu chứng mẩn ngứa

Các tác dụng khác: Cortisol làm giảm số lượng bạch cầu ưa acid, giảm bạchcầu lympho và giảm sự hình thành kháng thể miễn dịch, vì vậy có tác dụng chốngthải ghép Tăng nồng độ cortisol làm tăng chuyển T3 thành T4, giảm tổng hợphormon sinh dục, tăng bài tiết acid dịch vị có thể dẫn đến loét dạ dày, ức chế hìnhthành xương, giảm lắng đọng protein của xương gây loãng xương

Điều hòa bài tiết cortisol: điều hòa bởi ACTH theo cơ chế feed back, khi nồng

độ cortisol thấp kích thích tuyến yên bài tiết ACTH, gây tăng tổng hợp hormontuyến vỏ thượng thận [1] Cortisol được bài tiết theo nhịp ngày đêm

Nhóm hormon sinh dục vỏ thượng thận: rất ít tác dụng trừ khi có rối loạn bài

tiết gây tăng tiết hormon androgen trong nhóm bệnh lý TSTTBS Androgen gâynam hóa ở nữ như rậm lông, mọc ria mép và gây dậy thì sớm ở bé trai khoảng 9 –

10 tuổi với triệu chứng mọc ria, lông mu, phát triển sớm bộ phận sinh dục, vì vậytrẻ ngừng phát triển sớm, chiều cao hạn chế [3],[40],[41]

1.2 Bệnh lý rối loạn sinh tổng hợp và chuyển hóa hormon steroid

Các rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid chủ yếu được chia làm 3 nhóm baogồm nhóm bệnh giảm tổng hợp nhóm hormon chuyển hóa glucose, nhóm bệnh giảmtổng hợp hormon chuyển hóa muối- nước và nhóm bệnh giảm tổng hợp hormonsinh dục vỏ thượng thận Ngoài ra, một nhóm bệnh bất thường tại cơ quan đích củacác hormon steroid liên quan đến receptor gây giảm hoặc mất tác dụng của hormongiống triệu chứng giảm nồng độ hormon có thể gọi là nhóm thứ tư

Nhóm 1: Tăng sản thượng thận bẩm sinh do tuyến thượng thận không có

khả năng tổng hợp và bài tiết hormon glucocorticoid đặc biệt là cortisol Hậu quả làACTH được tăng tiết từ tuyến yên do cơ chế feed-back làm tăng tổng hợp cáchormon khác của tuyến thượng thận TSTTBS được mô tả lần đầu tiên trong vănvào năm 1865 bởi tác giả Luigi De Crecchio ở một bệnh nhân có cả dương vật và tử

cung Lúc mới sinh, bệnh nhân có đặc điểm cơ quan sinh dục nữ, sau 4 năm biểuhiện giống nam giới [2] Bệnh lý gặp trong nhóm này bao gồm:

Lipoid adrenal hyperplasia do không chuyển được cholesterol đến bất kỳ một

vị trí nào để tổng hợp hormon steroid Bệnh lý này rất ít gặp và dấu hiệu đặc trưng

là mất muối, lưỡng giới giả ở trẻ nam Ở trẻ nữ, cơ quan sinh dục bên trong và bênngoài đều là nữ nhưng không phát triển Triệu chứng giống với suy tuyến thượngthận bẩm sinh do thiếu hụt các hormon steroid thượng thận [3] Bản chất là do độtbiến nằm trên gen StAR (nhiễm sắc thể 8p11.2) gây bất thường protein StAR(Steroidogenic Acute Response Protein) hoặc bất thường P450scc trên gen CYP11A(nhiễm sắc thể 15q23-24) gây bất thường protein vận chuyển cholesterol vào bêntrong ty thể [42] Xét nghiệm thấy các hormon steroid trong máu và sản phẩmchuyển hóa trong nước tiểu giảm đồng thời với tăng ACTH trong máu, kali máu cóthể cao hoặc bình thường và natri có thể thấp hoặc bình thường Biểu hiện lâm sàng

có thể gặp tình trạng mất nước ở mọi lứa tuổi, kèm theo tinh hoàn không hạ xuốngbìu ở trẻ trai và cơ quan sinh dục ngoài không phát triển ở phụ nữ [4]

Thiếu hụt 17α-hydroxylaseα-hydroxylasehydroxylase gây lưỡng giới giả ở trẻ trai do thiếu hụt enzyme

giai đoạn trước khi tổng hợp nên testosterone nên tinh hoàn không xuống bìu, cácđặc tính sinh dục thứ phát kém phát triển khi trẻ dậy thì và trưởng thành Ở trẻ nữ,không phát triển các đặc tính sinh dục thứ phát do estrogen tạo ra Cả nam và nữđều gặp tăng huyết áp, giảm kali và tăng natri máu do tăng nồng độ hormon chuyểnhóa muối nước (deoxycorticosterone, corticosterone) trong khi giảm nồng độcortisol, aldosterone và hormon sinh dục (androgen, estrogen) [43]

Thiếu hụt enzyme 3β-hydroxylasehydroxysteroid dehydrogenase (3β-hydroxylaseHSD) gây nên không

hoàn chỉnh các đặc tính giới tính ở trẻ trai, tinh hoàn không xuống bìu do giảm tổnghợp hoặc mất hoạt tính của androgen Trẻ nữ thường biểu hiện đặc điểm sinh dụcngoài bình thường hoặc xuất hiện một vài đặc điểm thay đổi nhẹ hệ sinh dục theohướng nam hóa như phì đại âm vật do tăng hoạt tính của DHEA [1-457] Cả nam và

nữ có thể xuất hiện triệu chứng mất nước do giảm nồng độ natri và tăng kali máu

[44] Xét nghiệm thấy giảm nồng độ aldosterone, cortisol và hormon sinh dục trongkhi nồng độ ACTH tăng cao trong máu Tăng nồng độ 17-OHP và DHEA trongmáu [44] Thiếu hụt 3β-HSD thể không kinh điển xuất hiện sau khi sinh với dấuhiệu tăng DHEA, 17-OHP gây triệu chứng thừa androgen từ nhẹ đến trung bình, màkhông rối loạn điện giải [4].

Thiếu hụt enzym 21-hydroxylase hydroxylase (21-OHD) thường gặp nhất trong số các rối

loạn sinh tổng hợp và chuyển hóa hormon steroid [45], có thể chiếm trên 90% cáctrường hợp TSTTBS, tần xuất khác nhau tùy theo từng chủng tộc [4],[7] Triệuchứng nổi bật ở người thiếu hụt enzym 21-hydroxylase kinh điển (classical) là dotăng nồng độ androgen trong máu biểu hiện các dấu hiệu nam hóa ở trẻ nữ Sau khisinh, nếu không được điều trị kịp thời ở cả trẻ nam và nữ có tốc độ phát triển nhanh,dậy thì sớm ở trẻ trai Tuy nhiên đến 9-10 tuổi trẻ ngừng phát triển, thấp và nhẹ cânhơn bình thường [3] Khoảng 75% trường hợp thiếu hụt 21-hydroxylase kinh điển córối loạn nước- điện giải do giảm tổng hợp aldosterone [4],[41] Một số bệnh nhânthiếu hụt 21-hydroxylase kinh điển chỉ biểu hiện rối loạn giới tính đơn thuần Thiếuhụt 21-hydroxylase kinh điển là bệnh rối loạn sinh tổng hợp steroid bẩm sinh, ditruyền lặn mà gen quy định là CYP21 nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6(6p21.3) [46] Tần xuất thể thiếu hụt 21-hydroxylase kinh điển là khoảng 1:13000đến 1:15 000 trẻ sơ sinh [4],[7] Thiếu hụt 21-hydroxylase không kinh điển(nonclassical) khi mới sinh sẽ không có triệu chứng do androgen gây ra, các triệuchứng có thể xuất hiện sau khi dậy thì hoặc không xuất hiện [45] Tần xuất thiếu hụt21-hydroxylase không kinh điển cao hơn và có thể lên đến 3% tùy theo từng chủngtộc [4],[42] Tần xuất người ở trạng thái dị hợp tử trong quần thể New York City lênđến 1:100 Thiếu hụt 21-hydroxylase di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường, nênchỉ ở thể đồng hợp tử gen lặn mới biểu hiện rõ trên lâm sàng “Bệnh đặc biệt có tỷ lệmắc cao ở quần thể Ashkenazi Jewish, cứ 3 người lại có một người mang allen bệnh,1:27 người có biểu hiện bệnh” [4] Mức độ biểu hiện của thiếu hụt 21-hydroxylase làrất rõ trên lâm sàng với triệu chứng mất muối, nước, và rối loạn phát triển giới tính.Tuy nhiên lâm sàng chia ra ba thể bệnh thiếu hụt 21-hydroxylase là TSTTBS có kèm

rối loạn phát triển giới tính, TSTTBS chỉ có rối loạn phát triển giới tính đơn thuần vàthiếu hụt 21-hydroxylase không kinh điển xuất hiện sau khi sinh với triệu chứng nhẹhơn Nồng độ kali tăng khi có rối loạn nước điện giải và giảm nồng độ natri máu.Nồng độ 17-OHP tăng rất cao trong máu cùng với tăng DHEA, androstenedione,testosterone khi thiếu niên và trưởng thành ở thể thiếu hụt 21-hydroxylase kinh điển.17-keto steroid trong nước tiểu là sản phẩm chuyển hóa của pregnantriol và androgentăng Nồng độ ACTH trong máu tăng ở mọi lứa tuổi [1].

Thiếu hụt enzym 11β-hydroxylasehydroxylase chiếm 5-8% các trường hợp TSTTBS, đứng vị

trí thứ hai sau thiếu hụt 21-hydroxylase [4] Thể kinh điển có tính chất bẩm sinh vớitriệu chứng thường gặp do tăng tiết androgen tương tự như thiếu hụt 21-hydroxylase gây nam hóa trẻ nữ với cơ quan sinh dục ngoài không rõ ràng Giảmhoạt tính enzym 11β-hydroxylase đồng thời gây tăng hoạt tính enzym tổng hợp 11-deoxycorticosterone (DOC) tham gia vào chuyển hóa muối nước gây rối loạn thăngbằng nước – điện giải Nếu không điều trị có thể biểu hiện triệu chứng tăng huyết

áp, đau đầu, buồn nôn ở trẻ em [3] Xét nghiệm thấy tăng natri và hạ kali máu, giảmnồng độ các tiền chất, hormon khác như deoxycorticosterone, 11-deoxycortisol,androgen, cortisol, aldosterone và đặc biệt là ACTH giảm [3] Thể thiếu hụt 11β-hydroxylase không kinh điển với dấu hiệu xuất hiện sau khi sinh do thừa androgen,kết hợp tăng nồng độ deoxycortisol nhưng không gây rối loạn nước điện giải [4]

Nhóm 2: Các rối loạn hiếm gặp do bất thường trong bước cuối cùng sinh tổng

hợp các mineralocorticoid tham gia chuyển hóa muối nước và glucocorticoid thamgia chuyển hóa chuyển hóa glucose gây mất cân bằng nước và điện giải, thuộcnhóm 2 có các bệnh lý sau:

Thiếu hụt enzym corticosterone methyl oxidase II của tuyến thượng thận, gây

giảm tổng hợp aldosterone, biểu hiện là mất muối và mất nước ngay khi trẻ mớisinh Một số bệnh nhi có triệu chứng không đầy đủ Xét nghiệm ngay sau khi sinhthấy tăng kali và giảm natri máu đồng thời với giảm aldosterone và tăng 18-hydroxycorticosterone máu [3]

Glucocorticoid suppresible hyperaldosteronism là bệnh gen trội trên nhiễm

sắc thể thường đặc trưng bởi rối loạn hormon chuyển hóa muối nước do tác độngbất thường của ACTH lên tổng hợp aldosterone làm tăng nồng độ aldosterone.Lâm sàng xuất hiện triệu chứng tăng huyết áp, đau đầu Xét nghiệm thấy kalimáu thấp, aldosterone trong máu và 18-Oxocortisol trong nước tiểu cao ở mọilứa tuổi [3]

Thiếu hụt 11β-hydroxylasehydroxysteroid dehydrogenase type II gây mất hoạt tính của

cortisol làm tăng huyết áp kèm theo hạ kali máu mà không thấy tăng nồng độ cáchormon corticoid tham gia chuyển hóa muối nước Xét nghiệm thấy giảm kali máu,xét nghiệm trong nước tiểu thấy tỷ lệ tetrahydrocortisol/ tetrahydrocortisone giảm[2] Cơ chế có thể do thời gian bán hủy của cortisol kéo dài có khả năng gắn khôngchọn lọc với receptor của hormon chuyển hóa muối nước tại thận

Thiếu hụt 11 β-hydroxylasehydroxysteroid dehydrogenase type I xúc tác phản ứng khử

cortisone thành cortisol và ngược lại gây giảm tổng hợp cortisone (apparentcortisone reductase deficiency-AERD) [3] Cortisol giảm gây feed-back làm tăngtổng hợp ACTH, dẫn đến thừa endrogen và biểu hiện ra các triệu chứng lâm sàngcủa thừa endrogen ở nữ gây rối loạn phát triển giới tính Nếu không được điều trịphù hợp, kịp thời hiện tượng nam hóa trẻ nữ gây rối loạn hành vi, phong cách Biếnđổi nặng nề cơ quan sinh dục ngoài theo hướng nam hóa gây lưỡng giới [4] Mặc dùvậy, không có bất kỳ biểu hiện lâm sàng nào của tình trạng thừa cortisol trong máu(tăng đường máu, hội chứng Cushing…) Xét nghiệm thấy các thông số đều bìnhthường, nồng độ cortisol và ACTH bình thường trong khi nồng độ androgen củatuyến thượng thận như DHEA, androstenedione trong máu tăng cao ở thiếu niên vàngười trưởng thành 17-ketosteroid niệu và sản phẩm chuyển hóa của cortisol,cortisone trong nước tiểu tăng cao ở người trưởng thành [2],[3]

Nhóm 3: Thiếu hụt các enzym xúc tác phản ứng cuối trong sinh tổng hợp

hormon sinh dục, bao gồm các bệnh lý sau:

Thiếu hụt enzym 17α-hydroxylase,20-hydroxylaselyase dẫn đến lưỡng giới giả ở trẻ trai với sự thay đổi

ở cơ quan sinh dục không điển hình của nam giới mặc dù nhiễm sắc thể là XY nhưtinh hoàn không xuống bìu Thiếu hụt 17,20-lyase hoặc 17,20-desmolase trẻ nam và

nữ sẽ không phát triển dậy thì, nồng độ cortisol trong máu bình thường, không cótriệu chứng tăng huyết áp Xét nghiệm khi mới sinh thấy nồng độ 17-OHP tăng cao,trong khi nồng độ DHEA, androssteinedione testosterone trong máu giảm ở mọi lứatuổi kể cả người trưởng thành Ở trẻ nữ mang nhiễm sắc thể XX, các biểu hiện ở cơquan sinh dục ngoài là bình thường khi mới sinh, nếu bổ sung estrogen kịp thời cóthể có sự phát triển giới tính [48].

Thiếu hụt 17α-hydroxylaseβ-hydroxylasehydroxysteroid dehydrogenase (17β-hydroxylaseHSD), trẻ nam có sự phát

triển, dậy thì do tác dụng của androstenedion, ở trẻ nữ các triệu chứng thường mứctrung bình, không phát triển các đặc điểm sinh dục thứ phát do thiếu estrogen [3]

Thiếu hụt 5α-reductaseα-hydroxylasereductase xúc tác phản ứng chuyển testosterone thành

dihydrotestosterone (DTH) Đây là bệnh lý đã được biết đến gây ra rối loạn pháttriển giới tính ở nam giới [49] Mặc dù có bộ nhiễm sắc thể 46 XY nhưng ngườibệnh không có sự phát triển cơ quan sinh dục ngoài của nam khi sinh ra do nồng độdihydrotestosterone thấp DTH có tác dụng mạnh hơn gấp 10 lần so với testosteronetrên receptor của androgen làm phát triển cơ quan sinh dục (túi tinh, ống dẫn tinh,tinh hoàn) Bệnh nhân có thể biểu hiện phenotyp nữ gần như hoàn toàn hoặc cơquan sinh dục ngoài không rõ ràng, lỗ đái thấp, dương vật nhỏ, bìu chia làm hai…

[22],[27] Ở trẻ nữ, thiếu hụt 5α-reductaseα-hydroxylasereductase không biểu hiện triệu chứng lâm sàng Tần xuất thiếu hụt 5α-reductaseα-hydroxylasereductase đặc biệt cao ở nước cộng hòa Dominican [49] Xét

nghiệm thấy nồng độ testosteron bình thường và nồng độ DTH thấp

Thiếu hụt aromatase ở cả nam và nữ sẽ dẫn đến chậm phát triển thể chất và

chậm dậy thì, biểu hiện bằng chiều cao hạn chế khi trưởng thành Nữ bị thiếu hụtaromatase có biểu hiện các mức độ khác nhau về đặc tính sinh dục thứ phát dothiếu estrogen và thừa androgen như mọc mụn trứng cá Ở nam, các triệu chứngkhông rõ ràng, chiều cao và cân nặng phát triển hơn bình thường Xét nghiệm thấynồng độ estrogen trong máu giảm ở mọi lứa tuổi, LH và FSH tăng cao ở ngườitrưởng thành [1],[3]

Thiếu hụt Cytochrome P45α-reductase0 oxidoreductase: là bệnh di truyền trên nhiễm

sắc thể thường (gen POR7q11) do đột biến gen mã hóa flavoprotein làm nhiệm vụ

chuyển electron đến các vi thể chứa enzym P450 tham gia tổng hợp cholesterol vàhormon steroid như gây giảm hoạt tính enzym như P450c21, P450c17, P450arro[4] Bệnh biểu hiện của giảm nồng độ glucocorticoid kèm tăng nồng độ 17-OHP ở

cả nam và nữ Bên cạnh đó là các dấu hiệu rối loạn phát triển giới tính như namhóa trẻ nữ và kém phát triển các đặc tính sinh dục ở nam khi dậy thì [50]

Nhóm 4: Bất thường tại receptor của hormon steroid

Ngoài ba nhóm bệnh kể trên, còn một nhóm bệnh liên quan đến bất thườngcủa receptor steroid ở cơ quan đích, hoạt tính của hormon steroid không đượcphát huy sẽ biểu hiện như tình trạng thiếu hụt nồng độ hormon Bao gồm cácbệnh lý sau:

Hội chứng kém nhạy với androgen: Receptor của androgen được gen quy định

trên nhiễm sắc thể giới tính X Sự bất thường của receptor dẫn tới sự kém tác dụngcủa androgen lên cơ thể gây ra hội chứng kém nhạy với androgen một phần hayhoàn toàn Biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân nam mang nhiễm sắc thể XY là hìnhthức bên ngoài là phụ nữ tương đối bình thường có tuyến vú phát triển, không mọclông, cơ quan sinh dục ngoài là nữ, không có tử cung và tinh hoàn không hạ xuốngbìu mà nằm trong ổ bụng Xét nghiệm tăng androgen trong máu ở trẻ vị thành niên

và người trưởng thành, hormon LH và FSH tăng trong máu [3]

Tình trạng kháng estrogen mới chỉ được mô tả một lần trong y văn bởi Smith

EP và Boyd J năm 1994 Đó là một người đàn ông 28 tuổi, được mô tả là khángestrogen do nguyên nhân đột biến trên gen của receptor estrogen Xét nghiệm thấyandrogen bình thường, estrogen, LH, FSH tăng cao [51]

Tình trạng kháng progesterone do receptor với progesterone tại tử cung không

có đáp ứng với progesterone gây nên hội chứng kháng progesterone một phần.Nồng độ progesterone trong máu bình thường hoặc tăng nhẹ, bệnh không biểu hiện

ở nam giới Xét nghiệm androgen, estrogen, LH, FSH bình thường [3]

Kháng Glucocorticoid đặc trưng bởi tình trạng tăng cortisol trong máu mà

không có biểu hiện của hội chứng Cushing Một số bệnh nhân xuất hiện tăng huyết

áp, hạ kali máu do tác dụng của cortisol lên receptor của hormon chuyển hóa muối

nước [1],[3],[39].

Tình trạng giả thiếu hụt aldosterone (pseudohypoaldosteronism): xét

nghiệm thấy tăng nồng độ aldosterone và renin máu trong khi lâm sàng và xétnghiệm thấy nồng độ natri máu giảm giống như giảm nồng độ aldosterone Cơchế bệnh sinh do bệnh lý của receptor với hormon steroid tham gia chuyển hóamuối nước tại tuyến nước bọt, đại tràng, thận nên tại các cơ quan này không cóđáp ứng với hormon chuyển hóa muối nước Bệnh đặc trưng bởi thiếu hụt và đápứng với bổ sung thêm natri cho trẻ ngay sau khi sinh giống như tình trạng thiếuhụt aldosterone [3],[39]

Thông thường, các bước quá trình tổng hợp hormon steroid chính của vỏthượng thận với sự tham gia của các enzym kể trên và sản phẩm chuyển hóa chínhtrong nước tiểu của các hormon được mô tả trong hình sau:

Hình 1.2: Sơ đồ sinh tổng hợp và chuyển hóa hormon tuyến vỏ thượng thận [17].

1.3 Các rối loạn khác của tuyến vỏ thượng thận

Ngoài các rối loạn bẩm sinh tuyến thượng thận gây giảm tổng hợp một hoặcnhiều hormon steroid kể trên, các bệnh lý rối loạn sinh tổng hợp hormon tuyếnthượng thận ở người trưởng thành khác thường gặp là hội chứng Cusing, bệnhAddison, hội chứng Conn gây bệnh cảnh cường năng hoặc suy giảm chức năngtuyến vỏ thượng thận

Hội chứng Cushing là tình trạng tăng nồng độ cortisol mạn tính trong máu tác

động lên hầu hết các cơ quan trong cơ thể Hội chứng Cushing do nhiều nguyênnhân như u tuyến thượng thận adenoma hoặc carcinoma gây tăng tiết cortisol, khối

u lạc chỗ trong cơ thể tiết ACTH Đặc điểm của hội chứng Cushing là thường gặp ở

nữ hơn nam, độ tuổi từ 20 đến 40, bộ mặt tròn như mặt trăng, thể trạng không cânđối với mỡ tập trung ở phần thân, tăng huyết áp, giảm trí nhớ, rối loạn giấc ngủ [52] Xét nghiệm trong máu thấy nồng độ cortisol tăng rất cao, ACTH thấp trongmáu

Hội chứng giả Cushing do bệnh nhân sử dụng trong điều trị một thời gian dàithuốc chứa glucocorticoid như dexamethasone, prednisolon…Nồng độ thuốccorticoid cao liên tục trong máu gây ức chế tuyến yên sản xuất ACTH dẫn đến giảmtổng hợp cortisol Biểu hiện lâm sàng giống với hội chứng Cushing tuy nhiên xétnghiệm thấy nồng độ cortisol thấp trong máu đồng thời với ACTH thấp [1],[52] Bệnh Cushing do khối u tuyến yên tăng tiết ACTH khi đó làm tăng tiếtcortisol Triệu chứng giống với hội chứng Cushing, tuy nhiên xét nghiệm thấyACTH, cortisol tăng trong máu

Bệnh Addison: suy vỏ thượng thận mạn tính, được mô tả từ năm 1855 bởi

Addison Suy thượng thận là tình trạng giảm nồng độ các hormon glucocorticoid vàhoặc mineralocorticoid trong máu gây ra hạ natri, tăng kali máu Bệnh có thể tiênphát do sự phá hủy tuyến thượng thận hoặc thứ phát do giảm sản xuất ACTH [1],[53]

Hội chứng Conn còn gọi là cường aldosterone tiên phát, được mô tả lần đầu

năm 1955 bởi tác giả Conn Trong đó cường aldosteron type 1 do khối u lớp cầu vỏthượng thận ở một bên Cường aldosteron type 2 do quá sản thượng thận hai bên

liên quan đến đột biến gen tham gia tổng hợp P450-aldosteron, đặc trưng là tìnhtrạng rối loạn nước và điện giải như tăng natri máu, hạ kali gây tăng huyết áp, yếu

cơ, kiềm chuyển hóa [54],[55] Cường aldosteron tiên phát chiếm 5-13% nguyênnhân gây tăng huyết áp Bệnh có thể được chẩn đoán dựa vào định lượng nồng độ18-hydroxycortisol trong nước tiểu bằng các phương pháp khác nhau [55]

Ung thư vỏ thượng thận (adenocortical carcinoma hoặc adenocortical adenoma)

là bệnh lý ác tính hiếm gặp Khối u vùng vỏ thượng thận gây tăng tiết một hoặc nhiềuhormon steroid, các trường hợp được công bố trên tạp chí chỉ đơn lẻ một số trường hợptại nhiều quốc gia Năm 2009, Masakatsu và cộng sự công bố trên tạp chí Endocrinemột trường hợp khối u thượng thận tiết progesterone [23] Chẩn đoán ung thư tuyếnthượng thận dựa vào định lượng hormon steroid trong máu và sản phẩm chuyển hóatrong nước tiểu kết hợp với chẩn đoán hình ảnh để xác định vị trí khối u [24],[25]

1.4 Các kỹ thuật phân tích steroid

Bao gồm các kỹ thuật định lượng hormon steroid, tiền chất của hormon trong máu

và định lượng các sản phẩm chuyển hóa của hormon steroid trong nước tiểu

1.4.1 Kỹ thuật miễn dịch

Kỹ thuật miễn dịch được sử dụng trong phòng xét nghiệm lâm sàng để địnhlượng hormon từ những năm 1960 Định lượng hormon steroid trong huyết tươngnhư cortisol, aldosteron, 17-OHP, estradiol, estriol theo nguyên lý các hormonđóng vai trò kháng nguyên trong huyết tương phản ứng với kháng thể đặc hiệutrong thuốc thử tạo thành phức hợp miễn dịch kháng nguyên – kháng thể Phát hiệnnồng độ phức hợp kháng nguyên - kháng thể bằng các kỹ thuật khác nhau Tùythuộc vào từng hormon cần định lượng mà lựa chọn kỹ thuật, trang thiết bị xétnghiệm phù hợp đảm bảo giá trị xét nghiệm là đáng tin cậy

Kỹ thuật miễn dịch gắn emzym (Enzyme-linked immunosorbent ELISA): kỹ thuật này sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên cố định vào một tấmpolystyren Sau đó nó được dùng để bắt kháng nguyên hoặc kháng thể tương ứng ởmẫu thử và phức hợp KN-KT được phát hiện nhờ enzyme gắn với kháng thể hoặckháng nguyên tác động lên cơ chất đặc hiệu làm xuất hiện màu Đậm độ màu được

assay-đo bằng quang phổ kế tỷ lệ với nồng độ của kháng thể hoặc kháng nguyên ở trong

mẫu thử Kháng nguyên hoặc kháng thể liên hợp với enzyme vẫn giữ hoạt tính miễndịch Enzyme được sử dụng có thể là photphatase kiềm hoặc peroxydase Kỹ thuậtELISA cho kết quả khách quan và rất nhạy được sử dụng để định lượng nồng độ17-OHP trong sàng lọc TSTTBS ỏ trẻ sơ sinh trong đó có Nhật Bản [7].

Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang (Electrochemiluminescenceimmunoassay-ECLIA): kháng nguyên trong mẫu thử và kháng nguyên tổng hợpđánh dấu trong thuốc thử sẽ cạnh tranh nhau để kết hợp với kháng kháng thể đặchiệu gắn phức hợp biotin tạo thành phức hợp KN-KT đánh dấu (kiểu cạnh tranh)hoặc KN-KT-KN tổng hợp (kiểu sandwich) được liên kết với pha rắn qua liên kếtbiotin– vi hạt phủ streptavidin, phần không kết hợp bị rửa trôi trước khi được đưavào buồng đo, sử dụng dòng điện phóng ra từ điện cực gây hóa phát quangstreptavidin Dòng điện phát ra được thu lại bằng bộ tín hiệu, dựa vào đường chuẩn

để tính nồng độ kháng nguyên cần đo trong mẫu thử

Kỹ thuật miễn dịch vi hạt hóa phát quang (chemiluminescence microparticleimmunoassay-CMIA): hormon cần định lượng đóng vai trò kháng nguyên phản ứngvới kháng thể đặc hiệu đơn dòng gắn trên vi hạt micropartical tạo thành phức hợpKN-KT Phần dư thừa bị rửa trôi, sau đó cho thêm kháng kháng thể đánh dấuacredium, phức hợp miễn dịch được chuyển đến buồng đo, tín hiệu đo được tỷ lệvới nồng độ kháng nguyên trong mẫu thử Hai kỹ thuật ECLIA và CMIA thường sửdụng tại phòng xét nghiệm đo nồng độ hormon trong máu để thăm dò nhiều bệnh lýnội tiết

Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay-RIA):Dùng đồng vị phóng

xạ như Thymidin H 3, Cacbon 14, I 125 đánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể

để theo dõi phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể Phức hợp KN-KT đánh dấuphóng xạ được phát hiện và đo lường bằng máy tự động Phương pháp miễn dịchphóng xạ có độ nhạy rất cao được sử dụng để định lượng 17-OHP trong sàng lọcthiếu hụt 21-hydroxylase thể kinh điển ở trẻ sơ sinh tại nhiều quốc gia trên thế giớitrong đó có Hoa Kỳ [7]

Ưu điểm của kỹ thuật miễn dịch là tự động hóa, thời gian phân tích nhanh

khoảng 25-30 phút, dễ dàng triển khai áp dụng thường quy tại các phòng xétnghiệm hóa sinh trên toàn thế giới Kỹ thuật giúp ích rất nhiều trong sàng lọc, chẩnđoán bệnh lý rối loạn nội tiết và chuyển hóa ở trẻ em và người trưởng thành

Nhược điểm của kỹ thuật miễn dịch là không khắc phục được hoàn toàn phản

ứng chéo, bị nhiễu do nhiều nguyên nhân khác nhau [5] Nồng độ hormon thấp ở trẻ

sơ sinh và phụ nữ mãn kinh thường làm kết quả kém chính xác [19] Độ đặc hiệucủa kỹ thuật chưa thật sự cao nên một số trường hợp không thể chẩn đoán Có sựgiao động lớn về nồng độ hormon giữa các lần xét nghiệm nên khó nhận định kếtquả Nồng độ hormon rất cao có thể gây ra sai lệch kết quả do nồng độ KN, KTkhông tương ứng (high dose Hook effect)

Kỹ thuật miễn dịch chỉ thăm dò được một số hormon tại một thời điểm nhấtđịnh khi lấy máu, không thăm dò được tất cả các hormon Kỹ thuật miễn dịch cầnlấy một vài ml máu nên với trẻ sơ sinh không được thuận tiện [20]

1.4.2 Kỹ thuật sắc ký

1.4.2.1 Nguyên tắc chung của kỹ thuật sắc ký

Sắc ký là một phương pháp tách và phân tích các chất trong một hỗn hợp dựavào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và pha tĩnh

- Pha tĩnh (stationary phase): còn gọi là pha cố định, là phần chất liệu hay dung dịchđược giữ cố định trong quá trình sắc ký Pha tĩnh có tác dụng giữ các chất cần xácđịnh trong pha động lại

- Pha di động (mobile phase): là phần khí hay dung dịch đi qua pha tĩnh, pha diđộng có tác dụng kéo các chất đi

Hai pha này luôn tiếp xúc với nhau nhưng không trộn lẫn vào nhau Các chất

có ái lực càng cao với pha tĩnh sẽ di chuyển càng chậm trong quá trình sắc ký vàngược lại

1.4.2.2 Sắc ký khí

Pha động là một chất khí, tùy theo pha tĩnh người ta phân loại:

 Sắc ký khí - rắn: Pha tĩnh là một chất rắn và cơ chế phân tách các chất dựatrên nguyên lý của sắc ký hấp phụ

 Sắc kí khí - lỏng: Pha tĩnh là một chất lỏng và cơ chế phân tách các chất dựatrên nguyên lý sắc ký phân bố.

Sắc ký khí thường dùng trong phân tách phát hiện các chất và sử dụng cột sắc

ký chuyên dụng Phương pháp này có ưu điểm là thời gian sắc ký ngắn, lượng mẫu

ít, độ chính xác cao

1.4.2.3 Phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ-hydroxylaseGC/MS

GC/MS là phương pháp phân tích kết hợp giữa sắc ký khí và khối phổ để xácđịnh các thành phần hoạt chất khác nhau trong mẫu thử GC/MS được coi là tiêuchuẩn vàng để xác định các hoạt chất bởi vì đó là xét nghiệm đặc hiệu GC/MSđược ứng dụng trong phát hiện thuốc, các sản phẩm chuyển hóa trong nước tiểu, cácchất có trong mẫu thử chưa biết GCMS là một phương pháp có độ nhậy cao được

sử dụng để định tính và định lượng các chất ở thể khí (hay được hóa hơi) Ngưỡngphát hiện của phương pháp là picogram Phần sắc ký khí (GC) có nhiệm vụ phântách hỗn hợp thành từng chất tinh khiết Phần khối phổ (MS) có nhiệm vụ xác địnhđịnh tính và định lượng các chất Nguyên tắc định lượng của kỹ thuật khối phổ dựavào SCAN và/hoặc SIM (seleted ion monitoring) Kỹ thuật GC/MS được ứng dụngrất nhiều trong lĩnh vực an toàn thực phẩm, y học từ nhiều năm nay [5],[17],[20]

Cấu tạo của hệ thống GC/MS:

 Cửa tiêm mẫu: dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm vào hệ thốngtại cửa này Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ (thường là Helium).Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên cao để mẫu trở thành dạng khí

 Vỏ ngoài: Vỏ ngoài của hệ thồng GC chính là một lò nung đặc biệt Nhiệt độcủa lò này dao động từ 40oC cho đến 320oC

 Cột: Bên trong hệ thống GC chính là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài30m với mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt Các chất tronghỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này

Sau khi đi qua cột sắc kí khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ Ở đâychúng bị ion hóa bằng các ion đặc hiệu cho từng sản phẩm Sau khi khối phổ, chúng

sẽ tới bộ phận lọc Dựa trên khối lượng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khốilượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm

số lượng các hạt có cùng khối lượng Thông tin này sau đó được chuyển đến máy tính

để tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp và đưa ra kết quả khối phổ

Kỹ thuật khối phổ để phát hiện các sản phẩm sau khi sắc kí khí phân tách Kỹthuật khối phổ được James và Martin phát minh từ những năm 1950 [23] Đến nay,

MS được cải tiến liên tục và ứng dụng công nghệ kỹ thuật số, máy tính giúp rútngắn thời gian phân tích và phân tích được nhiều thành phần trong mẫu với độ đặchiệu cao Kết quả MS là một biểu đồ phản ánh số lượng các ion với các khối lượngkhác nhau đã đi qua bộ lọc

Kỹ thuật GC/MS được xem như công cụ hữu ích để chẩn đoán xác định tăngsản tuyến thượng thận bẩm sinh từ 35 năm qua [5] Kỹ thuật này có thể phát hiệncác sản phẩm chuyển hóa của hormon steroid, không phụ thuộc vào nồng độ, khôngphản ứng chéo với các chất gây nhiễu ở trẻ sơ sinh hoặc từ mẹ truyền sang qua nhauthai Bệnh phẩm phân tích có thể là huyết thanh, huyết tương, dịch cơ thể, nước tiểungẫu nhiên, nước tiểu 24 giờ tùy thuộc đối tượng và cách thức tiến hành nghiên cứu[4],[19] Trẻ sơ sinh thường sử dụng mẫu nước tiểu ngẫu nhiên để phân tích vì sựphù hợp và không gây tổn thương xâm phạm như lấy mẫu máu Kết quả phân tíchGC/MS là toàn bộ các sản phẩm chuyển hóa của steroid, tỷ lệ tiền chất/ sản phẩmđồng thời được đo lường làm tăng tính chính xác và độ tin cậy trong chẩn đoán.Phương pháp GC/MS ưu việt hơn định lượng 17-OHP vì có thể chẩn đoán nhiềudạng thiếu hụt enzyme khác nhau tham gia chuyển hóa steroid như 21-hydroxylase,17α-hydroxylase, và 11β-hydroxylase, 3β-HSD, 5α-reductase …và các thể bệnh nhẹkhông tăng 17-OHP [5],[23] Tuy nhiên kết quả phân tích steroid niệu trên GC/MS

có sự khác biệt ở trẻ sơ sinh đủ tháng và trẻ sơ sinh thiếu tháng với cân nặng thấpkhi sinh [14],[56],[57],[58] Nồng độ các sản phẩm chuyển hóa hormon steroidgiảm dần trong nước tiểu theo sự tăng dần ngày tuổi của trẻ [5],[17] Theo S AWudy và cộng sự, tốt nhất là phân tích steroid niệu để sàng lọc và chẩn đoánTSTTBS ở trẻ từ ngày thứ 2 để phân biệt tốt trẻ bị bệnh và trẻ khỏe mạnh [7],[20]

1.4.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ-hydroxylaseLC/MS/MS

Kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (liquid chromatography - tandem mas spectrometry)

có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn các kỹ thuật miễn dịch, thời gian phân tích ngắn

hơn GC/MS vì không phải thủy phân steroid liên hợp và dẫn xuất hóa Kỹ thuật này

dễ dàng tự động được nhiều phòng xét nghiệm chấp nhận sử dụng trên thế giới, cókhả năng phân tích nhiều mẫu bệnh phẩm, có thể lên đến 500 mẫu/ ngày [4]

Kỹ thuật kết hợp giữa sắc ký lỏng để phân tách các thành phần và kỹ thuật phântích hỗn hợp sau khi ion hóa sản phẩm sắc ký Lần đầu tiên, kỹ thuật MS/MS được

sử dụng để đo lường acylcarnitine Sau đó, kỹ thuật MS/MS được ứng dụng rộng rãitrong chẩn đoán bệnh lý liên quan đến bất thường về nồng độ nhiều chất và sảnphẩm chuyển hóa khác nhau trong huyết thanh như: carnitine toàn phần và tự do,phenylalanine và tyrosine, methionine, homocystein, sulfocysteine, pyrimidines,acyglycines, acid mật, steroids, plamalogens [4] MS/MS hiện nay được ứng dụngtrong sàng lọc hơn 20 bệnh rối loạn chuyển hóa di truyền ở trẻ sơ sinh, bắt đầu từnhững năm 1980 tại nhiều phòng xét nghiệm trên thế giới [58]

LC/MS/MS sử dụng mẫu máu để phân tích, vì vậy đối với trẻ em là việc gâychấn thương cho bệnh nhi và bố mẹ Hơn nữa, mẫu máu chỉ phản ánh các thay đổitại một thời điểm chứ không cho ta bức tranh toàn cảnh về chuyển hóa steroid nhưtrong phân tích steroid niệu bằng GC/MS Như vậy, mặc dù sự tiến bộ vượt bậc về

sử dụng LC/MS/MS trong phân tích hormon và tiền chất của nó, GC/MS vẫn tiếptục đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu các bệnh hiếm và không xác định, làcông cụ khám phá vượt trội và rất tốt trong nhi khoa nơi cần hạn chế lấy máu Nhưvậy, GC/MS và LC/MS/MS sẽ là những công cụ bổ trợ cho nhau chứ không phải làcạnh tranh với nhau [4],[18],[58]

1.4.3 Kỹ thuật phân tích gen

Việc phân tích gen và đột biến có thể cho biết nguyên nhân và cơ chế sinh lýbệnh của rối loạn sinh tổng hợp và chuyển hóa hormon steroid Các gen chi phốitổng hợp enzym tham gia chuyển hóa hormon steroid được biết khá rõ [1],[3] đượcthể hiện trong hình 1.2 tại các vị trí phản ứng do enzym chi phối bởi gen đó xúc tác.Nhiều dạng đột biến được công bố gây giảm tổng hợp enzym và trong thời gian tới,ứng dụng công nghệ gen trong điều trị TSTTBS ở trẻ em [4]

Tuy nhiên, do các dạng đột biến gen rất đa dạng, nên kỹ thuật phân tích genvẫn đang được tiếp tục nghiên cứu Hiện nay, ước tính có khoảng 60 đột biến khácnhau trên gen quy định tổng hợp enzym 21-hydroxylase gây nên thiếu hụt hoạt độenzym này cả hai thể kinh điển và không kinh điển [45],[46] Nghiên cứu của Angel

On Kei Chan cho thấy, chẩn đoán thiếu hụt 5α-reductase có thể sử dụngdihydrotestosterone (DTH) nhưng có thể không phát hiện được đầy đủ các trườnghợp mắc, cần kết hợp với phân tích gen [22] Kỹ thuật GC/MS phân tích steroidniệu có thể chẩn đoán thiếu hụt 5α-reductase ở trẻ sau khi sinh 3 tháng Phân tích

đột biến trên gen SRD5α-reductaseA2 [Steroid-5-alpha-reductase, alpha polypeptid 2

(3-oxo-5-alpha-steroid delta 4-dehydrogenase alpha 2)] bằng kỹ thuật PCR (polymerase chainreaction) và giải trình tự gen có thể được kết hợp với GC/MS để khẳng định chẩnđoán thiếu hụt 5α-reductase ở trẻ mang nhiễm sắc thể 46XY có rối loạn phát triểngiới tính [27] Hiện tại điều kiện ở Việt Nam chưa thích hợp để ứng dụng kỹ thuậtphân tích gen trong chẩn đoán các bệnh rối loạn chuyển hóa và sinh tổng hợphormon steroid

1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật GC/MS trên thế giới và ở Việt Nam.

Kỹ thuật sắc ký khí – khối phổ được James và Martin phát minh năm 1952, từ

đó đến nay có rất nhiều sự thay đổi, ứng dụng công nghệ thông tin với máy tính sốhóa giúp kỹ thuật được thực hiện dễ dàng hơn, thời gian phân tích ngắn hơn vì vậycông suất máy được nâng lên đáng kể

Ứng dụng GC/MS được nhiều nhà khoa học sử dụng trong chẩn đoán các rốiloạn nội tiết, đặc biệt ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ do mẫu bệnh phẩm là nước tiểu phùhợp với trẻ Sử dụng GC/MS thăm dò steroid niệu để chẩn đoán xác định các rốiloạn sinh tổng hợp hormon steroid ở trẻ sơ sinh được tác giả J.W Honour và cộng

sự công bố lần đầu trên tạp chí Ann Clin Biochem từ năm 1997 với nhiều ưu điểmnổi trội so với kỹ thuật miễn dịch định lượng nồng độ hormon trong máu [6] Sửdụng GC/MS trong chẩn đoán TSTTBS ở trẻ sơ sinh không chỉ phát hiện thiếu hụt21-hydroxylase mà còn phát hiện nhiều thiếu hụt enzym ít gặp khác [14],[16] Có

thể sử dụng GC/MS đơn độc hoặc kết hợp với phân tích đột biến gen để phát hiệnthiếu hụt 5α-reductase [27] S A Wudy đã kết hợp đo nồng độ 17-OHP trong máu

và các sản phẩm chuyển hóa trong nước tiểu bằng kỹ thuật GC/MS để chẩn đoánxác định thiếu hụt 21-hydroxylase ở 11 trẻ sơ sinh vào năm 2000 [3] Nghiên cứunày cho thấy 17-OHP giảm dần sau khi trẻ sinh ra, có thể phân biệt nồng độ 17-OHP của trẻ bình thường và bệnh lý TSTTBS vào ngày thứ 2 đến 4 sau khi sinh[20] Sàng lọc thiếu hụt 21-hydroxylase bằng 17-OHP cần thực hiện từ những ngàyđầu đời của trẻ nhưng cũng chưa đảm bảo phát hiện được toàn bộ bệnh nhân thiếuhụt 21-hydroxylase vì thể không kinh điển (nonclasical) có nồng độ 17-OHP tăngnhẹ hoặc không tăng [4],[5] Kỹ thuật GC/MS có thể sử dụng để định lượng 18-hydroxycortisol trong nước tiểu để chẩn đoán phân biệt các nguyên nhân gây tăngaldosterone tiên phát và được so sánh với kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (RIA),

kỹ thuật time resolved fluorometric assay (DELFIA) [55]

Năm 2003, Keiko Homma và cộng sự đã công bố nghiên cứu thiết lập giá trịtham chiếu cho xét nghiệm steroid niệu của trẻ em Nhật Bản mới sinh từ 1 đến 56ngày tuổi, đồng thời so sánh giá trị steroid niệu của 23 phụ nữ khỏe mạnh trưởngthành với trẻ sơ sinh bằng kỹ thuật GC/MS [32] Năm 2004, Keiko Homma và cộng

sự công bố nghiên cứu phân tích steroid niệu bằng GC/MS cho thấy sử dụngpregnanetriolone nhạy hơn pregnantriol trong chẩn đoán trẻ sơ sinh thiếu hụt enzym21-hydroxylase được sàng lọc bằng 17-OHP tăng trong máu [14] Năm 2006, KeikoHomma sử dụng GC/MS để phân tích steroid niệu để chẩn đoán thiếu hụtCytochrom P450 oxidoreductase [50]

SC Tiu và cộng sự năm 2009 đã sử dụng kỹ thuật GC/MS phân tích steroidniệu để chẩn đoán và theo dõi bệnh nhân u tuyến thượng thận dạng adenocorticalcarcinoma và adenocortical adenoma [24] Nghiên cứu chỉ ra rằng, có thể phân biệtcarcinoma và adenoma tuyến vỏ thượng thận nhờ phân tích steroid niệu bằngGC/MS Phân tích steroid niệu bằng kỹ thuật GC/MS giúp phát hiện các phân đoạncủa 17-ketosteroid trong nước tiểu bệnh nhân bị hội chứng Cushing Đó là chỉ dấu

sinh học mới để chẩn đoán adenoma tuyến yên và tuyến thượng thận mà không thấy

ở người khỏe mạnh [25] Các sản phẩm chuyển hóa steroid xem phụ lục 4

Kỹ thuật GC/MS phân tích steroid liên hợp trong nước tiểu cũng được sử dụng đểtheo dõi tác dụng của thuốc steroid điều trị theo đường uống và phát hiện các dạngđồng phân của steroid có thể bị dùng như chất gây nghiện trong thể thao [59],[60] Tại Việt Nam, chúng tôi chưa thấy nghiên cứu của tác giả nào công bố trên tạpchí về sử dụng GCMS trong sàng lọc, chẩn đoán các bệnh lý rối loạn sinh tổng hợphormon steroid Tại Việt Nam, chẩn đoán TSTTBS chủ yếu dựa trên xét nghiệm 17-OHP, tuy nhiên chưa được tiến hành rộng rãi cho toàn bộ trẻ mới sinh mà chỉ thựchiện khi có triệu chứng nghi ngờ mắc hội chứng sinh dục – thượng thận Chưa cónghiên cứu nào công bố về tần suất mắc TSTTBS ở trẻ em Việt Nam, vì vậy việcphát hiện sớm và điều trị sớm cho bệnh nhân chưa đạt hiệu quả cao Cần thiết phảiứng dụng phương pháp GC/MS vào phòng xét nghiệm tại Việt Nam để chẩn đoánbệnh lý rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid bẩm sinh ở trẻ em Tuy nhiên GC/MS

là kỹ thuật hoàn toàn mới với phòng xét nghiệm nên trước khi đưa vào sử dụngthường quy cần đánh giá phương pháp GC/MS định lượng các steroid niệu và xâydựng giá trị tham chiếu cho trẻ em Việt Nam

1.6 Thẩm định phương pháp

Thẩm định phương pháp xét nghiệm là việc thực hiện xét nghiệm theo hướngdẫn để cung cấp các bằng chứng khách quan chứng minh phương pháp đạt các yêucầu quy định để thực hiện xét nghiệm cho người bệnh và kết quả xét nghiệm là đángtin cậy, có thể áp dụng trong chẩn đoán y khoa Thẩm định phương pháp còn đượcgọi với nhiều tên khác nhau như đánh giá phương pháp, xác nhận phương pháp, xácnhận giá trị… mà tiếng Anh thường dùng là Method validation

Thẩm định phương pháp được James O Westgard và cộng sự giới thiệu từ năm

1978 [61] trên tạp chí Kỹ thuật y học Hoa Kỳ (American Journal of MedicalTechnology) với tên gọi đánh giá phương pháp (Method Evaluation) Thẩm địnhphương pháp rất cần thiết đối với các kỹ thuật, trang thiết bị xét nghiệm mới đưavào sử dụng tại phòng xét nghiệm và các thiết bị xét nghiệm sau khi bảo dưỡng,