NGHIÊN cứu đặc điểm tế bào DI TRUYềN và đột BIếN GEN của BệNH NHÂN lơ xê MI KINH DòNG BạCH cầu hạt tại VIệN HUYếT học TRUYềN máu TRUNG ƯƠNG

Các nghiên cứu khác về đặc điểm tế bào di truyền và đột biến gen của bệnh nhân LXMKDBCH trong nước...15 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...16 2.1... Ý nghĩa của NST Ph tron

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

TRẦN THỊ THU TRANG

NGHI£N CøU §ÆC §IÓM TÕ BµO DI TRUYÒN Vµ §éT BIÕN GEN CñA BÖNH NH¢N L¥ X£ MI KINH DßNG B¹CH CÇU H¹T T¹I VIÖN HUYÕT HäC TRUYÒN M¸U TRUNG ¦¥NG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2012 – 2016

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS Nguyễn Hà Thanh

HÀ NỘI – 2016

Trước hết, tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ môn Huyết học –Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Huyết Học –Truyền máu Trung Ương.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn

Hà Thanh, Phó Chủ Nhiệm Bộ môn Huyết học – Truyền máu,

Trưởng khoa Điều trị hóa chất, Viện Huyết học – Truyền máuTrung Ương, người Thầy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôithực hiện nghiên cứu và Thầy cũng là người cho tôi những ýkiến quý báu để tôi sửa chữa và hoàn thành khóa luận

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Phạm Quang

Vinh, Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học – Truyền máu, người

Thầy tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện

đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS.AHLĐ Nguyễn

Anh Trí, Viện trưởng Viện Huyết học – Truyền máu Trung

Ương, Thầy đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trìnhthực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Kế HoạchTổng Hợp, các cán bộ Khoa Khám Bệnh, Viện Huyết học –Truyền máu Trung Ương đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡtôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng

hộ, động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóaluận

Mặc dù đã cố gắng để thực hiện đề tài một các hoànchỉnh nhất Song do đây là lần đầu làm quen với việc nghiên

mà bản thân chưa thấy được Do vậy, tôi rất mong nhận được

sự góp ý từ Thầy Cô và bạn bè để khóa luận được hoàn chỉnhhơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 06 năm 2016

SV Trần Thị Thu Trang

Tên tôi là Trần Thị Thu Trang, sinh viên tổ 36, lớp Y4K,Trường Đại học y Hà Nội, tôi xin cam đoan:

1 Đây là khóa luận do bản thân tôi trực tiếp thực hiệndưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Hà Thanh

2 Các số liệu trong nghiên cứu được thu thập một cáchchính xác và khoa học từ Viện Huyết Học Truyền Máu TrungƯơng và không trùng lặp với với bất kỳ nghiên cứu nào đãđược thực hiện tại Việt Nam Các bài trích dẫn đều là nhữngtài liệu đã được công nhận

Hà Nội, tháng 06 năm

2016Người viết cam đoan

SV Trần Thị Thu Trang

ABL : Abelson

ADN : Acid Desoxyribonucleic

ARN: Acid Ribonucleic

ATP: Adenosine triphosphate

BCR : Breakpoint cluster region

CCyR : Complete cytogenetic ResponseCML : Chronic Myeloid Leukemia

CMR : Complete Moleculor Response

FISH : Flourescense In Situ Hybridization

IS : International Scale

LXMKDBCH : Lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt

m – BCR : minor breakpoint cluster region

M – BCR : Major breakpoint cluster region

NCCN : National Comprehensive Cancer Network

NST : Nhiễm sắc thể

P210 : Protein 210

PCR : Polymerase Chain Reaction

PCyR : Partial Cytogenetic Response

PDGF : Plathelet – Dereved Growth Factor

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái niệm 3

1.2 Vài nét về lịch sử bệnh LXMKDBCH 3

1.3 Dịch tễ học bệnh 4

1.4 Bệnh nguyên 4

1.5 Cơ chế bệnh sinh 4

1.5.1 NST Philadelphia 4

1.5.2 Gen hỗn hợp BCR-ABL 5

1.5.3 Sản phẩm mã hóa của gen hỗn hợp BCR-ABL 8

1.6 Biểu hiện lâm sàng 8

1.7 Biểu hiện cận lâm sàng 9

1.8 Các xét nghiệm tế bào di truyền và sinh học phân tử sử dụng trong chẩn đoán, theo dõi bệnh LXMKDBCH 10

1.8.1 Di truyền tế bào 10

1.8.2 Di truyền phân tử 11

1.8.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử 11

1.8.4 Đánh giá mức độ lui bệnh 12

1.9 Phương pháp điều trị 13

1.9.1 Giai đoạn mạn tính và tăng tốc 13

1.9.2 Giai đoạn chuyển cấp 14

1.10 Các nghiên cứu khác về đặc điểm tế bào di truyền và đột biến gen của bệnh nhân LXMKDBCH trong nước 15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 16

2.2.2 Quy trình nghiên cứu 17

2.2.3 Nội dung, biến số nghiên cứu 17

2.2.4 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 17

2.2.5 Xử lý số liệu 19

2.3 Đạo đức nghiên cứu 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 20

3.1 Đặc điểm của bệnh nhân nghiên cứu 20

3.1.1 Đặc điểm phân bố theo tuổi của bệnh nhân 20

3.1.2 Đặc điểm phân bố theo giới của bệnh nhân: 21

3.2 Đặc điểm công thức NST 21

3.2.1 Kết quả xét nghiệm công thức NST 21

3.3 Kết quả xét nghiệm sinh học phân tử 26

3.3.1 kết quả xét nghiệm RT-PCR xác định gen hỗn hợp BCR-ABL 26

3.3.2 Kết quả mức độ đáp ứng sau điều trị nhắm đích ở mức độ sinh học phân tử 27

3.3.3 So sánh kết quả xét nghiệm NST Ph và xét nghiệm RT-PCR xác định gen BCR-ABL 28

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 29

4.1 Đặc điểm của bệnh nhân nghiên cứu 29

4.1.1 Đặc điểm về tuổi của bệnh nhân 29

4.1.2 Đặc điểm về giới tính 29

4.2 Đặc điểm tế bào di truyền 29

4.2.1 Xét nghiệm công thức NST 29

4.3 Đặc điểm đột biến gen hốn hợp BCR-ABL 30

KẾT LUẬN 30

PHỤ LỤC

Bảng 3.1 Kết quả xét nghiệm công thức NST 22Bảng 3.2 tỷ lệ bệnh nhân có NST Ph 22Bảng 3.3: Các bất thường số lượng NST 23Bảng 3.4: các bất thường cấu trúc NST khác ngoài NST Ph 23Bảng 3.5 kết quả xét nghiệm định tính gen BCR-ABL 26Bảng 3.6 kết quả xác định kiểu gen BCR-ABL 26Bảng 3.7 kết quả đáp ứng điều trị nhắm đích ở mức độ sinh

học phân tử 27Bảng 3.8 Đánh giá lui bệnh ở mức độ sinh học phân tử 27Bảng 3.9 So sánh kết quả xét nghiệm NST Ph và xét nghiệm

gen BCR-ABL 28

Biểu đồ 3.1 Phân bố bệnh nhân theo tuổi 20 Biểu đồ 3.2 Phân bố bệnh nhân theo giới tính 21

Hình 3.1 Kết quả xét nghiệm công thức NST dương tính với

NST Ph của bệnh nhân Nguyễn Thị T 24Hình 3.2 Kết quả xét nghiệm công thức NST: thêm một NST

Ph của bệnh nhân Quản Anh T 25

Sơ đồ 1.1 Cấu trúc NST Philadelphia 4

Sơ đồ 1.2 Mô hình tạo gen lai BCR-ABL do chuyển đoạn NSTt(9;22)(q34;q11) 7

về cơ chế bệnh sinh cho rằng chính các bất thường gen ở tếbào gốc sinh máu đã gây ra bệnh [1].

Lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt (LXMKDBCH) là mộtbệnh nằm trong hội chứng tăng sinh tủy ác tính, bao gồm: (1)LXMKDBCH; (2) Đa hồng cầu tiên phát (bệnh Vaquez); (3)Lách to sinh tủy (xơ tủy vô căn); (4) tăng tiểu cầu tiên phát.Tiến trình tự nhiên của LXMKDBCH bao gồm 3 giai đoạn: (1)giai đoạn mạn tính; (2) giai đoạn tăng tốc; (3) giai đoạnchuyển cấp [2],[3]

LXMKDBCH là một bệnh lý ác tính được các nhà nghiêncứu quan tâm nhiều, một phần vì có cơ chế bệnh sinh kháđiển hình Một biến đổi nhiễm sắc thể trong LXMKDBCH rấtđặc trưng, nhiễm sắc thể Philadelphia (NST Ph) NST Ph cómặt trên 95% bệnh nhân LXMKDBCH ở giai đoạn mạn tính.Gen tổ hợp BCR-ABL được tạo thành mã hoá tổng hợp proteinbcr-abl, có hoạt tính tyrosin kinase nội sinh mạnh [4],[5],[6]

Sự ảnh hưởng của protein bcr-abl tới các đường truyền tínhiệu trong tế bào dẫn tới hậu quả là bất thường về phân bào,ảnh hưởng tới quá trình chết theo chương trình (apoptosis) và

tăng sinh tế bào Đây là cơ chế bệnh sinh chủ yếu được cho làgây ra bệnh LXMKDBCH [7],[8],[9].

Tại Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu vềđặc điểm tế bào di truyền và đột biến gen của bệnh nhân lơ

xê mi kinh dòng bạch cầu hạt [7],[10],[11],[12],[13],[14],[15],[16] Các xét nghiệm tế bào di truyền và sinh học phân tửđóng vài trò rất quan trọng trong việc chẩn đoán và theo dõibệnh LXMKDBCH Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề

tài: “Nghiên cứu đặc điểm tế bào di truyền và đột biến

gen của bệnh nhân lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung Ương” để góp phần

làm rõ thêm:

1 Nghiên cứu bất thường NST của bệnh nhân lơ xê

mi kinh dòng bạch cầu hạt.

2 Nghiên cứuđột biến gen hỗn hợp BCR-ABL của

bệnh nhân lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

về cơ chế bệnh sinh cho rằng chính các bất thường gen ở tếbào gốc sinh máu đã gây ra bệnh [1]

LXMKDBCH là một bệnh nằm trong hội chứng tăng sinhtủy ác tính, bao gồm: (1) LXMKDBCH; (2) Đa hồng cầu tiênphát (bệnh Vaquez); (3) Lách to sinh tủy (xơ tủy vô căn); (4)tăng tiểu cầu tiên phát Tiến trình tự nhiên của LXMKDBCHbao gồm 3 giai đoạn: (1) giai đoạn mạn tính; (2) giai đoạntăng tốc; (3) giai đoạn chuyển cấp [2],[3]

1.2 Vài nét về lịch sử bệnh LXMKDBCH

LXMKDBCH được Bennett và Virchow mô tả lần đầu tiênvào năm 1845 trên một bệnh nhân có triệu chứng lách rất to,thiếu máu và nhiều bạch cầu hạt trong máu [3]

Năm 1960 ghi nhận một sự kiện lịch sử rất quan trọng làNowel và Hunggerfort phát hiện ra sự bất thường của NSTnhóm G trên các bệnh nhân LXMKDBCH, đặt tên là NSTPhiladelphia (tên thành phố nơi hai ông tìm ra), viết tắt là NST

Ph [3],[17]

Năm 1973, bằng kỹ thuật nhuộm băng NST dùngQuinacrine và Giemsa, Rowley khám phá ra NST Ph là kết quảcủa chuyển đoạn nhánh dài giữa NST số 9 và NST số 22 [3].

Năm 1985 người ta đã chứng minh được kết quả của sựchuyển đoạn tạo nên NST Ph làm hình thành gen hỗn hợpBCR-ABL và sản phẩm mã hóa của gen này là protein P210BCR-ABL có hoạt tính tyrosin kinase cao [3]

1.3 Dịch tễ học bệnh

LXMKDBCH chiếm khoảng 20% tổng số các bệnh lơ xê mivới tỷ lệ bệnh nhân mới phát hiện hàng năm khoảng 1-1,5/100000 dân số Nam giới mắc bệnh nhiều hơn nữ (tỷ lệnam/nữ = 1,4/1) Theo các tác giả nước ngoài, bệnh có thểgặp ở mọi lứa tuổi với tỷ lệ mắc bệnh cao ở những người trên

50 tuổi [2],[3],[18]

1.4 Bệnh nguyên

Người ta cho rằng LXMKDBCH là một bệnh mắc phải,mặc dù trong đa số trường hợp không tìm thấy yếu tố nàotrực tiếp gây bệnh [3]

Tỷ lệ mắc bệnh khá cao trong những người nhiễm chấtphóng xạ sau vụ ném bom nguyên tử tại Hiroshima vàNagasaki và ở các bệnh nhân viêm cột sống dính khớp điều trịbằng tia xạ cho phép giả định rằng phóng xạ có thể là mộtnguyên nhân gây bệnh [2],[3],[19]

Chưa có bằng chứng chắc chắn nào về các yếu tố khác

có thể là nguyên nhân gây bệnh LXMKDBCH như virus hayhóa chất [20]

1.5 Cơ chế bệnh sinh

1.5.1.NST Philadelphia (NST Ph)

Sơ đồ 1.1 Cấu trúc NST Philadelphia

NST Philadelphia là một NST đột biến gặp ở trên 90% bệnhnhân LXMKDBCH Đây là một NST thuộc nhóm G được tạo ra do

sự chuyển đoạn giữa nhánh dài của NST số 9 và NST số 22.Bằng kỹ thuật nhuộm Quinacrine và Giemsa, người ta đã xácđịnh được điểm đứt gãy của NST số 9 và số 22 là cố định trêncùng một băng NST, cụ thể là băng q34 trên NST số 9 và băngq11 trên NST số 22 Như vậy, NST Ph là kết quả chuyển đoạnt(9;22)(q34;q11) [7], [21],[22]

Ý nghĩa của NST Ph trong chẩn đoán, tiên lượng bệnhLXMKDBCH: các nghiên cứu về tế bào di truyền của bệnhnhân LXMKDBCH cho thấy các bệnh nhân có NST Ph dươngtính hay âm tính có tiên lượng bệnh như nhau xét về thời giansống thêm cũng như về thời điểm chuyển cấp của bệnh [23]

1.5.2.Gen hỗn hợp BCR-ABL

1.5.2.1.Cấu trúc gen BCR-ABL

Trong LXMKDBCH, gen hỗn hợp bcr-abl được tạo thành

do kết quả chuyển đoạn t(9;22)(q34;q11) – chuyển đoạn tạonên NST Ph [23],[24]

Chuyển đoạn t(9;22)(q34;q11) hình thành nên gen hỗn hợp do các gen sau đây tham gia:

Proto-oncogen abl: Proto-oncogen abl ở người có cấu

trúc tương tự oncogen v-abl của virus A-MuLV (gây lơ xê micấp dòng lympho trên chuột) Gen abl nắm trên nhánh dàicủa NST số 9 Hai exon đầu tiên là 1a và 1b nằm cách exonthứ 2 tương ứng là 18 và 200kb 9 exon tiếp theo có cấu trúc

và trình tự tương tự oncogen v-abl của virus [3]

Gen bcr: gen bcr nằm trên nhánh dài của NST số 22.

Gen này có chứa khu vực điểm đứt gãy (Major breakpointcluster region- M-bcr) rất đặc trưng trong chuyển đoạn t(9;22)(q34;q11) gặp trong LXMKDBCH M-bcr có 5 exon TrongLXMKDBCH, điểm chuyển đoạn của gen bcr nằm ở vị trí (1)giữa exon 2 và 3; hoặc (2) giữa exon 3 và 4 của M-bcr [3],[24],[25]

Proto-oncogen c-sis: gen c-sis là proto-oncogen ở

người có cấu trúc tương đồng với oncogen v-sis của SimianSarcoma Virus Gen c-sis mã hóa tổng hợp yếu tố tăng trưởng

có nguồn gốc từ tiểu cầu (Platelet- Derived Growth Factor –PDGF) [26],[27]

Các vị trí đứt gãy trên gen bcr và gen abl để tạo nên các dạng gen bcr-abl.

Nghiên cứu sâu hơn ở mức sinh học phân tử, người taxác định được rằng vị trí đứ gãy của gen BCR và gen ABL gồm[28],[29],[30].

Gen trên abl: đứt gãy trên vùng tương đối rộng

(200kb), hay gặp nhất đứt gãy ở giữa exon thứ 1 và exon thứ

2 của gen abl (còn ký hiệu a2)

Gen trên bcr có 3 vùng đứt gãy:

Vùng M-BCR (Major breakpoint cluster region) dài 5,8kb,

từ exon 12 đến exon 16 của gen BCR hay còn được ký hiệu b1đến b5 của vùng M-BCR Hầu hết các đứt gãy xảy ra giữa b2

và b3 hoặc giữa b3 và b4 Kiểu đột biến này gặp ở hầu hếtbệnh nhân LXMKDBCH

Vùng m-BCR (minor breakpoint cluster region) dài 35kb

có các exon 1 đến exon 19, vị trí đứt gãy hay nằm giữa exon

1 và 2 Kiểu đột biến này gặp ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dònglympho nhiều hơn

Vùng µ-BCR: đứt gãy ở giữa exon 19 và exon 20 Kiểuđột biến này gặp ở bệnh nhân LXMKDBCH trung tính [31]

Tùy vào vị trí đứt gãy trên gen BCR và gen ABL mà genbệnh BCR-ABL sẽ có các dạng khác nhau Hai dạng hay gặpnhất là b3a2 và b2b2, hiếm hơn là b3a3, b2a3, e1a2,e19a2, [32],[33]

Sơ đồ 1.2 Mô hình tạo gen lai BCR-ABL do chuyển đoạn

NST t(9;22)(q34;q11)

- m-BCR, M-BCR, µ -BCR: các vị trí đột biến trên genBCR

- breakpoint vị trí đột biến gen trên ABL

- b2, b3: vị trí gắn của gen ABL trên NST số 22 để tạo racác kiểu đột biến b2a2, b3a2

1.5.2.2.Vai trò của gen bcr-abl trong cơ chế bệnh sinh của LXMKDBCH

Theo nhiều nghiên cứu ở mức độ sinh học phân tử củabệnh LXMKDBCH, cho thấy gen BCR/ABL bao giờ cũng có mặt

ở các bệnh nhân LXMKDBCH và là yếu tố có vai trò quyết địnhtrong cơ chế bệnh sinh của bệnh, không phụ thuộc vào việcNST Ph có có được tìm thấy bằng phương pháp tế bào ditruyền hay không [34] Nghiên cứu trên các bệnh nhânLXMKDBCH có các kiểu gen hỗn hợp BCR-ABL khác nhau cho

thấy thời điểm chuyển cấp của nhóm bệnh nhân có gen b2a2chậm hơn nhiều so với nhóm bệnh nhân có gen b3a2 [18],[35],[36].

1.5.3.Sản phẩm mã hóa của gen hỗn hợp BCR-ABL: Protein 210

Người ta thấy trên gen BCR ở NST số 22 có hai điểm gãy

để gắn với gen ABL Thông thường điểm gãy ở giữa exon 2 vàexon 3 của gen BCR gọi là điểm M (Major) và gen lai M-BCR-ABL

mã hóa một protein có trọng lượng phân tử là 210KD (ký hiệu làP210) P210 có hoạt tính tyrosin kinase mạnh hơn sản phẩmcủa gen ABL bình thường là P145, do đó tế bào tăng sinh, biệthóa quá mức và gây bệnh lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt [4],[5],[6]

Cơ chế hoạt động của protein P210 và vai trò của P210trong có chế gây bệnh LXMKDBCH: P210 gắn với ATP vàchuyển nhóm phosphat từ phân tử ATP sang gốc tyrosin ởprotein đích, tức là xúc tác cho phản ứng phosphoryl hóa.Người ta đã xác đinh rằng P210 gây ra tình trạng giảm khảnăng liên kết của các tế bào gốc tạo máu với tế bào đệm của

vi môi trường sinh máu Kết quả là thời gian tương tác giữacác tế bào gốc tạo máu trong LXMKDBCH có thời gian sinhsản lâu hơn trước khi bước vào quá trình biệt hóa [13],[24],[21]

Gen hỗn hợp BCR-ABL và protein 210 còn được cho là cóthể làm giảm khả năng chết theo chương trình (apoptosis)của tế bào máu vì vậy các tế bào này sống lâu hơn các tế bào

bình thường và góp phần làm tăng bạch cầu trong bệnhLXMKDBCH [7],[8],[9].

1.6 Biểu hiện lâm sàng

Các nghiên cứu về diễn biến bệnh cho thấy LXMKDBCH làmột bệnh lý nhiều giai đoạn, thường diễn biến tự nhiên qua bagiai đoạn [17],[19],[37]:

(1)Giai đoạn mạn tính (chronic phase): đặc trưng củagiai đoạn này là có các triệu chứng của một lơ xê mi kinh điểnhình

(2)Giai đoạn tăng tốc (accelerated phase): đặc trưng làtrên nền của lơ xê mi kinh xuất hiện những cơn blast (blastcrisis)

(3)Giai đoạn lơ xê mi cấp thực sự (acute leukemia): biếuhiện triệu chứng đặc trưng của lơ xê mi cấp

Triệu chứng lâm sàng:

Giai đoạn mạn tính:

- Lách to, gặp ở 85-90% người bệnh Gan to gặp trên50% người bệnh

- Mệt mỏi, kém ăn, sụt cân, ra mồ hôi đêm

- Thiếu máu mức độ nhẹ hoặc vừa

- Tắc mạch (tắc mạch lách, tắc mạch chi, tắc tĩnh mạchdương vật, phù gai thị, giảm hoặc mất thị giác một bên, giảmthính giác…) [38]

- Biểu hiện của bệnh Goute do tăng axit uric máu gặp trênmột số người bệnh

Giai đoạn tăng tốc:

- Biểu hiện lâm sàng nặng lên (thiếu máu, xuất huyết,nhiễm trùng).

- Lách to không đáp ứng với điều trị

Giai đoạn chuyển lơ xê mi cấp:

- Trong giai đoạn này thường gặp biểu hiện lâm sàng đặctrưng cho lơ xê mi cấp như triệu chứng thiếu máu, xuất huyết,nhiễm trùng, hội chứng thâm nhiễm

1.7 Biểu hiện cận lâm sàng

109 /l (gặp trong khoảng 50-70% trường hợp)

- Tuỷ xương: (1) Tuỷ giàu tế bào (số lượng tế bào tuỷtrên 100 x 109 /l); (2) Tăng sinh dòng bạch cầu hạt đủ các lứatuổi; tỷ lệ M:E trên 10:1 (bình thường là 3-4:1) [3],[19],[20];(3) Tỷ lệ tế bào blast hoặc nguyên tuỷ bào và tiền tuỷ bàodưới 15%;

- NST Phvà/hoặc gen bcr-abl: Dương tính trong khoảng 95%trường hợp

-Men phosphatase kiềm bạch cầu: giảm trên đa số bệnhnhân

- Nồng độ axit uric máu: Tăng trên 40-60% trường hợp

Giai đoạn tăng tốc:

- Máu ngoại vi: (1) Tăng tỷ lệ tế bào blast hoặc nguyêntuỷ bào và tiền tuỷ bào nhưng dưới 20%; (2) Giảm số lượnghồng cầu và nồng độ hemoglobin; (3) Số lượng tiểu cầu có thểtăng hoặc giảm.

- Tuỷ xương: (1) Giảm sinh dòng hồng cầu và dòng mẫutiểu cầu; (2) Xu hướng tăng tế bào non ác tính (tế bào blast),trong đó tỷ lệ tế bào blast hoặc nguyên tuỷ bào và tiền tuỷbào nhưng dưới 20%

Giai đoạn chuyển lơ xê mi cấp:

- Máu ngoại vi: (1) Tăng tỷ lệ tế bào blast hoặc nguyêntuỷ bào và tiền tuỷ bào ≥ 20%; (2) Giảm số lượng hồng cầu

và nồng độ hemoglobin; (3) Giảm tiểu cầu

- Tuỷ xương: (1) Giảm sinh dòng hồng cầu và dòng mẫutiểu cầu; (2) Tăng sinh các tế bào non ác tính (tế bào blast),trong đó tỷ lệ tế bào blast hoặc nguyên tuỷ bào và tiền tuỷbào ≥ 20%

1.8 Các xét nghiệm tế bào di truyền và sinh học phân

tử sử dụng trongchẩn đoán, theo dõi bệnh LXMKDBCH 1.8.1.Di truyền tế bào (kỹ thuật công thức NST – Karyotyping) [39]

Di truyền tế bào là nghiên cứu về NST Đây là mộtphương pháp tổng quát nhất để đánh giá bất thường NST, baogồm cả bất thường về số lượng và bất thường về cấu trúc

Mục đích chỉ định xét nghiệm: phát hiện NST Ph và bấtthường số lượng, cấu trúc khác

Tuy nhiên phương pháp này có một số hạn chế như: chỉphân tích được NST ở kỳ giữa (metaphase), độ nhạy thấp

(5x10-1) và không phát hiện được các bất thường ở mức độsinh học phân tử.

1.8.2 Di truyền phân tử (kỹ thuật lai tại chỗ- FISH) [39]

Kỹ thuật FISH được sử dụng để phân tích những thay đổiDNA đặc hiệu trong tế bào hoặc NST

Ưu điểm so với di truyền tế bào là FISH chỉ cần sử dụng

tế bào ở kỳ trung gian (interphage) mà không cần phải là NST

ở kỳ giữa

Tuy nhiên độ nhạy của kỹ thuật FISH mặc dù cao hơn kỹthuật di truyền tế bào (5x10-2) nhưng vẫn chưa đủ để đáp ứngtheo dõi lui bênh mức độ sinh học phân tử

1.8.3.Các kỹ thuật sinh học phân tử (RT-PCR, PCR) [39]

Realtime-Mục đích: RT-PCR phát hiện gen BCR-ABL để tìm đíchđiều trị, Realtime-PCR phát hiện gen BCR-ABL để xác địnhmức độ biểu hiện của gen BCR-ABL trước điều trị, theo dõimức độ lui bệnh về sinh học phân tử khi đạt lui bênh hoàntoàn về di truyền tế bào (CCR), theo dõi ngăn chặn tái phátbệnh khi đạt lui bệnh hoàn toàn về sinh học phân tử (CMR)

Ưu điểm nổi bật của các kỹ thuật sinh học phân tử là có

độ nhạy cao (10-6-10-3) và khả năng tự động hóa Vì vậy hiệnnay các kỹ thuật sinh học phân tử trở thành các xét nghiệmchính để chẩn đoán và theo dõi bệnh

Giá trị của kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán, theo dõi điều trị bệnh LXMKDBCH: đây là một xét nghiệm rất

quan trọng để chẩn đoán xác định bệnh LXMKDBCH [40], do

xét nghiệm huyết tủy đồ không rõ ràng và không có NST Ph.Phát hiện sự có mặt của gen BCR-ABL cho phép khẳng địnhchẩn đoán bệnh LXMKDBCH [40] Do các kỹ thuật RT-PCR,Realtime-PCR có khả năng phát hiện tế bào ác tính ở ngưỡng

mà các kỹ thuật di truyền tế bào và di truyền phân tử khôngphát hiện được

Đây cũng là một xét nghiệm quan trọng trong theo dõiđáp ứng điều trị với thuốc nhắm đích Imatinib (Gleevec):trong quá trình điều trị bệnh , bệnh nhân được coi là lui bênhhoàn toàn khi không còn triệu chứng lâm sàng và không pháthiện tế bào lơ xê mi trong tủy xương qua xét nghiệm tủy đồ.Tuy nhiên trong tủy xương vẫn còn quần thể tế bào lơ xê micòn tồn lưu Do đó việc sử dụng các xét nghiệm có độ nhạycao như RT-PCR, Realtime-PCR để xác định các quần thể đó

có ý nghĩa rất lớn cho tiên lượng cũng như quyết định điều trịtiếp theo [11]

1.8.4.Đánh giá mức độ lui bệnh:

Hiện nay trongphác đồ điều trị nhắm đích (như CML), sốlượng các tế bào chứa bất thường di truyền trong mỗi giaiđoạn bệnh được coi như các tiêu chí để đánh giá mức độ luibệnh cho người bệnh Các tiêu chí được đánh giá cụ thể nhưsau (theo NCCN Guidelines Version 2.2014):

-Đánh giá lui bệnh ở mức độ di truyền tế bào (đánh giá ítnhất trên 20 metaphase quan sát):

 Lui bệnh hoàn toàn ở mức độ di truyền tế bào(Complete Cytogenetic Response- CCyR): khi xétnghiệm không còn dương tính với NST Ph

 Lui bệnh phần lớn ở mức độ di truyền tế bào (MajorCytogenetic Response- PCyR): khi có 1 đến 35% tếbào dương tính với NST Ph.

 Lui bệnh một phần ở mức độ di truyền tế bào (PartialCytogenetic Response): khi có 36% đến 65% tế bàodương tính với NST Ph

 Lui bệnh tối thiểu ở mức độ di truyền tế bào (MinorCytogenetic Response): khi có 66% đến 95% tế bàodương tính với NST Ph

 Không lui bệnh: khi có >95% tế bào dương tính vớiNST Ph

-Đánh giá lui bệnh ở mức độ phân tử:

 Lui bệnh hoàn toàn ở mức độ phân tử (CompleteMolecular Response- CMR): khi xét nghiệm thấy nồng

độ bản sao BCR-ABLgiảm dưới 0,0032% với kỹ thuậtQuantitative-PCR theo chuẩn quốc tế (InternationalScale – IS)

 Lui bệnh phần lớn ở mức độ phân tử (Major MolecularResponse): khi tỷ lệ mARN BCR-ABL so với gen thamchiếu ( theo IS) ≤ 0,1% xét nghiệm với kỹ thuật Q-PCR

1.9 Phương pháp điều trị

1.9.1.Giai đoạn mạn tính và tăng tốc

1.9.1.1 Điều trị nhắm đích bằng thuốc ức chế hoạt tính tyrosin kinase

- Lựa chọn điều trị thứ nhất là các thuốc ức chế hoạt tính tyrosin kinasethế hệ 1 và 2, cụ thể là:

+ Thuốc ức chế hoạt tính tyrosin kinase thế hệ 1: Imatinib Liều dùngban đầu: 400 mg/ngày (4 viên hàm lượng 100 mg/ngày) ở giai đoạn mạn tính;600-800 mg/ngày ở giai đoạn tăng tốc, 800 mg/ngày ở giai đoạn chuyển lơ xê

+ Tủy đồ và NST Ph (công thức NST và/hoặc FISH) sau mỗi 3 tháng

kể từ lúc bắt đầu điều trị;

+ Định lượng gen bcr-abl (kỹ thuật PCR định lượng) từ lúc chẩn đoán

và mỗi 3 tháng trong quá trình điều trị để lượng hóa mức độ lui bệnh phân tử;

+ Phát hiện đột biến gen bcr-abl kháng thuốc khi người bệnh không đápứng với điều trị bằng kỹ thuật giải trình tự gen

1.9.1.2 Các thuốc điều trị khác

Hydroxyurea: Liều khởi đầu 30-60 mg/kg cân nặng cơ thể/ngày Giảmliều tuỳ theo số lượng bạch cầu rồi chuyển sang điều trị duy trì liều thấp (10-

20 mg/ngày) khi số lượng bạch cầu trở về giá trị bình thường

- Interferon-: Liều khởi đầu 5 MU/m2/ngày Điều trị trong vòng 3 nămsau khi đạt lui bệnh về tế bào di truyền Sau đó có thể giảm liều Interferon-rồi dừng thuốc và xét nghiệm NST Ph mỗi 6 tháng

1.9.1.3 Ghép tế bào gốc tạo máu

- Ghép tế bào gốc tạo máu đồng loại với người cho phù hợp HLA làphương pháp cho phép đạt tới tình trạng lui bệnh lâu dài với khả năng tiến tớikhỏi bệnh

1.9.1.4 Điều trị hỗ trợ

- Truyền máu nếu người bệnh có thiếu máu nhưng cần hạn chế chỉ địnhtruyền máu khi số lượng bạch cầu còn cao trên 100G/L để tránh làm tăngnguy cơ tắc mạch

- Bổ sung dịch bằng đường uống (2-3 lít nước/m2 hàng ngày), kiềm hóanước tiểu, lợi niệu cưỡng bức phòng ngừa hội chứng tiêu khối u

- Allopurinol đường uống 300 mg/ ngày phòng ngừa và điều trị tăngaxit uric máu

- Gạn bạch cầu khi số lượng bạch cầucao trên 100G/L

1.9.2.Giai đoạn chuyển cấp

Trong giai đoạn chuyển cấp của lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt, cầnđiều trị như đối với lơ xê mi cấp (đa hoá trị liệu và ghép tuỷ đồng loại) phốihợp với điều trị nhắm đích bằng các thuốc ức chế hoạt tính tyrosin kynase

1.10 Các nghiên cứu khác về đặc điểm tế bào di truyền

và đột biến gen của bệnh nhân LXMKDBCH trong nước

Tại Việt Nam đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu

về bệnh LXMKDBCH, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vàodịch tễ học, đặc điểm lâm sàng, huyết học và điều trị bệnh[7],[10],[37],[41],[42] Các nghiên cứu đều cho thấy ở nước

ta, bệnh LXMKDBCH là một bệnh thường gặp nhất trong cácbệnh thuộc hội chứng tăng sinh tủy ác tính

Các nghiên cứu về dịch tễ học:Theo nghiên cứu của tácgiả Ngyễn Thị Minh An tại bệnh viện Bạch Mai thì tỷ lệ bệnhLXMKDBCH chiếm 23,91% trong số các bệnh lơ xê mi và5,63% các bệnh máu nói chung [41] Năm 2003, theo tác giảNguyễn Hà Thanh, tỷ lệ mắc bệnh nam/nữ là 2,2/1, tuổi trungbình của bệnh nhân là 38,2, nhóm tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất là

30 – 60 tuổi [7] Theo tác giả Nguyễn Thiên Lữ thì tuổi trungbình của bệnh nhân là 36,37, tỷ lệ nam/nữ là 1,69/1 [11]

Gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu đi sâu vàophân tích bất thường tế bào di truyền trong bệnh LXMKDBCH.Tại bệnh viện Truyền máu – Huyết Học TP.Hồ Chí Minh đã ápdụng kỹ thuật FISH nhằm phát hiện bất thường NST trongbệnh LXMKDBCH Theo tác giả Nguyễn Hà Thanh, có 92,5%bệnh nhân có NST Ph dương tính [7],[12],[13] Theo tác giảPhạm Quang Vinh, khoảng 90-98% bệnh nhân LXMKDBCH cóNST Ph dương tính [43],[44]

Nhiều công trình nghiên cứu phân tích về gen đột biến:

Đa số BN có gen BCR/ABL, trong đó đột biến hay gặp là kiểu

b3a2 [44],[45] Tại bệnh viện Truyền máu – Huyết Học TP.HồChí Minh, kết quả nghiên cứu cho thấy 88,68% bệnh nhânCML dương tính với BCR-ABL nhờ kỹ thuật RT-PCR Theo cáctác giả Phan Đình Điền, Phạm Hùng Vân, Nguyễn Thái Sơn tỷ

lệ gen tổ hợp BCR-ABL được phát hiện dương tính trong máungoại vi của bệnh nhân CML với tỷ lệ 98,33%, tỷ lệ tương ứngcủa các kiểu gen đột biến b2a2 và b3a2 là 32,20% và44,07%, dạng kết hợp chiếm 23,73% [46]

CHƯƠNG2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi bao gồm 140 bệnhnhân, được chia thành 2 nhóm để nghiên cứu với mục tiêukhác nhau:

 Nhóm 1:120 bệnh nhân vào viện lần đầu và có kết quảxét nghiệm công thức NST và sinh học phân tử từ tháng 1năm 2014 đến tháng 3 năm 2016 Số liệu thu được dùng đểnghiên cứu bất thường NST và gen đột biến của bệnh nhân

 Nhóm 2: 20 bệnh nhân được chẩn đoán và điều trịLXMKDBCH từ tháng 1 năm 2012 đến tháng 3 năm 2016.Nhóm 2 được chúng tôi nghiên cứu với mục đích để tìm hiểuthêm về mức độ đáp ứng sau điều trị nhắm đích ở mức độsinh học phân tử

- Địa điểm nghiên cứu: Viện Huyết Học – Truyền Máu TW

2.1.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán

Chẩn đoán xác định: dựa vào triệu chứng lâm sàng, xétnghiệm tế bào máu ngoại vi, tủy đồ, NST Ph, gen hỗn hợpBCR-ABL, theo tiêu chuẩn của WHO năm 2001.

Chẩn đoán phân biệt: phản ứng giả lơ xê mi gặp trongnhiễm trùng nặng, các bệnh khác trong hội chứng tăng sinhtủy mạn ác tính, theo bảng xếp loại của WHO năm 2008

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang, hồi cứu, bao gồm các bước:

2.2.2 Quy trình nghiên cứu

Lập hồ sơ bệnh án theo mẫu riêng để thu thập các biến

số nghiên cứu

Phân tích kết quả các xét nghiệm di truyền tế bào, sinhhọc phân tử

Xử lý số liệu

2.2.3 Nội dung, biến số nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm di truyền tế bào:

+ Phân tích kết quả xét nghiệm công thức NST –Karyotyping: bất thường về số lượng, cấu trúc bộ NST Phân tíchkết quả trên 120 bệnh nhân (Nhóm 1)

- Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen bệnh máu ác tínhBCR-ABL:

+ Phân tích kết quả xét nghiệm phát hiện gen bệnh máu

ác tính BCR-ABL P210: định tính gen hỗn hợp, kiểu gen độtbiến Phân tích kết quả trên 120 bệnh nhân (Nhóm 1)

+ So sánh kết quả xét nghiệm công thức NST và kết quảxét nghiệm gen hỗn hợp BCR-ABL.

- Phân tích kết quả đáp ứng thuốc sau điều trị nhắm đích

ở mức độ sinh học phân tử trên 20 bệnh nhân (Nhóm 2)

2.2.4 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.2.4.1 kỹ thuật công thức NST tủy xương (hay còn gọi là kỹ thuật phân tích kiểu nhân – karyotyping)[39].

Được tiến hành theo quy trình tiêu chuẩn của khoa ditruyền – sinh học phân tử của Viện Huyết học - Truyền máuTrung ương được trình bày trong sách kỹ thuật xét nghiệmhuyết học và truyền máu ứng dụng trong lâm sàng

Nguyên lý: Bình thường ở tủy xương, các tế bào sinh

máu vẫn liên tục tăng sinh và trưởng thành, do vậy quátrình phân chia tế bào xảy ra một cách tự nhiên Dựa vàotính chất này có thể làm tiêu bản tế bào NST tủy xương trựctiếp hoặc sau khi nuôi cấy tế bào trong môi trường nhân tạo

để phân tích NST

2.2.4.2 Kỹ thuật sinh học phân tử [39].

Các xét nghiệm sinh học phân tử được dùng để xác địnhbản sao BCR-ABL và định lượng số lượng bản sao để giúp theodõi đáp ứng sinh học phân tử trong quá trình điều trị

- Kỹ thuật Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR):

Xét nghiệm xác định gen BCR/ABL thực hiện bằng kỹthuật RT-PCR, theo qui trình tiêu chuẩn đang thực hiện tạiViện Huyết học - Truyền máu Trung Ương